Souris
Immunisation de rongeurs en vue du développement d’anticorps monoclonaux.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 120
600 rongeurs, 480 souris et 120 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 420 tués à l'issue et 180 réutilisés. Ils reçoivent plusieurs injections d'un immunogène émulsionné avec l'adjuvant de Freund, puis un rappel sous anesthésie, avant d'être tués pour prélever leur rate et récupérer les anticorps. Le porteur indique que les bons répondeurs sont tués tandis que les mauvais répondeurs sont tués ou versés à un programme de formation. Il affirme le recours aux rongeurs "indispensable" et le prélèvement d'organes possible seulement sur un "organisme entier".
Objectifs
Depuis les années 1980, les anticorps monoclonaux ont profondément modifié la thérapeutique dans un grand nombre de pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Bien que le développement des anticorps monoclonaux soit un processus complexe, et que certains d'entre eux peuvent entraîner des effets indésirables préoccupants, leur apport dans l'arsenal thérapeutique est majeur. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Après immunisation de l’animal, l’objectif est de récupérer les cellules B productrices d’anticorps (spécifiques de l’immunogène) pour générer des lignées monoclonales d’hybridomes sécrétant les anticorps d’intérêt. Une phase dite de « tolérisation » où le système immunitaire de l’animal sera rendu tolérant pour les antigènes « non-d’intérêt » pourra être réalisée par l’ajout d’une drogue immunosuppressive. L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps monoclonaux contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Les immunisations seront réalisées par voie intrapéritonéale dans un premier temps et par voie intrapéritonéale chez la souris ou intraveineuse chez le rat (stimulation forte des lymphocytes, qualifié de boost final). Le volume administré sera choisi en respectant les volumes maximaux d’administration chez la souris et le rat. Des prélèvements de sang pourront être réalisés à la veine sub-mandibulaire afin de suivre le niveau d’immunisation des souris ou la veine jugulaire chez le rat. A la fin du protocole, les prélèvements de rate et de ganglions lymphatiques seront réalisés afin de récupérer les cellules B productrices d’anticorps à la vue de la fabrication d’hybridome.
Bénéfices attendus
Les anticorps monoclonaux et leurs dérivés constituent la classe des principes actifs qui connaît le plus fort taux de développement actuel dans les domaines biotechnologique et pharmaceutique. En effet, ces anticorps sont des outils de recherche, des réactifs pour les tests d'analyses biologiques et des candidats potentiels à une utilisation thérapeutique. Ils offrent de nouvelles perspectives pour générer une réponse immunitaire protectrice et durable. Ainsi, ils sont aujourd’hui utilisés dans les traitements de cancers, de maladies inflammatoires, de migraine et plus récemment dans la lutte des formes graves de la Covid 19. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Ce présent projet a pour but d’engendrer une réponse immunitaire spécifique de l’immunogène injecté à l’animal. L’objectif principal est de récupérer les cellules B productrices d’anticorps (spécifiques de l’immunogène) pour générer des lignées monoclonales d’hybridomes sécrétant les anticorps d’intérêt.
Procédures
Pour la génération d’anticorps monoclonaux chez la souris BALB/c ou le rat Wistar, nous effectuerons deux à trois injections par voie intrapéritonéale (i.p.) à quinze jours d’intervalle puis un rappel par voie intrapéritonéale et par voie intraveineuse, trois jours avant la mise à mort. Les administrations i.p. (5-10 ml/kg) sont réalisées sur animaux vigiles en contention. Lors de la première i.p., le liquide injecté contient l’immunogène émulsionné volume à volume avec (ou sans) de l’adjuvant complet de Freund. Les injections suivantes se déroulent de la même façon mais en présence (ou non selon la nature de l’immunogène) d’adjuvant incomplet de Freund. Quinze jours plus tard, le « boost » final est réalisé par voie intrapéritonéale (ou intraveineuse chez le rat). Ce dernier est réalisé via la veine pénienne sous anesthésie gazeuse. Pour ce rappel, l’immunogène est repris uniquement dans du tampon PBS dans un volume final de 0,1mL/animal. Trois jours plus tard, les animaux seront mis à mort et la rate sera prélevée stérilement. Les ganglions lymphatiques pourront également être récupérés. Une phase dite de « tolérisation » où le système immunitaire de l’animal sera rendu tolérant pour les antigènes « non-d’intérêt » pourra être réalisée par l’administration d’une drogue immunosuppressive. Deux à quatre injections ip seraient réalisées à 14 jours d'intervalle (soit 4 injections sur 42 jours au maximum), trois jours avant le début du protocole de l'immunisation décrit ci-dessus. Chez la souris, des prélèvements de sang via la veine mandibulaire permettront de tester la présence d’anticorps spécifiques dans le sérum. Le prélèvement sera réalisé sur souris vigiles. Un prélèvement sera réalisé un jour avant l’immunisation (basal) puis 7 jours après la deuxième immunisation et 7 jours après la troisième immunisation s’il y en a une. Le volume maximal prélevé est de 0,5 mL de sang total. Chez le rat, les prélèvements se feront au même timing par ponction de la veine jugulaire au travers du muscle pectoral sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4% pour l’induction puis maintien à 2% avec un mélange 50% air / 50% O2). Le volume maximal prélevé est de 1 ml. Un prélèvement terminal de sang pourrait être demandé par le sponsor. Dans ce cas, l’animal sera anesthésié comme indiqué ci-dessus, et un volume de 1 ml pour la souris et 4ml pour le rat serait prélevé. L’animal serait ensuite mis à mort.
Impact sur les animaux
Les points limites ont été fixés sur la base de l’évaluation de signes caractéristiques de la douleur mais aucune mortalité et souffrance n’est attendue dans ce projet (Raffinement). Une grille d’évaluation clinique avec établissement d’un score sera utilisée et des mesures adaptées seront prises pour réduire ou supprimer la douleur des animaux en fonction de ce score.
Devenir
Après analyse des échantillons de sang par nos sponsors, les animaux montrant une bonne réponse immunitaire seront sélectionnés. Ces animaux seront mis à mort afin de pélever leur rate pour récupérer les anticorps monoclonaux. Après analyse des échantillons de sang par nos sponsors, les animaux montrant une mauvaise réponse immunitaire ne seront pas sélectionnés. Ces animaux seront soit mis à mort ou gardés en vie pour être réhabilité dans un programme de formation.
Remplacement
L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps monoclonaux contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Ces développements nécessitent l’utilisation d’animaux. En effet, ces tests doivent être réalisés sur un organisme entier afin de prélever les organes tels que la rate où sont retrouvés les cellules excrétrices d’anticorps.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est une estimation des projets à venir et a été déterminé par un calcul de N = 10 animaux par série expérimentale. Ce nombre est suffisant pour générer les anticorps par la technique d’hybridomes.
Raffinement
L'acclimatation des animaux durera au minimum 5 jours. À réception, les souris seront collectivement hébergées (au minimum 3 souris par cage selon le poids) dans des cages dédiées de dimensions conformes aux recommandations en vigueur. Les rats seront hébergés par deux dans des cages dédiées de dimensions conformes aux recommandations en vigueur. L'eau et la nourriture (RM1, SDS Dietex, ou équivalent) seront données ad libitum. Les animaux auront accès à différents types d’enrichissements, changés de manière hebdomadaire afin d’éviter une éventuelle lassitude ou habituation (maison, coton, cubes de bois, rouleaux de carton, papier kraft). Les conditions d’hébergement et le bon état de santé́ des animaux seront contrôlés quotidiennement. Bien que aucune douleur ne soit attendue si les animaux venaient à présenter des signes de souffrance, des administrations de buprénophine seront réalisées jusqu'aux prélèvements terminaux. La buprénorphine serait administrée par voie sous cutanée, BID, à 0,01 mg/kg pour le rat et 0,05 mg/kg pour la souris. Pour les injections i.v., une anesthésie gazeuse à l'isoflurane sera utilisée.
Choix des espèces
Pour de nouvelles cibles antigéniques, l’utilisation d’animaux pour l’immunisation et la génération d’hybridomes reste nécessaire car aucun modèle in silico (modèle mathématique, analyse bio-informatique) ne permet à l’heure actuelle de recréer la réponse du système immunitaire de l’animal en présence d’un antigène. Les nouveaux modèles de génération d’anticorps monoclonaux (utilisation de souris transgéniques « xenomouse » produisant des anticorps humains ou immunisation in vitro de lymphocytes B de souris) ne permettent pas de s’affranchir également de l’utilisation des animaux. La maturité sexuelle des souris et des rats se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes d’immunisation. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite. Les souris BALB/c ou les rats Wistar seront donc âgées de 8 à 10 semaines lors du démarrage du protocole d’immunisation.
Utilisation d’animaux à des fins de production réglementée pour la production de sérums rongeurs utilisés comme réactifs par les laboratoires dans le cadre de contrôles in vitro au moyen de procédures de classe de gravité légère.
- Production de routine
- Tests réglementaires
Rats : 150
Cochons d'Inde : 200
Hamsters dorés : 200
1 150 animaux non-humains, 600 souris, 150 rats, 200 cobayes et 200 hamsters dorés, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère. Chacun reçoit l'injection d'un agent infectieux puis subit des prélèvements sanguins répétés, jusqu'à un prélèvement terminal, pour produire des sérums servant de réactifs aux contrôles de lots pharmaceutiques. Le porteur présente cette production comme un moyen de limiter le nombre d'animaux utilisés dans les contrôles qualité. Il affirme la production de sérums "irréalisable" in vitro, sans détailler les alternatives explorées.
Objectifs
Ce projet a pour objectifs : - la production de réactifs sériques (anticorps polyclonaux) nécessaires aux laboratoires pour effectuer et valider les tests in vitro, et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés dans les procédures de contrôles qualité ayant pour but la libération d’un lot pharmaceutique. Ces tests sont effectués sur espèces rongeurs, il n’existe actuellement pas de modèle in vitro alternatif. - être en adéquation avec les exigences réglementaires du dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM).
Bénéfices attendus
Ces tests permettent la réalisation des contrôles in vitro réalisés dans les laboratoires. Ceci permet la libération de vaccins qui protègent efficacement les animaux contre les maladies infectieuses, améliorent directement la qualité sanitaire des élevages et assurent un meilleur bien-être animal en favorisant les méthodes alternatives.
