Souris
Analyse de l’innervation cornéenne en imagerie in vivo chez des souris agées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Une lésion est provoquée sur la cornée de chaque animal, qui subit ensuite jusqu'à cinquante-deux séances d'imagerie sous anesthésie, à raison d'une par semaine pendant un an. Le porteur reconnaît que la répétition des anesthésies peut entraîner une détresse respiratoire et une opacification de la cornée. Il étudie le vieillissement de l'innervation cornéenne et juge l'animal "indispensable", sans alternative in vitro.
Objectifs
Les maladies de la cornée sont la deuxième cause de cécité dans le monde après la cataracte. Leur origine peut être génétique, dégénérative (vieillissement, diabète) et/ou environnementale. Il est donc essentiel de mieux comprendre la physiologie de la cornée pour proposer de nouvelles options thérapeutiques aux patients souffrant de défauts de la cornée. L'atteinte de l'innervation cornéenne se traduit par des symptômes allant d'une diminution de la sensibilité oculaire sans lésion cornéenne au syndrome de l'oeil sec en passant par la kératite neurotrophique et la perforation cornéenne. Actuellement, il n'existe aucun traitement disponible en routine pour la gestion de l'innervation cornéenne. Dans ce projet, nous souhaitons étudier comment l’innervation cornéenne est affectée par le vieillissement. Grâce à des techniques d’imagerie en temps réel combinés à l’utilisation de souris transgéniques, nous sommes capables de suivre l’innervation de la cornée des souris au cours du temps.
Bénéfices attendus
La bonne compréhension des mécanismes de dégénérescence de l’innervation de la cornée ainsi que les interactions se produisant entre les nerfs et les cellules immunitaires pourront servir de base pour développer et tester des traitements contre la dégénérescence de l’innervation cornéenne
Procédures
Un partie des animaux recevra une injection unique par voie intrapéritonéale (réalisé sur animal vigil, l'acte dure moins de 1 min par animal). L'induction de la lésion de l'épithélium cornéen concerne tous les animaux du projet, l'acte est réalisé sous anesthésie, par une personne expérimentée et dure moins de 5 min par animal. Chaque animal sera imagé 1x par semaine pour une durée allant jusqu'à 1an (soit 52 sessions d'imagerie réalisées sous anesthésie d'une durée de 40-45min chacune). Les animaux seront euthanasiés en fin d'expérimentation par une méthode réglementaire en vue des prélèvements et analyses complémentaires.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux recevront une injection unique en intrapéritonéale. Au moment de la réaliser, la contention et l'introduction de l'aiguille peut être source de stress pour les animaux. Pour réaliser ce projet, nous allons induire une lésion de l'épithélium cornéen chez les animaux pour étudier la réinnervation de la cornée. Cette lésion induit une perte de sensation au niveau de la cornée. L'imagerie en temps réelle est non invasive et n'engendre pas de douleur à l'animal. Cependant, la répétition des anesthésies peuvent augmenter le risque de détresse respiratoire lors de celles-ci. Toute difficulté respiratoire (gasp) entraînera l’interruption de la procédure en cours. Egalement, les sessions d'imageries répétées peuvent provoquées dans de rares cas une opacification de la cornée des animaux étudiés. L'anesthésie peut dans de rare cas amené un stress thermique ou une potentielle détresse restpiratoire chez les animaux.
Devenir
A l'issus de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques complémentaires (les yeux seront prélevés et l'ensemble des cornées des animaux sera disséqué).
Remplacement
Du fait de la complexité de la complexité de l’innervation cornéenne et des interactions avec les cellules immunitaires et le tissu épithélial de la cornée, l’utilisation de l’animal nous est indispensable. Il n’y a pas d’alternative par des modèles in vitro.
Réduction
Ce projet impliquera au maximum 150 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique de ce projet. Un test de puissance a été réalisé pour determiner le nombre minimal d'animaux requis. Des tests statistiques adéquats seront utilisés pour analyser les résultats obtenus.
Raffinement
Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Des points limites ont été définis (tels que la surveillance du poids des animaux, l'absence de locomotion, l'état du pelage, la prostration). Pour l'étape d'induction de la lésion et pour les sessions d'imagerie, les rongeurs bénéficieront d'une anesthésie gazeuse complémenté par une anesthésie locale de la cornée.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement. En effet plus de 98 pourcent de son génome est identique à celui de l’Homme. Par ailleurs, ce modèle permet la transgénèse et donc de pouvoir étudier in vivo les conséquences de la délétion d’un gène. La souris, et en particulier avec le fond génétique C57Bl6J, est un modèle utilisé depuis de très nombreuses années pour l’étude du système nerveux et de l’innervation cornéenne. De ce fait de nombreuses données sont déjà disponibles sur lesquelles notre étude peut se reposer. Le modèle animal est requis pour ce projet car seule l'utilisation d'animaux transgéniques permet de visualiser les interactions entre les neurones et les cellules immunitaires. Il a été observé une dégénérescence de l'innervation cornéenne à partir de 6ème mois, due au vieillissement des animaux. Ainsi, nous induirons les lésions de l'innervation de la cornée au 6ème mois de vie des animaux pour étudier le potentiel de régénération de l'innervation dans un contexte de vieillissement. Comme il n'est pas attendu d'effet lié au sexe des animaux, nous utiliserons indifféremment les souris mâles et femelles.
Induction de la satiété par électrostimulation des voies nerveuses sympathiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 523 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance majoritairement sévère (1 506 individus). Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec pose de fibre optique et injection intracérébrale de virus, l'implantation d'électrodes spinales ou abdominales, un régime gras et sucré destiné à les rendre obèses, puis des séances répétées d'électrostimulation sur cinq semaines. Le porteur reconnaît que ces impulsions peuvent déclencher des comportements d'automutilation, auquel cas la stimulation est arrêtée. Il vise un dispositif médical contre l'obésité et affirme qu'aucune méthode sans animaux ne peut aborder la question, la souris restant selon lui un prérequis réglementaire au développement préclinique.
Objectifs
Ce projet vise à développer une méthode médicale pour traiter l'obésité en utilisant une technique d'électrostimulation du système nerveux. Contrairement aux traitements médicamenteux actuels, qui ont montré une faible efficacité dans la perte de poids, les interventions chirurgicales comme le bypass gastrique sont actuellement les options les plus efficaces pour traiter l'obésité. Cependant, ces interventions chirurgicales sont irréversibles et peuvent présenter des risques à long terme ainsi que des effets indésirables. Des études récentes ont suggéré que les effets bénéfiques du bypass gastrique sont liés au système nerveux sympathique. En conséquence, la stimulation électrique de ce système pourrait représenter une alternative moins invasive à la chirurgie pour traiter l'obésité. Plusieurs données scientifiques soutiennent cette approche, notamment la démonstration de l'inhibition des signaux nerveux spécifiques responsables de l'augmentation de la prise alimentaire. Le développement d'un dispositif médical utilisant l'électrostimulation du système nerveux pour réguler la prise alimentaire et le métabolisme pourrait être une solution prometteuse pour lutter contre l'obésité. Dans ce projet, l'objectif est d'étudier l'effet de l'électrostimulation du système nerveux sur la régulation de la prise alimentaire. Pour cela, des souris génétiquement modifiées sont utilisées comme modèle animal, permettant de surveiller en temps réel l'activité des neurones responsables de la satiété chez l'animal éveillé.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels ne permettent pas de réduire efficacement le poids chez les personnes obèses ou en surpoids. Cependant, cette surcharge pondérale peut entraîner plusieurs problèmes de santé tels qu'une élévation de la tension artérielle, un excès de triglycérides et un excès de sucre dans le sang, pouvant à long terme conduire au diabète de type 2 et/ou à des maladies cardiovasculaires (infarctus) et/ou hépatiques (cirrhose). Par conséquent, le développement de traitements plus efficaces est nécessaire pour lutter contre l'obésité. Les expériences menées dans le cadre de ce projet nous permettront d'évaluer, dans un modèle préclinique, les effets de l'électrostimulation des nerfs périphériques ou de la moelle épinière sur la perte de poids chez des animaux rendus obèses.
Procédures
Dans une première série d'expériences, les animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins de 30 minutes au cours de laquelle nous poserons une fibre optique et réaliserons une injection intracérébrale de virus à l'aide d'un cadre stéréotaxique. Les souris seront soit sacrifiées 3 semaines après la chirurgie par surdosage d’anesthésique pour le prélèvement des cerveaux après perfusion intracardiaque, soit suivies pour un enregistrement en fibre optique pendant 3 sessions d'une heure après un jeûne de 5 heures sur 10 jours, avec isolement en cages individuelles pendant la durée de l'enregistrement. Aucun prélèvement n'est prévu pour cette procédure. Dans d'autres expériences, les animaux subiront deux procédures chirurgicales de moins d'une heure chacune. La première consistera à poser une fibre optique et à injecter par voie intracérébrale un virus, le tout après avoir immobilisé la tête de l'animal sur un cadre stéréotaxique. La seconde consistera à implanter des électrodes de stimulation au niveau spinal ou abdominal. Une semaine après la chirurgie, les animaux seront mis à jeun pendant 5 heures, puis seront soumis à une électrostimulation après avoir été isolés en cages individuelles. Cette électrostimulation sera effectuée selon différents protocoles pendant une durée maximale de 5 semaines, avec un total de 30 sessions de stimulation de 10 minutes par semaine, réparties sur 3 jours hebdomadaires. Aucun prélèvement n'est prévu pour cette procédure. Enfin, concernant certains animaux, ils seront nourris avec un régime enrichi en graisses et en sucres pendant 9 semaines. Ensuite, ces animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins de 45 minutes, comprenant l'implantation d'électrodes de stimulation au niveau spinal ou abdominal. Une semaine après la chirurgie, les animaux seront placés dans des cages métaboliques pour habituation pendant une semaine puis seront électrostimulés pendant 10 minutes avant chaque repas (fournis toutes les 2 heures) en suivant différents schémas temporels. Cette électrostimulation sera poursuivie pendant 3 semaines avant la mise à mort. Aucun prélèvement n'est prévu.
