Souris

132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte dans l'artère caudale des cellules de cancer du sein humain, une partie recevant en plus un gavage quotidien d'inhibiteurs, pour étudier le rôle de certains lipides dans les métastases osseuses. Le porteur indique que ces métastases provoquent chez l'humain des douleurs liées à la dégradation de l'os, et prévoit d'arrêter les procédures à sept jours, avant tout point limite. Il affirme que ce phénomène "ne peut pas être apprécié" par des tests in vitro, les retombées annoncées pour les patientes restant lointaines.

Objectifs

Le cancer du sein est une tumeur maligne qui peut se propager dans tout l'organisme : on dit alors que la tumeur a métastasé. Les cellules de cancer du sein migrent préférentiellement à l’os, ou elles vont être responsables d’une destruction massive de l’os. Celles-ci génèrent de grandes douleurs et des fractures pathologiques et peut même engager le pronostic vital des patientes. A l’heure actuelle, les métastases osseuses sont incurables et les traitements sont donnés uniquement pour améliorer la qualité de vie des patients. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par le biais desquels les métastases dérivant d’un cancer du sein se forment afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les leucotriènes sont des lipides biologiques produits naturellement par les leucocytes dans des conditions inflammations. Il a été observé récemment que les cellules cancéreuses sont elles-mêmes capables de produire ces lipides car elles possèdent les enzymes nécessaires. Cependant, le rôle des leucotriènes produits par les cellules cancéreuses dans la formation des métastases osseuses n’est absolument pas connu. Notre projet vise à comprendre comment ces leucotriènes peuvent contribuer à la formation des métastases osseuses des cancer du sein.

Bénéfices attendus

A terme ce projet apportera des informations indispensables pour limiter la rechute métastatique à l’os des cancers du sein et d’améliorer la survie des patients.

Procédures

Une suspension de cellules cancéreuses sera injectée dans l’artère caudale des souris. Pour cela les souris seront anesthésiées sous isoflurane, maintenues à 37°C et un gel anesthésiant de lidocaïne sera placé sur le dos des souris. Les animaux recevront une seule injection de cellules cancéreuses pour les procédures 1 et 2. Dans le cas de la procédure 2 les animaux recevront un traitement quotidien par gavage d’une solution pharmacologique d’inhibiteurs des enzymes de la voie de synthèse des leucotriènes. La durée des procédures 1 et 2 est de 7 jours.

Impact sur les animaux

La formation de métastases osseuses a pour caractéristique chez l’homme d’induire des douleurs. On sait que ces douleurs sont dues à la dégradation de l’os. Dans le but de réduire la douleur des animaux toutes les procédures seront arrêtées 7 jours après l’injection des cellules tumorales où aucune dégradation osseuse n’est détectable et où aucun point limite n’est atteint. La quantification des métastases osseuses sera réalisée par histologie post-mortem.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de pouvoir évaluer post-mortem in vitro le nombre de cellules métastastiques ayant colonisé les os longs.

Remplacement

L’influence que peuvent avoir les enzymes clés de la synthèse des leucotriènes sur des phénomènes tumoraux tels que la migration, la colonisation et l’ancrage osseux lors de la formation des métastases ne peut pas être appréciée par des tests in vitro. L’utilisation d’une lignée cellulaire d’origine humaine du sein que nous avons préalablement testée in vitro pour sa capacité à être invasive nous permettra de reproduire chez la souris le plus fidèlement possible la situation pathologique du cancer du sein chez la femme.

Réduction

La procédure n°2 ne sera réalisée que si la procédure n°1 donne les résultats attendus. La taille des groupes a été déterminée à l’aide d’une analyse de puissance réalisée avec le logiciel BiostaTGV. Sur les 3 ans de réalisation du projet, un nombre total de 132 souris sera nécessaire

Raffinement

Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans un environnement enrichi (maison rouge, coton) renouvelé une fois par semaine. Afin de permettre l’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement, les souris seront placées en stabulation durant deux semaines au sein de l’animalerie d’accueil sous surveillance journalière. Tous les protocoles d’injection des cellules tumorales seront réalisés sur des souris anesthésiées au moment des injections. L’état de bien être des souris sera évalué quotidiennement par l’observation des principaux signes physiologiques, comportementaux et de l’apparence de l’animal. Les animaux seront pris en charge au premier signe d’inconfort.

Choix des espèces

La souris Balb/c nude est couramment utilisée en oncologie. Ces souris présentant une déficience du système immunitaire nos conditions d’hébergement dans un local à air contrôlé sont adaptées à cette spécificité des animaux. Les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 6 semaines. Nous utiliserons des souris femelles car notre étude porte sur le cancer du sein.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-rétiniennes de gènes, passent des tests de vision, une imagerie du fond d'œil et un électrorétinogramme sous anesthésie, avant une mise à mort et un prélèvement de la rétine. Le porteur indique que ces injections peuvent provoquer des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires, et que l'anesthésie répétée peut entraîner une hypothermie. Il affirme que ce modèle "ne peut pas être remplacé" par la culture cellulaire ou les organoïdes, les retombées pour les patients atteints de rétinite pigmentaire restant renvoyées au long terme.