Procédures
Une période d’acclimatation de 2 jours minimum est requise pour les rongeurs. Les modes opératoires débutent par l’administration du produit à J0. Il y a ensuite une phase d’observation quotidienne avec éventuellement jusqu’à 8 rappels en fonction des techniques qui sont appliquées. Des prélèvements sanguins intermédiaires sont réalisés pour vérifier le taux d’anticorps et un prélèvement sanguin final est effectué. La principale substance injectée pour ces tests est : la souche de l’agent infectieux Le volume injecté dépend de l’espèce et de l’âge des animaux.
Impact sur les animaux
Aucun dommage n’est attendu, un léger stress lié aux manipulations et injection des souches peut apparaître. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé et compétent. Ces tests garantissent la qualité du produit pour les animaux et leur environnement.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés
Remplacement
La production de sérums est actuellement irréalisable sur un modèle In vitro. Il faut passer par le modèle in vivo. Les sérums produits entrent ensuite comme réactifs dans les contrôles in vitro réalisés permettant la libération d’un lot.
Réduction
le nombre d’animaux est fixé par les laboratoires en fonction de leurs besoins et du type de réactifs nécessaire. Il n’est actuellement pas possible de le réduire.
Raffinement
Dans ce projet, aucune souffrance ou stress significatif est attendu. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Tous les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements du milieu ont été mis en place dans les hébergements. Les conditions d’hébergement varient en fonction de l’espèce et de l’âge des animaux pour maximiser leur confort. Des copeaux pressés sont disposés dans la cage, et un igloo ou hutte transparente colorée pour les souris, hamsters et les rats sont ajoutés, ainsi qu’une hutte transparente colorée pour les cobayes. Du foin irradié est fourni aux cobayes et des briquettes végétales et bonny bloc à ronger sont ajoutées aux rats.La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Les réactifs produits sont spécifiques et liés à l’espèce. Rongeurs : 4 à 10 semaines
Rôle de l’environnement parental précoce sur le développement émotionnel et comportemental de rongeurs monogames et polygames
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Autres rongeurs : 250
500 rongeurs, 250 souris domestiques et 250 souris glaneuses, vont être utilisés et tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Aucun acte invasif n'est prévu, seulement des mesures comportementales et de la thermographie infrarouge pour comparer le développement émotionnel des jeunes selon un environnement parental monogame ou polygame. Les couples reproducteurs sont maintenus vivants le temps des tests successifs, puis les parents comme les jeunes sont mis à mort après le sevrage. Le porteur affirme que ces conséquences comportementales ne peuvent être évaluées autrement que sur des animaux, sans autre justification du choix.
Objectifs
La monogamie est rare chez les mammifères, mais existe chez quelques espèces de rongeurs, dont la souris glaneuse. Chez cette espèce, si les unités familiales biparentales sont les plus fréquentes, il n’est pas exceptionnel de trouver dans la nature des unités familiales composées de 2 voire 3 femelles et 1 mâle. Cette structure familiale polygame a un fort impact sur le succès reproducteur des femelles, qui auront moins de jeunes par portée et des portées plus espacées dans le temps comparativement à des femelles vivant seules avec un mâle. Par ailleurs, chez cette même espèce, le mâle s'impliquant fortement dans les soins parentaux, son départ ou sa mort constituent une perte en terme de soins aux jeunes difficilement compensable par la femelle. Chez les rongeurs polygames tels que la souris domestique, la structure familiale la plus commune dans le milieu naturel est composée d'un mâle adulte et de plusieurs femelles apparentées ou non, celles-ci contribuant à l’élevage des différents jeunes naissant au sein du groupe familial. Chez cette espèce, les soins paternels sont généralement peu intenses. Ces différentes structures familiales dans lesquelles naissent les jeunes mammifères constituent une diversité d’environnements précoces dont les conséquences sur le développement émotionnel et comportemental de la progéniture demeurent mal comprises. L'objectif de notre projet est d'en évaluer les effets sur les profils émotionnels de la progéniture. Ces profils seront caractérisés par une série de tests effectués à différents âges où des paramètres comportementaux constitueront la base de cette caractérisation. Ceux-ci seront toutefois complétés par des mesures physiologiques non invasives par l'emploi de la thermographie infrarouge. Les tests comportementaux seront répétés afin d'évaluer la stabilité des caractéristiques émotionnelles des animaux.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont d'apporter des informations d'une part sur les conséquences d'une monogamie contrariée chez les espèces monogames, du fait par exemple de la mort du partenaire, et d'autre part sur les conséquences d'une polygynie contrariée chez les espèces polygames, du fait par exemple de la non disponibilité de multiples partenaires lorsques les conditions écologiques dans lesquelles ces animaux évoluent se trouvent perturbées. Un autre bénéfice attendu est d'apporter des informations sur les traits émotionnels des rongeurs, et en quoi leur environnement précoce peut affecter ces traits. Une meilleure connaissance des caractéristiques émotionnelles de ces animaux peut notamment apporter des informations pertinentes relatives à l'appréciation de leur bien-être.
Procédures
Les animaux ne seront soumis à aucun traitement invasif. Seules des mesures comportementales seront effectuées et des mesures non invasives de réponses émotionnelles par thermographie infrarouge.
Impact sur les animaux
Aucun acte invasif n'est prévu dans le cadre de ce projet. Les effets indésirables pouvant survenir sont ceux que l'on peut occasionnellement observer ches les rongeurs hébergés en animalerie (apathie, stéréotypie, ou intolérance sociale). Des enrichissements continus (tubes de carton, barres de bois, nids) sont prévus pour palier à ces nuisances.
Devenir
Procédure 1: Les unités parentales (140 individus - 70 par espèce) sont maintenues jusqu’à la procédure n°3, où les jeunes individus sont alors sevrés. Les jeunes individus issus de la reproduction de ces unités parentales (360 individus – 180 par espèce) sont maintenus en vie pour être testés dans les procédures suivantes. Le projet portant sur les conséquences de l'environnement parental précoce sur développement comportemental et émotionnel des individus ceux-ci doivent être maintenus vivantpour les différentes procédures où les animaux sont testés à des âges différents. Procédure 2: idem. Les parents sont maintenus avec leurs jeunes, ces derniers ont alors 8 à 10 jours. Procédure 3: Après la reproduction et le sevrage de leurs jeunes, les animaux constituant les unités parentales seront mis à mort (140 individus - 70 par espèce). Les femelles potentiellement gestantes une seconde fois sont isolées des mâles, et mises à mort ainsi que leurs jeunes lorsque ces derniers atteignent l’âge du sevrage. Les jeunes sevrés sont conservés en vie pour les procédures suivantes (360 individus - 180 par espèce). Procédure 4: Tous les animaux testés ici sont maintenus en vie (360 individus – 180 par espèce). Ils serviront de sujets pour les procédures suivantes. Des études corrélationnelles sont prévues afin de relier les profils obtenus par ces individus lors de cette procédure et les profils comportementaux identifiés dans les autres procédures. Procédure 5: Tous les animaux testés ici sont maintenus en vie (360 individus – 180 par espèce). Ils serviront de sujets pour la procédure suivante. Des études corrélationnelles sont prévues afin de relier les profils obtenus par ces individus lors de cette procédure et les profils comportementaux identifiés dans les autres procédures. Procédure 6: Sur les 360 individus, 120 individus (60 au sein de chacune des deux espèces) seront utilisés dans cette procédure, les autres seront mis à mort dès que leurs congénères seront mis en couple reproducteur. A l'issue de cette procédure, ces 120 individus seront eux aussi mis à mort. Les individus mis en couple s'étant reproduits seront mis à mort ainsi que leur jeunes après leur sevrage.
Remplacement
Les conséquences des l’environnement parental précoce sur le développement des caractéristiques comportementales et émotionnelles des individus ne peuvent être évaluées par d’autres moyens que ceux où l’utilisation d’animaux est requise.
Réduction
Le projet sera mené sur deux espèces distinctes: l'une monogame, la souris glaneuse, l'autre polygame, la souris domestique. Trois conditions parentales seront testées pour chacune d’elles : la monoparentalité (la femelle élève seule ses jeunes), la bi-parentalité (le mâle et la femelle élèvent le jeunes), la pluriparentalité (2 femelles et un mâle élèvent les jeunes). Une dizaine d'unités parentales par condition sont nécessaires afin d'obtenir une représentativité acceptable des conditions parentales testées. Pour chacune des deux espèces, cette trentaine d'unités parentales (10 mono-, 10 bi-, 10 pluri-parentales, soit 70 individus au total par espèce) produira un nombre moyen estimé de 6 jeunes par portée. Sur cette base, 70 individus parents produiront 180 souris glaneuses et 70 individus parents produiront 180 souris domestiques, soit un total de 500 animaux seront utilisées pour la globalité du projet. Ce projet est une étude longitudinale. Les différentes caractéristiques émotionnelles, sont évaluées sur les mêmes individus permettant ainsi de relier ces caractéristiques les unes aux autres, mais également de réduire considérablement le nombre d’individu testés si celles-ci devaient être évaluées indépendamment.
Raffinement
Des enrichissements environnementaux (matériels de construction de nid, rondins de bois à ronger) seront constamment fournis aux animaux, et un système de surveillance vidéo placé au dessus des cages pour notamment quantifier les comportements parentaux sans perturbations externes et permettra également de veiller à l'absence d'agressions au sein des cages. Tous les transferts des animaux d'une cage à une autre ou à un dispositif de test se feront sans manipulation directe mais par l'emploi d'une petite boite dans laquelle l'animal sera incité à entrer. Les différents tests auxquels seront soumis les animaux seront brefs (10 minutes maximum), et non invasifs. Ces tests laissent généralement aux sujets la possibilité d’adopter une solution comportementale qui leur convient. C’est cette solution comportementale adoptée par l’animal qui constitue généralement la mesure expérimentale qui nous intéresse.
