Souris
Etude chez la souris humanisée de l’effet d’un traitement par anticorps monoclonaux sur la réaction de greffon contre la tumeur
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
250 souris "humanisées" vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur une centaine de jours, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des cellules sanguines humaines et des anticorps monoclonaux, pour tester lesquels renforcent la réaction du greffon contre la tumeur. Le porteur prévoit une mise à mort dès qu'une tumeur atteint 2 000 mm³ ou qu'une souris perd 20 % de son poids, et décrit des tumeurs pouvant s'ulcérer et se nécroser. Il justifie le recours à ces souris immunodéficientes, seules à accepter des cellules humaines, comme une alternative aux primates en recherche préclinique.
Objectifs
En transplantation, l'effet greffon contre la tumeur a été observé après une greffe de cellules souches hématopoïétiques. Le greffon contient des cellules lymphocyte T du donneur qui peuvent être bénéfiques pour le receveur en éliminant les cellules malignes résiduelles. Dans le but d'évaluer le potentiel thérapeutique d'anticorps monoclonaux sur l'effet greffon contre la tumeur nous testons in vivo plusieurs candidats médicamenteux dans un modèle de greffe contre la tumeur chez la souris immunodifficiente. Ces anticorps monoclonaux ont été générés et validés in vitro mais les études in vivo sont indispensables pour pouvoir envisager des essais cliniques.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus à l’issue de cette étude, permettront de : - Comparer les résultats in vivo aux data in vitro - Déterminer le potentiel thérapeutique des anticorps testés sur les réponses immunes dans le contexte de cette maladie - Comprendre les différents mécanismes d’action mis en place - Valider et sélectionner pré-cliniquement la meilleure molécule avant d’envisager les tests cliniques
Procédures
- Rasage des souris la veille de l’injection des cellules tumorales, cette action s’effectuera sur animal vigile (2min/animal)- Injection des cellules tumorales en sous-cutanée (sur toute les souris) sous anesthésie gazeuse (10min/animal), 8 jours avant le début de protocole - une fois que les tumeurs sont détectables par palpation injection des cellules sanguine humaines en intraveineuse sur animal vigile (hormis le groupe de tumeur seul) 5min/animal - Injection des traitements en intra-péritonéal sur animal vigile (1min/animal) en fonction des groupes, deux fois par semaine - Prélèvement sanguin (100µl de sang,) tous les deux semaines sur toutes les souris (10min/souris)sous anesthésie gazeuse - Euthanasie sous anesthésie général et dislocation cervical de toutes les souris. A préciser que la durée totale de l'expérience est de 100 jours, chaque intervention sera réalisées à part dans un instant t. A noter que l’utilisatrice est une personne expérimentée en procédure animale, ce qui réduira les temps d’intervention et par conséquence moins de stress et d’angoisse animal
Impact sur les animaux
Ce modèle murin de GvT consistera à injecter des cellules tumorales en sous-cutanée, ce qui engendre quelques paramètres à surveiller régulièrement qui concerne la masse tumorale et l’animal lui-même. *La masse tumorale : les cellules seront injectées localement en sous-cutanée, la tumeur prendra de volume au fur à mesure, une surveillance quotidienne sera appliquée pour vérifier si la tumeur pousse ou pas en mesurant la longueur et la hauteur pour calculer le volume ? ; si elle envahie les tissus voisins en palpant la masse tout en cherchant les contours et des éventuelles adhérences avec le tissu cutané ? si elle s’ulcère, une ulcération de la tumeur sera visible l’œil nu, la tumeur sera rouge et présente un point de nécrose, à noter que le flanc de l’animal sera toujours rasé pour faciliter l’observation. *Le poids : une perte de poids est un signe d’un mal-être, souffrance ou douleur ; le poids sera suivi 2-3 fois par semaine, une perte supérieure ou égale à 20% est considéré comme point limite qui oblige l’euthanasie de l’animale. *Comportement : le comportement d’un animal souffrant d’un mal-être sera modifié, une baisse d’activité, une voussure de dos, pelage ébouriffé, froidure et pâleur des extrémités… tous ces critères indiquent une douleur. L’animale sera soulagé par une l’administration de l’anti-douleur adéquat et disponible dans notre laboratoire. A savoir que les animaux qui souffrent de manière chronique vont être suivis avec une attention particulière non seulement pour soulager leur souffrance, mais aussi parce qu’ils nécessitent une gestion et un mode de vie particuliers (manipulation délicate, accès facile à l’eau et à la nourriture, réduire le nombre de souris dans la cage, administration d’anti-douleur Ci-dessous une liste des points limites qui déterminera l’euthanasie de l’animal La masse tumorale : • L’évolution de la croissance tumorale est un des paramètres clés de cette étude, mais la masse tumorale ne doit pas interférer les fonctions normales de l’animale ni induire une souffrance pour son déplacement. Un volume tumoral supérieur ou égal à 2000mm3 est un point limite. • Une ulcération/infection à l’emplacement de la tumeur • Un envahissement des tissus voisin par la tumeur localisée La perte de poids • Une perte supérieure ou égale 20 % du poids du corps d’un animal normal (en tenant compte de la masse tumorale) Comportement anormale • Une détresse, un mal-être
Devenir
Mise à mort
Remplacement
Des études fonctionnelles ont été réalisées in vitro à partir de cellules humaines, les résultats sont prometteurs mais sont limités par l’absence du contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire et ne peuvent remplacer les études in vivo. Il est donc nécessaire de tester l’efficacité immuno-régulatrice des molécules d’intérêt dans un modèle in vivo proche de l’Homme. Une alternative solide à l’utilisation de primates en recherche préclinique est le modèle de souris dites « humanisées ».
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est réduit à 25, nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. Les souris seront divisées en 10 groupes (25 souris/groupe). Le groupe témoin recevra un isotype contrôle ou PBS, les autres groupes seront traités avec les différents anticorps test. Le nombre de groupes a été réfléchi afin d’avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus. Le nombre total des animaux est de 250.
Raffinement
Afin de respecter le bien-être animal, au début de protocole les souris seront réparties par groupe de 3-5 souris par cage, avec des moyens d’enrichissement (frisottis, dôme et tunnel). Une surveillance quotidienne des animaux en protocole, pour déceler une douleurs, souffrance ou mal-être. Les animaux souffrants d’une douleur seront séparés des autres (étant donné qu’il existe toujours un animal dominant dans une cage, qui empêche l’animale faible d’accéder à la nourriture ou l’eau. En séparant les animaux faibles dans des cages offre une facilité d’accès à la nourriture et l’eau. Une administration d’analgésique buprénorphine 0.05mg/kg en sous cutané deux fois par jour pour tout animale souffrant, à noter que en cas de point limite (souffrance qui ne sera pas gérable par anti-douleur) l’animale sera euthanasié. Les différents points limites, une perte de poids de 20%, un volume tumoral de 2000mm3 ou montrant des signes physiques caractéristiques d’un mal-être seront euthanasiés (inhalation d'isoflurane suivie par une dislocation cervicale).
Choix des espèces
Les propriétés immuno-régulatrices de l’anticorps ne peuvent être testées que dans un modèle primate ou humanisé. Nous avons choisi les souris NOD/SCID/Il2R gamma-/- déficientes en cellules immunes car elles permettent l'acceptation de cellules immunes humaines. Un tel protocole chez des souris immunocompétentes ne serait pas possible, les cellules et tissus humains seraient rejetés par le système immunitaire. Ces souris sont issues de l'animalerie Charles River et sont reproduites au sein notre animalerie. A noter également que cette espèce animale présente une facilité de reproduction, d'hébergement et de manipulation.