Impact sur les animaux
Toutes les expériences présentées dans cette demande comportent une phase chirurgicale incluant les éléments suivants : • Injection sous-cutanée d'analgésique préopératoire ; • Perte de poids et douleur durant les 2 à 3 premiers jours chez les animaux après l'intervention chirurgicale ; • Surveillance et manipulation des animaux durant les 4 jours de récupération post-chirurgicale (pesée, palpation) ; • Risques chirurgicaux inhérents à toute opération chirurgicale, tels que les risques d'infection ou de rupture des fils de suture ; • Mobilité entravée par la connexion aux générateurs externes pendant la période d'enregistrement et d'électrostimulation. Par ailleurs, les impulsions électriques peuvent causer un inconfort temporaire chez l'animal, ce qui nécessitera une évaluation et une limitation de la durée au maximum. De plus, certaines expériences impliquent un changement de régime alimentaire pouvant entraîner une prise de poids anormale chez cette souche murine et éventuellement des problèmes de malocclusion. Enfin, bien que les animaux soient en général hébergés avec leurs congénères, des périodes d'isolement (hébergement individuel) seront nécessaires : • pendant les enregistrements par fibre optique (maximum 5 heures par jour, tous les deux jours, pendant une durée maximale de 5 semaines) et • lors du suivi métabolique dans des cages dédiées (3 semaines en tout).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort dès la fin des expériences pour des analyses anatomopathologiques et histologiques.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucune méthode in vitro ou in silico scientifiquement validée pouvant servir d'alternative à l'expérimentation animale pour aborder les questions soulevées par ce projet. En effet, l'étude de l'obésité ne peut être adéquatement réalisée in vitro en raison de sa nature complexe. Elle requiert une approche in vivo, prenant en compte l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. Ainsi, l'utilisation d'une espèce le plus proche possible de l'espèce humaine s'avère nécessaire, car la physiologie digestive est caractéristique de chaque groupe phylogénétique. Par exemple, l'utilisation d'animaux modèles de type insectes ou nématodes n'est pas réaliste pour de telles études. En revenanche, la souris posséde un système digestif proche de celui de l'homme même s'il présente des spécificités dont nous devrons tenir compte. Par ailleurs, l'usage d'un modèle expérimental in vivo murin s'avère essentiel en tant que prérequis pour la phase de développement préclinique, selon les autorités régulant la mise sur le marché de dispositifs médicaux.
Réduction
Le nombre de souris a été minimisé tout en restant suffisant pour obtenir des résultats exploitables. Compte tenu de l'expérience pratique des chercheurs, nous estimons qu'un maximum de 17 souris sera nécessaire pour élaborer les différentes étapes du modèle pour la mise au point de la phase chriurgicale. Les chercheurs ont déjà utilisé des points de repère anatomiques et pratiqué des gestes chirurgicaux sur des cadavres de souris, mais l'utilisation d'animaux vivants est nécessaire avant de passer à la phase d'optimisation des paramètres de stimulation. Quant à la deuxième phase, étant donné que le nombre de paramètres d'électrostimulation possibles est pratiquement infini et afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires, nous utiliserons des modèles de régression linéaire. Nous estimons qu'au maximum, 582 souris seront nécessaires pour cette procédure. Ce nombre total de souris est une estimation maximale, car nous effectuerons les expérimentations sur des lots de 10 animaux et des évaluations seront effectuées toutes les 20 souris. Ainsi, si 10 paramètres d’électrostimulation satisfaisants sont identifiés (permettant de réduire l'activité des neurones de la satiété) avant la fin de la procédure, nous mettrons fin aux expérimentations. En ce qui concerne les effets de l'électrostimulation sur la prise de poids, nous avons déterminé le nombre d'animaux par une approche statistique reconnue. Étant donné que notre stratégie expérimentale repose sur la comparaison du poids des animaux électrostimulés par rapport à ceux qui ne le sont pas, nous aurons besoin au maximum de 924 animaux, sachant que nous testerons différents schémas d'administration de l'électrostimulation pour les 10 types de stimulation sélectionnés lors de la phase préliminaire. Ce nombre total de souris est également une estimation maximale, car nous arrêterons les expérimentations dès qu’une combinaison de stimulation/schéma d’administration permet de diminuer significativement le poids des animaux.
Raffinement
• Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (tubes en carton pour se cacher, briques de bois à grignoter). • Une période d’acclimatation d'au moins 7 jours aura lieu, au cours de laquelle aucun geste technique lié à la procédure expérimentale ne sera effectué. Il convient de noter que pour la phase mesurant l'impact de l'électrostimulation spinale sur le prise de poids, les animaux recevront un régime alimentaire enrichi en graisse et en sucre et seront observés au moins 3 fois par semaine par les expérimentateurs afin de surveiller leur état de santé général. • Les chirurgies seront réalisées par du personnel compétent, et les animaux seront placés sous anesthésie et analgésie pour prévenir toute souffrance. Les animaux seront observés deux fois par jour pendant les quatre jours suivant l'opération. Les soins post-opératoires incluront notamment l'administration d'analgésiques pendant 3 jours, ainsi que l'administration d'un traitement anti-inflammatoire stéroïdien dans l'eau de boisson, qui sera maintenu pendant les 2 jours suivants. • Les effets potentiellement douloureux de l'électrostimulation seront évalués tout au long de la procédure, afin de mettre fin à l'électrostimulation dès que des signes de douleur apparaissent. Plus particulièrement, des comportements tels que des sauts de l'animal, une course de la souris ou des comportements d'automutilation entraîneront l'arrêt immédiat de l'électrostimulation en cours, y compris les intensités supérieures. • Les effets sur la prise de poids seront évalués sur un nombre d'animaux strictement nécessaire pour évaluer les effets à long terme de l'électrostimulation. • Enfin, des critères limites ont été définis pour anticiper toute détérioration de l'état de santé général des animaux, qu'ils soient sous anesthésie ou conscients. Si nécessaire, des protocoles de soins appropriés seront appliqués. En cas de détérioration de la santé de l'animal, la mise à mort sera effectuée immédiatement sur décision du responsable de l'étude.
Choix des espèces
L'espèce murine sera utilisée en raison des données de la littérature démontrant une implication du système nerveux dans la prise alimentaire sur ce modèle. De plus, c'est la seule espèce pour laquelle un large panel d'animaux modifiés génétiquement existent, permettant ainis de mesurer l'activité neuronale par photométrie. Nous utiliserons des animaux adultes, car l'objectif est de développer un dispositif médical pour les sujets adultes (âgés de ≥ 8 semaines).
Technologie du plasma à gaz médical contre les bactéries résistantes aux antibiotiques infectant les plaies chroniques : Partie 3 : Efficacité des plasmas froids contre des plaies aigës ou pseudo-chroniques infectées par Staphylococcus aureus chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, deux plaies dorsales leur sont créées au biopsy punch avec pose d'une attelle et de sutures, puis infectées par la bactérie Staphylococcus aureus, avant l'application d'un plasma froid ou d'un antibiotique et quatre prises de sang. Le porteur signale une douleur et une gêne au réveil, ainsi qu'un risque de blessures si les souris se grattent ou se mordent, l'objet étant de tester le plasma froid contre les bactéries résistantes des plaies. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe pour cette phase et présente le porc, dont la peau est plus proche de la nôtre, comme écarté pour des raisons logistiques.
Objectifs
L’objectif est à la fois d’optimiser les technologies plasmas existantes et de développer de nouvelles technologies pour éliminer les bactéries résistantes responsables d’infections nosocomiales. Ceci est accompli dans un consortium interdisciplinaire et international qui met en synergie ses expertises démontrées. Les sources de plasma sont testées dans différents contextes pour leur efficacité antimicrobienne in vitro et in vivo en utilisant un modèle murin de plaie infectée. Des études mécanistiques sur la destruction bactérienne médiée par le plasma froid sont effectuées tandis que des échantillons de plaies provenant de patients facilement disponibles sont utilisés pour fournir du matériel réaliste pour étudier l’efficacité de cette nouvelle approche. Enfin, le traitement de plaies colonisées par des bactéries résistantes aux antibiotiques fournira les données d’une preuve de concept. Les résultats ne serviront pas uniquement à rendre prometteur l’utilisation du plasma froid contre les plaies infectées, mais également à améliorer la cicatrisation de plaies afin de lutter contre le développement de l’antibiorésistance en médecine humaine et vétérinaire. Le projet se déroule en trois étapes et feront l’objet de plusieurs demandes d’autorisation de projet. Première étape : Le premier objectif a été de mettre au point un modèle murin de plaie pseudo-chronique et de montrer l'efficacité des plasmas à froid sur la cicatrisation. Cette étape est donc validée et a permis de mettre en place le modèle de chirurgie, les soins à la douleur et le traitement à plasma froid.
Bénéfices attendus
Au sein du projet global, il est attendu que l’utilisation de plasma froid avec différents gazs soit efficace pour lutter contre l’infection par des bactéries résistantes aux antibiotiques ou pas et pour améliorer la cicatrisation des plaies présentant un déficit cicatriciel. Cela se traduirait notamment par une baisse significative de la colonisation bactérienne de la plaie, et une éventuelle accélération de la cicatrisation des plaies. Un nouveau dispositif à plasma sera également utilisé et ses effets seront comparés à ceux du plasma de référence, déjà utilisé dans des cas cliniques en Allemagne. Il est attendu que ce nouvel outil soit aussi efficace, sinon plus, que le plasma de référence quant à la désinfection et la cicatrisation des plaies, car il permettrait de traiter une surface de plaie plus importante plus rapidement et d’augmenter l’efficacité de la réponse immunitaire. A plus long terme, cela pourrait permettre de généraliser l’utilisation de divers dispositifs à plasma à l'être humain, chez des patients souffrant de troubles de la cicatrisation (diabète, immunodépression, etc.) ; mais aussi de lutter contre l’antibiorésistance s’installant notamment sur ces plaies dans le cas d’infections nosocomiales. Cela pourrait également offrir des opportunités de traitement dans divers domaines (chirurgie, ophtalmologie, oncologie, etc.). La généralisation de l’utilisation de cette technologie pour entièrement décontaminer du matériel médical en milieu hospitalier pourrait être envisagée.