Choix des espèces
La souris glaneuse Mus spicilegus est une espèce monogame et la souris domestique Mus musculus domesticus est une espèce polygame. L'objectif de l'étude étant d'évaluer les conséquences du milieu parental et des soins parentaux sur le comportement et les profils émotionnels de la progéniture, et l'une de nos hypothèses étant que les environnements parentaux ont des effets différents selon que l'espèce soit monogame ou polygame, nous avons choisi deux espèces de rongeurs relativement voisines au système d'appariement différent. L'objectif du projet étant d'évaluer les conséquences des conditions de vie précoce des animaux sur leurs profils comportementaux, les indivdus seront testés tout au cours de leur développement: - des tests précoces, avant le sevrage, auront pour objectif d'évaluer la nature sécurisante que constitue l'environement parental. Les premiers tests auront lieu quand les animaux auront 9-10 jours, où les vocalisations ultrasonores des animaux lors de la séparation seront quantifiées. Des tests de ce type plus tardifs risquent de compromettre les productions ultrasonoes caractéristiques des jeunes souriceaux. A l'âge de 19 jours, les animaux seront testés selon un protocole différent, où les réponses comportementales à un situtation anxiogène seront évaluées en présence et en absence de membres de 'lunité parentale. Ces tests seront brefs et les animaux rejoindront leur unité parentale aussitôt après le test effectué. - des tests après le sevrage jusqu'à la maturité sexuelle seront éffectués pour évaluer les profils émotionnels des individus. - des tests sociaux de rencontre avec un congénère étranger de même sexe et de sexe opposé, et une évaluation des comportements reproducteurs seront effectués chez les ainmaux ayant atteint l'âge adulte (80-90 jours).
Dérégulations Précoces pour Expliquer la Prédisposition aux Cancers dans le Syndrome de Li-Fraumeni
- Recherche fondamentale
- Oncologie
15 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Porteuses de mutations du gène TP53 qui prédisposent aux cancers, elles ne subissent pas d'intervention mais sont suivies puis tuées avant six mois pour analyse post-mortem de leurs organes, toute suspicion de tumeur entraînant une mise à mort anticipée. Le porteur étudie le syndrome de Li-Fraumeni et vise des biomarqueurs ou des cibles thérapeutiques transposables en clinique. Il affirme avoir d'abord travaillé sur des modèles cellulaires mais juge le modèle murin "irremplaçable" pour analyser plusieurs organes.
Objectifs
Le syndrome de Li-Fraumeni (LFS) est une maladie autosomale dominante de prédisposition aux cancers multiples dès le plus jeune âge, portée par des mutations germinales du gène tumeur suppresseur TP53. La prévalence des mutations de TP53 dans la population générale est estimée à 1/5000. Nos recherches utilisant des lignées de fibroblastes (non cancéreuses) de patients atteint de LFS, ont déterminé que les mutations de TP53 engendrent des défauts transcriptionnels et métaboliques, qui pourraient être à l'origine de la prédisposition aux cancers. Nous souhaitons maintenant aller plus loin et transposer nos résultats dans des contextes physiologiques, afin de cartographier les dérégulations transcriptionnelles et métaboliques qui ont lieu dans de nombreux organes murins, dont ceux qui sont susceptibles au développement de cancers.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra, grâce aux modèles murins, de mieux caractériser les perturbations moléculaires qui prédisposent à l'apparition de cancers dans le syndrome de Li-Fraumeni. Les perspectives de ce travail sont de transposer nos découvertes en clinique pour une utilisation de type biomarqueur ou cible thérapeutique.
Procédures
Nous ne prévoyons pas d'interventions sur nos animaux pour ce projet.
Impact sur les animaux
Les lignées murines du LFS (R270H et R172H) présentent une médiane de survie de 16 mois, et peuvent développer différents cancers au cours de leur vie. L’âge auquel peuvent apparaître les cancers n'est pas bien documenté. Notre projet vise à étudier des souris de la colonie à un âge inférieur à 6 mois, afin de limiter au maximum l'apparition de cancers et des douleurs associées. Un suivi strict des souris sera mis en place (voir points limites) et toute suspicion de développement rapide de tumeurs entraînera l'euthanasie de l'animal. Une analyse rétrospective de ces 2 modèles murins sera menée afin de raffiner le modèle et d'étendre les connaissances concernant l'âge auquel les cancers se développent dans différents organes.
Devenir
Tous les animaux sont sacrifiés à la fin de la procédure pour analyse post-mortem (récolte d'organe, histologie et analyses moléculaires).
Remplacement
REMPLACEMENT : nous avons réalisé en amont les expériences sur des modèles cellulaires pour éviter d'utiliser l'animal, mais à ce stade de nos recherches nous ne pouvons pas nous en passer car aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle murin pour analyser les différents organes et la physiologie des individus porteurs du LFS.
Réduction
REDUCTION : Nous avons réalisé un design d'élevage et d'expérimentation qui utilise juste le bon nombre de souris, et nous plafonnons le nombre d'animaux grâce à la multiplication des tests/analyses sur un seul animal.
Raffinement
RAFFINEMENT : Nous tenons compte des meilleures conditions d'hébergement pour nos modèles murins et nous veillerons au bien-être animal de nos souris. Pour se faire, nous utilisons des points limites spécifiques et des critères d'arrêt de souffrance.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l’homme, notamment dans le cadre d’études visant à comprendre le développement de cancers, avant d’entreprendre des études cliniques chez l’humain. De plus, la majeure partie des études expérimentales sur l'étude du LFS utilisent les modèles murins, ce qui permettra une comparaison et confrontation des résultats obtenus avec la littérature. Les modèles d'études murins de LFS R270H et R172H sont admis par la communauté scientifique et sont disponibles chez Jax. Leur phénotype a été initialement décrit dans Mutant p53 Gain of Function in Two Mouse Models of Li-Fraumeni Syndrome (Olive et al, Cell, 2004). Ces modèles de souris ont une faible mortalité dans les 10 premiers mois de la vie, ainsi qu'une faible pénétrance de cancers. Le but de notre étude étant d'étudier les tissus sains, avant qu'ils ne développent de cancers, nous n'excéderons pas un âge de 6 mois pour l'étude de ces souris. Les animaux seront sacrifiés à 1 mois, 3 mois et 6 mois. En effet, nous souhaitons étudier différents organes sains, chez des animaux qui n'ont pas encore développés de tumeurs, afin de mesurer les effets délétères de la mutation germinale de TP53, qui pourraient prédisposer au développement de cancers au cours de la vie.
Etude de la physiopathologie des infections aspergillaires au cours de la BPCO
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au sévère, 232 relevant de la gravité la plus élevée. Exposées douze semaines à la fumée de cigarette pour reproduire une bronchopneumopathie chronique, elles sont infectées par le champignon Aspergillus fumigatus par voie intranasale, puis subissent un prélèvement de sang rétro-orbital avant d'être tuées pour prélever poumons, rate, cœur et cerveau. Le porteur vise l'identification de marqueurs précoces d'une infection au pronostic sombre chez les patients atteints de BPCO. Il affirme que la complexité de la réaction de l'hôte rend un modèle in vivo "nécessaire".
Objectifs
L’objectif de notre projet est d’étudier les mécanismes impliqués dans les aspergilloses invasives (AI) au cours de la BPCO. En effet, ces infections ont une incidence de 1,6-3,9%, surviennent principalement chez des patients BPCO traités par corticothérapie systémique, et sont associées à une mortalité élevée (72-100%). Cependant, peu de données sont disponibles sur la physiopathologie des AI au cours de la BPCO. L’exposition à la fumée de cigarettes et les infections aspergillaires se traduisent par une inflammation pulmonaire et le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires. Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de facteurs et de structures de l’hôte qui ne peuvent être reproduites in vitro, de même que la production de biomarqueurs pulmonaires et sanguins associés aux infections aspergillaires. C’est pourquoi l’utilisation d’un modèle in vivo est nécessaire.
Bénéfices attendus
Ce travail devrait permettre de mieux comprendre la contribution des macrophages au défaut de réponse anti-Aspergillus au cours de la BPCO et d’identifier des marqueurs précoces afin d’améliorer la prise en charge diagnostique, thérapeutique et le pronostic de ces infections.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux vigiles sont : - L’inoculation intra-nasale de conidies d’A. fumigatus : n=1, durée environ 10 min (temps d’anesthésie par injection IP de xylazine/kétamine inclus) - La réalisation de prélèvements sanguins par voie rétro-orbitale : n=1, durée environ 10 min (temps d’anesthésie par injection IP de xylazine/kétamine inclus)
Impact sur les animaux
- Inoculation intra-nasale de conidies d’A. fumigatus : accélération transitoire du rythme respiratoire (le retour à la normale après quelques minutes sera vérifié). - Prélèvement sanguin par voie rétro-orbitale : ce prélèvement étant réalisé sous anesthésie, juste avant euthanasie des animaux, aucun effet indésirable ayant un impact durable n’est attendu.
Devenir
Une mise à mort étant nécessaire pour permettre le recueil des échantillons utilisés pour la réalisation des analyses (poumons, rate, coeur, cerveau, LBA, sang par ponction intra-cardiaque), elle sera réalisée pour l'ensemble des animaux.
Remplacement
L’exposition à la fumée de cigarettes et les infections aspergillaires se traduisent par une inflammation pulmonaire et le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires. Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de facteurs et de structures de l’hôte qui ne peuvent être reproduites in vitro, de même que la production de biomarqueurs pulmonaires et sanguins associés aux infections aspergillaires.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque expérience, et le nombre de réplicats (n=2) sont réduits à leur minimum tout en permettant d’atteindre une puissance statistique significative dans l’analyse de nos paramètres, notamment de la mortalité, ainsi que des charges fongiques pulmonaires et cardiaques.
Raffinement
Les conditions d'hébergement (notamment l’enrichissement des cages par ajout d’abri en carton et papier de nidification) et de réalisation des expériences (anesthésie lors de l’inoculation intra-nasale des conidies, de l’évaluation de la fonction pulmonaire, de la réalisation de prélèvements sanguins ; établissement de points limites et mise à mort en cas de dépassement de ces points) permettront de réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux.