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Hamsters dorés : 10000
60 000 souris et hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la souffrance déclarée va de légère à sévère, dont 5 900 en gravité sévère. Ils reçoivent un vaccin vétérinaire puis se voient inoculer la souche pathogène correspondante, parfois par injection intracérébrale sous anesthésie, pour contrôler l'activité et l'identité de lots commerciaux de vaccins destinés aux chiens, chats, furets et animaux d'élevage. Le porteur décrit chez les témoins non vaccinés une prostration, des tremblements, une parésie, une paralysie, des convulsions et un "état proche de la mort", et attribue le nombre d'animaux et le recours à ces épreuves à la réglementation de la Pharmacopée européenne. Il affirme qu'aucun test in vitro n'existe pour remplacer ces contrôles, dont les rongeurs servent d'espèces de substitution aux espèces cibles.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de déterminer l’activité de vaccins ou de principes actifs destinés aux animaux de compagnie (chien, chat, furet) ou aux bovidés, ovidés et équidés domestiques, ainsi que l’identité de souches vaccinales. Ces objectifs doivent être respectés afin d’être en conformité avec les exigences réglementaires de la Pharmacopée Européenne et des pays tiers destinataires pour la constitution d’un dossier de mise sur le marché et pour la fabrication d’un lot commercial. Les contrôles d’activité et d’identité d’un vaccin se basent sur le développement ou non de la pathologie après injection de la souche d’épreuve (les animaux vaccinés sont protégés). Ils sont effectués in vivo sur espèce alternative. L’utilisation d’espèces alternatives est possible si les espèces utilisées (dans le cas présent des souris ou des hamsters) sont sensibles aux souches testées. Ceci permet d’éviter le recours aux espèces cibles, et de garantir une commercialisation de vaccins efficaces et sûrs qui protègent l’animal de la maladie. La Pharmacopée Européenne demande la démonstration de résultats concrets, certains obtenus sur l’animal.
Bénéfices attendus
L’avantage est que ces tests permettent la libération d’un nombre important de doses de vaccins améliorant considérablement la santé et le confort des animaux de compagnie ainsi que des propriétaires.
Procédures
Après au moins deux jours d’acclimatation, les rongeurs peuvent entrer dans la phase de test avec l’administration d’un vaccin. Pour les trois contrôles une même démarche est appliquée : Il y a en premier lieu l’administration du vaccin aux animaux. Après un certain temps pour que l’immunité s’installe, la souche d’épreuve est inoculée aux animaux. Tous les animaux sont ensuite suivis deux fois par jour jusqu’à la fin du test. Une anesthésie est réalisée avant l’injection des souches d’épreuve en intra cérébral.
Impact sur les animaux
Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé et compétent. Les animaux peuvent présenter une légère augmentation du stress due aux injections des vaccins et aux manipulations. Les témoins montrent les symptômes liés aux maladies infectieuses testées: la prostration, le dos voussé, les reins creusés, des tremblements et l’absence de réactions aux stimuli. Pour les maladies virales avec un tropisme pour le système nerveux : les poils hérissés, la réduction des déplacements, des tremblements, des mouvements saccadés, la parésie, la paralysie, des flancs creusés, les yeux enfoncés, des convulsions et/ou un état proche de la mort. Des points limites spécifiques aux pathologies sont appliqués.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés
Remplacement
La nécessité d’utilisation des animaux provient de la réglementation en vigueur sur ces tests, en conformité avec la réglementation des pays destinataires. Elle permet de démontrer l’activité et l’identité des lots de vaccins à commercialiser. Les tests in vitro sont actuellement inexistants pour remplacer le modèle in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux est imposé par la réglementation. Une réduction du nombre d’animaux est possible grâce à la mutualisation de lots témoins.
Raffinement
Des points limites spécifiques aux pathologies sont déterminés pour les témoins non vaccinés. Le personnel vérifie l’évolution de l’état général et si les points limites spécifiques sont atteints. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés du milieu ont été mis en place dans les hébergements. Pour les hamsters, un igloo ou hutte et des copeaux compressés sont disposés dans la cage lors de la période de vaccination, au passage en épreuve, des copeaux compressés sont disposés dans la cage. Et pour les souris, un igloo et des copeaux compressés sont disposés dans la cage lors de la période de vaccination, au passage en épreuve, l’enrichissement est limité à la litière et aliment afin d’éviter tout risque EHS de manipulation de l’enrichissement par l’opérateur lors des observations quotidiennes. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Ces espèces de rongeurs sont utilisées comme espèces alternatives aux espèces d’animaux de compagnie (chien, chat, furet) ou aux bovidés, ovidés et équidés domestiques. Ces espèces sont sensibles aux souches testées et permettent de réaliser les tests. Pour l’épreuve rage sur souris : Il faut des souris de 4 à 6 semaines pour la technique d'identité ou de 4 à 5 semaines pour la technique d'activité par épreuve. Pour l’activité par épreuve leptospirose sur hamster : Il faut des hamsters de 35 à 55g, c’est-à-dire de 3 à 6 semaines. Pour l’activité par épreuve rhinopneumonie équine sur hamster : Il faut des hamsters de 40 à 50g. Ces stades de développement sont ceux requis pour répondre à la Pharmacopée Européenne et aux dossiers déposés aux autorités.
Restaurer l’assemblage des nucléoporines pour traiter le syndrome de l’X fragile
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent sous anesthésie une chirurgie stéréotaxique d'injection de virus dans le cerveau, puis passent une série de tests comportementaux (labyrinthe surélevé, open field, reconnaissance d'objet et reconnaissance sociale, enfouissement de billes, nidification), pour tester une thérapie génique contre le syndrome de l'X fragile sur une lignée de souris Fmr1-KO. Le porteur revendique une preuve de concept déjà obtenue in vitro et affirme que ces mécanismes comportementaux ne peuvent être étudiés que dans un "organisme complexe" comme la souris. Les bénéfices annoncés pour les patients restent au stade de la preuve de concept, l'objectif immédiat étant de mesurer une correction du comportement avant prélèvement du cerveau.
Objectifs
Le syndrome de l’X fragile (FXS) représente la première cause héréditaire de déficience intellectuelle et d’autisme pour lequel il n'existe à ce jour aucune thérapie. Nous avons récemment découvert un mécanisme moléculaire qui serait à l’origine du FXS. Nous proposons maintenant de tester une approche par thérapie génique afin de corriger le mécanisme moléculaire défaillant pour traiter le FXS. Pour mettre en œuvre cette approche expérimentale, nous utiliserons un modèle animal FXS qui a été développé chez la souris. La souris FXS récapitule une grande partie des phénotypes observés chez l’homme et constitue un excellent modèle animal de la maladie. Ainsi ce projet vise à déterminer : 1. Est-ce que la thérapie génique permet de restaurer le mécanisme moléculaire défaillant pour traiter le FXS ? 2. Est-ce que la thérapie génique permet de restaurer le comportement du modèle de souris FXS ?
Bénéfices attendus
Notre étude a pour but de fournir la preuve de concept que le mécanismes moléculaire que nous avons identifié précédemment contribue à la pathologie du FXS. Nous proposons des nouveaux outils de thérapie génique pour corriger ce mécanisme moléculaire défaillant et le comportement du modèle de souris FXS. Jusqu'à présent, toutes les stratégies thérapeutiques envisagées pour traiter le FXS ont échoué cliniquement. Notre projet s'appuie sur des connaissances nouvelles acquises au laboratoire, et qui pour la première fois, lient le FXS à un nouveau mécanisme moléculaire. Notre approche repose ainsi sur des données préliminaires publiées et solides pour fournir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter le FXS.
Procédures
480 animaux subiront, sous anesthésie générale, une chirurgie stéréotaxique afin d’injecter des adénovirus associés dans une zone particulière du cerveau. La durée de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est 1h – 1h30. Après l'injection de virus, ils seront soumis à des tests comportementaux : semaine 1. Analyse du rythme circadian (36H) + Labyrinthe surelevé (5min). semaine 2.Open field (15min), toilettage (15min). semaine 3. nidification (24h) + reconnaissance d’objet (2x10min) + enfouissement de billes (15 min) semaine 4. Reconnaissance sociale (3x10min).