Objectifs

Notre objectif est d'étudier le bénéfice thérapeutique de la combinaison de deux gènes dans la dégénérescence rétinienne. Les deux gènes ont pour fonction de protéger la rétine. Les souris qui ont perdu les deux gènes ont montré des déficits visuels marqués. Des expériences cellulaires ont également confirmé que les produits codés par les deux gènes peuvent prolonger la durée de survie des cellules rétiniennes. Dans cette étude, un modèle murin de dégénérescence rétinienne sera utilisé pour co-administrer les produits des deux gènes et l'effet thérapeutique du traitement combiné sur la vision des souris sera évalué par les tests visuels. Les résultats obtenus pourraient également s'inscrirent dans un futur assai clinique pour la thérapie génique au profit des patients.

Bénéfices attendus

La rétinite pigmentaire manque actuellement de traitements efficaces. Le projet étudiera le rôle protecteur de deux gènes dans la rétine. Une stratégie thérapeutique basée sur l'un de ces gènes est entré en essai clinique cette année. Les deux gènes prolongent la survie des cellules rétiniennes de différentes manières. Nous possédons des arguments pour penser que l’administration des deux gènes d’intérêt aurait un effet thérapeutique synergistique. A plus long terme l’objectif est de faire la preuve de concept du bénéfice pour la vision d’une thérapie combinant les deux. Les résultats obtenus seront bénéfiques pour faire avancer le traitement de la rétinite pigmentaire.

Procédures

Le projet comporte 2 étapes : La première étape consiste à injecter le traitement à des souris modèles. Chaque lot d'expériences est divisé en 5 groupes (n = 5), dont 4 groupes recevront des injections (un total de 20 souris) et 1 groupe sera un groupe témoin non injecté (un total de 5 souris). Des souris seront injectées sous anesthésie gazeuse et une pommade oculaire sera appliquée sur la cornée pour une anesthésie locale et une analgésie. La procédure d'injection durera environ 5 minutes par souris. La deuxième étape est l'évaluation de la fonction visuelle. La deuxième étape est l'évaluation de la fonction visuelle. 5 groupes de souris seront testés 1, 4 et 6 mois après l'injection. Au total, 4 tests seront effectués, comme suit : Test 1 : La vision sera mesurée pour chaque souris pendant environ 5 minutes chacune (sur éveillé). Test 2 : Des photos du fond d'œil des animaux seront prises pour évaluer la santé du fond d'œil. Les animaux seront testés sous anesthésie gazeuse. Test 3 : Une imagerie rétinienne d'animaux sera réalisée pour obtenir des informations structurelles rétiniennes. Les animaux seront testés sous anesthésie gazeuse. Les tests 2 et 3 seront réalisés sous la même anesthésie gazeuse et dureront 15 à 20 min par souris. Test 4 : La fonction électrophysiologique de la rétine de l'animal sera testée. L'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale. Le test durera au total 30 minutes.

Impact sur les animaux

Lésion : Les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés au niveau de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Douleur : Les injections intra péritonéales, sous-cutanées peuvent induire une douleur ponctuelle réversible. Maladie : La majorité des gestes expérimentaux auxquels sont soumises les souris seront réalisés sous anesthésie générales par induction gazeuse ou chimique (injection intraoculaire, fond d’œil, tests de la structure rétinienne et des fonctions électrophysiologiques). L’anesthésie peut provoquer une hypothermie. Environnement non adapté : Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme) et lors des tests visuels d’optocinétique.

Devenir

Au regard des résultats que nous attendons, le point final est fixé à 6 mois, mais on se laisse la possibilité d'aller jusqu'à 10 mois si les résultats observés le nécessitent. Les animaux seront euthanasiés et la rétine sera prélevée pour obtenir la quantification des photorécepteurs à cônes.

Remplacement

Le modèle de souris de la dégénérescence de la rétine peut simuler le processus pathologique de l'homme, qui ne peut pas être remplacé par la culture cellulaire et les organoïdes rétiniens. Le test d'acuité visuelle et la mesure de la fonction électrophysiologique des photorécepteurs à cônes ne peuvent pas être réalisées sur des modèles in vitro.

Réduction

Il y a 5 groupes au total, dont 4 groupes de souris injectées, et 1 groupe contrôle sans injections, comme suit : Groupe 1 : 10 souris recevront une injection de vecteur vide sans effet thérapeutique Groupe 2 : 10 souris recevront une injection de médicament contenant le produit du gène 1 Groupe 3 : 10 souris recevront une injection de médicament contenant le produit du gène 2 Groupe 4 : 10 souris recevront un médicament comprenant une combinaison de deux produits géniques Groupe 5 : 8 souris non injectées Pour réduire le nombre d'animaux, nous ne définissons pas un groupe de contrôle fictif séparé, remplaçant en profitant des deux yeux. Un contrôle fictif a été utilisé pour évaluer l'effet de l'intervention chirurgicale elle-même sur les résultats expérimentaux. Nous injecterons le traitement dans l'œil droit, et l'œil gauche sera un contrôle factice avec une seule opération chirurgicale. Le nombre de souris par groupe est estimé à partir de travaux antérieurs pour garantir la génération de résultats statistiquement significatifs, en tenant compte d'environ 15 pour cent de perte d'animaux au cours de la progression.