Choix des espèces
L’étude des pathologies pulmonaires est facilitée chez la souris du fait de la grande disponibilité des outils d’exploitation et d’analyse, ce dont les autres espèces sont dépourvues. La BPCO touche majoritairement les adultes, très peu les populations jeunes ou les enfants, nous utiliserons donc des animaux adultes. Les souris commencent à être exposées à la fumée de cigarettes à partir de 7-8 semaines d’âge. Le protocole d’exposition à la fumée de cigarettes est de 12 semaines, afin de reproduire une inflammation pulmonaire chronique associée à une altération fonctionnelle pulmonaire. Les souris sont donc infectées par A. fumigatus à l’âge de 19-20 semaines.
Acquisition de gestes de base pour la manipulation de la souris dans le cadre de l’enseignement du BUT Génie Biologique parcours BMB en IUT
- Enseignement supérieur
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris vigile est utilisée par des étudiants de première année pour s'exercer à une injection intrapéritonéale, avec jusqu'à trois tentatives par animal, puis elle est mise à mort au CO2 faute de pouvoir être gardée entre deux semestres. Le porteur reconnaît qu'un geste mal exécuté peut provoquer une douleur. Il affirme cet apprentissage "indispensable" et juge la souris le modèle le plus pertinent, sans envisager d'alternative.
Objectifs
L'objectif du projet est l'acquisition des gestes de base sur la souris de laboratoire à des étudiants en 1ère année du BUT Génie Biologique.
Bénéfices attendus
Pour les étudiants, le projet permet l'apprentissage de gestes techniques de base sur la souris. Cet apprentissage est indispensable pour appréhender les travaux pratiques de physiologie animale / pharmacologie / toxicologie au cours des semestres suivants.
Procédures
Chaque souris vigile sera: - sortie de sa cage d'hébergement - maintenue dans le respect du bien-être animal, afin d'éviter tout stress - injectée avec 0,1 mL d'une solution de NaCl 0,9% en intra-péritonéal dans le quart inférieur droit, avec les gestes permettant de limiter tout stress ou toute douleur à l'animal. A la fin de la séance (environ 20 minutes), les souris sont remises en cage.
Impact sur les animaux
Etant donné qu'il s'agit de la première expérience des étudiants sur la souris vigile, un stress peut être ressenti par la souris. Une douleur peut être induite en cas de geste mal effectué lors de l'injection intra-péritonéale. Les formatrices qualifiées seront vigilantes afin de permettre au maximum la réalisation d'un geste correct. Le nombre de tentatives sera limité à trois pour chaque souris.
Devenir
Mise à mort par inhalation de CO2 avec un automate. Etant établissement d'enseignement, les souris ne peuvent pas être gardées dans l'attente d'un prochain projet utilisant les souris (enseignement semectrialisé).
Remplacement
Le modèle souris est le plus fréquemment utilisé comme animal de laboratoire. Dans le cadre de la formation BUT Génie Biologique parcours Biologie Médicale et Biotechnologie, ce modèle nous semble le plus pertinent, afin de former les étudiants aux gestes de bases de la manipulation sur animal. Donc, il nous semble difficile de remplacer la souris par un autre modèle.
Réduction
Pour la formation de nos 80 étudiants, seules 48 souris seront utilisées. Le nombre total d'animaux a été réduit à son maximum soit 3 lots de 16 souris. Quatorze étudiants + 2 formatrices = 16 souris. Ces trois lots seront utilisés à deux reprises, en prenant soin d'avoir un temps de récupération suffisant pour l'animal, entre deux manipulations.
Raffinement
Les souris sont hébergées par groupe, dans des cages avec enrichissement modifiable (rouleau de papier, feuilles de papier ouaté)
Choix des espèces
Le modèle souris est le plus fréquemment utilisé comme animal de laboratoire. Dans le cadre de la formation BUT Génie Biologique parcours Biologie Médicale et Biotechnologie, ce modèle nous semble le plus pertinent, afin de former les étudiants aux gestes de bases de la manipulation sur animal. Souris adultes, poids moyen 30 grammes
Etude de la réponse inflammatoire dans les modèles d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
6 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au sévère, 1 200 relevant de la gravité la plus élevée. Toutes subissent une biopsie de queue pour génotypage, une partie recevant des injections intracérébrales, la pose d'une fenêtre crânienne ou des injections dans la cisterna magna, avant une perfusion intracardiaque terminale pour prélever le cerveau. Le porteur suit la douleur au moyen d'une grille d'expressions faciales et administre buprénorphine et kétoprofène. Il affirme que la réaction inflammatoire de la maladie d'Alzheimer ne peut s'étudier que dans un "organisme entier", les cultures d'organoïdes ne la reproduisant pas.
Objectifs
Les études d’analyse génomique concernant la maladie d’Alzheimer montrent l’influence de gènes intervenant dans la réponse immunitaire notamment ceux exprimés dans les cellules de la microglie. Afin de suivre cette réponse inflammatoire durant l’évolution de la maladie nous allons utiliser une souris reportrice HexdtTomato. Chez cette souris les cellules de la microglie expriment une protéine fluorescente (dtTomato) sous le contrôle de la sous-unité bêta du gène hexominidase (Hexb) facilitant la localisation et le suivie de ces cellules in vivo et ex vivo. Nous allons utiliser cette souris dans nos modèles de la maladie d’Alzheimer. Ainsi nous allons déterminer l’influence de 2 gènes d'intéret dans la réponse inflammatoire dans le modèle de souris APPSwe/Ind. La souris APP Swe/Ind exprime une forme humaine de la protéine APP (Amyloid Precusor Protein) porteuse de la mutation humaine Swedish/Indiana. Cette souris développe des plaques amyloïdes à partir de 8 mois. Nous travaillerons sur des animaux âgés de 2 à 4 mois et de 10-11 mois. Nous voulons déterminer comment évoluent les cellules de la microglie à des temps précoces de la maladie (2-4 mois) et à des temps où la maladie est installée soit 10-11 mois. Ainsi on pourra définir les rôles de nos deux gènes d’intérêt dans l’évolution de la réaction inflammatoire au sein du modèle APP Swe/Ind.
Bénéfices attendus
La mise en œuvre de ce projet provient des résultats des analyses génétiques réalisées sur des malades de la maladie d’Alzheimer. En effet de nombreux gènes liés au système immunitaire ont été retrouvés tel que Trem2. En travaillant sur 2 temps, on peut voir comment la réaction inflammatoire évolue aux cours du développement de la maladie d’Alzheimer. La réalisation de ce projet nous permettra de caractériser les différents types de microglie et nous permettra de définir la « bonne microglie » qui favoriserait la clairance et la dégradation des plaques amyloïdes.
Procédures
En vue du génotypage des animaux, ces derniers doivent subir une biopsie de queue qui se fait sous anesthésie. Nombre 6900 fréquence une fois. Sur des animaux vigiles, nous effectuons des injections intrapéritonéales (nombre 600, fréquence 5, une fois par jour), intranasales ( nombre 800, fréquence 5 fois, une fois par jour ), intraveineuses ( nombre 800 fréquence une fois) et des gavages (nombre 600 fréquence une fois par jour pendant 30 jours ou une fois par jour pendant une semaine). Sur des animaux anesthésies avec un suivi postopératoire nous réalisons des injections intracérébrales (nombre 600 une fois Injection), injection dans la cisterna magna (nombre 200 une fois) et la pose d’une fenêtre crânienne (nombre 400 une fois). Sur des animaux anesthésiés nous les sacrifions après une perfusion intracardiaque (nombre 6900 une fois).
Impact sur les animaux
Les animaux sont suivis régulièrement. Les effets indésirables dans ce projet sont essentiellement pour les procédures qui impliquent un acte chirurgical soit les procédures 6-7-9. Un tableau de « scoring » a été établi pour suivre les animaux (tableau joint). La durée maximale avant le sacrifice est de 7 jours dans le cas de la procédure 7. La phase post opératoire est la suivante: - lors de la phase de réveil, l’animal est placé dans une cage sur du papier propre afin d’éviter des contacts entre la sciure et la suture, et sous une lampe chauffante pour éviter toute hypothermie due à l’anesthésie. Pour la réhydratation de l’animal on injecte du NaCl 0.9% glucosé à 5% (500µl). - lors du réveil, les animaux reviennent dans la salle d’hébergement. Des observations fréquentes sont réalisées (2 fois par jour sur une semaine) pour vérifier l’état de la suture. Pour réduire la douleur due à certaines procédures chirurgicales nous utilisons BUPREMORPHINE (0.1MG/KG, SC 100µL) ET KETOPROFENE (5MG/KG, SC 100µL) DEUX FOIS PAR JOUR DURANT 2 JOURS. Les animaux reçoivent une nourriture humide et du Diet Boost gel pour récupérer son poids initial. -Si la perte de poids de l’animal dépasse 15% il est euthanasié. Si les animaux présentent une activité absente, une immobilité et des déplacements difficiles dans les 24 heures postopératoire, l’animal est sacrifié.
Devenir
L'ensemble de nos procédures se terminent par le sacrifice des animaux et par la réalisation de la procédure 8. En effet nous devons prélever le cerveau ce qui implique le sacrifice de l'animal pour déterminer le nombre de plaques amyloïdes, réaliser des dosages d'Abeta42, suivre l'activité de certaines enzymes intervenant dans le métabolisme de la protéine précurseur de l'amyloïde (APP).
Remplacement
Les études d'analyse génomique concernant la maladie d'Alzheimer montrent l'influence de gène intervenant dans la réponse immune notamment les cellules de la microglie. Le développement de la maladie d'Alzheimer est accompagnée d'une réponse inflammatoire. Cette réponse ne peut se faire qu'au sein d'un organisme entier de l'animal. Les techniques de culture d’organoïdes in vitro ne nous permettent pas de suivre le développement d’une réaction inflammatoire lors du développement de la maladie d’Alzheimer. Mais l'utilisation d'une souris reportrice HexbdtTomato (sous unité beta du gène codant pour l'hexosaminidase), nous permettra de limiter le nombre de souris car les cellules de la microglie pourront être suivies grâce au gène rapporteur Tomato.