Impact sur les animaux
La chirurgie stereotaxique est utilisée pour délivrer des vecteurs viraux (adénovirus associés) dans une zone particulière du cerveau. Ces vecteurs permettront l'expression de notre protéine d'intérêt ou de récepteurs particulier dans des populations neuronales spécifiques. La chirurgie pourrait provoquer une réaction inflammatoire locale post- chirurgicale.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.
Remplacement
Toutes les validations experimentales in vitro ont été réalisées et publiées. Nous avons ainsi apporté la preuve de concept in vitro que notre approche expérimentale fonctionne. Il convient maintenant de valider in vivo nos données. Etant donné que le phénotype comportemental est l'un des traits les plus importants du FXS, ces mécanismes complexes ne peuvent être étudiés que dans des organismes complexes tels que la souris
Réduction
Nous utiliserons un total de 480 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris. Pour toutes ces raisons, le nombre d'animaux a éte déterminé en prennant en compte les contraintes experimentales.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant l'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. Aucune douleur ou souffrance n'est attendu dans la plupart des procédures expérimentales utilisées mais l'usage d'anesthésique et d'analgésique sera systématique pour les procédures expérimentales potentiellement douloureuses. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience et les différentes expériences seront réalisées par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur après avis vétérinaire. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale. Les injections stéréotaxiques seront réalisées par une personne détentrice d'une formation en chirugie et formée spécifiquement à cet acte chirurgical.
Choix des espèces
L’utilisation des souris se justifie par l’existence d'une lignée génétiquement dans laquelle la protéine Fmr1 est invalidé. La souris Fmr1-KO récapitule une grande partie des phénotypes observés chez l’homme (altération de la mémoire, perte d’interaction sociale, hyperactivité, macro-orchidisme, anomalie des épines dendritiques) et constitue un excellent modèle animal de la maladie. Les chirurgies stéréotaxiques concernant l'injection des AAVs seront réalisées chez des animaux chez les nouveau nés à P0 pour prévenir le phénotype du FXS. Chez des souris âgées de 8 semaines (jeune adulte), stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées et chez des anuimaux adultes de 20 semaines afin de corriger le FXS Les animaux seront injectés dès l'âge de 8 semaines pour la première partie du projet (PE1).
Rôle des neutrophiles dans l’induction de l’arthrite induite par des anticorps pathologiques.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections d'un sérum d'auto-anticorps qui déclenche une arthrite, avec gonflement des articulations des pattes d'intensité variable, pour étudier le rôle des neutrophiles dans le déclenchement de la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur prévoit une mise à mort des souris dont l'épaisseur des pattes dépasse 3,5 mm au pic de la maladie, et affirme que l'expérimentation animale est "indispensable" car les études in vitro ne peuvent que la compléter. Les bénéfices annoncés se limitent à poser les bases de travaux ultérieurs sur ces mécanismes.
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire chronique qui affecte principalement les articulations. Dans cette maladie des anticorps pathologiques (appelés " auto-anticorps" car il s'agit d'anticorps reconnaissant des molécules du soi) participent à l’induction et la pérennisation de la maladie. Certaines cellules immunitaires sont activées par ces auto-anticorps pathologiques et, de par ce fait, jouent un rôle dans l’induction de cette pathologie. Cependant les mécanismes impliqués restent méconnus. Notre objectif est donc d’identifier les mécanismes par lesquels différentes cellules immunitaires sont impliquées dans l’induction de l'arthrite suite à l’administration d’autoanticorps pathologiques.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus poseront les bases pour réaliser par la suite une étude plus appronfondie des mécanismes impliqués dans l’induction de la pathologie par les auto-anticorps et qui sont dépendants des neutrophiles.
Procédures
Les souris seront injectées avec un sérum provoquant le développement de l'arthrite, par injection intra-péritonéale à J0 (début de l’expérience) et J1 (le lendemain). Avant injection, l’épaisseur des pattes postérieures sera mesurée à l’aide d’un pied à coulisse électronique. Chaque souris sera suivie quotidiennement pour évaluer la cinétique et la sévérité de l’arthrite, par mesure de l’épaisseur des pattes (pied à coulisse électronique, non invasif).
Impact sur les animaux
L'induction de l'arthrite provoque un gonflement des articulations des pattes des animaux, dont l'intensité varie d'un animal à l'autre et d'une articulation à l'autre. Du gel de nourriture hydratée est placé dans la cage pour faciliter l'accès à la nourriture des animaux arthritiques.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à différents temps après induction de l'arthrite pour pouvoir prélever différents organes et récupérer les cellules immunitaires d'intérêt dans les différentes phases de la maladie.
Remplacement
Le but du projet est d’identifier les mécanismes immunitaires impliqués dans l’induction de la PR qui sont dépendants des neutrophiles, afin de développer à terme, des nouvelles interventions thérapeutiques pour traiter cette maladie auto-immune. Ceci nécessite un modèle expérimental doté d’un système immunitaire complexe (et complet) et permettant l’étude intégrée de la réponse immunitaire dans un véritable contexte pathologique. Ceci étant difficilement possible chez l'homme, afin de progresser dans cette perspective les expérimentations animales sont indispensables. Des méthodes alternatives (études in vitro) peuvent être complementaires mais ne peuvent pas se substituer à l’utilisation des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux prévus est basé sur des expériences réalisées précédemment au laboratoire. Grâce à l’expertise de l’équipe dans ce modèle expérimental, nous nous sommes basés sur le paramètre le plus variable pour estimer le nombre d'animaux nécessaire et suffisant. L’utilisation d’un minimum de 5 animaux par lot à chaque expérience est nécessaire car il garantit l’obtention d’un nombre suffisant de cellules immunitaires pour étudier leur rôle. Pour des raisons de reproductibilité et confirmation des résultats obtenus, les expériences doivent être réalisées en triplicat, d’où le nombre de 15 animaux par lot indiqué (3X5).
Raffinement
Les actes techniques réalisés (injections, suivi du gonflement de pattes) sont peu invasifs et conformes aux recommandations des textes de référence. Des mesures destinées à réduire la contrainte des animaux ont été prévues : enrichissement du milieu (carrés de cellulose, cabanes, …), gels de nourriture hydratée placés dans la litière afin de faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau. Tout au long des expériences, une observation régulière du bien être des souris sera effectuée. Tout animal présentant un événtuel signe de souffrance sera soigné ou euthanasié. Par ailleurs, nous maîtrisons les gestes expérimentaux et nous surveillerons le site d'injection. Nous avons mis en place des points limites. Notamment, l’arthrite sera évaluée quotidiennement par la mesure de l’épaisseur des pattes postérieures. Si l’épaisseur de pattes suite à l’inflammation induite devient supérieure à 3,5 mm au pic de la maladie (7-8 jours), les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des souris pour lesquels des données scientifiques de la réponse immunitaire sont bien établies et de nombreux outils sont disponibles pour étudier de façon approfondie la réponse immunitaire, ceci avec un recul statistique. Le projet est basé sur l’utilisation d’une souche de souris présentant un système immunitaire complet (C57/Bl6) disponible commercialement. Le choix de cette souche (C57/Bl6) est justifié par leur système immunitaire compétent et pour leur susceptibilité à développer l'arthrite dans notre modèle expérimental. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 10 et 14 semaines) pour que le système immunitaire soit mature et pour permettre une induction de l’arthrite avec une incidence de 100% de façon synchronisée.
Effets de l’application topique de peptides sur la réparation épithéliale intestinale après inflammation chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une inflammation du côlon leur est provoquée chimiquement, puis elles reçoivent des peptides en gel par voie intrarectale sous anesthésie, avec coloscopie sous anesthésie et prélèvements sanguins par incision de la veine de la queue, pour tester si ces peptides favorisent la cicatrisation intestinale. Le porteur cite l'article R214-104 sur la "stricte nécessité" des procédures et affirme que les modèles sans animaux ne peuvent pas encore se substituer à la colite chimio-induite, tout en indiquant travailler sur des organoïdes intestinaux. Les bénéfices annoncés pour les patients atteints de rectocolite hémorragique restent au stade préclinique.