Raffinement

Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifie de l’animalerie et seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation. Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifie de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront héberges dans des cages de stabulation avec enrichissement, alimentation et abreuvement à volonté. Une anesthésie courte, permettant un réveil rapide de l’animal, sera privilégiée quand les procédures le permettent. Les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale au gaz pour les procédures courtes (injection intraoculaire, techniques d’imageries), et d’une anesthésie générale par injection intrapéritonéale pour les procédures plus longues (électrorétinogrammes). Une anesthésie locale de la cornée sera réalisée pour les injections cornéenne pendant les procédures. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu'à leur complet réveil. Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections intraoculaires/intrapéritonéales/sous-cutanées. Application d’une pommade anti-inflammatoire et antibactérienne en post injection intraoculaire er a la fin des électrorétinogrammes. Un temps de repos minimal de 24h sera réalisé entre une anesthésie au gaz et une anesthésie fixe (injection intrapéritonéale ) et de 7 jours entre deux anesthésies fixes. Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel, ainsi que nourriture et eau à volonté. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrête ou points limites ont été détermines pour chaque étape de la procédure expérimentale. Les animaux provenant de l’extérieur observeront un période d’acclimatation de 5 jours minimum.

Choix des espèces

Les souris modèles de dégénérescence rétinienne sont un modèle de rétinite pigmentaire (RP) autosomique récessive. Le modèle imite la RP humaine typique, et s'avère être un excellent modèle pour étudier les approches thérapeutiques de la RP. Le traitement par injection sous-rétinienne sera effectué sur PN15 (15 jours post-natal). Le début de la dégénérescence rétinienne dans ce modèle se situe autour de PN25, le traitement doit être le plus précoce. A PN15 , les yeux des souris sont ouverts et suffisamment pour les injections sous-rétiniennes. Le test de vision sur les 5 groupes sera effectué à 1, 4 et 6 mois après l'injection selon les études publiées avec un traitement similaire. Au regard des résultats que nous attendons, le point final est fixé à 6 mois, mais on se laisse la possibilité d'aller jusqu'à 10 mois si les résultats observés le nécessitent.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont vaccinées puis soumises à une infection par Staphylococcus aureus, avant un prélèvement sanguin et une mise à mort à trois ou vingt-quatre heures pour dénombrer les bactéries dans le foie, la rate et les reins. Le porteur fixe des points limites, une température inférieure ou égale à 33 °C et une perte de poids supérieure à 20 %. Il affirme que le recours aux animaux est "indispensable" pour tester si l'antigène administré sous forme d'ADN protège mieux que sous forme de protéine.

Objectifs

Les differentes stratégies vaccinales développées à ce jour vis-à-vis de S. aureus – un pathogène bactérien représentant un enjeu majeur de santé publique chez l’homme – se sont révélées décevantes. La principale raison invoquée aujourd’hui est que ces stratégies ciblaient uniquement une réponse immune humorale et ne stimulaient pas l’immunité cellulaire. La voie de recherche actuellement privilegiee consiste ainsi a obtenir une reponse immunitaire a la fois humorale et cellulaire, comme cela est le cas par vaccination ADN ou ARN. Dans une etude recente, nous avons identifie une proteine de S. aureus constituant un antigène vaccinal prometteur. Néanmoins, lorsqu’elle est utilisée pour immuniser les souris sous forme de protéine purifiée, elle n’a qu’un effet protecteur partiel vis-à-vis d’un challenge infectieux de S. aureus (diminution significative de la charge bactérienne uniquement dans les reins). Le present projet vise a etudier si l’utilisation de cet antigène candidat sous forme ADN permet d’accroître le pouvoir protecteur de cet antigène (baisse significative de la charge bactérienne dans les reins, mais aussi dans le foie et la rate des animaux), et ce dans le meme modele murin d’infection a S. aureus que celui que nous avons utilise precedemment. Le vaccin utilisé consiste en l’antigène candidat sous forme ADN associé au véhicule Nanotaxi®, qui est administré par voie intramusculaire tibiale antérieure ; les animaux témoins reçoivent une injection du véhicule seul selon le même protocole.

Bénéfices attendus

Les différentes stratégies vaccinales développées à ce jour vis-à-vis de S. aureus – un pathogène bactérien représentant un enjeu majeur de santé publique chez l’homme – se sont révélées décevantes. La principale raison invoquée aujourd’hui est que ces stratégies ciblaient uniquement une réponse immune humorale et ne stimulaient pas l’immunité cellulaire. La voie de recherche actuellement privilegiée consiste ainsi a obtenir une réponse immunitaire a la fois humorale et cellulaire, comme cela est le cas par vaccination ADN ou ARN. Dans une étude recente, nous avons identifié une proteine de S. aureus constituant un antigène vaccinal prometteur. Néanmoins, lorsqu’elle est utilisée pour immuniser les souris sous forme de protéine purifiée, elle n’a qu’un effet protecteur partiel vis-à-vis d’un challenge infectieux de S. aureus (diminution significative de la charge bactérienne uniquement dans les reins). Le présent projet vise a étudier si l’utilisation de cet antigène candidat sous forme ADN permet d’accroître le pouvoir protecteur de cet antigène (baisse significative de la charge bactérienne dans les reins, mais aussi dans le foie et la rate des animaux), et ce dans le même modele murin d’infection a S. aureus que celui que nous avons utilise précédemment.