Procédures
Des puces d’identification dorsales seront injectées en sous-cutané à tous les animaux, sous anesthésie (5 minutes par animal). Les animaux seront soumis à une anesthésie générale et à la chirurgie visant à créer les plaies chroniques (biopsy punch et pose de l’attelle avec points de suture, 20 minutes par animal). 4 prises de sang à la veine submandibulaire seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une aiguille. Tous les animaux seront vigiles (2 minutes par animal). Pendant 3 jours après la chirurgie, tous les animaux recevront des injections d’analgésiques en sous-cutané pour gérer la douleur au maximum (2 minutes par animal). Les plaies des animaux seront infectées par Staphylococcus aureus (dépôt de solution non invasif, 5 minutes par animal). Des prélèvements seront effectués à la surface des plaies de chaque animal à l’aide d’un coton-tige (10 secondes par animal). Les traitements plasma à froid ou avec antibiotique seront appliqués sur les plaies (5 min par animal vigile).
Impact sur les animaux
Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après l’injection de la puce d’identification pourrait être observés. Suite à la création des deux plaies dorsales, une douleur et une gêne possible dans les déplacements sont attendues au reveil de l’animal sans analgésie. Si les souris se grattent ou se mordent, des blessures pourraient apparaitre sur le dos ou les flancs. La contention lors des prises de sang peut engendrer du stress pour l’animal. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés. Des symptômes de l’infection pourraient être observés après l’inoculation de S. aureus.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort soit les 672 souris. Des prélèvements de tissus seront effectués post-mortem pour la partie histologie (zone de biospsie et rate) pour l'analyse biologique de la reconstruction de l'épiderme cutané, ainsi que des prélèvements de la surface de la plaie pour analyses bactériologiques. La décision est prise par les responsables scientifiques et concepteurs.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale pour cette partie du projet, puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur l'infection et la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro. Les premières expériences du projet global sont des expériences in vitro qui ont confirmé la nécessité d’une phase in vivo pour obtenir des résultats supplémentaires et plus précis quant à l’objectif final : la phase clinique.
Réduction
Les volumes de sang à prélever par animal et leur fréquence étant contraints, les volumes prélevés à chaque prise de sang seront « poolés » par 2 (même couple d'animaux pour chaque prise de sang). Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques et en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique pour l’étude de la réponse immunitaire et de l’effet de l’infection sur les dérivés oxygénés produits notamment. Deux plaies dorsales seront réalisées sur chaque animal. Cela permet de réduire le nombre d'animaux car le nombre d’échantillons par animal est multiplié par deux, plutôt que de n’avoir qu’une seule plaie plus étendue par animal.
Raffinement
Dès l'arrivée des animaux à l’animalerie, une semaine d’acclimatation est prévue pour permettre l'adaptation des animaux à leur nouvel environnement. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour à partir du jour de la chirurgie (J0) : relevé télémétrique de la température de J0 à J10, signes cliniques tels que le poids, l’aspect du faciès et le comportement général. En cas de mal-être suspecté, de la nourriture sera déposée sur le sol de la cage pour limiter les efforts nécessaires aux animaux. Pour éviter toute souffrance, les animaux seront euthanasiés par inhlalation contrôlée de CO2 dès que leur état état clinique se dégradera en dépit du traitement analgésique mis en place. En particulier, l’expression de trois des signes cliniques suivants sur une période de 24h entrainera leur mise à mort : hypothermie, de J0 à J2, hyperthermie de J2 à J10, comportement anormal, prostration, amaigrissement (>15%), poil hérissé, isolement, diarrhée. Les souris bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid et objet à ronger). Les souris sont hébergées 4 par cage dans une animalerie A2 en portoirs ventilés. Afin de diminuer la douleur de l'injection de la puce, les animaux seront sous anesthésie générale et un léger massage au niveau de la zone d’injection est effectué. Pour la partie chirurgie et le suivi post-opératoire : Période préopératoire : injection pré-opératoire 'un analsgésique (0,1 mg/kg, SC), au moins 20 minutes avant le début de la chirurgie, maintien au chaud sous lampe chauffante Période opératoire : anesthésie gazeuse : 4% pour l’induction, 1-2% pour le maintien, sur tapis chauffant Période postopératoire : injection post-opératoire immédiate d'un anti-inflammatoires non stéroïdiens (10 mg/kg, SC), maintien au chaud sous lampe chauffante. Injection d'un anti-inflammatoires non stéroïdiens (même dose) le soir. Injection d'un anti-inflammatoires non stéroïdiens (10 mg/kg SC, 1 fois/jour, à J1 et J2). Injection d'un analsgésique (même dose) (2 fois/jour, à J1 et J2), voire J3 en fonction du résultat de l'évaluation de la douleur, si elle n'est pas contrôlée par le méloxicam. Visite animalier matin et soir de J0 à J10. En cas d’hypothermie, les souris seront placées sous une lampe chauffante n’émettant pas de lumière. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type bouchés fruitées ou des rondelles de bananes sèches ou popcorn sera réalisée.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus utilisé en expérimentation animale, en particulier quand il s’agit d’expériences impliquant un dispositif médical. Puisque l’objectif est de généraliser l’utilisation du plasma à froid à l’être humain, le porc aurait pu être choisi car la structure de l’épiderme est plus proche de la nôtre. Cependant, il est tout de même préférable de commencer par des expérimentations sur souris d’un point de vue logistique et statistique. Age des souris = 6-7 semaines pour la lignée de référence (déjà validée pour la chirurgie et l'infection à S. aureus). Les souris doivent être de jeunes adultes pour avoir la place de faire les biopsies (décrits dans les modèles publiés) et avoir un système immunitaire mature. Age des souris = 12-13 semaines pour la lignée diabétique Les souris doivent présenter un diabèté confirmé au moment de la réalisation des plaies pour mimer au mieux ce qui se déroule chez le patient.
Etude des conséquences de l’inactivation et de la surexpression de gènes impliqués dans des maladies neurodeveloppementales
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
15 946 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une laparotomie au cours de laquelle l'utérus est exposé et chaque embryon transpercé par un capillaire de verre avant l'application d'un courant électrique, technique d'électroporation in utero destinée à modifier l'expression de gènes dans le cerveau en développement. Les femelles sont tuées pour collecter embryons et nouveau-nés, ces derniers subissant une injection dans le cerveau ou une perfusion intracardiaque terminale, tous étant tués pour prélever les cerveaux. Le porteur affirme que la complexité du cortex ne peut pas être recréée in vitro et conclut à la nécessité de la souris.
Objectifs
Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Un grand nombre de gènes y ont été reliés. Notre objectif est de comprendre les rôles de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies. Chez certains patients avec des maladies du développement cortical, il existe des mutations dans des gènes qui montrent une forte probabilité d’être la cause de la maladie. Ces pathologies sont associées aussi bien à des défauts de prolifération, de migration et de différenciation neuronale. Comprendre les mécanismes par lesquels la mutation entraine la pathologie est essentiel pour faciliter le diganostic d’autres maladies et envisager un traitement. Pour comprendre ce qu’il se passe dans les neurones, nous allons adopter une approche génétique visant à modifier l’expression ou la fonction des molécules étudiées. Nous utiliserons l’électroporation in utero chez la souris. Cette technique permet l’introduction de matériel génétique contrôle et muté dans les cellules progénitrices de la zone ventriculaire du cerveau en développement, permettant donc l’étude de la structure, de la fonction et du développement du système nerveux central. Elle offre l’avantage d’un contrôle spatio-temporel de la délivrance d’ADN, permet des études de perte et de gain de fonction et est simple, rapide et efficace. On pourra ainsi étudier l’effet d’un gène : # sur la prolifération : électroporation au stade embryonnaire (un seul stade par gène selon le pic d’expression du gène étudié) et analyse du devenir des cellules modifiées 1 ou 2 jours plus tard. Dans ce cadre, les mères recevront une ou deux injection(s) nous permettant des analyses de données plus fines# sur la migration des neurones : électroporation au stade embryonnaire et analyse du devenir des cellules modifiées 3 ou 4 jours après # sur la différenciation et la connectivité neuronale en introduisant le gène d’intérêt au stade embryonnaire et en analysant 2, 4, 8 ou 21 jours après la naissance .
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de comprendre la fonction de protéines ou d'autres molécules impliqués dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquels leur déplétion ou surexpression conduit à des troubles du neurodéveloppement. Ce projet aura des retombées pour les patients. En effet, notre collaboration avec des cliniciens nous permet de tester par cette approche des variants retrouvés chez des patients présentant des maladies du développement du cerveau. Comprendre les mécanismes peut permettre d’envisager des pistes thérapeutiques.
Procédures
Les femelles gestantes vont subir une injection d’analgésique (environ 5 secondes), suivie d’une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, pour une durée de 1 à 10 secondes pour chaque embryon). La durée totale de la chirurgie n'exèdera pas 45 minutes ( en moyenne 25 minutes pour un chirurgien expérimenté). Un courant électrique sera appliqué sur la paroi utérine, en 5 pulses de 50 ms espacés de 1 seconde (temps total entre 5 et 6 secondes par embryon). Elles seront par la suite placées dans des cages isolées. Certaines recevront une ou deux injections (5 secondes) 1-2 jours après la chirurgie. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (entre 1 et 10 secondes). Certains nouveaux nés vont subir une injection d’analgésique (environ 5 secondes) puis d’un anesthésique (environ 5 secondes) avant de subir une chirurgie de perfusion intracardiaque terminale sous anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
La barrière cutanée des femelles gestantes donc rompue en plusieurs endroits (site d'injection dans le dos entre les omoplates, aiguille très fine, cicatrice de la laparotomie sur le ventre), il en résulte une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Elles seront par la suite placées dans des cages isolées et de ce fait privées de congénères pendant quelques jours de convalescence. Certaines recevront une ou deux injections sous cutanées 1-2 jours après la chirurgie, pouvant entrainer un stress et d'autre(s) rupture(s) le la barrière cutanée. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin aux stades embryonnaires ainsi que l'application d'un courant électrique sur leur tête. Certains nouveaux nés vont subir une injection d’analgésique puis d’un anesthésique (pouvant entrainer du stress) avant de subir une chirurgie terminale de perfusion intracardiaque.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Les femelles sont mises à mort pour collecter les embryons ou dès collecte des nouveaux nés. Les embryons ou nouveaux nés sont mis à mort pour collecter les cerveaux.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cortical qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération de gènes sur le développement embryonnaire cortical.