Objectifs
Ce projet préclinique a pour but d’évaluer les effets de peptides synthétiques (motifs répétés d'acides aminés capables de s'auto-assembler) sur la cicatrisation colique, nécessitant un protocole d’expérimentation animale induisant une inflammation colique. Il vise également à définir les modalités d’application locale de ces peptides avant une étude clinique. Les modèles animaux sont donc irremplaçables dans le but d’améliorer la prise en charge des patients atteints de maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI)
Bénéfices attendus
Valider la pertinence de l'administration de peptides synthétiques sur la cicatrisation colique après inflammation intestinale.
Procédures
Une application intrarectale de peptides sous forme de gel sera réalisée sous anesthésie. Cette procédure dure 5 minutes par animal en raison de l'induction de l'anesthésie et 15 secondes pour l'application. Un examen coloscopique sera réalisé sur un tiers des animaux sous anesthésie (5 minutes par animal). La perméabilité intestinale sera mesurée sur un tiers des animaux: après gavage, un prélèvement de sang par incision de la veine latérale de la queue sera réalisé 4h plus tard.
Impact sur les animaux
Absence d'effet ou aggravation de la colite avec l'administration des peptides synthétiques.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour étudier les effets des peptides sur la réparation du côlon. Du sang ainsi que le foie seront également prélevés pour évaluer l’impact de l’inflammation et de la cicatrisation coliques au niveau systémique.
Remplacement
En conformité avec l’article R214-104 du code rural et de la pêche maritime, « les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information ». Le projet s’inscrit en effet dans le cadre d’études pré-cliniques visant à favoriser la cicatrisation muqueuse chez les patients atteints de rectocolite hémorragique. Les objectifs du projet ne peuvent donc être atteints sans recours à un animal modèle de l’Homme (modèle de colite chimio-induite). Il est nécessaire de travailler in vivo pour reproduire au mieux le modèle de colite, aucun modèle in vitro n’est encore possible dans ce contexte mais nous y travaillons (modèle d’organoïdes intestinaux).
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé à partir de la variabilité des paramètres étudiés,. Il s'agit du nombre miminal d'animaux utilisables pour pouvoir comparer les paramètres étudiés à l'aide de tests statistiques adéquats (n=10-12/groupe).
Raffinement
Les animaux seront élevés dans des conditions favorables à leur bien être en cage collective (enrichissement: carré de cellulose pour faire un nid) ou individuelle (enrichissement: carré de cellulose pour faire un nid et nid en plastique).
Choix des espèces
L'induction de l'inflammation colique sera réalisée chez la souris C57BL/6, souche la plus communément utilisée et la plus facilement manipulable pour ce type de projet. Ce modèle de colite chimio-induite est couramment utilisé par les équipes qui s’intéressent à l’étiologie et aux traitements pharmacologiques et nutritionnels des MICI. Nous avons développé ce modèle chez la souris (et le rat) lors d’études précédentes et récemment dans l'EU, ce qui nous a permis de bien maitriser ce modèle et de caractériser sa cinétique en cage individuelle. Age jeune adulte : 6 semaines à la réception (22g), âge de référence utilisé lors de nos précédentes investigations. A cet âge adulte, les souris présentent une physiologie digestive mâture (absorption intestinale et intégrité épithéliale) et des systèmes intégrés de détoxification, immunologiques et de stress oxydatifs optimaux. Il s’agit par ailleurs d’un âge murin communément utilisé pour l’expérimentation animale permettant d’obtenir une reproductibilité des résultats et des comparaisons avec les données scientifiques disponibles.
Propriétés thérapeutiques d’agonistes du récepteur Sigma1: impact sur la neuroprotection et la réparation neuronale et oligodendrocytaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 742 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une alimentation additionnée de cuprizone pour provoquer une démyélinisation du cerveau, puis passent des batteries de tests comportementaux évaluant 61 critères neurologiques, des séances d'IRM et des électrocardiogrammes, pour tester deux agonistes du récepteur Sigma1 comme candidats médicaments contre la sclérose en plaques. Le porteur affirme que ce modèle ne provoque pas de signe clinique évident et n'altère pas la prise alimentaire, et conclut qu'aucune alternative in vitro ou in silico n'existe pour reproduire ces mécanismes. Les retombées annoncées pour les patients restent renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat étant de mesurer la neuroprotection avant mise à mort par injection létale et perfusion intracardiaque.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie neuroinflammatoire évoluant sur différents modes cliniques. De récentes études montrent le caractère hétérogène et complexe de cette maladie auto-immune. Son étiologie est à l’heure actuelle encore inconnue. L’interaction de facteurs environnementaux et génétiques mènerait à la génération d’une réponse immunitaire anormale. L’immunité cellulaire et le système humoral sont impliqués dans la pathogénie de la maladie, provoquant des lésions démyélinisantes inflammatoires du système nerveux central (SNC) qui peuvent être classifiées en quatre catégories. Les lésions de type I et II ont de nombreuses caractéristiques communes (localisation péri-veineuse, démyélinisation active associée à la présence de lymphocytes T et de macrophages). Les lésions de type III présentent des infiltrats leucocytaires beaucoup moins importants et une oligodendropathie intense. Elles seraient la conséquence d’une exposition à des facteurs environnementaux produisant un stress métabolique. Les traitements de la SEP disponibles ne présentent qu’une efficacité restreinte sur la progression du handicap à long terme, c’est pourquoi il reste nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cibler les processus de démyélinisation paraît être une voie prometteuse pour moduler la phase progressive de la maladie. La proteine Sigma1 (S1R) est exprimée dans le cerveau et la moelle épinière, plus particulièrement par les neurones, les oligodendrocytes et la microglie. S1R est également exprimé par le système immunitaire (notamment par les lymphocytes B et T). Des ligands de S1R ont été synthétisés. La pharmacomodulation a permis d’augmenter leur affinité et leur sélectivité. L’impact de deux de ces composés a été testé in vivo dans un modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, EAE. Ce modèle animal de SEP reproduit les lésions de type I et II. Des résultats prometteurs ont été obtenus.
Bénéfices attendus
Le modèle de démyélinisation toxique et les diverses analyses associées permettront d’analyser l’impact de nos candidats médicaments sur les processus de neuroprotection et de réparation.
Procédures
Tests comportementaux permettant l'évaluation de 61 critères neurologiques larges (30 minutes). Acquisitions IRM afin d'assurer un suivi longitudinal des animaux sans sacrifice (45 minutes). Electrocardiogrammes (ECG) afin de mesurer l'espace QT et de valiser une abscence de perturbation du rythme cardiaque (10 minutes).
Impact sur les animaux
Le modèle expérimental d'induction de la démyélinisation par la cuprizone est usuellement réalisé chez la souris. Les atteintes oligodendrocytaires et neuronales de la substance blanche sont majoritairement localisées dans le corps calleux et le pédoncule cérébelleux supérieur, cependant les animaux ne présentent pas de signe clinique évident. Leur prise alimentaire et hydrique n'est pas altérée.
Devenir
Tous les animaux sont mis a mort au point d'analyse final. Les animaux recevront une dose létale de Dolethal afin de réaliser d'une perfusion intracardiaque qui permettra de fixer les tissus avant les études en microscopie.
Remplacement
Des études in vitro ont été réalisées avec des agonistes S1R préalablement à cette expérimentation. Il est décrit que des ligands synthétiques moins selectifs et moins affins que nos composés montrent des capacités à inhiber la démyélinisation ou à activer la remyélinisation. Nos molécules pharmacologiques ont donné des résultats prometteurs lors de leurs injections dans des souris développant une EAE. Nous avons construit une collaboration scientifique avec un partenaire industriel dans le but d’étudier plus précisément l’implication de nos composés sur les processus de démyélinisation/remyelinisation qui constituent une voie prometteuse pour moduler la phase progressive de la SEP. Les mécanismes impliqués dans ces processus sont complexes. Ils impliquent la destruction tissulaire, le système immunitaire et la neuropathologie chronique. Ces événements sont uniquement reproduit dans des modèles animaux, aucune alternative in vitro, ni in silico n'existe actuellement.