Réduction
Le nombre d’animaux inclut dans ce projet a été établi par rapport à des études précédentes que nous avons effectuées. Nous utilisons les 2 sexes afin de minimiser le nombre d’animaux. Pour réduire le nombre, nous effectuons sur un hémisphère cérébral pour les analyses immunohistologiques et sur le second les extractions d’ARNm ou de protéines. Le test d’analyse de variance (logiciel Graphpad) est le test que nous avons choisi afin de comparer les différents génotypes a été déterminé à l’aide du logiciel BiostatTGV. Nous utilisons le test Man et Whiney pour les études pilotes.
Raffinement
NOUS OBSERVONS REGULIEREMENT LES ANIMAUX. NOUS AVONS INCLUS DIFFERENTS POINTS LIMITES DANS NOS EXPERIENCES (PERTE DE POIDS, PILOERECTION, DOS ROND, HYPOACTIVITE, DEMARCHE ANORMALE). NOUS AVONS ETABLI UN TABLEAU DE SCORING (NC3R) DANS LEQUEL NOUS SUIVONS LES PARAMETRES D'EXPRESSION FACIALES SUIVANTS : CONTRACTION ORBITRAIRE, GONFLEMENT DU NEZ, DES JOUES, POSITION DES OREILLES ET DES MOUSTACHES). L'EVALUATION DE LA DOULEUR PAR LE SUIVIE DES EXPRESSIONS FACIALES A ETE UTILISE DANS LE CAS DE CRANIOTOMY (SCIENTIFIC REPORTS (2019)9:359). NOUS AVONS ETABLI UN TABLEAU OU SELON L'OBSERVATION EFFECTUEE NOUS NOTONS ZERO POUR UN CAS NORMAL,1 POUR UNE ALTERATION MODEREE ET 2 POUR UN SIGNE EVIDENT. LA SOMME DES OBSERVATION NOUS DONNERA UN SCORE QUI INDIQUERA L'ETAT DE L'ANIMAL. CONTRE LA DOULEUR, NOUS ADMINISTRONS DE LA BUPREMORPHINE (0.1MG/KG, SC 100µL) ET KETOPROFENE (5MG/KG, SC 100µL) DEUX FOIS PAR JOUR DURANT 2 JOURS. NOUS AJOUTONS DANS LES CAGES DE L’ALIMENT ET DE L’EAU EN GELEE. NOUS DEVELOPPONS DES CULTURES D’ORGANOÏDE MAIS NOUS POUVONS PAS ETUDIER L’ETABLISSEMENT DE LA REACTION INFLAMMATOIRE DANS LE DEVELOPPEMENT DE LA MALADIE D’ALZHEIMER AVEC CE TYPE DE MODELE.
Choix des espèces
Dans cette espèce différents outils génétiques existent : des souris transgéniques, KO, KI permettant de réaliser des études dans des conditions physiologiques. Nous disposons donc de modèle qui développe la maladie d'Alzheimer mais également de souris reportrice nous permettant de suivre des cellules de la microglie par l'expression d'une protéine fluorescente la protéine tomato. Ainsi en utilisant ces souris nous pouvons suivre le développement de la réaction inflammatoire lors de l'établissement de la maladie d'Alzheimer. Pour cela nous travaillerons à deux temps, un temps précoce 2-4 mois et un temps plus tardif où la maladie est installée soit 10-11 mois. Au stade 10-11 mois nous pouvons observer des plaques amyloïdes dans le cerveau des souris. Grace à la souris reportrice HexdtTomato, nous pourrons déterminer le rôle de la microglie dans la formation de ces plaques (taille, forme, ...).
Endothélium, un nouvel acteur de la neuroplasticité.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Rats : 1283
1 991 animaux non-humains, 708 souris et 1 283 rats, vont être utilisés et tués à l'issue, en majorité dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. Ils sont soumis à un exercice imposé sur tapis roulant ou à une électrostimulation musculaire, puis, sous anesthésie, à une laparotomie, une thoracotomie, un prélèvement de sang intracardiaque et une perfusion transcardiaque qui provoque leur mort, avant décapitation et prélèvement du cerveau, des muscles et des vaisseaux. Le porteur affirme n'attendre aucune nuisance hormis l'inconfort de l'exercice imposé, et vise l'endothélium comme cible thérapeutique et l'électrostimulation comme alternative à l'exercice pour les personnes peu mobiles. Il indique qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut remplacer le modèle rongeur.
Objectifs
La neuroplasticité (capacité du cerveau à moduler le nombre et l’efficacité de ses synapses) est dépendante de l’activation des récepteurs TrkB (tropomyosin related kinase B) neuronaux par le BDNF (brain-derived neurotrophic factor). Alors qu’il est bien admis que la principale source cellulaire du BDNF est le neurone, nos récents travaux supportent l’hypothèse originale selon laquelle l’endothélium serait également un acteur clé de la neuroplasticité. En effet, nous avons montré que : -l’endothélium (périphérique ou cérébral) exprimait fortement BDNF -50% du BDNF cérébral correspondait à du BDNF endothélial -la synthèse endothéliale de BDNF était corrélée positivement à la production d’oxyde nitrique(NO) et qu’il existait un feedback positif entre productions endothéliales de NO et de BDNF. Enfin, les pathologies associées à une dysfonction endothéliale, connues pour affecter négativement la santé cérébrale, réduisent l’expression endothéliale et les taux cérébraux de BDNF. A l’opposé, l’exercice physique (EX), reconnu pour induire la neuroplasticité et améliorer les capacités cognitives, les augmente. De façon intéressante, bien que peu nombreux, de récents travaux montrent que l’électromyostimulation (EMS) reproduit les effets de l’EX sur la fonction endothéliale et les taux cérébraux de BDNF. Cette analogie entre EX et EMS pourrait s’expliquer par la capacité des muscles squelettiques à sécréter une hormone: l’irisine; l’inactivation de l’irisine circulante réduisant les bénéfices cognitifs de l’EX chez la souris Alzheimer. Mais quelle est la cible cellulaire de l’irisine circulante : le neurone ? la cellule endothéliale cérébrale ? Par ailleurs, alors que nous avons récemment démontré que les effets salutaires de l’EX sur la santé cérébrale pouvaient également s’expliquer par son impact positif sur le système cardiovasculaire (voie hémodynamique), à ce jour il n’existe que peu de données sur les effets de l’EMS sur le débit sanguin cérébral (DSC). Dans ce contexte, les objectifs sont : 1) de montrer que le BDNF endothélial est un acteur clé de la neuroplasticité grâce aux caractérisations biochimique et cognitive d’une souris génétiquement modifiée incapable d’exprimer BDNF au niveau endothélial (endoBDNF-/-), 2) d’explorer la connexion existante entre irisine musculaire et BDNF endothélial, 3) d’étudier le rôle du BDNF endothélial sur la cognition 4) de connaître les effets de l’EX et l’EMS sur les paramètres cérébro-vasculaires.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à tester, d’une part, l’hypothèse selon laquelle la cellule endothéliale est une composante majeure de la neuroplasticité et, d’autre part, de comprendre comment la contraction musculaire (induite via l’EX ou l’EMS) impacte la santé cérébrale via l’étude du BDNF, de l’irisine et plus largement de la cognition. La compréhension des mécanismes impliqués nous permettrait : - De définir la cellule endothéliale comme une cible thérapeutique prometteuse aisément accessible dans la lutte contre les maladies neuro-cardio-vasculaires. En effet, l’endothélium est impliqué dans bon nombre de pathologies, soit comme déterminant physiopathologique, soit comme sujet à des dommages collatéraux. - De définir l’EMS comme une alternative au protocole d’EX chez les personnes n’ayant pas la motivation ou la capacité physique permettant de réaliser des séances régulières. Le but ultime étant de préserver et améliorer la cognition et donc la santé cérébrale.
Procédures
Tous les prélèvements effectués sur nos animaux (n=1991) se feront sous anesthésie générale (aucun prélèvement sur animal vigile). L’administration des substances pharmacologiques (Procédure 4, n=688) sera réalisée par voie injectable (Intra-péritonéale ou sous-cutanée) sur des animaux vigiles (1 seule administration/animal). L’ensemble des animaux (708 souris + 1011 rats) inclus dans les procédures 1, 2 (EMS Chronique), 4 (Point 2 –Impact de l’EX ou l’EMS sur la cognition), 5 et 6 seront soumis aux interventions suivantes : -Anesthésie générale de l’animal -Laparotomie, thoracotomie -Prélèvement intracardiaque de sang (~2 ml/rat et prélèvement des structures cérébrales ou cerveau entier -Prélèvement des muscles squelettiques (soléaires et gastrocnémiens) -Prélèvement des vaisseaux (aorte thoracique et abdominale). Concernant les animaux inclus dans les procédures 3 (32 rats) et 4 (Point 1-Impact de l’EMS sur la FC, PA et DSC, 240 rats): -Anesthésie générale -Contrôle et maintien de la température rectale à 37.5/38.5°C jusqu’à la mise à mort -Cathétérisme de la veine du pénis pour administration d’héparine et d’agents vasopresseurs si la pression artérielle est inférieure à 60 mm Hg. Cathéter mis en place en moins d’une minute. Durée entre 60 et 90 minutes. - Cathétérisme de l’artère carotide commune gauche en vue de la mesure de la PA et des prélèvements sanguins (mesure des GDS). Cathéter mis en place en moins de 10 minutes. Durée entre 60 et 90 minutes. - Intubation trachéale, mise sous respiration assistée et curarisation. Intubation mise en place en moins de 5 minutes. Durée 60 et 90 minutes. - Placement de l’animal sur l’appareil stéréotaxique - Incision du crâne et trépanation à l’aide d’un fraisage doux. Durée 5-10 minutes. - Placement de la sonde doppler sur la dure mère. Durée 5-15 minutes. - Mesure du DSC. Durée 30 minutes. - Mise à mort par décapitation => prélèvement cerveau - Laparotomie, thoracotomie => prélèvement d’organes A noter également que l’administration des substances pharmacologiques (Procédure 4, n=688) sera réalisée en subchronique par voie injectable (Intra-péritonéale ou sous-cutanée).