Réduction
Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés, aucune nouvelle expérience ne sera effectuée avant qu’une analyse complète des précédentes ne soit réalisée. Les experiences (prolifération, migration, maturation) seront choisies en fonction de la nature du gène étudié, son profil d’expression et du phénotype observé chez les patients. Aussi toutes les expériences ne seront pas systèmatiquement éffectuées. Seules celles relevantes seront faites. En ce qui concerne les études post-natales, et afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés et d’éviter le cannibalisme des souris, nous avons adapté nos croisements pour obtenir des souris moins agressives et meilleures nourrices. La bonne maitrise de la technique chirurgicale acquise par l’équipe tout au long de ces dernières années permet d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons (40-80%) ce qui limite fortement le nombre de femelles gestantes manipulées. Nous prévoyons aussi dans cette étude 10 femelles gestantes pour la formation de nouveaux expérimentateurs afin de nous assurer de leur succès et d’un bon taux de survie.
Raffinement
Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Avant le début de l’expérience, les femelles reçoivent une injection d'analgésique 30 minutes avant l’anesthésie. Durant l’expérimentation les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse. Leurs yeux sont protégés de la deshydratation. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’anesthésie. Un anti-inflammatoire non-stéroïdien, est injecté à la fin de l’opération afin de prendre le relais de l’analgésique pendant 24h. L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent, s’abreuvent et se toilettent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections postchirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement.
Choix des espèces
La technique d’électroporation dans le cerveau a été mise au point chez la souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par animal rend cette méthode efficace. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neuro-développementales chez l’homme. 1) Etude de la prolifération : Femelles adultes gestantes de 13 jours ou 14, stades auxquels la proliferation des progeniteurs est à son maximum. Le choix du stade se fera en fonction du profil d’expression deu gène d’intérêt (un seul stade sera retenu pour les expériences, celui avec le pic d’expression de la protéine d’intérêt) : l’électroporation du matériel génétique d’intérêt en même temps qu’un marqueur fluorescent permettra de suivre la prolifération de ces cellules. Analyse à 14 ou 15 jours de gestation, stade d’étude de la prolifération cellulaire. 2) Etude de la migration cellulaire : Femelles adultes gestantes de 13,5, 14,5 ou 15,5 jours, stades auxquels les neurones migrent le long de la glie pour atteindre leur localisation finale. L’electroporation à ces trois stades permettra de visulaiser la migration de types neuronaux diffèrents (nés à chacun de ces stades). Analyse à 18,5 jours de gestation pour les visualiser grâce à un marqueur fluorescent électroporé en même temps que le matériel génétique à étudier. 3) Etude de la maturation neuronale et connectivité : femelles adultes gestantes de 15,5 jours (stade auquel les neurones callosaux sont générés). L’electroporation des embryons à ce stade permettra d’intégrer le gène à étudier uniquement dans ces neurones et de suivre leur développement grâce à un marqueur fluorescent. Etant donné que les étapes majeures de la formation du corps calleux sont la croissance des axones, le passage dans l’autre hémisphère et la phase terminale de l’invasion par les axones du cortex contralatéral à 2, 4 et à 8 jours après la naissance respectivement et le branchement des axones à 21 jours post-natals, nous prévoyons 4 stades afin d’évaluer ces différentes étapes.
Ciblage thérapeutique d’une population cellulaire impliquée dans la résistance tumorale prostatique chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lésions précancéreuses de la prostate leur sont induites par des injections répétées, puis elles reçoivent pendant 28 jours des composés par injection intrapéritonéale ou par gavage, seuls ou combinés. Le porteur affirme que l'induction n'entraîne "pas de douleur ni de souffrance dans la fenêtre choisie" et n'attend pas d'effet indésirable des composés testés, l'objet étant de cibler une population cellulaire liée à la résistance du cancer. Il indique que des études en culture ont précédé le projet et envisage des organoïdes en trois dimensions s'ils reproduisent fidèlement les tumeurs.
Objectifs
Le cancer de la prostate est la 3ème cause de mortalité par cancer chez l'homme. Dès lors qu'il est invasif, il conduit inévitablément au décès du patient par échappement aux traitements actuels. Notre laboratoire et d'autres ont identifié des populations des cellules épithéliales résistantes aux traitements dans des modèles "souris" qui reproduisent l'évolution du cancer de la prostate chez l'homme. Par des analyses moléculaires, nos collaborateurs ont identifié des molécules régulatrices de cellules résistantes aux traitements. Ces facteurs réprésentent donc des cibles thérapeutiques potentielles pour les formes aggressives du cancer de la prostate. L'efficacité des composés chimiques ciblant ces facteurs a déjà été demontré par nos collaborateurs dans des systèmes cellulaires en culture. Nous aimerions continuer leur charactérisation dans le modèle de souris pour étudier l'effet de ces drogues sur les tumeurs prostatiques aggressives.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'effectuer l'analyse des potentielles cibles thérapeutiques sur un modèle du cancer de la prostate aggressif.
Procédures
Les animaux seront sujets à des traitements par des injections au niveau de l'abdomen pendant 5 jours pour induire l'apparition des lésion précancéreuses prostatiques. Une fois que les lésions précancéreuses deviennent sufisamment avancées (3 ou 5 mois après injection initiale), des injections quotidiennnes d'un des composés en intra-péritonéale pendant 28 jours seront réalisées (30 souris/lot). Un autre composé sera administré aux souris par gavage tous les 3 jours pendant 28 jours (30 souris/lot). Enfin, une thérapie combinée sera également vérifiée avec un composé injecté en intrapéritonéal et l'autre - administré par gavage à la même souris (30 souris/lot). Les injections intra-péritonéales comprennent une préhension de souris et l'injection en elle-même ce qui prend environ 10 secondes. Les gavages comprennent une préhension de souris et le gavage en lui-même, environ 15 secondes sont réquises pour effectuer ce geste par le personnel formé.
Impact sur les animaux
Les injections répétitives peuvent induire l'irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d'injection. Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables liés aux gavages.Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables liés aux composés administrés. L'induction des lésions précancereuses dans notre modèle de souris conduit à une augmentation de taille de prostate mais ne cause pas de douleur ou de souffrance dans la fenêtre choisie pour cette étude d'après les analyses longitudinales de cette lignée effectués dans le cadre du projet antérieur.
Devenir
Tous les animaux de l'étude seront mis à mort et sa prostate sera utilisé pour les analyses moléculaires et cellulaires.
Remplacement
Des études préliminaires ont été ménées par nos collaborateurs sur les modèles cellulaires en culture pour montrer l'efficacité des drogues sur les cellules épithéliales similaires à celles retrouvées dans notre modèle de souris. Nous allons mettre en place des cultures d'organoides (cultures cellulaires en 3D) à partir des souris non-traîtées et si ces derniers reproduisent de manière assez fidèle les charactéristiques moléculaires de nos tumeurs, nous envisageons de les utiliser davantage dans le cadre de ce projet.
Réduction
Nous prévoyons d'utiliser 30 souris par lot expérimental dont 10 souris pour les analyses histologiques, 10 souris pour les analyses de populations cellulaire et 10 souris pour les expériences sur les organoides. A l'aide des calculs statistiques, nous avons estimé que 10 souris par lot étaient suffisantes afin d'observer un effet de traitement sur les populations cellulaires étudiées.
Raffinement
Immédiatement après et la semaine suivante les injections intra-péritonéales, la souris sera surveillée afin de détecter les signes de douleurs, des irritations ou d'inflammation du site d'injection. De plus, les injections seront réalisées en altérnant les côtés d'injection. Immédiatement après le gavage oral, la souris sera surveillée pour détecter les signes de passage de traitement dans les conduits respiratoires. Suite aux traitements, les souris seront pésées quotidiennement. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage en cas de perte de poids. Tout animal en souffrance sans possibilité de soulagement sera sorti de l'étude et mis à mort.
Choix des espèces
Notre modèle de souris récapitule de manière fidèle l'évolution des lésions précancéreuses et du cancer de la prostate chez l'homme. Etant donné que le but de l'étude est d'évaluer l'efficacité des traitements, nous allons étudier l'effet systémique de ces traitement ce qui est impossible en utilisant les systèmes in vitro. Seuls les souris mâles adultes seront utilisés pour ce projet car l'induction de lésions précancéreuses doit se faire sur des prostates matures et donc après la puberté.
Développement post-natal de la souche KI-L178A : Impact physiopathologique du blocage de l’interaction du tPA avec les récepteurs NMDA.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 240 tuées sans réveil et le reste dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou modéré. Issues d'une lignée génétiquement modifiée bloquant l'interaction entre le tPA et un récepteur cérébral, elles sont caractérisées du stade nouveau-né à l'âge adulte par des tests sensorimoteurs, cognitifs et émotionnels, une partie subissant la pose d'un cathéter et un amincissement du crâne pour l'imagerie du couplage neurovasculaire. Le porteur signale une possible perte de poids, des douleurs post-opératoires et des déficits fonctionnels, l'objet restant de comprendre le rôle physiologique de cette interaction. Il affirme le "caractère de stricte nécessité" des procédures et l'impossibilité de les remplacer.
Objectifs
L'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une sérine protéase, connue pour être synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour intervenir dans la fibrinolyse. Ces propriétés font que le tPA est utilisé comme traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. Le tPA est également considéré comme un neuromodulateur au sein du système nerveux central (SNC). Il est produit par les neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales. Il est impliqué dans de nombreux processus physiologiques. Le tPA est connu pour interagir avec différents récepteurs et que l'interaction entre le tPA et un récepteur d'intérêt (tPA/NMDAR) était impliquée dans certains processus physiologiques et pathologiques (AVC, processus inflammatoires). Afin de mieux comprendre le rôle spécifique de cette interaction et de pouvoir élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à celle-ci, nous avons généré, avec la clinique de la souris une nouvelle souche de souris. La spécificité de cette nouvelle souche est une mutation entrainant le blocage de l’interaction du tPA avec ce récepteur d'intérêt. Ainsi, dans ce projet, nous allons caractériser phénotypiquement ces souris et leurs contrôles en conditions physiologiques au cours du développement (des stades post-nataux jusqu’au stade adulte) et évaluer l’impact du blocage de cette interaction sur l’unité neurovasculaire, par l’étude du couplage neurovasculaire.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre l’interaction entre le tPA et notre récepteur d'intérêt dans des processus physiologiques.