Procédures

Un prélèvement sanguin sub-mandibulaire est effectué juste avant l’euthanasie à H3 ou H24 post-challenge. Un volume maximum de 500 microL de sang sera prélevé.

Impact sur les animaux

Nous n’attendons aucun effet délétère sur les animaux. Néanmoins : - La prise de température permettra d’être réactif (point limite : température égale ou inférieure à 33°C). - En cas de perte de poids, la surveillance sera renforcée et l’alimentation complémentée par de la nourriture gélifiée ; une perte de poids trop importante (supérieure à 20% par rapport au poids le jour de la première intervention/injection) constituera un point limite. Enrichissement du milieu : carrés de cellulose et à bâtonnets de bois (même matériau que la litière).

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir prélever les organes (foie, rate, reins) pour dénombrement des « UFCs ».

Remplacement

•Le recours a des animaux est indispensable à ce stade du processus d’évaluation préclinique dans une perspective de développement réglementaire du vaccin envisagé.

Réduction

•Limitation du nombre d’animaux utilisés : étude uniquement de l’antigène d’intérêt (pas de comparaison avec l’antigène d’intérêt sous forme de protéine (expérience précédente), ou avec d’autres antigènes connus) ; sous-groupes de 6 souris par temps et par dose, de manière à obtenir des analyses statistiques amenant à une significativité (p ≤ 0,05 par le test de Kruskal-Wallis). •Les expériences utilisent le nombre minimal d’animaux par sous-groupe nécessaire à une analyse statistique amenant à des résultats significatifs (variabilité individuelle) : 6 animaux sont, en effet, utilisés pour chaque point d’analyse, soit un total de 36 animaux vaccinés par l’antigene d’interet et 36 animaux contrôles.

Raffinement

•Enfin, concernant le bien-être des animaux : - Les animaux sont anesthésiés avant de recevoir les injections de vaccin et le challenge infectieux, et aucun effet délétère n’est attendu jusqu’à leur euthanasie (utilisation de doses non létales de S. aureus et euthanasie au plus tard 24 heures après l’inoculation de S. aureus) ; - Le bien-être proprement dit des animaux sera assuré a tous les stades des expériences, qu’il s’agisse de l’espace d’hébergement, des soins ou des modes operatoires. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement du milieu (carrés de cellulose et bâtonnets de bois). Les soins et les gestes operatoires seront effectués par du personnel expérimenté et qualifié. La surveillance des animaux reposera sur une évaluation quotidienne utilisant une grille de scoring. La prise de température permettra d’être réactif (point limite : température égale ou inférieure à 33°C). Une perte de poids trop importante (supérieure à 20% par rapport au poids de référence de l’animal) sera également un point limite.

Choix des espèces

Les souris, et particulièrement les souris BALB/c, sont très sensibles à l’infection par S. aureus et sont donc des animaux particulièrement pertinents pour juger de l’efficacité d’une protection vaccinale. Les souris utilisées auront 6 semaines au moment de leur arrivée à l’UE-IERP, recevront leur première dose de vaccin ADN à 7 semaines, et seront âgées de 15 semaines au moment du challenge infectieux.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de nanoparticules d'ARN messager par voie intraveineuse ou intramusculaire, suivies d'une imagerie de bioluminescence, pour optimiser des formulations vaccinales. Le porteur indique n'attendre d'autre douleur que celle liée à l'aiguille et suivre les animaux par une grille de points limites. Il affirme que des études sur "l'animal entier" restent nécessaires et qu'aucune méthode de remplacement fiable n'est disponible.

Objectifs

Les différents vaccins contre le COVID ont montré que la technologie de vaccination ARNm permet une réponse rapide à un nouveau pathogène. Ces vaccins (Moderna, Pfizer, Curevac) sont administrés sous forme de nanoparticules lipidiques (LNP) par voie intramusculaire et induisent une réponse immune protectrice. De nombreux essais cliniques utilisent des vaccins LNP ARNm avec des résultats prometeurs contr ede nombreux cancers solides. De plus, de bons résultats précliniques ont été démontrés pour la régénération tissulaire après administration locale d'ARNm codant des gènes de morphogénèse. Notre projet vise donc à optimiser à la fois la séquence des ARNm et leur mode de délivrance pour maximiser leur expression in vivo. Ce projet vise à mettre au point des vaccins à base de nanoparticules d’ARNm en testant différents types de nanoparticules et différentes séquences ARNm développés au laboratoire. Le projet comporte deux étapes: une première étape d'injection des complexes ARNm et une deuxième étape d'injection du substrat et d'imagerie non-invasive de bioluminescence. Les applications thérapeutiques sont la vaccination anticancéreuse et la régénération tissulaire. L'optimisation des séquences d'ARNm et de leur formulation permettra de diminuer les quantités d'ARNm injectées et de réduire les coûts des vaccins.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous allons évaluer différentes formulations de LNP et séquences d’ARNm pour maximiser l’expression de l’ARNm après injection intraveineuse ou intramusculaire chez la souris. L’expression des ARNm sera évaluée par imagerie non-invasive de bioluminescence. Nos travaux seront menés dans le respect de la règle des 3R : l’effectif des souris mis en œuvre est limité au strict minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables statistiquement. Des expériences in cellulo ont montré que les nanoparticules de types LNP sont capables de transfecter des cellules musculaires ou des cellules dendritiques avec l’ARNm. Les travaux chez le modèle animal sont dans la continuité de ces résultats.