Impact sur les animaux
Aucune nuisance, ni effet indésirable est attendu sur nos animaux, tout au plus un inconfort lié au caractère imposé de notre protocole d’EX sur tapis roulant (procédure 1). Par ailleurs, afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, - Les actes chirurgicaux seront réalisés après prémédication à la buprénorphine (30 minutes avant induction de l’anesthésie afin d’en potentialiser ses effets) et sous anesthésie générale par du personnel statutaire qualifié et/ou par des étudiants en recherche préalablement formés. La profondeur de l’anesthésie sera contrôlée pour chaque animal afin d’éviter tout réveil pendant la chirurgie. - Les injections sous cutanées et intrapéritonéales seront réalisées avec des aiguilles 25G chez le rat et 27G chez la souris. - Le réveil des animaux anesthésiés sera réalisé en cage individuelle dans une salle de repos sous surveillance de l’expérimentateur et contrôle de la température corporelle. - Le stress des animaux dû à la nouveauté (expérimentateur, tapis roulant) sera prévenu par une phase préalable « d’habituation ». Dans la mesure du possible, les animaux d’une même expérience seront en contact avec un expérimentateur unique.
Devenir
L’intégralité des animaux inclus dans les 6 procédures seront mis à mort pour prélèvement des tissus (cerveau, muscles squelettiques, vaisseaux).
Remplacement
L’absence de méthodes substitutives (in vitro ou in silico) pour étudier : 1) l’influence des variations du flux sanguin (induites par l’EX ou l’EMS) sur la neuroplasticité et la cognition et, 2) l’étude des interactions entre les différents éléments intervenant dans la connexion muscle/cerveau, ne nous permet pas de remplacer le modèle rongeur (souris et rats).
Réduction
Une première approche nous permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés est de travailler avec des procédures standardisées - de la réception des animaux jusqu’à leur mise à mort. Ces procédures, disponibles au laboratoire sous forme de documents écrits précisant tous les détails pratiques, sont maitrisées par du personnel statutaire ; les souches d’animaux, leur âge et le nombre/groupe sont appropriés à la validation/invalidation de notre hypothèse. Par ailleurs, les expériences du projet tiennent compte des facteurs reconnus pour influencer la cognition (interaction sociale, poids corporel, prise de nourriture, cycle nycthéméral, hormones sexuelles). Une seconde approche est de soumettre les animaux d’un même groupe à 2 ou 3 procédures différentes. Concernant les analyses statistiques, nous utiliserons des tests adaptés aux petits échantillons et aux types de comparaison (multigroupes ou 2 groupes, analyses variable continue ou pas, mesures appariées ou pas). Les groupes à comparer sont déterminés avant de conduire les expériences et le nombre d’animaux inclus dans chaque groupe tient compte : - de l’obligation de réduire le nombre d’animaux utilisés - de la variabilité interindividuelle quant à la réponse des animaux - de la possibilité d’échec dans la réalisation de certains gestes chirurgicaux - de la nécessité de conduire une étude statistique de qualité Ce nombre sera raisonnablement compris entre 8 (pour la mesure des paramètres cérébro-vasculaires et les analyses biochimiques) et 16 (pour l’étude de la cognition), compromis entre limitation du nombre d’animaux et obtention d’une analyse statistique fiable.
Raffinement
Afin de raffiner au maximum notre projet, Avant l’expérimentation Les rats et souris seront respectivement hébergés au nombre de 5 et 10 par cage afin de maintenir une interaction sociale et demeureront avec les mêmes congénères tout au long des procédures afin de ne pas rompre la hiérarchie intra-cage. Afin de déceler toute souffrance physique ou psychologique conduisant à un inconfort, les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne. Par le biais d’une phase d’habituation (4/5 jours), les animaux seront entraînés à coopérer (renforcement positif) de manière à diminuer au maximum le stress de l’animal engendré par l’expérimentateur et/ou l’appareillage (tapis roulant). Pendant l’expérimentation La majorité des procédures utilisées nécessitera une anesthésie générale dont les effets seront potentialisés par une prémédication à la buprénorphine. Nos procédures seront pour la grande majorité « sans réveil », il n’en demeure pas moins qu’une vigilance particulière sera accordée aux soins pré- et per-opératoires. Nos procédures ne nécessiteront pas d’établir des points limites néanmoins, en ultime recours, nous prendrons les dispositions nécessaires afin de limiter toute souffrance animal par le biais d’une mise à mort par injection i.p. d’Euthasol. Après l’expérimentation Afin d’exploiter au mieux les résultats obtenus lors de notre expérimentation, une analyse statistique rigoureuse sera effectuée (cf point 3.3.6.2.).
Choix des espèces
Pour le Rat : -Forte analogie dans l’organisation des vaisseaux cérébraux homme/rat -Volume du cerveau et taille des vaisseaux appropriés aux techniques de dosages utilisées. Néanmoins, pour valider notre hypothèse selon laquelle l’endothélium est une source importante de BDNF cérébral, nous nous sommes orientés vers la fabrication et la caractérisation sur les plans cardiovasculaire et cérébral d’une souris génétiquement modifiée incapable de fabriquer du BDNF endothélial (endoBDNF -/-). Bien que les tailles du cerveau et des vaisseaux de souris soient plus petits, il n’en demeure pas moins que la morphologie du réseau vasculaire cérébral est hautement conservée entre rats et souris. La fabrication de la souris endoBDNF-/- a été financée par le Projet Structurant d’Envergure Région Bourgogne France Comté « BDNF cardiovasculaire et fonction cognitive » (106 364€) et sera valorisée par 3 équipes de recherche: INSERM U1093 CAPS(Dijon), EA4267 PEPITE(Besançon) et EA-481(Besançon). Les rats (Wistar) et les souris (C57BL/6J, endoBDNF-/- et littermates) seront utilisés au stade jeune adulte soit entre 7 et 9 semaines afin de s’affranchir des effets de l’âge sur le système cardiovasculaire et le système nerveux central.
Etude du rôle des macrophages dans le réveil des cellules de carcinomes mammaires dormantes chez la souris obèse
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Rendues obèses par un régime riche en graisse, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales mammaires sous anesthésie puis des injections intrapéritonéales trois à quatre fois par semaine, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs glandes mammaires. Le porteur cherche à établir le rôle des macrophages dans le réveil de tumeurs dormantes et renvoie au conditionnel de nouvelles stratégies contre la récidive du cancer du sein. Il indique recourir déjà à des cultures organotypiques mais affirme qu'elles ne reproduisent pas la complexité de l'organe.
Objectifs
Les cancers du sein sont la première cause de décès liés au cancer dans le monde occidental chez la femme. Un challenge majeur dans le traitement des cancers du sein est leur récurrence, et cela même plusieurs années après rémission. Nous savons aujourd’hui que les cellules tumorales dormantes sont responsables de la récurrence du cancer mais les facteurs impliqués dans le réveil de ces cellules tumorales sont encore méconnus. L’obésité est un facteur de risque dans le développement et la récurrence du cancer du sein. Nos données in vitro démontrent que les macrophages induisent le réveil des cellules tumorales dormantes. Les macrophages sont connus pour s’accumuler dans le tissu adipeux, tissu présent dans la glande mammaire. Pour ces raisons, nous nous intéressons à l’implication des macrophages dans le réveil de cellules tumorales dormantes dans le tissu adipeux de la glande mammaire de souris obèses. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer l’impact des macrophages dans le réveil des cellules tumorales dormantes in vivo. Nous voulons confirmer nos résultats chez la souris en utilisant le modèle de tumeur primaire dormante chez la souris obèse.
Bénéfices attendus
Un challenge majeur dans le traitement des cancers du sein est leur récurrence, et cela même plusieurs années après rémission. Les facteurs impliqués dans le réveil des cellules tumorales restent donc à identifier. La réalisation de ce projet va donc permettre d’identifier ces facteurs de récurrence du cancer du sein. En effet, nous avons mis en évidence, in vitro, que les macrophages peuvent induire le réveil de cellules tumorales dormantes. Notre modèle in vivo, nous permettra alors de confirmer ou non l’implication des macrophages dans le réveil tumoral. L’identification des macrophages comme facteurs induisant le réveil des cellules tumorales dormantes dans le tissu adipeux de la glande mammaire pourra déboucher vers de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter dans la récurrence du cancer du sein.
Procédures
Procédure 1 : Pas d’injection. Pas d’anesthésie Procédure 2 - Injection dans la glande mammaire : 336 animaux, 1 fois/animal, durée 7 minutes sous anesthésie générale - Injection intrapéritonéale : 96 animaux, 3 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. - Injection intrapéritonéale : ¨192¨ animaux, 4 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. Procédure 3 - Injection dans la glande mammaire : 192 animaux, 1 fois/animal, durée 7 minutes sous anesthésie générale - Injection intrapéritonéale : 96 animaux, 3 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. - Injection intrapéritonéale : 96 animaux, 4 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. Procédure 4 - Injection dans la glande mammaire : 336 animaux, 1 fois/animal, durée 7 minutes sous anesthésie générale - Injection intrapéritonéale : 96 animaux, 3 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. - Injection intrapéritonéale : 192 animaux, 4 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. Procédure 5 - Injection dans la glande mammaire : 96 animaux, 1 fois/animal, durée 7 minutes sous anesthésie générale - Injection intrapéritonéale : 96 animaux, 3 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1.
Impact sur les animaux
L’implantation de cellules tumorales pourra générer des tumeurs au niveau de la glande mammaire. En revanche, les souris seront suivies 3 fois par semaine avec mesure de la bioluminescence, du poids et du volume tumoral. Nous pourrons donc surveiller le développement tumoral. Aussi, l’implantation des cellules tumorales sera effectuée sous anesthésie générale et une attention particulière sera portée au réveil des souris ainsi qu’à l’aspect du site d’injection des cellules. Une rotation des sites d’injection en IP des drogues et de la luciférine permettra d’éviter tout problème au niveau de ces sites. Le suivi des souris permettra également de déceler tout problème de locomotion ou de souffrance potentiellement généré par l’éventuelle tumeur.
Devenir
A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. Les glandes mammaires et des échantillons sanguins seront alors prélevés pour analyses.