Procédures
1-Prélevements : La totalité des animaux seront mise à mort pour prélèvement des organes (n=240, durée de la procédure : 15 minutes). 2/3- Comportements : La totalité des animaux seront soumis (selon les groupes établis) à l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; n=240, durée de la procédure : 30minutes/tests). 4-Couplage Neurovasculaire : Chaque animal fera l'objet d’une pose de cathéter intraveineux pour l'injection de traitements (n=120, durée de la procédure : 15 minutes). Puis le modèle de couplage neurovasculaire sera réalisé (n=120, durée de la procédure : 1 heure). Après un amincissement du crâne, un train de stimulation des vibrisses sera effectué sous imagerie (fUS ou Doppler/Speckle).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification du traceurs injectés de l'intégrité anatomique et vasculaire du SNC.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (AVC, SEP, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant l’évaluation du couplage neurovasculaire, les souris seront sous anesthésie générale (isoflurane 2% O2/N2O 30/70 puis médétomidine à 0,1 mg/kg) et sous anesthésie locale (Xylocaine 5%, nébuliseur). Les yeux des souris seront couverts (vitamine A en gel et gel oculaire) afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de SEP et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques, les souris KI-L178A déficientes pour le site d’interaction du tPA sur la sous-unité GluN1 du NMDAR. Ce modèle transgénique ne peut être réalisé que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Les procédure 1 et 2 concernent une évaluation développementale de l’influence du blocage de l’interaction du tPA avec les NMDAR chez les animaux, à savoir des stades P0, P3, P5, P15, P30 et P60. Concernant les autres procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires.
Évaluation dans un modèle murin d’une méthode d’immunothérapie pour traiter le paludisme
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de protéines puis de parasites du paludisme, un traitement, des prélèvements sanguins tous les un à deux jours et, sous anesthésie, une exposition de 45 minutes à des piqûres de moustiques. Le porteur signale un affaiblissement, une anémie et de possibles symptômes neurologiques liés à l'infection, l'objet étant de tester une immunothérapie redirigeant des anticorps existants vers les globules rouges infectés. Il indique qu'aucune culture continue de ce parasite ne permet de remplacer la souris pour produire et sélectionner les parasites transgéniques.
Objectifs
Le paludisme est dû à l’infection par le parasite Plasmodium, qui se multiplie dans les globules rouges. L’émergence de parasites résistants aux médicaments antipaludiques actuels impose de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet a pour objectif d’évaluer dans un modèle murin une nouvelle stratégie d’immunothérapie contre le paludisme, visant à rediriger une réponse anticorps pré-existante vers les globules rouges infectés pour entraîner leur destruction par le système immunitaire. Une preuve de concept de cette stratégie a déjà été établie contre des cellules cancéreuses.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à apporter la preuve de concept de l'efficacité d'une stratégie d'immunothérapie contre le paludisme dans un modèle pré-clinique murin. Le développement de thérapies basées cette méthode, interférant avec la pathogénicité et/ou la transmission du parasite, pourrait offrir de nouvelles alternatives de contrôle du paludisme.
Procédures
Administrations sur animaux vigiles: injection intrapéritonéale d'anesthésiants (1 injection, durée 10 secondes), injection sous-cutanée de protéines (3 injections espacées de 2 semaines, durée du geste 10-15 secondes), injection intrapéritonéale de protéines (2 injections espacés de 2 jours, durée du geste 10-15 secondes), injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes), injection intraveineuse de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes), injection intrapéritonéale de médicament (3 injections espacées d'1 jour, durée du geste 10 secondes), administration de médicament dans l'eau de boisson (durée 7 à 10 jours). Prélèvements sur animaux vigiles: prélèvement d'une goutte de sang ( tous les 1 à 2 jours pendant 3 à 21 jours, durée du geste 10 secondes). Prélèvements sur animaux anesthésiés: prélèvement de sang (acte unique, durée 10 minutes, suivi immédiatement par une euthanasie par une méthode réglementaire). Exposition d'animaux anesthésiés à des piqûres de moustiques (pendant 45 minutes).
Impact sur les animaux
Stress lié à la contention, douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales, intraveineuses ou sous- cutanées sur animaux vigiles, douleur de courte durée lors des prélèvements sur animaux vigiles, douleur au site des injections sous-cutanées, risques associés à l'anesthésie (hypothermie, détresse respiratoire), contraintes liées à l'infection elle-même (affaiblissement, anémie, symptômes neurologiques).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.
Remplacement
Le projet vise à évaluer dans un modèle murin une nouvelle stratégie d'immunothérapie contre le paludisme, notamment à l'aide de parasites génétiquement modifiés. Le projet nécessite l'utilisation d'un organisme immuno-compétent, en l'occurrence la souris. De plus, il n'existe pas à l'heure actuelle de système de culture continue des Plasmodium berghei in vitro permettant le remplacement du modèle murin pour la production et la sélection de parasites transgéniques.
Réduction
Au total ce projet utilisera 320 souris. Le nombre d'animaux a été réduit au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs des procédures. La taille des effectifs a été établie à l'aide d'un calcul de puissance pour permettre de détecter un effet significatif par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de contribuer au raffinement des procédures, les animaux sont hébergés avec leurs congénères (2 à 5 par cage) dans un milieu enrichi (lanières de papier Kraft ou équivalent). Les conditions environnementales des locaux d’hébergement sont réglementaires. Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Une période d'habituation sera également respectée dans l'appareil de contention avant les injections intraveineuses sur animaux vigiles, afin de réduire le stress. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur. La présence de points limites définis permettra d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection par Plasmodium berghei. Afin de faciliter l’alimentation et l'hydratation chez les animaux infectés par Plasmodium, la nourriture pourra être donnée sous forme de bouillie ou de gel directement dans la cage. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, pour vérifier l’apparence et l’état clinique des animaux, la prise alimentaire et hydrique ainsi que leur comportement, afin de détecter toute modification suggérant une douleur, une souffrance ou une détresse.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal permettant des études fonctionnelles chez Plasmodium berghei, un parasite qui reproduit de multiples aspects du paludisme causé par les parasites infectant l'homme. La souris est un hôte doté d'un système immunitaire permettant d'évaluer l'efficacité de stratégies d'immunothérapie contre le paludisme. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures, conformément aux protocoles classiques utilisés dans ce type d'étude.
Test d’une nouvelle génération de vecteurs pour la Sclérose Latérale Amyotrophique liée aux mutations SOD1 chez un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 460, modéré pour 130 et sévère pour 130. Issues d'une lignée transgénique qui développe une sclérose latérale amyotrophique, elles perdent du poids vers 90 jours puis se paralysent jusqu'à la mort vers 130 jours, une partie étant suivie jusqu'à ce point limite. Elles reçoivent une injection dans la moelle épinière et une injection dans le cerveau, puis des prélèvements sanguins et des tests moteurs répétés, pour tester des vecteurs de thérapie génique visant à réduire la protéine SOD1 toxique. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire n'existe et que le modèle murin est "indispensable".
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie qui se traduit par la perte des motoneurones (cellules de la moelle épinière) et conduit à la paralysie puis au décès des patients dans un délai de 5 ans après le diagnostic. La maladie se présente sous forme sporadique (90% des cas) ou héréditaire (10%). 20% de la forme héréditaire sont dus à une mutation dans le gène SOD1 et sont à l'origine d'une accumulation de la protéine correspondante dans les cellules, entrainant toxicité et mort cellulaire. C’est sur cette forme de la pathologie que notre projet est focalisé. A l'heure actuelle il n’existe pas de traitements efficace chez l’Homme. L’étude sera réalisée sur une souche de souris transgéniques qui est le modèle le plus communément utilisé dans l’étude de cette maladie car les animaux développent les même symptômes que les patients. Ces animaux déclarent les premiers symptômes à 90 jours, puis leur état général se dégrade jusqu’à la mort à 130 jours environ. Ayant démontré l’efficacité d'une thérapie génique dans la SLA, nous avons maintenant pour but d’optimiser cette thérapie génique en testant l'efficacité d'une nouvelle génération de vecteurs, afin de diminuer la dose de vecteur à injecter (ce qui permettrait de réduire les effets secondaires tels qu’une réaction immunitaire, une toxicité…) tout en gardant l’efficacité du premier produit testé.
Bénéfices attendus
Ce projet mené à terme nous permettra de constater l'efficacité de notre traitement sur la réduction des niveaux de SOD1 toxique et par conséquent sur l'augmentation de la survie, l'amélioration des signes moteurs et le retard de l’apparition des symptômes, avec pour objectif à long terme, de proposer un traitement dans le cadre de thérapies géniques dans la Sclérose Latérle Amyotrophique chez l'homme. Il n’existe actuellement aucun traitement dans cette maladie
Procédures
Les souris élevées pour ce projet sont susceptibles de développer un phénotype dommageable caractérisé par une perte de poids vers 90 jours puis une atteinte musculaire conduisant à la paralysie (vers 120 jours) puis la mort de l'animal. Un prélèvement de queue sera réalisé sur ses souris vigiles afin de vérifier si elles sont ou non porteuses du gène qui nous intéresse. Une anesthésie locale sera réalisée par immersion de la queue de l'animal dans de l'éthanol refroidi. Ce geste ne nécessite que quelques secondes. 4 différentes interventions auront lieu au cours des différentes procédures dont 2 sur souris anesthésiée et 2 sur souris vigiles ; une unique injection intramoelle à J50, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, et d’une durée n’excédant pas les 15 minutes, une unique injection intracérébroventriculaire à J50, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, et d’une durée n’excédant pas les 30 minutes, des prélèvements de sang au niveau de la veine sous-mandibulaire sur souris vigiles, tous les 20 jours de J40 jusqu’au point limite. 1 minute suffit pour réaliser ce geste et, sur souris vigiles, tests comportementaux (pesée, test de force musculaire, neuroscore et test de coordination motrice) une fois par semaine de J50 jusqu’au point limite. Le temps total pour réaliser ces tests comportementaux n’excède pas 20 minutes par souris ; le neuroscore et la pesée sont réalisés l’un après l’autre avec une durée totale d’environ 1min, suivi par le griptest, qui nécessite moins de 5 minutes pour les 3 mesures. Pour finir, le rotarod a une durée totale inférieure à 10 minutes avec 2 mesures (de 2minutes maximum) avec 5 minutes de repos entre les 2. Concernant l'euthanasie, les animaux pour lesquels des prélèvements seront réalisés seront euthanasiés par une méthode réglementaire sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative des motoneurones de l'adulte qui se caractérise par une dégénérescence progressive des motoneurones. Elle provoque une paralysie progressive de l'ensemble des muscles. Les souris utilisées pour la survie présenteront donc des signes de dégénérescence comme la paralysie des pattes et/ou du bassin. Cela entrainera des difficultés pour se déplacer, s'hydrater et s'alimenter. Les différentes procédures réalisées chez l’animal (intramoelle, injection intracérébroventriculaire) sont à même d’entraîner une douleur post-opératoire. Le prélèvement caudal ainsi que les prélèvements sanguins peuvent également être une source de stress et de douleur de courte durée. Les différents tests fonctionnels réalisés chez la souris (pesée, neuroscore, test de force musculaire, test de coordination motrice et neuroscore) peuvent également entraîner un stress chez l’animal.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés selon la méthode justifiée pour chaque procédure afin de prélever tous les organes nécessaires à la réalisation des analyses biochimiques et histologiques prévues dans notre étude. Ces prélèvements sont réalisés post-mortem et nécessite donc l'euthanasie des animaux.