Procédures

aucun prélèvement ni chirurgie ne sont prévus

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à une douleur suite à l'injection des formulations, mis à part la douleur induite lors de l'injection liée à l'aiguille. Nous prendrons en compte la douleur générée par les injections intramusculaires. Nous suivrons les animaux avec une grille de scoring présentant des points limites prédictifs liés à la douleur et à la désiorientation.

Devenir

les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure

Remplacement

L’utilisation des modèles cellulaires a déjà démontré que certaines structures augmentent la traduction des ARNm. Cependant, des études sur l'animal entier sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations et les ARNm de différentes structures. Etant donné la complexité des processus mis en jeu, aucune méthode de remplacement fiable n’est disponible.

Réduction

Réduction: l’effectif des souris mis en œuvre est limité au strict minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables statistiquement. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive, le suivi longitudinal permettra de diminuer le nombre d'animaux.

Raffinement

les méthodes utilisées seront mises en œuvre par du personnel formé (niveau chirurgie) et les points limites sont validés par le comité éthique local. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive chez la souris.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris Balb/c car c'est ce modèle qui a été utilisé dans nos expériences précédentes de vaccination ARNm et de régénération tissulaire. Le modèle souris permet d'évaluer les capacités des formulations ARNm dans une espèce à cycle de vie court où les mécanismes immunitaires sont les mêmes que chez l'Homme mais à des échelles de temps compatibles avec un criblage de formulations et de structures ARNm Des souris adultes (à partir de 8 semaines) ayant un système immunitaire mature seront utilisées.

2 368 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une chimiothérapie ou sont irradiées puis greffées de moelle pour reproduire une réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids et diarrhée attendues, avant d'être tuées par dislocation cervicale sous anesthésie pour prélever l'intestin. Le porteur teste divers facteurs censés renforcer la barrière intestinale et améliorer la survie. Il affirme qu'un "système biologique intégré" est "indispensable", la souris restant selon lui le modèle de choix.

Objectifs

L'étude de la barrière intestinale étant difficilement réalisable en pratique chez les patients, nous souhaitons utiliser des modèles murins de chimiothérapie/radiothérapie et de GvHDa. Notre objectif est de mieux comprendre et de renforcer l’effet de barrière de l’intestin de ces souris en intervenant sur leur microbiote/flore, leur mucus et leur trophicité épithéliale. Pour cela nous testerons individuellement chaque facteur susceptible de renforcer la barrière intestinale, puis l'association des facteurs ayant individuellement fait la preuve de leur efficacité.

Bénéfices attendus

Nous attendons que un ou plusieurs des facteurs testés (alimentation hyperprotéique, glutamine, vitamine D, Zinc, prébiotique et facteurs de croisssance intestinaux) permette : i. la diminution du retentissement clinique, de la perméabilité intestinale, du score histologique des dommages intestinaux, de la translocation intestinale et de la dysbiose ; ii. l' amélioration de la survie, de la citrulline plasmatique.

Procédures

1. Dans le modéle de chimiothérapie: les animaux recevront soit 5 jours de chimiothérapie par injection quotidienne intra-péritonéale. Il pourront également recevoir des gavages d'antibiotiques, de prébiotiques ou d'eau pendant une 10aine de jours. Le sacrifice sera réalisé à J6 ou J8 par rapport à l'initiation de la chimiothérapie. 2. Dans le modèle de gvHDa les animaux seront irradiés et recevront le lendemain une greffe de moelle par injection intrapétonéale ou injection dans le sinus retro-orbitaire (après anesthésie à l'isoflurane). Les animaux recevront le facteur testé sous forme de nourriture, de gavage ou d'injection sous-cutanée pendant 14 jours. Le sacrifice sera réalisé à J7. L'étude de la survie ne sera pas prolongée au delà d'un mois. Dans tous les cas, le sacrifice sera réalisé par discolation cervicale après anesthésie à l'isoflurane.

Impact sur les animaux

Perte de poids et asténie liée à la chimiothérapie, à l'irradiation et à laGvhDa qui peuvent également entrainer de la diarrhée. Administration par gavage ou voie sous cutanée de certains facteurs. Injection du greffon par injection intrapéritonéale ou dans le sinus retro-orbitaire (sous anesthésie par inhalation d'isoflurane concernant ce dernier).

Devenir

1. Modèle chimio: les animaux devront être sacrifiés à J6 ou J8 pour analyse de leur intestin. 2. >Modèle GvHDa: les animaux servant à la préparation des greffons sont sacrifiés sans aucune expérimentation au préalable. La majorité des animaux sont sacrifiés à J7 post-greffe pour étude leur intestin. L'étude de la survie n'est pas prolongée au delà de J30 post-greffe (euthanasie au delà).