Remplacement
De nombreuses publications ont décrit les cultures organotypiques comme une méthode de remplacement pour l’étude du développement métastatique. Elles sont déjà utilisées en routine au laboratoire et sont envisagées aussi souvent que possible, comme attesté par les publications du laboratoire. Ainsi, nous avons déjà développé au laboratoire plusieurs modèles in vitro qui nous ont permis de vérifier le rôle des macrophages dans le réveil des cellules tumorales. Cependant, ces cultures ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe (matrice extracellulaire différente, et culture organotypique devenant un vrai challenge technique pour la culture de multiples types cellulaires), c’est pourquoi nous avons maintenant recours à des animaux.
Réduction
D’après la littérature, seules 45-50% des souris Balb/C sont sensibles au régime riche en graisse. Ainsi, nous prévoyons un nombre de souris plus conséquent afin d’obtenir un nombre suffisant de souris obèses. De plus, notre modèle in vitro développé au laboratoire a été réalisé sur des cellules tumorales dormantes issues de carcinome mammaire de souris Balb/c. Pour cette raison, nous devons utiliser des souris Balb/C dans notre modèle in vivo. Nos groupes expérimentaux sont composés de 24 animaux en accord avec la pénétrance du modèle d’obésité chez la souris Balb/C. De plus, seules des femelles seront utilisées étant donné le type de cancer étudié (cancer du sein).
Raffinement
Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées dans le respect de la réglementation européenne en cours afin de respecter le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Les animaux seront manipulés dans le plus grand calme et nous favoriserons une attitude des plus apaisantes pour leur manipulation. Les animaux sont hébergés en condition A1, en raison de 4 par cages, avec un rythme nycthéméral de 12h, l’eau et la nourriture sont données à volonté et pour le groupe à 60% de graisse, la nourriture sera remplacée trois fois par semaine. Le change des litières est hebdomadaire. Chaque cage est dotée d'un double enrichissement (standard à l'animalerie) : mouse house et carrés de coton. De plus, les cages d'expérimentation sont maintenues de manière séparée des élevages, permettant un suivi plus adapté. La période d’acclimatation avant manipulation sera de 5 jours au minimum. Le régime riche en graisse débutera donc après la période d’acclimatation. Le suivi des animaux sera évalué grâce à la grille de score. En cas de score supérieur à 9 (point limite atteint), les animaux seront alors immédiatement euthanasiés par dislocation cervicale. Les souris seront pesées 2 fois par semaine, le volume tumoral sera mesuré au moyen d’un pied à coulisse 3 fois par semaine et la bioluminescence sera également mesurée 1 fois par semaine. Aucun anti-inflammatoire ne pourra être donné aux souris puisque l’objectif de l’étude est de mieux caractériser le rôle de l’inflammation dans le réveil des cellules tumorales. Une attention toute particulière sera donc apportée à l’analyse de la douleur des souris (voir fiche de score). Aucun dérivé morphinique ne pourra être utilisé puisqu’il a été montré que leur administration à des souris diminuait la prise tumorale.
Choix des espèces
Nous souhaitons étudier le rôle des macrophages dans le réveil de cellules tumorales dormantes. Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Les procédures expérimentales seront réalisées sur des souris âgées d’au moins 8 semaines, âge à partir duquel la glande mammaire est mature/formée.
Impact de la combinaison d’une exposition prénatale aux polluants atmosphériques et au stress sur le développement et le fonctionnement cérébral
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
210 souris vont être utilisées, 180 tuées à l'issue et 60 réutilisées comme souris visiteuses, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes sont exposées à une atmosphère reconstituant la pollution de Pékin, leurs descendants reçoivent une puce RFID, subissent trois contentions de 45 minutes puis des tests d'interactions sociales, de mémoire et d'anhédonie, cinq par groupe passant une imagerie cérébrale sous anesthésie. Le porteur indique viser des biomarqueurs et des conseils de prévention aux familles et aux décideurs, retombées renvoyées au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme que le niveau d'intégration cognitif requis interdit les modélisations informatiques et les espèces autres que les mammifères.
Objectifs
La pollution atmosphérique est un problème majeur de santé publique dans les zones urbaines. Outre les conséquences directes de l'inhalation de polluants sur le système cardiorespiratoire et les décès prématurés, l'exposition prénatale à la pollution urbaine serait associée à une augmentation du risque de développer des troubles psychiatriques, comme l’autisme ou la schizophrénie. Les dommages cérébraux liés à la pollution ont principalement été étudiés chez l’homme au travers d’études épidémiologiques. Ces dernières sont souvent limitées par des facteurs de confusion, qui résultent de l’histoire personnelle de l’individu et de l’évaluation rétrospective de l’exposition aux polluants. En outre, elles ne permettent généralement pas d’évaluer comment ces polluants affectent le système nerveux central. Les modèles animaux apportent des solutions à ces limites. Ils permettent une maîtrise des conditions d’exposition et la reproductibilité des expériences. Notre projet propose ainsi d’évaluer l’impact de l’exposition prénatale à des polluants atmosphérique sur le développement cérébral et le comportement. Par ailleurs, la vulnérabilité aux troubles psychiatriques correspond à une sensibilité qui varie d’un individu à l’autre. Celle-ci est conférée par des facteurs génétiques ou environnementaux, rendant les individus plus sensibles à des facteurs externes comme le stress. Afin de tester si la vulnérabilité induite par une exposition prénatale à des polluants atmosphériques augmente la sensibilité au stress, des souris gestantes seront exposées au cours de leur dernière semaine de gestation à une atmosphère type de la ville de Pékin, dans laquelle les taux de polluants moyens enregistrés dépassent les seuils limites recommandés par l’Organisation Mondiale de la Santé. Chez la descendance des souris exposées, nous évaluerons l’impact d’une telle exposition sur le comportement des animaux et en particulier sur leurs interactions sociales, connues pour être altérées dans l’autisme et la schizophrénie. Afin de tester la sensibilité au stress, la moitié des animaux sera exposée avant les tests à un stress aigu et l’autre non. Sur ces deux groupes d’animaux, nous testerons les capacités cognitives et sociales. Nous étudierons également la structure et le fonctionnement cérébral. Notre projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs. Les souris seront exposées à la pollution dans le premier et le comportement des descendants sera étudié dans le second.
Bénéfices attendus
Des résultats préliminaires obtenus dans le cadre d’un précédent projet ont montré une diminution des interactions sociales chez des femelles adolescentes dont les mères avaient été exposées à la pollution atmosphérique de la ville de Pékin, mais aucune différence n’avait été observée pour les mâles. Des différences d’expression de plusieurs gènes chez ces mêmes souris femelles ont également été montrées alors qu’aucune différence significative n’a été observée chez les mâles. Cette étude nous permettra de voir si les différences d’interactions sociales observées chez les femelles exposées in utéro à la pollution atmosphérique sont associées à des modifications cérébrales qui pourraient servir de biomarqueurs d’une telle exposition chez l’homme. Elle nous permettra également d’évaluer les conséquences de la combinaison de deux facteurs d’exposition environnementaux sur les comportements cognitifs sociaux et non sociaux non seulement chez les femelles, mais également chez les mâles chez qui aucune différence n’a pu être observée jusqu'alors. Cette double exposition, proche des conditions écologiques rencontrées par l’homme au cours de sa vie, nous permettra d’établir des stratégies de communication auprès des décideurs publiques ou de prévention dans les familles de personnes avec des troubles psychiatriques en leur conseillant d'éviter de vivre dans des zones fortement exposées à la pollution.
Procédures
La moitié des femelles gestantes sera exposée à une pollution atmosphérique type, équivalente à celle rencontrée dans la ville de Pékin dans le premier établissement utilisateur. Dans le second établissement, la moitié des animaux étudiés sera soumis à trois stress de contention d'une durée de 45 minutes qui précédent les tests d’interactions sociales et le premier test de mémoire. Tous les animaux étudiés seront soumis à des tests de comportement mesurant les interaction sociales (1 fois 10 min), la cognition (test de mémoire, 1 fois 10min puis le lendemain 2 fois 10 min) et l'anhédonie (3 jours consécutifs). Cinq animaux par groupe seront anesthésiés pour être étudiés par imagerie cérébrale. A 12 mois, les animaux qui n'auront pas été étudiés par imagerie cérébrale seront soumis à un test de reconnaissance sociale (3 fois 10 min) et un test de locomotion et d'anxiété (1 fois 10min).
Impact sur les animaux
Une puce RFID sera injectée à tous les descendants des souris gestantes. La moitié de ces descendants sera exposée trois fois à un stress de contention pendant 45 minutes avant l'évaluation de leurs interactions sociales et de leur cognition. Avant les tests d'interactions sociales, les animaux seront isolés pendant 30 min. Les animaux seront isolés pendant les tests de cognition pour des sessions inférieures à 10 min. Les animaux étudiés pour l’imagerie cérébrale seront anesthésiés. Les animaux soumis à des stress de contention sont considérés impliqués dans une procédure de sévérité modérée. Les autres animaux subissent une procéure de sévérité légère.
Devenir
Tous les animaux d'étude, c'est-à-dire les descendants des mères exposées (N=120), seront mis à mort à la fin de la procédure pour étudier leur cerveau. Les mères (N=30) seront mises à mort après le sevrage pour étudier l'impact de l'exposition directe à la pollution sur leur cerveau. Les souris visiteuses pour les tests des interactions sociales (N=60) seront réutilisées dans d'autres projets.
Remplacement
Les objectifs de ce projet étant de déterminer l’impact de l’exposition prénatale à une atmosphère polluée sur le développement cérébral et le comportement, incluant des profils cognitifs individuels et des comportements intégratifs, le niveau d’analyse requis n’est envisageable que chez des animaux possédant un niveau d'intégration cognitif suffisant et ne peuvent donc être remplacés par des modélisations informatiques. Pour les mêmes raisons, ces expériences ne peuvent pas être conduites chez des espèces autres que les mammifères.
Réduction
Toutes les méthodes possibles sont utilisées pour limiter le nombre d’animaux et prendre en compte leur bien-être et leur potentielle souffrance. La réduction du nombre d’animaux sera liée au fait que les mêmes animaux seront étudiés par plusieurs tests de comportement (interactions sociales, cognition sociale et non sociale, anhédonie). Ces mêmes animaux seront également utilisés pour des analyses neuroanatomiques. Les tests statistiques nous permettent d'estimer que nous devons utiliser 15 animaux par groupe pour chaque condition expérimentale pour que le nombre d’animaux utilisés corresponde au minimum requis pour que les données soient scientifiquement interprétables.