Réduction
La recherche d’une grille de lecture clinique permettra de parfaire le suivi de l’évolution de chaque individu. L’utilisation de techniques IRM nous permettra de suivre les modifications présentes au sein du SNC durant 12 semaines, sans sacrifice. Notre plan d’expériences imbriquées permettra de limiter le nombre d’individus. Un grand nombre d'animaux sera sacrifié durant la seconde procédure expérimentale afin de valider un seul protocole d'administration et deux fenêtres thérapeutiques. Les données des animaux témoins seront réutilisés.
Raffinement
Le modèle de démyélinisation est maitrisé par notre équipe et répandu dans les laboratoires étudiants la physiopathologie des phénomènes de démyélinisants/remyélinisants. Les points d’analyses nécessitant une euthanasie ont été clairement définis grâce à la bibliographie. Leur pertinence pour chaque animal sera attestée par l’utilisation d’une grille de lecture clinique affinées et d’un suivi IRM longitudinal.
Choix des espèces
Le modèle expérimental d’induction de la démyélinisation par la Cuprizone est usuellement réalisé chez la souris. La souris C57BL/6 male est classiquement utilisée. Cependant, aucune différence notable des profils de démyélinisation n’est observée en fonction du sexe. Les souris sont âgées d’environ 8 semaines lors de la mise sous une alimentation additionnée de cuprizone (0,2%). Nous veillerons à effectuer une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant d’engager tout protocole. Les animaux seront donc livrés à l’âge de 7 semaines.
Mise au point d’une interférence avec l’expression de la connexine 43 dans le complexe vagal dorsal du tronc cérébral
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie stéréotaxique du cerveau d'environ 40 minutes, puis une perfusion intracardiaque terminale ou une décapitation sous anesthésie, pour valider des outils d'interférence ARN ciblant une protéine des cellules gliales. Le porteur décrit les suites de la chirurgie cérébrale, saignements, douleur, faiblesse et risque infectieux pendant la cicatrisation. Il présente ce projet pilote comme fournissant des résultats "indispensables" à la publication de travaux ultérieurs sur le contrôle de la balance énergétique.
Objectifs
L’obésité est définie par une accumulation anormale ou excessive de masse adipeuse qui peut entraîner des conséquences néfastes sur la santé. Le contrôle de la balance énergétique (équilibre entre les dépenses énergétiques de l’organisme et les apports par la prise alimentaire) est normalement assuré par le cerveau, avec un rôle important dévolu à une structure localisée dans le tronc cérébral caudal. Le tissu nerveux comporte des neurones et des cellules gliales, ces dernières ayant longtemps été considérées comme apportant un simple soutien nutritif aux neurones. Les neurones du tronc cérébral caudal sont sensibles à de multiples signaux informant du niveau des réserves énergétiques de l’organisme. Un dysfonctionnement de ces neurones n’explique pas totalement la pathogenèse de l’obésité chez l’Homme. Dans ce contexte, il est aujourd’hui admis que les cellules gliales interagissent avec les neurones pour réguler la balance énergétique mais les mécanismes régissant leur communication demeurent largement inconnus. La connexine 43 est une protéine permettant aux cellules gliales de communiquer entre elles et avec les neurones. Notre objectif global est d’évaluer le rôle de la connexine 43 exprimée par les cellules gliales du tronc cérébral caudal dans la balance énergétique chez la souris. Il nous faut pour cela être à même d’inhiber spécifiquement l’expression de cette protéine dans ces cellules gliales chez des souris adultes. La technologie choisie pour cette inhibition est l’interférence ARN, ciblant un gène particulier. Dans le cadre du projet pilote constituant la présente demande d’autorisation, nous avons conçu et fait produire deux vecteurs viraux permettant d’exprimer spécifiquement dans les cellules gliales du tronc cérébral caudal, une protéine fluorescente, ainsi qu’un ARN interférant dirigé contre la connexine 43 ou un ARN inactif. Notre objectif est de valider la capacité de nos outils ARN interférant et leurs vecteurs viraux à réduire sélectivement l’expression de de la connexine 43 dans ces cellules, sur une durée compatible avec l’analyse d’un impact sur la balance énergétique.
Bénéfices attendus
Ce projet pilote a pour but la mise en place d’injections intracérébrales aigues permettant d’induire une réduction de l’expression de la connexine 43 dans les cellules gliales du complexe vagal dorsal du tronc cérébral. Le principal objectif de ce projet est de raffiner la méthodologie et valider les outils que nous utiliserons par la suite pour étudier l’effet d’une réduction de l’expression de la connexine 43 sur la balance énergétique des souris. Cette étude pilote fournira les preuves scientifiques de la validité des outils utilisés, des résultats indispensables pour la publication de l’ensemble de travaux. Nous utiliserons ce protocole pour mieux comprendre l’implication de la communication des cellules gliales sur le maintien de la balance énergétique.
Procédures
Toutes les souris incluses dans le projet (36) sont soumises à une chirurgie stéréotaxique sous analgésie et anesthésie (une fois, durée environ 40 minutes) et soit à une perfusion intracardiaque terminale sous analgésie et anesthésie avec un fixateur formolé (12 souris ; durée inférieure à 2 minutes entre la première incision et la mort), soit à une décapitation sous anesthésie (24 souris ; durée inférieure à 1 seconde).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sont ceux liés à chirurgie d’injection intracérébrale : saignements per et post-opératoires, douleur post-opératoire, faiblesse transitoire post-opératoire pouvant limiter les capacités d’accès à la nourriture et à l’eau, fragilité durant la phase de cicatrisation avec risque inflammatoire et infectieux.
Devenir
PROCEDURE 1 : La mise à mort des animaux est requise pour l’analyse histologique permettant de vérifier la bonne expression de nos vecteurs viraux. PROCEDURE 2 : La mise à mort des animaux est requise pour l’analyse de l’expression de la connexine 43 et la détermination des modifications de structure de cette protéine ayant un impact sur son fonctionnement.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de la consommation alimentaire et du poids corporel.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire à ce projet est de 36 souris mâles. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu du nombre de paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Ce projet s’inscrit parfaitement dans une démarche de réduction des répétitions inutiles puisqu’il permet d’établir un protocole robuste pour des injections intracérébrales permettant d’induire une réduction de l’expression de la connexine 43 dans les gliales du complexe vagal dorsal. Le protocole sera reproduit dans le prochain projet pour étudier la contribution de la connexine 43 au maintien de la balance énergétique. Les délais de mise à mort ont été choisis par rapport aux données bibliographiques ayant testé les délais post-traitement à partir desquels l’expression de vecteurs viraux est effective. Néanmoins aucune donnée bibliographique n’existe pour le vecteur viral que nous injecterons dans la région cérébrale ciblée. Ces expériences sont donc essentielles.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet sont contrôlés visuellement de façon quotidienne et pesés au minimum deux fois par semaine. Toute détection d’une apparence générale et/ou d’un comportement général suspect et/ou d’une perte de poids supérieure à 5% entraine la mesure d’un score de souffrance selon une grille adaptée et des actions correctives adaptées en cas d’atteinte des points limites ou points d’arrêt établis. Toutes les procédures chirurgicales sont accompagnées d’un traitement pharmacologique ayant pour but de réduire, supprimer ou soulager l’inconfort, la détresse ou l’angoisse subie par les animaux. La chirurgie d’injection intracérébrale est réalisée sous analgésie morphinique, anesthésie locale, anesthésie générale et contrôle stéréotaxique, avec un traitement antiinflammatoire en postopératoire. Par ailleurs dans ce projet, les injections intracérébrales sont réalisées uniquement en unilatéral pour diminuer le temps de chirurgie et la sévérité de la procédure. Un suivi post-opératoire renforcé permet de repérer précocement tout animal en souffrance de sorte à administrer un traitement analgésique supplémentaire, ou sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites ou points d’arrêt établis. En fin de projet, la mise à mort des animaux pour l’analyse histologique est réalisée sous analgésie et anesthésie générale. Tout au long du projet, l’hébergement des animaux se fait avec un enrichissement du milieu, dans un environnement à température et hygrométrie contrôlées et un cycle jour/nuit 12h/12h. Après la chirurgie, les animaux doivent être hébergés dans des cages individuelles pour leur protection. Néanmoins, les cages transparentes pour rongeurs en polycarbonate sont disposées de façon à permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères.