Remplacement

Chez l’homme, il s'avère en pratique difficile d’évaluer l’atteinte intestinale avant ou lors de la déclaration d’une GvHDa du fait du risque et de la contrainte que constitue la réalisation d'examens endoscopiques digestifs répétés avec biopsies. L’utilisation d’un système biologique intégré est indispensable pour l’étude des conséquences de la chimiothérapie et de la GvHDa sur barrière intestinale. La souris reste un modèle de choix pour étudier la barrière intestinale (mucus/muqueuse/immunité) comparativement aux modèles plus éloignés dans l’évolution.

Réduction

Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Les paramètres mesurés seront analysés par des tests non-paramétriques non appariés (test de Wilcoxon-Mann- Whitney, coefficient de Spearman). La littérature indique que les groupes doivent être constituées d'au minimum de 12 souris pour atteindre une puissance statistique suffisante. Le nombre prévu est de 15 souris par groupe contrôle et 25 par groupe traité. Une analyse intermédaire (sur le score histologique des dommages intestinaux) sera réalisée à 2/3 des inclusions par groupe, afin d'interrompre toute expérimentation montrant un résultat déjà significatif à ce stade. - La réalisation de l'étude i. de la perméabilité intestinale (FITC-Dextran), ii. de la survie sera toujours soumise à un GO/No GO et ne sera par conséquent réalisée qu'en cas d'effet positif de la condition testée sur le score histologique des dommages intestinaux. Ces mesures permettent de passer d'un effectif de 2368 animaux au maximum à un effectif de 947 animaux au mimimum.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans une animalerie EOPS agréée avec une surveillance quotidienne. L’environnement sanitaire sera donc idéal pour l’hébergement (température et hygrométrie réglementaire et stables). Les animaux livrés seront laissés en quarantaine pendant une semaine avec de la nourriture ad libitum. Les souris, hébergées par 2 à 5 individus/cage avec un enrichissement (batonnets en coton permettant la confection de cocons) seront manipulées par des personnels formés en possession d’une habilitation à l’expérimentation animale. Les expérimentations seront effectuées par un duo, toujours identique, afin de minimiser des différences inter-individuelles. L'injection du greffon dans le sinus rétro-orbitaire sera réalisée sous anesthésie. Avant dislocation cervicale les animaux seront anesthésiés. Le sacrifice sera réalisé à J7 avant que la perte de poids et la prostration liées à l'irradiation et/ou laGvHDa ne soient trop importantes. Durant l'étude de survie, les animaux avec une perte de poids > ou = à 20% ou atteints d'une prostration importante seront euthanasiés.

Choix des espèces

- La souris est un modèle de mammifère proche de l’Homme pour la physiologie intestinale. - Le laboratoire a créé une souris génétiquement modifiée pour renforcer le mucus intestinal. - La modélisation de la GvHDa chez des souris hybrides F1 est bien documentée. Adultes de 8 à 12 semaines (étude des animaux dont le systéme immunitaire est mature)

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de mutations du gène c-MET associées à des mutations LPR ou GLD, elles reçoivent des injections censées induire une inflammation articulaire, subissent des ponctions de moelle osseuse sous anesthésie, puis sont tuées et disséquées pour analyse de leurs organes. Le porteur relie ce modèle au cas d'une patiente cumulant cancer du sein, syndrome myéloprolifératif et polyarthrite. Il affirme les modèles in vitro "limités" et juge ses lignées murines les seules à répondre à sa problématique.

Objectifs

A partir de l’observation, chez une jeune femme de 36 ans, d’une association inhabituelle de maladies graves (un cancer du sein, un syndrome myéloprolifératif de type Vaquez, et une polyarthrite rhumatoïde), nous avons fait la preuve du concept d’une approche individuelle en génétique constitutionnelle. Pour notre patiente, nous avions deux échantillons pathologiques: un fragment de son cancer du sein et un prélèvement de moelle osseuse. A l’aide d’une nouvelle technologie d’analyse génomique, nous avons identifié une mutation de l’oncogène cMET. C’est une mutation constitutionnelle, retrouvée dans l’ADN de la patiente et dont la valeur pathologique n’était jusqu’alors pas connue. Nous avons établi un modèle de transgénèse non dommageable pour cette mutation de c-MET chez des souris de fond génétique C57bl/6. La caractérisation phénotypique a mis en évidence des syndromes auto-immuns et myéloprolifératifs semblables à ceux observés chez la patiente. Cependant, les phénotypes restent peu sévères et n’altèrent en rien la survie des animaux. Un premier projet sur ces animaux a permis de montrer l'aspect multifactoriel de l'apparition des syndromes autoimmuns en associant cette mutation c-MET avec l'administration de molécules pro-inflammatoires. Toutefois, ce travail n'a pas permis de mettre en évidence de développement tumoral chez ces animaux. Notre objectif est de poursuivre l'étude de cette mutation c-MET et de démontrer son rôle dans l'apparition des cancers.

Bénéfices attendus

L'apparition des cancers trouvent souvent des origines multifactorielles. Cette mutation dans le gène c-MET peut être qualifiée de moyenne à faible pénétrence, ce qui signifie qu'elle ne peut, à elle seule, induire la survenue tumorale. Toutefois, nous penssons que l'on associe cette fragilité génétique à d'autres facteurs, cela peut aboutir à la formation de cancers. Au delà de l'étude des implications que peuvent avoir cette mutation c-MET dans le dévelopement de pathologies, cela constitue également un outil d'étude des fragilités génétiques aboutissant à l'apparition de tumeurs.