Raffinement
Les animaux sont exposés in utéro à des atmosphères polluées (exposés) et non polluées (contrôles) en isolateurs dans des cages enrichies. Après leur exposition, les animaux seront transportés en groupes par un transporteur agréé en cages de transport. Lors du transport, les cages seront munies d'un enrichissement (papier permettant de réaliser des nids), de nourriture sous forme de pellet et d'eau sous forme de gelée. Tout au long des expériences les animaux seront maintenus en conditions standard comportant un enrichissement (cotons permettant de réaliser des nids, éléments de jeux tels que tunnels, bâton de bois, igloos). Afin de suivre leur évolution individuelle, ils seront identifiés à l’aide de puces RFID injectées en sous cutanés à la base du cou au moment de leur sevrage (P21) grâce à une procédure non invasive sans anesthésie ni chirurgie. Nous étudierons l’effet sur les deux sexes pour vérifier l’absence de différence entre les sexes. Les animaux seront observés tous les jours pour détecter toute manifestation de souffrance. Nous surveillerons particulièrement les changements de poids, l’apparence physique (poils très ébouriffés, posture anormale, yeux fermés) et le changement de comportement (vocalisations non-sollicitées, automutilation, animal très agité ou immobile, yeux fermés). En cas de signes de mal-être, la fréquence d’observation passera à 2 fois par jour. En cas de persistance au-delà de 48h, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Les objectifs de ce projet étant de déterminer l’impact de l’exposition prénatale à une atmosphère polluée sur le développement cérébral et le comportement, incluant des profils cognitifs individuels et des comportements intégratifs, le niveau d’analyse requis n’est envisageable que chez des animaux possédant un niveau d'intégration cognitif suffisant qui ne peuvent être remplacés par des modélisations informatiques ou des espèces autres que les mammifères. Nous étudierons le comportement des animaux à partir de l'adolescence (à partir de 30 jours post-natal) et jusqu'à l’âge adulte (>P90), car c'est une période clé du développement cérébral pour des manifestations phénotypique caractéristiques des troubles du spectre autistique ou de la schizophrénie (troubles cognitifs, de la communication et des interactions sociales). Nous étudierons également les animaux au cours du vieillissement, car l'exposition précoce à la pollution atmosphériqu a été associée chez l'homme à l'apparition anticipée de marqueurs de vieillissement.
Impact d’une lipide kinase dans la progression du sepsis
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un sepsis leur est induit par chirurgie de péritonite ou par injection intrapéritonéale de bouillie caecale, avec euthanasie et prélèvement d'organes entre six et quarante-huit heures après. Le porteur annonce une septicémie, une perte de poids et un retrait social, et suit des points limites fondés sur les expressions faciales et la posture. Il présente le recours à la souris comme "irremplaçable" en raison de la complexité du sepsis et de l'usage de modèles génétiquement modifiés.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer l’impact d'une protéine d'intérêt dans la progression du sepsis
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de savoir si la protéine d'intérêt peut être considérée comme une cible thérapeutique capable de protéger l’intégrité du vaisseau dans le contexte thrombo-inflammatoire du sepsis afin d’améliorer le traitement de cette pathologie.
Procédures
Les animaux Cre/lox seront soumis pendant 10 jours (2 fois 5 jours) à 1 injection/jour en IP pour induire la délétion de la protéine d'intérêt. Une procédure chirurgicale sera réalisée pour induire un sepsis grâce au modèle de péritonite (intervention qui dure environ 10 min sous anesthésie) et une procédure induisant le sepsis par injection de bouillie caecale en intrapéritonéal (1 seule injection par souris). Une prise de sang à la veine cave inférieure sera ensuite réalisée, 6H, 12H ou 48H post-induction du sepsis (animaux anesthésiés). Suite à cette prise de sang unique, les animaux seront euthanasiés et leurs organes prélevés pour être analysés. Pour l'évaluation de la perméabilité des vaisseaux sanguin : 1 seule injection (veine de la queue) de colorant sera réalisée (animal anesthésié) suivie de l'euthanasie de la souris 30min apres l'injection et leurs organes seront ensuite prélevés pour être analysés.
Impact sur les animaux
Les modèles génétiquement modifiés de ce projet ne présentent pas de phénotype dommageables. Par contre, l’induction du sepsis va entrainer une septicémie chez les souris qui seront euthanasiées 6h, 24h, ou 48h post induction afin de suivre l’évolution du sepsis. Les effets indésirables attendus sont une perte de poids, une perte de vitalité et de sociabilité (souris qui reste isolée dans la cage).
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et l'évolution du sepsis étudiée.
Remplacement
Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation des modèles génétiquement modifiées.
Réduction
Réduction du nombre d'animaux : plusieurs résultats obtenus avec un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables en évitant la répétition d’études antérieures déjà réalisées et/ou publiées et en fonction des résultats obtenus au fur et à mesure du développement du projet. Les inhibiteurs seront testés uniquement si des résultats concluants sont obtenus avec les souris déficientes pour la protéine d’intérêt. Suite à l’induction du sepsis, nous obtiendrons dans un premier temps des résultats préliminaires sur 1 lot de 6 animaux nous permettant de définir s'il peut exister des différences statistiquement quantifiables entre les différents groupes. Si ces différences existent, elles seront statistiquement affinées avec des groupes de 15 souris si besoin. Une approche statistique sera utilisée pour vérifier les différences obtenues entre groupes.
Raffinement
Les souris ont un accès illimité à la nourriture et boisson. Si besoin de l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Une observation quotidienne (3 fois par jour) des souris sera réalisée par les zootechniciens et les expérimentateurs. Des points limites ont été mis en place et seront basés sur l’examen visuel des expressions faciales (ouverture des yeux, nez et joues « froncés », position des oreilles et des moustaches) et de la posture (prostration, absence d’interaction sociale). Expérience en manipulation des animaux et en chirurgie des expérimentateurs (formation en chirurgie validée).
Choix des espèces
Ce projet a pour but une meilleure compréhension des mécanismes impliquant une protéine d'intérêt dans la progression du sepsis. Les effets pléïotropes dans ce contexte font intervenir des fonctions cellules multiples dans l'organisme non modélisables par des approches in vitro. Le recours à l'expérimentation animale est donc l'unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans ce contexte. Par ailleurs, nous travaillons avec des souris génétiquement modifiées pour notre protéine d’intérêt (pas de phénotype dommageable). Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte non vieillissant de l'animal).
Effet de l’insulino-résistance sur la réponse à l’inflammation intestinale chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des mises à jeun, un gavage, des prélèvements de sang et l'implantation chirurgicale d'une pompe osmotique, avec induction d'un diabète et d'une inflammation intestinale. Le porteur reconnaît une polydipsie, un poil hérissé, une léthargie, un dos courbé, une ataxie et des tremblements possibles. Il indique avoir utilisé des organoïdes intestinaux mais présente le recours à la souris comme nécessaire pour ces dialogues inter-organes.
Objectifs
L’intestin est directement en contact avec le bol alimentaire et les bactéries de la flore intestinale et assure donc un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage concomitant de produits bactériens dans le sang aient été proposés comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2 (DT2), les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit indépendemment de l'obésité et de l'hyperglycémie, à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action de l'insuline contribue, indépendemment de l'obésité, à l'hyperperméabilité intestinal et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales. Notre projet permettra l'identification dans l'épithélium intestinal des cibles cellulaires et des voies de signalisation dérégulées au cours de la résistance à l'insuline, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.
Procédures
-1 lot d’animaux vigiles fera l’objet d’une mise à jeun (14h), de 6 à 7 contentions (45 secondes chacune), d’une administration orale de produit (1 minute chacune), de 2 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun), d’un prélèvement de sang mandibulaire (1 minute chacun) et de 2 à 3 injections de produit (45 secondes chacune). Une partie de ces animaux sera également placée sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). -1 autre lot d’animaux vigiles fera l’objet de 2 mises à jeun (4h et 14h), de 7 à 8 contentions (45 secondes chacune), de 2 administrations orale de produit (1 minute chacune), de 2 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun), d’un prélèvement de sang mandibulaire (1 minute chacun) et de 2 à 3 injections de produit (45 secondes chacune). Une partie de ces animaux sera également placée sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). -Tous les animaux seront placés sous analgésie et anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).
Impact sur les animaux
Les prélèvements, l’anesthésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Certains actes peuvent induire une sensation de douleur chez l'animal : douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille) ou encore les douleurs post-opératoire (implantation de la pompe) ou liées à l’inflammation intestinale. De plus, la chirurgie comporte un risque pour l'animal lié à l'anesthésie (réveil, dépression respiratoire, hypothermie). Les souris rendues diabétiques présenteront une polydipsie associée à une glycosurie. L’implantation des pompes osmotiques en sous cutanée peuvent entraîner localement une inflammation (rougeur, gonflement) ou une infection (écoulements). Concernant les procédures incluant l’induction d’une inflammation intestinale, l’infection par des entéropathogènes, ou l’induction d’un diabète, l’apparition de signes généraux de souffrances peut survenir : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Ils permettent d'obtenir une représentation simplifiée de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux issus de souris diabétiques pour démontrer que la résistance à l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.
Réduction
L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. L'étude comprend au total 480 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests statistiques adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser la réponse des cellules épithéliales intestinales à l'insuline à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas à l’insuline. Cette technique ne nécessite donc aucun traitement chez la souris. Elle permet également à partir d'une seule souris d'étudier plusieurs parties de l'intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.
Raffinement
La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post-opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Par ailleurs, le choix de cette espèce est motivé par la volonté de comparer les résultats de ce projet obtenus sur des modèles de perte d'action globale globale de l'insuline à ceux d'un autre projet obtenus sur des souris génétiquement modifiées, déficientes pour l’action de l’insuline spécifiquement au niveau intestinal. Les souris utilisées seront âgées de 12 à 14 semaines pour toutes les procédures. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.