Choix des espèces
La souris est l’animal le mieux documenté dans la littérature pour le rôle du cerveau dans le contrôle de la balance énergétique. Des souris adultes à partir de 8 semaines seront utilisées. Ce stade de développement correspond à celui préalablement utilisé pour établir la carte de référence du cerveau de la souris permettant de repérer chaque structure cérébrale par ses coordonnées en trois dimensions. Les souris seront commandées à l’établissement éleveur pour une arrivée à 7 semaines, permettant une semaine d’habituation et d’acclimatation avant les expériences.
Formation aux techniques d’administration et de prélèvement chez la souris
- Formation professionnelle
2 310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles servent de support d'entraînement à des gestes techniques, jusqu'à cinq par animal, gavage, injections sous la peau, dans le péritoine ou la veine de la queue, prélèvement derrière l'œil et ponction cardiaque. Le seul objet du projet est de former et d'entretenir les compétences des expérimentateurs, aucune connaissance scientifique n'étant produite. Le porteur affirme réaliser ces gestes "tout en impactant au minimum le bien-être des animaux non-humains", les souris étant tuées après cinq gestes au maximum ou réutilisées pour d'autres séances.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’enseigner et/ou d’entretenir les compétences des expérimentateurs sur différentes techniques d'administration et de prélèvement chez la souris. Celles-ci sont utilisées selon les besoins liés aux divers projets scientifiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont doubles puisqu’il permettra de former et de maintenir les compétences et les connaissances des expérimentateurs pour la réalisation de prélèvement sanguin et/ou d’administration de qualité chez la souris, tout en impactant au minimum le bien-être des animaux.
Procédures
Un maximum de 5 administrations/prélèvements (procédures expérimentales 1, 2 et 3 confondues) pourra être réalisé sur un nombre maximum de 2310 animaux. Les 4 gestes techniques suivants seront réalisées sur animaux vigiles : 1. Administration d'un volume maximum de 10 mL/kg d'eau stérile par voie orale, à l'aide d'une sonde de gavage adaptée à la souris ; 2. Administration d'un volume maximal de 20 mL/kg (seringue de 1 mL + aiguille 26G) d’une solution tampon de phosphate salin (PBS) stérile par voie IP, dans le quart inférieur droit ; 3. Administration d'un volume maximal de 10 mL/kg (seringue de 1mL + aiguille 26G), de PBS stérile par voie SC (pli cutané au niveau du dos ou exposition au niveau du flanc) ; 4. Administration d'un volume maximal de 5 mL/kg (seringue 1 mL + aiguille 30G) de PBS stérile par voie IV, dans la veine caudale latérale. La souris sera positionnée dans une boîte de contention adaptée et conçue pour les injections veineuses à la queue. Les 2 gestes techniques suivants seront réalisés sous anesthésie générale (par voie gazeuse à l’isoflurane) associée à un analgésique local (instillation d’1 goutte de Tétracaïne 1% dans l’œil de l’animal) : 1. Administration d'un volume maximal de 5 mL/kg (seringue de 1 mL + aiguille 30G) de PBS stérile par voie IV au niveau du sinus rétro-orbital ; 2. Prélèvement rétro-orbital d'un volume maximal de 100 µL pour une souris de 25 g ou plus (soit V
Impact sur les animaux
Les gestes réalisés sur les animaux, dans les procédures 1 et 2, bien que pouvant être répétés et/ou multiples, sont de gravité légère. Aucune incidence significative sur le bien-être ou l’état général ne devrait être observée. La procédure 3 est menée intégralement sous anesthésie générale au terme de laquelle l’animal ne reprend pas conscience. Celle-ci n'occasionne aux souris aucune douleur, aucun mal ou dommage, ne provoque pas de grande anxiété et ne perturbe pas notablement leur état général.
Devenir
Dans les procédures 1 et 2, les animaux seront sacrifiés après un nombre d’administrations/prélèvements maximum de 5 (toutes procédures confondues) afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Pour les animaux ayant subit un nombre inférieur à 5, ils pourront être réutilisés dans l’une des 3 procédures afin de limiter au maximum le nombre d’animaux entrant en expérimentation. La procédure 3 se déroule intégralement sous anesthésie générale, au terme de laquelle l’animal ne reprend pas conscience. Les animaux sont ainsi sacrifiés sans subir de nuisance ou d’effet indésirables.
Remplacement
L'objectif de ce projet est de maîtriser un certain nombre de techniques d'administration et de prélèvement chez la souris, dans des conditions comparables à celles utilisées dans les projets scientifiques. L'utilisation d'animaux est donc incontournable.
Réduction
Nous sommes dans le cadre d’une formation et aucune statistique ne sera utilisée. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, ces derniers seront, dans la mesure du possible, des souris de réforme issues des élevages et/ou des animaux réutilisés d’un projet antérieur. Elles pourront être utilisées plusieurs fois dans la limite des volumes maximum recommandés et d’un nombre maximum d’administrations/prélèvements cumulés de 5.
Raffinement
Pendant toute la période précédant la mise en œuvre du projet, les animaux seront hébergés à 2-5 par cage avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. En fonction de la procédure, afin de réduire au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux, ces derniers pourront être anesthésiés (isoflurane) et/ou analgésiés (buprénorphine en préanesthésie, tétracaïne 1%).
Choix des espèces
La souris étant le modèle d'étude des expérimentateurs de l'animalerie, il est donc pertinent que la formation/maintien des compétences soit réalisé sur cette espèce. Les souris seront utilisées à partir de 7 semaines et jusqu'à une 20aine de semaines en fonction des euthanasies programmées dans l'animalerie (dans le cas de réformes issues des élevages et/ou d’animaux réutilisés d’un projet antérieur).
Création de lignées divergentes murines sur le critère de la sociabilité
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sélectionnées et croisées pour former deux lignées plus ou moins sociables, elles passent de nombreux tests comportementaux, dont l'interaction sociale, l'enfouissement de billes, la reconnaissance d'odeurs de prédateur et la nage forcée, pour chercher les bases moléculaires de la sociabilité. Le porteur décrit comme seules nuisances une légère inflammation au point de puçage et un léger stress lié aux tests. Les souris sont tuées par perfusion intracardiaque pour prélever leurs organes.
Objectifs
Les Mammifères, incluant les humains, les animaux de ferme et les rongeurs, ont majoritairement adoptés un mode de vie en groupes sociaux complexes afin de favoriser la survie du groupe et de l’espèce. La vie en groupe est devenue, en retour, essentielle au bien-être de chaque individu. En effet, des chocs psychologiques précoces, comme l’isolement d’individus, entraînent un repliement social et une agressivité exacerbée envers les autres congénères, et sont souvent accompagnés de comportements stéréotypés et répétés. Sans aller jusqu’à ces extrêmes, des variations individuelles des capacités sociales existent au sein d’un même groupe social. Les substrats moléculaires associés à ces variations individuelles sociales n’ont pas été identifiées à ce jour. L’objectif de cette étude est donc 1) de mettre en évidence ces variations individuelles des capacités sociales en créant deux lignées divergentes Sociable+ et Sociable- par croisement respectivement des souris les plus sociables et les moins sociables entre eux , 2) de déterminer les substrats moléculaires associés après plusieurs générations par une approche omique et 3) de les valider.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d'identifier des nouvelles cibles thérapeutiques afin d'améliorer l’interaction sociale chez la souris. Ce projet dans son ensemble permettra de valider ces cibles dans différentes espèces établies en groupes sociaux dont l’Homme et les animaux d’élevage. Ces expériences vont significativement contribuer à l’augmentation des connaissances scientifiques des troubles de l'interaction sociale dont les acteurs moléculaires mis en jeu reste méconnus, et également à long terme de développer des nouvelles approches thérapeutiques pour soulager ces troubles.