Procédures

2 nouvelles lignées ont été créés portant à la fois la mutation c-MET et une mutation du gène LPR ou GLD. Des modèles de souris mutés LPR ou GLD sont commercialisés et ces mutations sont associés à des syndromes auto-immuns tels que l'arthrite, et des lymphadénopathie aboutissant dans 10% des cas à des tumeurs chez les sujets âgés. Les souris double mutés c-MET et LPR ou GLD ont un phénotype non dommageable comparable à celui des souris seulement mutées pour le gène c-MET. La survenue des pathologies trouvant souvent leur origine dans des processus multifactoriels, nous souhaitons traiter ces souris afin de déterminer l’impact de facteurs additionnels sur l’aggravation du phénotype des animaux. Cette objectif sera atteint par l'injection de 2 composés, l'un permettant d'induire une inflammation, et l'autre se liant spécifiquement à cMET. La sévérité se traduira par l'observation d'un gonflement au niveau des articulations. Ce travail propose d’étudier des pathologies très diverses dont l’élément clé serait la mutation du gène MET pour lequel nous avons des modèles animaux pertinents, qui reproduisent la pathologie humaine et sur lesquels nous pouvons étudier les facteurs d’aggravation des phénotypes.

Impact sur les animaux

Les études précédentes sur les souris c-MET traitées avec du LPS et HGF ont montré l'apparition de syndrome auto-immuns sans pour autant induire de répercutions physiologiques visibles chez l'animal. Ici, l'association avec une mutation dans le gène LPR ou GLD devrait permettre d'amplifier ces phénotypes.

Devenir

A l'issu de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés et disséqués afin d'effectuer des analyses histologiques fines des organes, et ainsi qualifier les atteintes (apparition de tumeurs, syndromes auto-immuns, syndromes myéloprolifératifs).

Remplacement

Les modèles d’étude in-vitro sont limités et peu pertinent dans ce cas de figure exceptionnel. L’objectif de notre projet est d'étudier un modèle porteur d'une mutation du gène Met et de faire le lien génétique entre des maladies graves et très différentes telles que la polyarthrite rhumatoïde, des syndromes myéloprolifératifs de type Vaquez mais aussi des cancers. De ce fait, il est actuellement très difficile d’étudier ces pathologies très diverses in-vitro, et les modèles cellulaires dont nous disposons ont des résultats limités. Par ailleurs il s’agit aussi de proposer un projet qui s’inscrive dans une démarche préclinique a visée thérapeutique pour les patients porteurs de cette mutation et pour les patients atteints de ces pathologies. Aussi, les lignées murines uniques développées sont des modèles de choix puisqu’elles reproduisent fidèlement les atteintes humaines. Les modèles dont nous disposons sont les seuls qui permettent de répondre à notre problématique pour laquelle l’expérimentation animale ne peut pas être substituée.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé au minimum sur la base d’une étude statistique pour nous permettre d’atteindre les objectifs fixés. Ce nombre est porté à 144 souris. Tous les animaux sont disséqués selon un protocole rigoureux pour valoriser les animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Les actes de ponctions de moelles seront réalisés sous anesthésie générale. Un suivi quotidien des animaux est assuré par les membres de l’animalerie et le personnel formé de l’unité. Pour assurer le bien-être des animaux, les souris sont placées en groupes sociaux et dans des cages avec enrichissement. Des points limites précoces ont été fixés pour limiter la gêne et la souffrance éventuelle des souris.

Choix des espèces

Ce projet utilisera 144 souris C57bl/6 portant la mutation cMET et la mutation LPR ou GLD mâles et femelles. En raison de ses bonnes performances de reproduction, cette souche a été utilisée pour la mise en place de la lignée transgénique. Le modèle murin est un modèle robuste et parfaitement caractérisé sur lequel il est relativement facile de réaliser des expériences de transgénèse. Souris adultes de 8 semaines. Les souris sont obtenues par croisements. Certaines seront utilisées pour les générations suivantes, les autres pour les injections d’HGF ou de LPS. Les animaux seront utilisés pour nos expériences dès l’âge de 8 semaines. En effet, la patiente chez laquelle la mutation Met a été découverte était agée de 36 ans lors du diagnostic. Nous nous plaçons ici dans les mêmes conditions pour nos souris jeunes adultes.

204 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec injection de vecteurs viraux et implantation de fibres optiques ou de lentilles, un test d'évitement de lieu associé à des chocs électriques, puis une perfusion intracardiaque létale pour fixer le cerveau. Le porteur relie ce travail à l'évitement observé dans le stress post-traumatique et espère y trouver des cibles thérapeutiques. Il affirme qu'un "organisme vivant intègre" est nécessaire, aucun modèle in vitro ou informatique ne pouvant selon lui le remplacer.