Remplacement
Actuellement, aucun modèle cellulaire n’existe pour pouvoir mener une étude pré-clinique dans la Sclérole Latérale Amyotrophique. Le modèle animal est indispensable pour optimiser et développer notre approche de thérapie génique pour cette maladie. Ce modèle, particulièrement bien caractérisé, nous permettra de quantifier l’efficacité de notre traitement sur la réduction des niveaux de SOD1 toxique et par conséquent sur la survie, l'amélioration des signes moteurs et le retard de l’apparition des symptômes.
Réduction
Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé, les groupes seront constitués du nombre minimal nécessaire à une interprétation statistique viable. Si possible, les études seront réalisées sur des animaux du même sexe, afin, encore une fois, d'utilisé un nombre minimal d'animaux. Les animaux ne répondant pas aux exigences pour l’étude (porteur ou non de la maladie) seront systématiquement proposés pour d’autres études déjà validées. De plus sur chaque animal utilisé un maximum d’échantillons biologiques sera prélevé pour parer à toute nouvelle analyse à effectuer. Ce qui nous donne : 45 femelles SOD impliqué pour la procédure 2, 35 femelles B6SJL pour la procédure 3, 50 femelles SOD pour la procédure 4 et 65 mâles et 65 femelles SOD pour la procédure 5. Pour la procédure 1, il y aura également 16 mâles reproducteurs ainsi que 380 animaux non inclus en protocole mais nécessaire pour générer les souris en protocole ainsi que 64 souris supplémentaires pour garantir le bon nombre de souris au phénotype attendu, ce qui nous donne un nombre total de 720 souris.
Raffinement
Les animaux seront regroupés par groupe de 6 animaux du même sexe au maximum. Si des bagarres entre mâles sont observées, ceux-ci seront séparés immédiatement. Dans chaque cage un enrichissement sera apporté sous forme de papier craft pour la confection des nids, voir avec des abris en carton si besoin. Lors des injections, un anesthésiant adéquat sera utilisé et la qualité de l'anesthésie testée avant de procéder aux expérimentations et une analgésie adapté apporté si nécessaire. Enfin chaque animal sera suivi quotidiennement de sa naissance à sa mort et un contrôle du poids réalisé une fois par semaine avant l'apparition des symptômes de la maladie et autant de fois que nécessaire après l'apparition des symptômes afin de contrôler précisément les points limites qui, une fois atteint, entraineront automatiquement l'euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance excessive. De plus pour minimiser le stress des animaux, ceux-ci seront manipulés tout au long de l’expérimentation par un nombre limité de personne pour créer une habituation souris/manipulateur. De plus, les souris seront hébergées dans une salle réservée à notre équipe, ce qui limitera les venues dans la pièce et donc, le stress des animaux. Il est à noter qu’un soin particulier sera apporté aux animaux commençant à développer la maladie pour leur faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau. Ainsi des croquettes ou de la bouillie pourront être placés directement dans la cage, ainsi que de l’hydrogel en cas de besoin. Quelque soit la procédure, en cas de douleur aigue, les animaux seront immédiatement euthanasiés pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les modèles animaux les plus communément utilisés pour les projets de thérapie génique pour le traitement de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) sont des lignées murines. Dans notre projet nous utiliserons le modèle murin transgénique pour la SLA. Ce modèle reproduit les principaux symptômes de la SLA et est par conséquent adapté pour évaluer l’efficacité de nos traitements sur la forme génétique de la maladie. Les animaux présentent des symptômes à partir de 90 jours (perte de poids) due à une accumulation de la protéine SOD1 entrainant une paralysie progressive à partir de 115 jours et la mort des animaux à 130 jours. Les animaux seront injectés à l’âge de 50 jours. Ce stade correspond à des animaux adultes pré-symptomatiques pour lesquels l’accumulation de la protéine toxique SOD est déjà commencée. Ce stade est idéal pour mimer un traitement puisque la pathologie est déjà présente et décelable (biochimie) mais les conséquences ne sont pas encore irréversibles.
Cartographie fonctionnelle et spatiale du tPA endogène au cerveau, en conditions normales ou ischémiques.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 10 tuées sans réveil. Une lignée génétiquement modifiée rend le tPA cérébral fluorescent, et une partie des souris subit un accident vasculaire cérébral provoqué au laboratoire, suivi d'une imagerie à trois, six, douze et vingt-quatre heures avant le prélèvement du cerveau. Le porteur signale une possible perte de poids, des douleurs post-opératoires, une détresse et des déficits fonctionnels, l'objet étant de cartographier l'origine cellulaire de cette protéase. Il affirme le "caractère de stricte nécessité" du recours à la souris et l'absence de méthode de remplacement.
Objectifs
L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une protéase clé du système fibrinolytique sanguin. Par ses propriétés, le tPA est le seul traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. Le tPA est aussi un élément clef dans le système nerveux central (SNC), mais l’élucidation des sources cellulaires de tPA est limitée par un manque d’outils de détection fiable. Cette question est pourtant majeure, pour comprendre comment le tPA favorise ou limite les fonctions et la survie neuronale. L’objectif de cette première étude est de mieux comprendre l’origine cellulaire et les fonctions du tPA dans le SNC par des approches ex vivo/in vivo en se basant sur un nouvel outil original d’étude : une souris génétiquement modifiée, qui d’une part exprime le tPA (associé à une protéine fluorescente) pour le rendre détectable, et d’autre part permet de déléter spécifiquement celui-ci dans les cellules du SNC sans altérer son expression dans les autres compartiments. Cette lignée de souris sera utilisée pour des études histologiques et fonctionnelles, en conditions physiologiques ou dans un modèle d’AVC ischémique développé au laboratoire.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles pour comprendre le rôle complexe d’un acteur clef de la physiopathologie cérébrale. Cette meilleure compréhension permettra d’identifier des cibles thérapeutiques pour la prise en charge des patients victimes d’un AVC ischémique.
Procédures
Procédure 1 : Prélèvement sous anesthésie (sans réveil). Procédure 2 : - Chirurgie sous anesthésie ; évaluation des lésions cérébrales et des transformations hémorragiques par imagerie cérébrale : J+3h, J+6h, J+12h, J+24h. - Prélèvement sous anesthésie (sans réveil)
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : une perte de poids/arrêt de la prise alimentaire et de boisson, des douleurs post-opératoires, des signes de détresse, du stress, des déficits fonctionnels.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser autant que possible le nombre minimal d’animaux adéquat, afin de correspondre au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible. Les tests statistiques utilisés pour les résultats de l’étude comprendront des tests non-paramétriques (Test de Kruskal-Wallis, suivi du test post-hoc de Dunn’s) ou un t-test si la distribution des échantillons suit une loi normale (Shapiro-Wilk).
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend donc cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, les souris utilisées seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Régulation d’un récepteur antitumoral dans les lymphocytes pour l’élimination de tumeurs par immunothérapie.
- Recherche appliquée
- Cancers
837 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de mélanome leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent des cellules immunitaires modifiées, un suivi par imagerie pendant neuf semaines et des prélèvements sanguins hebdomadaires, une partie étant soumise à un régime carencé en acides aminés. Le porteur reconnaît que ces tumeurs peuvent entraîner une perte de poids importante et gêner les déplacements, l'objet étant de tester un système limitant l'expression du récepteur anti-tumoral à l'intérieur de la tumeur. Il affirme s'appuyer sur de nombreuses données en culture cellulaire mais conclut à la nécessité de la souris pour valider l'approche sur un "organisme entier".
Objectifs
Aujourd’hui de nombreux essais ont démontré l’efficacité de l’immunothérapie par injection de cellules immunitaires modifiées pour exprimer un récepteur leur permettant de détruire les cellules tumorales, notamment dans le cas des leucémies et lymphomes. Cependant leur efficacité est bien moindre quand il s’agit de tumeurs solides telles que les mélanomes, en raison des propriétés de la tumeur qui supprime la réponse immunitaire contre les cellules cancéreuses. La solution proposée est d’équiper les cellules immunitaires du patient avec un nouveau récepteur leur permettant de détecter et détruire efficacement les cellules tumorales. Cependant, ces modifications qui renforcent l’agressivité des cellules immunitaires peuvent engendrer des effets secondaires de destruction des tissus sains de l’organisme. Pour accroitre l’efficacité des cellules immunitaires tout en minimisant les effets adverses, nous préconisons l’utilisation de notre système de régulation pour que les cellules immunitaires modifiées, n’expriment le récepteur anti-tumoral qu’à l’intérieur de la tumeur. En effet cette régulation permet de contrôler spatialement (dans la tumeur) ou temporellement (par le biais d’un traitement pharmacologique ou d’un régime spécial), l’expression du récepteur anti-tumoral à la surface de ces cellules permettant d’allier efficacité et sécurité dans le contexte de ces thérapies. Le contrôle de l’expression du récepteur anti-tumoral permettrait d’éviter les effets secondaires précédemment mentionnés de manière à considérablement accroitre l’efficacité et le contrôle de ces stratégies d’immunothérapies dans le contexte des tumeurs solides. L’étude préclinique proposée constitue une étape indispensable de notre projet de sécurisation des thérapies par récepteur anti-tumoral à l’aide du système de régulation, pour confirmer chez l’animal les résultats précédemment obtenus, montrant l’efficacité de ce système sur cellules isolées.