Procédures
contention (5 fois, 5 sec), puçage des animaux (1 fois, 10min par animal), tests de comportement et habituation (2 fois 30 min, sauf caractérisation entière 10 fois 30min), la perfusion intra-cardiaque (1 fois, 30min). Le comportement social sera évalué en utilisant le test d’interaction sociale directe et le test des trois chambres pour la sociabilité, le test de monte pour le comportement socio-sexuel et le test de déplacement du nid pour le comportement maternel. Enfin, la préférence et la détection olfactives seront mesurées pour la préférence des odeurs sociales. Les comportements stéréotypés, persévérants et répétitifs sont évalués par le scorage en direct des stéréotypies motrices, en mesurant les alternations dans un petit labyrinthe en Y. Les comportements de type anxieux sont mesurés dans le test de l’enfouissement de billes, le test de suppression de prise de nourriture induite par la nouveauté, le test de reconnaissance des odeurs de prédateurs et le test de la nage forcée.
Impact sur les animaux
puçage des animaux : légère inflammation des tissus localement au site d'injection; Tests de comportement: léger stress des animaux dans un nouvel environnement.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Il n’y a pas de méthode de remplacement du comportement social in vitro. Le comportement animal et les substrats moléculaires sous-jacents de l’interaction sociale ne peuvent être étudier que sur des animaux vivants. Il est donc indispensable de recourir à des procédures expérimentales in vivo.
Réduction
Le nombre de mâles et de femelles sont calculés pour voir des effets statistiques et en quantité suffisante pouravoir des couples reproducteurs sociable+ et sociable- pour générer la génération suivante. Il est prévu de faire 6 générations, mais si les animaux sociables+ et sociables- sont obtenus à la quatrième génération, les autres générations ne seront pas nécessaires, réduisant les effectifs de minimum 30%. De plus, les souris issues de ses croisements seront utilisées dans d’autres saisines.
Raffinement
Les procédures expérimentales, majoritairement des tests de comportements, sont les plus brèves possibles et réalisées dans le calme et sous des éclairages faibles afin de minimiser l’inconfort et l’anxiété des animaux. De plus, ces expériences ont pour but de déterminer des nouvelles cibles pour améliorer le comportement social, un des marqueurs de bien-être des animaux. En effet, le repliement social est la première dégradation mineure du bien-être des animaux sociaux (incluant les animaux d'élevage et la souris). Les tests de comportement bien que légèrement anxiogènes au début permettent de staisfaire les comportements de curiosité naturelle des souris à explorer en enreichissant leur environnement.
Choix des espèces
Les souris sont des petits animaux sociaux qui se reproduise bien et vite et dont les comportements sociaux et stéréotypés sont mesurables par des tests bien décrits. Les expériences seront réalisées chez la souris jeune adulte (7-10 semaines) à un stade post-pubère où les neurones sont bien caractérisés et matures. Ces animaux seront mis en reproduction à 3 mois.
Intérêt de l’inhibition de l’activité phosphatase de l’époxyde hydrolase soluble pour la prise en charge des maladies cardiovasculaires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 168
360 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 160 d'entre eux. Une partie subit la ligature d'une artère du cœur, une autre l'ablation d'un rein, avant des examens d'IRM, pour tester si l'inhibition d'une enzyme protège des maladies cardiovasculaires. Le porteur indique que les animaux hypertendus risquent l'accident vasculaire cérébral et l'insuffisance cardiaque ou rénale. Il présente le projet comme validé par l'Inserm et financé par l'ANR, les animaux étant tués pour analyser leurs artères et prélever leurs organes.
Objectifs
Il s’agit d’un projet s’inscrivant dans le domaine de la recherche publique préclinique. L'objectif central du projet de recherche expérimentale est de répondre pour la fois à la question : l’inhibition de la sEH phosphatase peut-elle constituer une nouvelle approche thérapeutique pour la prévention et/ou le traitement des maladies cardiovasculaires ? Ce programme de recherche a été validé scientifiquement par l'Inserm (CSS4), ainsi que par des experts internationaux sollicités. Il sera financé par l’ANR.
Bénéfices attendus
Le but ultime de cette recherche est de pouvoir démontrer pour la première fois que la sEH phosphatase constitue une cible thérapeutique d’intérêt pour prévenir et/ou traiter les maladies cardiovasculaires et nous espérons que cette recherche permettra la mise en place d’une nouvelle classe de traitements.
Procédures
le but de cette étude est un modèle d'hypertension artérielle et d'insuffisance rénale. La procédure N°1 chirurgicale , concernant le modèle de ligature coronaire comprends un nombre de 66 souris et 84 rats La procédure N°2 chirurgicale , concernant le modèle de Néphrectomie comprends également un nombre de 66 souris et 84 rats. Les animaux restant ne subissent aucune chirurgie mais un traitement, concernant le diabete. Tous l'ensemble des animaux, c'est à dire 192 souris et 168 rats auront un IRM standart.
Impact sur les animaux
Concernant le groupe de la procédure N°1 sur l'Hypertension Artérielle, ces animaux seront hypertendus; il y a donc des riques d'AVC et les animaux vont développer une insufisance cardiaque, d'ou une surveillance et un contrôle particulier quotidien, cela n'engendre pas de réponse d'un point de vue comportemenatale. Les animaux de la procédure N°2, sur le modèle d'insufisance rénale, auront egalement un facteur risque d'AVC , ils peuvent aussi développer une insufisance cardiaque. cette pathologie n'engendre pas de signe comportementaux, la surveilance quotidienne est absolument indisprensable.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour l'étude de la fonction vasculaire del'artère mésentérique par artériographie et les prélèvements sanguins, ainsi que les différents organes qui serviront aux analyses anatomiques et moléculaires, seront prélevés.
Remplacement
Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées pour la bonne réussite de ce projet. En effet, ce projet se propose d’étudier les effets cardiovasculaires de l’inhibition d’une enzyme dans des conditions de physiopathologie intégrées, autrement dit, chez des rats et des souris avec une hypertension artérielle, une insuffisance rénale ou un diabète induits expérimentalement. L’utilisation de cellules ou de modèles expérimentaux ex vivo est par conséquent inadéquate pour répondre de façon pertinente aux questions posées dans le cadre de ce travail. Ainsi, les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
réduire le nombre d'animaux par l'utilisation de méthodes non invasives (IRM, échocardiographie) permettant de répéter les analyses sur le même animal au cours de la maladie. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de souris et de rats nécessaire afin de détecter une différence de 15% (one way ANOVA et test de Tukey).
Raffinement
raffiner les modèles afin de réduire la variabilité entres animaux permettant de limiter le nombre d'animaux par groupe : utilisation de régimes alimentaires pour potentialiser le développement de l’atteinte rénale ou des complications cardiovasculaires. De plus, les animaux seront hébergés aux normes requises et un enrichissement (plaques de cellulose vierge et des maisons en carton) est mis en place. Enfin, une anesthésie et une analgésie adéquates seront mises en place pour chaque animal en fonction de chaque type de procédure. Si les animaux arrivent aux points limites, les animaux recevront une injection d’un euthanasiant.