Objectifs

Ce projet a pour objectif général d’identifier les circuits neuronaux impliqués dans la persistance de l’évitement de place chez la souris. Ce projet se focalisera sur les circuits liant l’hippocampe au noyau accumbens via le septum latéral. L’hippocampe a déjà été impliqué dans la persistance d’évitement de place et le noyau accumbens joue un rôle clef dans la génération du comportement d évitement. Or, aucune étude à ce jour n’a cherché à comprendre comment l’hippocampe contrôle la persistance de l’évitement de place chez la souris. Pour atteindre l’objectif général, nous réaliserons une caractérisation neuroanatomique et optogénétique des circuits neuronaux activés pendant l’encodage et le reversal de l’évitement de place. Un point clé de cette étude est l’aspect longitudinal indispensable à la caractérisation de ces circuits neuronaux. Ce projet nécessitera ainsi l'utilisation de différentes lignées de souris transgéniques permettant la manipulation et enregistrement de l’activité au sein de ces différents circuits.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier comment les souris apprennent à éviter un lieu dangereux et à cesser d’éviter un lieu qui ne l’est plus. Ce phénomène, autrement appelé persistance d’évitement est couramment observé dans le syndrôme de stress post traumatique. Cet évitement comportemental et cognitif excessif limite l’efficacité de la thérapie comportementale. Comprendre son corrélat neuronal pourrait donc permettre d’identifier des cibles thérapeutiques pour le traitement de l’évitement persistant chez les patients atteints de stress post-traumatique.

Procédures

Ce projet implique 4 procédures expérimentales décrites en item 4. Chaque procédure (classe modérée) comprend la chirurgie stéréotaxique pour des injections de vecteurs viraux (30-45 min), le comportement d’évitement de place (10-30 min par jour pendant 3-4 jours) et la perfusion intracardiaque (10 min). La procédure 3 comprend également une chirurgie stéréotaxique pour l’implantation de lentilles à gradient d’indice (30-45 min) et la pose d’une baseplate qui n’implique pas de chirurgie stéréotaxique (30-45 min) pour les études d’imagerie calcique. La procédure 4 comprend également une chirurgie stéréotaxique pour l’implantation de fibres optiques (30-45 min) pour les études d’optogénétique.

Impact sur les animaux

Le comportement d’évitement de place et la perfusion intracardiaque n’engendrent ni douleur ni stress. L'intensité du choc électrique choisie (maximum de 0.2 mA) est largement inferieure aux intensités de chocs classiquement utilisées dans la littérature (0,7 mA). Par ailleurs, ce protocole a été démontré comme n’étant pas plus stressant que l’exploration délibérée d’un environnement familier. Les approches de chirurgie stéréotaxique sont des procédures douloureuses, l’usage d’anesthésiques et analgésiques est prévu, avant, pendant et après la chirurgie (jusqu’à 8 jours).

Devenir

Notre étude nécessite d’une part de fixer les tissus cérébraux afin d’y réaliser des marquages immunohistochimiques. Ce but expérimental nécessitant la mise en place d’une méthode de mise à mort de perfusion intracardiaque. A l’issue de chaque procédure, les souris recevront une dose létale d’anesthésique et perfusées avec une solution fixatrice (4% paraformaldéhyde). Ces souris ne seront donc pas impliquées dans une autre procédure.

Remplacement

L’utilisation d'animaux vivants se justifie par la nécessité d’identifier des phénomènes physiologiques complexes au sein des circuits neuronaux impliqués dans le comportement d’évitement chez la souris, ainsi que leur interaction fonctionnelle. De nombreuses structures cérébrales entrent en jeu et communiquent entre elles. Il est donc nécessaire d’étudier un organisme vivant intègre, qui ne peut être remplacé à ce jour par des techniques in vitro. De plus, le niveau de complexité dans une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que de nombreux mécanismes biologiques contrôlant la persistance de l’évitement actif restent inconnus.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser un maximum de 204 souris adultes (mâles et femelles) sur un période de 5 ans. Nous avons optimisé les protocoles afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. De plus, ce chiffre comprend le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires (pilotes), afin de 1) déterminer les conditions optimales lors des tâches comportementales de conditionnement et 2) mettre en place de nouvelles techniques, ce qui permettra de diminuer la quantité d’animaux utilisés à long terme. Les animaux mâles et femelles seront utilisés pour toutes les expériences. L'analyse des données se fera en tenant compte du sexe car dans de nombreux cas le niveau basal dans les tâches comportementales est différent. Ceci nous permettra d'utiliser toutes les souris générées.

Raffinement

Enfin, en vue du raffinement des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Le manque d’interactions sociales pour les expériences ou les souris sont stabulées individuellement est compensé par un enrichissement des cages avec des cylindres de coton permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation. En outre, les cages, transparentes, sont rapprochées les unes des autres afin que chaque animal puisse avoir un contact visuel avec ses congénères. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, pour les procédures impliquant une neurochirurgie, un protocole d’anesthésie et d’analgésie péri-opératoire est en place afin de garantir la bonne prise en charge de nos animaux. La santé des animaux sera surveillée tout au long de l'expérience et évaluée grâce à une grille codifiant le niveau de bien être. Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée si un premier signe de souffrance est détecté.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés (la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement) et dont la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical. Toutes les souris C57Bl6/j arriveront dans notre animalerie expérimentale à l’âge de 11 semaines. Les souris transgéniques seront élevées dans notre animalerie. Les procédures expérimentales débuteront après 1 semaine d’habituation. Il est admis qu’à 12 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris ne seront plus utilisées au delà de 10 mois.