Bénéfices attendus
Ce projet qui combine des approches en culture cellulaire et chez l’animal, permettra de caractériser, pour la première fois, l’efficacité d’un système de régulation pour l’expression exclusive du récepteur anti-tumoral à l’intérieur de la tumeur à l’aide de conditions présentes de manière systématique dans les tumeurs solides, à savoir une baisse des niveaux de nutriments et d’oxygène. Les avancées remarquables récentes dans ce domaine de recherche, en équipant les cellules immunitaires avec des récepteurs anti-tumoraux pour combattre les cancers, permettent désormais de combiner différentes thérapies innovantes et de décupler l’efficacité de ces nouveaux traitements en les adaptant à chaque patient. Notre projet innovant, met en avant les bénéfices de notre système permettant l’expression du récepteur anti-tumoral par les conditions particulières présentes dans la tumeur et prévient les effets adverses autrement liés à ces traitements. De plus ce système d’expression régulée permettra de rendre possible une thérapie combinant, régimes alimentaire spéciaux, ayant par ailleurs d’importants effets anti- tumoraux. Ces effets combinés sur l’expression du récepteur anti-tumoral et sur la réduction de la croissance des tumeurs peuvent potentiellement favoriser l’effet curatif. Dans ce projet, nous nous attendons à ce que notre système restreigne l’expression du récepteur anti-tumoral spatialement et temporellement, permettant de réduire les risques d’effets secondaires délétères chez les patients. En effet, les connaissances générées par nos travaux pourraient à terme être exploitées dans le cadre des thérapies par l’expression d’un récepteur anti-tumoral dans les cellules immunitaires, chez des patients atteints de tumeurs solides, aujourd’hui dans une impasse thérapeutique.
Procédures
Ce projet inclut des injections sous la peau de cellules tumorales et en intraveineux dans la queue pour les injections de cellules immunitaires. Les injections en sous-cutané seront faites sur souris anesthésiées tandis que les injections en intraveineux seront faite sur souris éveillées et ne dépasseront pas 5 minutes. L’injection sous la peau de cellules tumorales faite au début de l’expérience permettra la croissance d’une tumeur de mélanome et les injections intraveineuses faites 8 jours après l’injection des cellules tumorales, permettront d’administrer les cellules immunitaires, permettant la potentielle destruction de la tumeur. Le suivi de la croissance tumorale sera effectué par imagerie non invasive sur souris anesthésiées (maximum 10 minutes par individu) une fois par semaine pendant 9 semaines. De plus, des prélèvements sanguins (au niveau de la veine la joue; durée 30s) seront effectués une fois par semaine pour quantifier l’état inflammatoire des animaux (9 prélèvements au maximum). Pour tester la combinaison de notre système d’expression avec un régime alimentaire altérant la croissance tumorale, les souris suivront un régime alimentaire à base de croquettes carencées en acides aminés à partir du jour de l’injection des cellules immunitaires. En parallèle, pour tester la combinaison de notre système avec l’utilisation de molécules cliniques permettant de réduire la croissance tumorale, des souris recevront une injection intraveineuse d’une de ces molécules à des doses cliniques, à partir du jour de l’injection des cellules immunitaires.
Impact sur les animaux
Les protocoles de développement de tumeurs utilisées dans ce projet pourraient entraîner une perte de poids importante chez les animaux et une réduction de leur activité. Les tumeurs sous-cutanées sur le flanc de l’animal, même celles considérées comme relativement petites, pourraient causer des problèmes aux animaux lors de leur toilettage ou de leurs mouvements, ainsi que des lésions cutanées bien que celles-ci n’aient pas été décrites. Les procédures d’injection de médicaments intraveineux ne devraient pas produire de nuisances particulières. Par ailleurs, le traitement par un régime alimentaire spécial se fera en utilisant des croquettes spéciales mais ne devrait être associé à aucun effet indésirable important.
Devenir
Tous les animaux intégrés dans les procédures expérimentales seront euthanasiés en fin d'étude. Les tumeurs seront prélevées pour leur analyse histologique ; la rate et le sang seront également prélevés pour l’analyse par immuno- marquage et cytométrie, des cellules immunitaires administrées.
Remplacement
L’étude de l’expression du récepteur anti-tumoral induite dans la tumeur ou par le biais d’un régime alimentaire ou d’un traitement pharmacologique, nécessite des modèles animaux récapitulant des conditions complexes, qu’on ne sait pas modéliser en culture de cellules. Cependant, dans un souci de pratique éthique, en accord avec la règle des 3R (réduire, remplacer, raffiner), la faisabilité de ce projet est basée sur une grande quantité de données préalablement réalisées sur cellules primaires humaines en culture. Ces expériences indiquent dans des modèles de culture de masses de cellules tumorales, qu’il est possible d’induire l’expression du récepteur anti-tumoral par les cellules immunitaires modifiées, grâce à notre système de régulation dans des conditions récapitulant des aspects importants de l’environnement tumoral. Cependant, l’étude chez l’animal, doit permettre de mesurer le bénéfice clinique de la greffe de cellules exprimant le récepteur anti-tumoral de façon régulée dans la tumeur sur un organisme entier, plus proche de la clinique humaine. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser la souris comme modèle d’étude pour ce projet de recherche, car cela permettra d’étudier plus précisément la régulation du récepteur anti- tumoral, dans un contexte de développement tumoral dans un organisme entier. Les résultats obtenus contribueront à l’élaboration de nouveaux traitements pour le ciblage de tumeurs solides en médecine humaine.
Réduction
Pour standardiser nos résultats, nous utiliserons des souris mâles. À la fin de chaque expérience, une étude rétrospective permettra de déterminer la possibilité de réduire le nombre d'animaux dans les expériences suivantes. L’imagerie, nous permettra de faire des observations sur l’animal vivant et ainsi de maximiser l’utilité de chaque animal. Les données et les échantillons issus de tissus seront stockés pour une utilisation ultérieure par nous- mêmes ou par d'autres. Nous utiliserons le nombre minimal d'individus pour chaque procédure tout en garantissant la fiabilité des résultats (reproductibilité et significativité). Nous n’avons pas d’expérience antérieure nous permettant d’évaluer statistiquement la taille des groupes nécessaire pour évaluer un effet biologique avec ce modèle. Cependant de nombreuses publications sur des modèles semblables parviennent à obtenir des différences statistiquement significatives entre groupes de 5 à 9 individus. Aussi, dans notre étude nous prévoyons d’utiliser 9 animaux par groupe pour obtenir des résultats permettant de pouvoir effectuer des analyses statistiques. Après accumulation de plusieurs expériences, si les données sont reproductibles et suivent une distribution normale et peuvent être comparées unilatéralement, le nombre d’animaux nécessaire pour chaque nouvelle expérience sera revue à la baisse.
Raffinement
Une surveillance quotidienne sera mise en place pour permettre un suivi clinique des animaux utilisés avec la mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille de score (grille de signes cliniques prenant en compte l’apparence physique, le comportement, le poids, etc.). Toute souris qui atteindra un point limite sera euthanasiée. Les études menées ne permettent pas l'utilisation d'un traitement anti-inflammatoire en raison d’une possible perturbation de la réponse immunitaire. En cas de signe de douleur (expression faciale, posture voutée) ne justifiant pas l’euthanasie immédiate, les souris seront traitées avec un antalgique. Si 24h après l’administration d’antalgique, l’état de l’animal ne s’améliore pas, nous procèderons à l’euthanasie de l’animal. Une étude rétrospective sera menée pour déterminer les moyens de standardiser les procédures afin de minimiser la variabilité des gestes expérimentaux et ainsi pouvoir réduire le nombre d’animaux dans les expériences suivantes. Le design expérimental a été conçu pour minimiser la douleur des animaux, notamment en limitant le nombre de cellules tumorales injectées, la taille maximale des tumeurs ainsi que la durée des expériences. La grille de score sera utilisée quotidiennement, c’est-à-dire incluant les week-ends, pendant 9 semaines.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal le plus utilisé pour les études concernant le développement tumoral, car le taux de prise de greffe est le plus élevé. De plus, par sa petite taille, la souris est facilement manipulable et il existe dans cette espèce plusieurs types de souris qui acceptent la greffe de cellules d’autres espèces. Aussi, ces dernières sont couramment utilisées pour étudier le fonctionnement de cellules immunitaires humaines dans le contexte d’un cancer implanté chez ces animaux. Les souris sans système immunitaire présentent également la particularité de ne pas avoir de poils, ce qui facilite le suivi de la formation de la tumeur. Le bien-être de la souris est également facilement évaluable notamment par l’observation des signes cliniques et de modifications du comportement et peut être pris en charge. Les souris utilisées seront âgées de 6 à 8 semaines, âge à partir duquel les souris sont considérées comme jeunes adultes.
Etude de l’interaction neurone-microglie et son lien avec la fonction motrice dans un modèle murin inflammatoire de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalite auto-immune leur est induite par injection pour reproduire une sclérose en plaques, provoquant troubles de la marche, faiblesse musculaire et perte de poids, avant une série de tests moteurs sur couloir filmé, grille d'agrippement et tapis roulant. Le porteur veut mesurer si un entraînement physique modéré module le dialogue entre neurones et microglie et favorise la rémyélinisation, les applications pour les patients restant formulées au conditionnel. Il indique travailler d'abord sur des modèles in vitro et ex vivo, mais conclut que le modèle murin est "ultimement nécessaire".