Choix des espèces
Le choix du rat et de la souris se justifie par l’expérience du laboratoire et sur la possibilité de recourir aux animaux transgéniques (rat KI pour la sEH phosphatase) pour approfondir les résultats de la recherche. Les opérations chirurgicales et les mises sous régime seront effectuées sur les souris entre 6 et 8 semaines de vie et sur les rats entre 10 à 12 semaines de vie. Les animaux seront immédiatement traités avec l’agent thérapeutique inhibiteur de la sEH phosphatase (SWE101 administré dans l’eau de boisson : 40 mg/L pour les modèles d’hypertension artérielle et de diabète ou anticorps administré par voie intrapéritonéale pour le modèle d’insuffisance rénale, la dose d’anticorps sera ajustée en fonction des données d’inhibition obtenues in vitro sur la sEH recombinante murine) . Concernant le modèle d’hypertension artérielle et le modèle d’insuffisance rénale, le recueil des urines puis les mesures invasives de la pression artérielle seront réalisées 10 semaines après l’opération, l’imagerie fonctionnelle in vivo 10 à 12 semaines après l’opération et la mise à mort 12 semaines après l’opération. Concernant le modèle de diabète, le recueil des urines puis les mesures invasives de la pression artérielle seront réalisées 14 semaines après le début du régime riche en graisses saturées, l’imagerie fonctionnelle in vivo 14 à 16 semaines après le début du régime et la mise à mort 16 semaines après le début du régime.
Suivie d’une instillation nasale de fragments d’anticorps chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
6 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une unique instillation nasale d'un fragment d'anticorps sous anesthésie gazeuse, pour localiser où la molécule se disperse dans les bronches, dans le cadre d'un travail préliminaire sur l'asthme sévère. Le porteur n'attend pas d'effet indésirable de la molécule, seulement de légers effets liés à l'anesthésie et à l'instillation. Les souris sont tuées pour prélever leurs bronches et y repérer le fragment d'anticorps.
Objectifs
L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. Le terme « d’asthme sévère » s’applique aux patients présentant un asthme dont le contrôle est impossible malgré des traitements inhalés à fortes doses, dont l’observance et la technique d’inhalation est bonne, et malgré une gestion optimale des comorbidités. Un des besoins non couverts dans l’asthme sévère est la prévention efficace des exacerbations. Ces exacerbations sont des épisodes caractérisés par une majoration des symptômes d'essoufflement, de toux, de respiration sifflante ou d'oppression thoracique et par une diminution de la fonction respiratoire. L'asthme est caractérisé par une hyperréactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Le remodelage bronchique est un changement structurel qui comprend, entre autre, l’augmentation de la taille du muscle lisse bronchique (MLB). La taille du MLB est une valeur très importante car son augmentation est associée à une fonction respiratoire dégradée et à un taux d’exacerbation plus élevé. Le MLB de patients asthmatiques se caractérise par l’excès de prolifération cellulaire associée à des modifications du métabolisme énergétique. L’équipe de recherche a déterminé différentes cibles potentielles de régulation du métabolisme énergétique dont l’inhibition permettrait de réduire la taille du MLB et donc de diminuer la pathologie. L’objectif de ce travail est de permettre des expérimentations préliminaires afin de localiser dans la bronche la dispersion d’un fragment d’anticorps (scFv). Le but de ce travail est d’étudier si le blocage du métabolisme des acides gras est capable de diminuer les symptômes de la maladie dans le modèle murin de l’asthme allergique chronique.
Bénéfices attendus
Ce projet préliminaire a pour but d’étudier la dispersion des molécules scFv dans les différentes structures de l’arbre bronchique après leur installation par voie nasale.
Procédures
Les animaux ne seront soumis qu’à une seule instillation nasale de fragments d’anticorps (scFv) sous une anesthésie gazeuse (Isoflurane).
Impact sur les animaux
Concernant les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux, nous nous attendons à pas d’effets indésirables quant à l’effet de la molécule instillée chez les animaux. Par ailleurs, l’anesthésie sous isoflurane et le mode d’instillation nasale, pourrait cependant avoir des légers effets indésirables (dyspnée et mauvaise absorption nasale) qui sont directement corrigés avec une diminution du pourcentage d’isoflurane comme décrit dans la procédure.
Devenir
L’objectif de ce projet préliminaire doit permettre la récupération des bronches des animaux traités afin de localiser dans quelles structures bronchiques les fragments scFv se situent. En fin de protocole, les animaux doivent donc être euthanasiés afin de procéder aux prélèvement de l’organe d’intérêt.
Remplacement
En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme suite au blocage du gène clé de la biogénèse mitochondriale. L’utilisation du modèle d’asthme chroniques murin dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes.
Réduction
Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Ainsi, nous utiliserons 3 souris dans chacun des deux groupes.
Raffinement
Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie pour les instillations, analgésie et anesthésie pour les mesures des paramètres respiratoires), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupe sociaux, coppeaux et bâtons), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle au cours de l’anesthésie, induite par les instillations intranasales, peut être traitée par la nébulisation pendant 15 s d’un broncho-dilatateur d’action rapide (salbutamol 1g/ml).
Choix des espèces
La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Souris adultes âgées de 7 semaines
Le test de la catalepsie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent le test de la barre, qui mesure la catalepsie par l'incapacité de l'animal à quitter une position imposée, pour vérifier qu'un candidat médicament ne provoque pas cet effet indésirable. Le porteur indique que toute souris atteignant un point limite est aussitôt mise à mort, et que les prélèvements sanguins se font par ponction cardiaque ou par décapitation à la guillotine sous anesthésie. Le cerveau est ensuite prélevé pour analyse.
Objectifs
La catalepsie se caractérise par une rigidité musculaire et par une perte des mouvements volontaires. C'est un des effets indésirables que peuvent provoquer certains médicaments psychotropes. L'objectif de ce projet est de vérifier qu'un médicament candidat n'induit pas de catalepsie. Celle-ci est mesurée par le test de la barre. Le principe de ce test repose sur l’incapacité d’un animal à se libérer d’une position imposée par l’expérimentateur. Le temps mis par l’animal pour quitter cette position est alors utilisé pour évaluer l’intensité de la catalepsie. Plus le temps mis par la souris pour revenir à une position « normale » est important et plus la catalepsie est sévère.
Bénéfices attendus
Les antipsychotiques, tel que l’halopéridol, utilisé dans le traitement de la schizophrénie et d’autres troubles psychiques, engendrent des effets secondaires extrapyramidaux tel que la catalepsie. La catalepsie induite par l'halopéridol est due au blocage des récepteurs dopaminergiques et à une réduction de la transmission dopaminergique.C'est pourquoi, la mesure des effets cataleptiques potentiels est importante dans la recherche de nouveaux médicaments antipsychotiques, afin de limiter les effets secondaires de ces derniers.
Procédures
La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal. Selon les directives du donneur d’ordre les prélèvements de sang sont réalisés : 1) soit en intracardiaque sous isoflurane pour un prélèvement sanguin compris entre 0.5 ml à 1 ml maximum ; 2) soit par décapitation, sous anesthésie générale, avec une guillotine dans le cas d’une nécessité de prélèvement sanguin important (supérieur à 1 ml). A la suite, du prélèvement sanguin, le cerveau de l’animal est prélevé.
Impact sur les animaux
Au moment du test, l’état général des animaux est également évalué selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Une grille de score, comprenant les points limites prédictifs, est remplie chaque jour de test et 24h après. Des paramètres supplémentaires ont été rajoutés, ils concernent les effets indésirables potentiels qu’un traitement pourrait provoquer. L’expérimentateur doit alors noter l’intensité de chacun de ces paramètres.
Devenir
A la fin du test de la catalepsie, les animaux seront soumis: 1) à un prélèvement de sang en intracardiaque sous anesthésie générale ou par décapitation, sous anesthésie générale, avec une guillotine dans le cas d'une nécessité de prélèvement sanguin important et 2) à un prélèvement de cerveau.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d’évaluer les effets cataleptiques potentiels des médicaments. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Ces analyses statistiques ont montré qu’un nombre de 10 animaux par groupe est nécessaire pour l’obtention de résultats fiables et reproductibles.
Raffinement
Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans ce projet : - Les lignées de souris utilisées sont : C57Bl/6 J (consanguine) et SWISS (non consanguine). - Une lignée de souris transgénique-KO est également utilisée : GPR88-KO (pas de phénotype dommageable) Stade de développement : 6-7 semaines au moment du test (âge adulte). Les produits testés sont destinés à des patients adultes.