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire, démyélinisante et dégénérative du système nerveux central et la première cause d’handicap neurologique non traumatique chez les jeunes adultes. Dans cette maladie, on observe des phases de démyélinisation dans lesquelles l’organisation des fibres myélinisées est altérée, conduisant à des déficits fonctionnels chez les patients. Un mécanisme de réparation existe, mais il est incomplet et très variable selon les patients. Les cellules microgliales, cellules immunes du système nerveux central sont activées précocément lors de la démyélinisation et participent à la réparation de la gaine de myéline. La microglie contacte par ailleurs les neurones et cette interaction peut influencer positivement la réparation post-démyélinisation. Dans ce projet nous souhaitons étudier le lien potentiel entre les interactions microglie-neurones et l’évolution du déficit moteur dans un modèle murin de sclérose en plaques. Nous voulons de plus évaluer comment un entrainement physique d’intensité modérée durant la phase de réparation pourrait influencer les interactions microglie-neurones et ainsi moduler la rémyélinisation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des interactions neurones-microglie dans la sclérose en plaques. La mise en évidence d’effets bénéfiques de l'activité physique sur la réparation via une modulation directe du dialogue neurone-microglie pourrait permettre d'envisager des stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du handicap chez les patients.
Procédures
Les animaux sont entrainés à effectuer des tests comportementaux non invasifs durant une semaine (sessions de maximum 10 min/jour par animal). Ensuite, nous immunisons les souris pour induire l’encéphalite expérimentale auto-immune, le model murin inflammatoire de sclérose en plaques. Le jour de l’induction deux types d’injections sont nécessaires, en injection sous-cutanées et par voie intrapéritonéale. Afin de minimiser le stress et la douleur liée à l’induction de l’encéphalite autoimmune experimentale, les animaux sont préalablement anesthésiés par anesthésie gazeuse, qui est rapidement réversible (durée totale d'anesthésie et du geste 10 minutes/animal). Les animaux ayant déclenché la maladie seront amenés à effectuer de nouveaux les tests comportementaux non invasifs auxquels ils étaient préalablement entrainés. Durant ces tests, les animaux seront amenés à marcher dans des couloirs équipés d’une caméra ou de capteurs mesurant automatiquement les caractéristiques de la marche, agripper une grille avec les quatre pattes pour mesurer la force musculaire ou marcher sur un tapis roulant. Tous les tests ont une durée courte (maximum 10 min/session) avec des intervalles de repos de minimum 2 heures par souris et n’entrainent pas de stress émotionnel ou physique pour les animaux. Les animaux sont euthanasiés en fin d’étude par une méthode réglementaire pour réaliser différents prélèvements tissulaires.
Impact sur les animaux
Nous étudions un modèle murin de démyélinisation inflammatoire, l’encéphalite auto-immune expérimentale, fréquemment utilisé pour étudier la sclérose en plaques. Après immunisation, les souris peuvent développer des troubles de la marche, de la coordination, une faiblesse musculaire et une perte de poids. Ces symptômes s’installent progressivement sur 3-5 jours suivis d’une récupération partielle ou complète. Aucun autre effet délétère n’est attendu chez les animaux en rapport avec les tests fonctionnels et l’activité physique mais une fatigue et un stress léger sont possibles. L’anesthésie gazeuse mise en place pour minimiser le stress lié à la manipulation des souris et la douleur des injections sous-cutanées étant très courte (2 à 3 minutes), le risque de défaillance cardio-respiratoire est infime.
Devenir
Des prélévements et analyses sont réalisés post mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux
Remplacement
Dans un effort de remplacement, nous travaillons en première approche avec des modèles in vitro et ex vivo. Les modèles murins in vivo sont ultimement nécessaires pour l’étude fondamentale de la sclérose en plaques, car ils permettent d'étudier la démyélinisation et la remyélinisation dans un contexte intégré, impliquant des interactions entre tissus nerveux, effecteurs de l’immunité circulante et apports métaboliques par le réseau sanguin, qui sont des composantes importantes de cette pathologie.
Réduction
Des approches statistiques permettront d’optimiser le nombre d’animaux utilisés, estimés à 150, après des expériences pilotes, et de ne pas sur-dimensionner le nombre d’animaux étudiés lors de nos expériences : ce nombre sera calculé pour chaque groupe d’expériences à l’aide d’un calcul de puissance après utilisation initiale de 8 à 10 animaux par condition, selon l’expérience considérée. Des tests paramétriques, des tests de corrélation et de régression linéaire seront utilisés pour l’analyse statistique des résultats obtenus, adaptées à chaque expérience et réalisées en partenariat avec des biostatisticiens.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe, dans un environnement à température et d’hygrométrie contrôlées, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs, sous la supervision de la structure bien être animal du vétérinaire désigné. Un environnement enrichi est fourni aux animaux, comprenant nidification (carré de coton, kraft), cachette (maisonnette, dôme) et/ou bâtonnet à ronger. Les animaux sont manipulés uniquement par un personnel qualifié et sensibilisé au bien-être animal. Nous mettons en place des points-limites définis en accord avec le vétérinaire ainsi qu’un suivi quotidien par l’équipe de recherche pour éviter la souffrance de l’animale. Afin de minimiser le stress et la douleur liée à l’induction de l’encéphalite autoimmune experimentale, les animaux sont préalablement anesthésiés par anesthésie gazeuse, qui est rapidement réversible (durée totale d'anesthésie et du geste 10 minutes/animal). Concernant les tests comportementaux, les animaux ont des phases d’habituation et de repos adaptés aux différents tests effectués.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues et sont relativement proches de l'Homme. Le modèle d’encéphalite autoimmune expérimentale chez la souris est un modèle classique de sclérose en plaques, permettant de reproduire en partie l’aspect inflammatoire observé chez les patients, et qui apporte une approche intégrée des déficits observés dans la pathologie. Des animaux adultes C57BL6, âgés de 10-12 semaines au moment de l’induction de l’encéphalite autoimmune expérimentale seront utilisés pour cette étude. L’âge adulte est requis pour pouvoir induire l’encéphalite autoimmune expérimentale et faire les tests comportementaux envisagés. L’usage de jeunes adultes reproduit par ailleurs bien les conditions d’initiation de la sclérose en plaques chez l’humain et limite les risques d’artefacts liés au vieillissement de l’animal.
Etude de la maturation du BDNF dans les plexus choroïdes de souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
92 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Elles reçoivent une injection intraveineuse d'une protéase fluorescente, le tPA recombinant, avant un prélèvement de liquide cérébro-spinal, un prélèvement de sang intra-cardiaque et l'extraction du cerveau, une partie servant d'abord à un apprentissage de la pose de cathéter. L'objet est de comprendre si les plexus choroïdes participent à la maturation du BDNF, les retombées pour les patients victimes d'accident vasculaire cérébral ou de sclérose en plaques restant renvoyées à un horizon thérapeutique lointain. Le porteur affirme le "caractère de stricte nécessité" du recours aux souris et l'impossibilité d'un remplacement.
Objectifs
Les plexus choroïdes, structures cérébrales dont le principal rôle est de produire le liquide cérébro-spinal (LCS), sont aussi capables de sécréter de nombreux facteurs neurotrophiques dont le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF). Le BDNF existe sous sa forme précurseur (pro-BDNF) ou, après protéolyse, mature (mBDNF). Malgré leur localisation parfois commune, le mBDNF et le pro-BDNF se distinguent parfois dans leurs (dys)fonctions neurologiques. Différentes protéases semblent capables de réaliser la maturation du pro-BDNF en mBDNF, notamment l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Le tPA est une protéase synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour favoriser la fibrinolyse, grâce à sa capacité à activer le plasminogène en plasmine. Il est également sécrété par les neurones et par d’autres types cellulaires du système nerveux, tels que les astrocytes, la microglie et les oligodendrocytes. Par ses propriétés fibrinolytiques, le tPA recombinant (rtPA) est le seul traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. En plus de participer à la maturation du BDNF, l’ARNm (acide ribonucléique messager) du tPA est parfois retrouvé dans les mêmes régions cérébrales que celui du BDNF. De plus, le tPA et le BDNF sont présents dans les mêmes vésicules au niveau des neurones, co-transportés et co-libérés par les dendrites neuronales. Le tPA a précédemment été identifié dans les plexus choroïdes, suggérant également une synthèse endogène de cette protéase dans ces structures. De plus, le tPA vasculaire peut être transporté par des vésicules à travers les plexus choroïdes. Ainsi l’objectif de cette étude est de determiner si les plexus choroïdes peuvent être une zone de maturation et de libération de BDNF et si le tPA (endogène ou exogène) est un acteur de la maturation et/ou de la sécrétion de BDNF dans le LCS par des approches in vivo chez des souris entièrement déficientes en tPA (tPANull) et des souris contrôles (tPAWT).
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre d’acquérir des données fondamentales sur la maturation du BDNF dans les plexus choroïdes et sa modulation potentielle par le tPA à des fins thérapeutiques. En effet, une meilleure compréhension de la maturation du BDNF nous aidera d’une part à évaluer le potentiel effet du tPA vasculaire, et d’autre part, à envisager d’améliorer les performances de patients dans des conditions pathologiques, par le couple pro/m-BDNF.
Procédures
L'unique procédure réalisée, consistera en une injection intraveineuse de tPA recombinant couplé à un fluorochrome chez des souris entièrement déficientes en tPA et des souris contrôles, pour suivre son passage du compartiment vasculaire vers le parenchyme cérébral et détecter sa présence en immunohistochimie à différents temps. De même, du LCS et du sang seront prélevés pour réaliser diverses études protéiques et transcriptomiques. - Souris Swiss : phase d’apprentissage (Pose d’un cathéter veineux et prélèvement intra-cisternal de LCS). - Souris contrôles : injection I.V saline ou rtPA. - Souris déficiente : injection I.V saline ou rtPA. Mise à mort des souris de la phase d’apprentissage, immédiatement après le prélèvement intra-cisternal. Mise à mort des souris contrôles/déficientes à différents temps post injection : +10 minutes, à +30 minutes et à +60 minutes. Pour chaque animal : un prélèvement de LCS sera effectué, puis un prélèvement de sang en intra-cardiaque et enfin le cerveau sera extrait.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour cette procédure sans réveil : du stress lié à la manipulation des animaux.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (AVC, SEP, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, la procédure expérimentale décrite dans ce projet a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards aux normes. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront pesés tous les jours et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques suivant l’approche chirurgicale. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant l’ensemble des procédures, les souris seront sous anesthésie générale (et sous anesthésie locale. Les yeux seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir leur déshydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend donc cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, les souris utilisées seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature.