Souris

Gavées jusqu'à onze fois, injectées jusqu'à dix fois, saignées à la joue puis à la queue, mises à jeun six heures, 252 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus. Le projet cherche à mettre au point un dosage sanguin d'une molécule bactérienne reconnue par un récepteur immunitaire, soupçonné de relier le microbiote intestinal à la régulation du glucose. Le porteur affirme que cette étude ne peut être menée ni en culture cellulaire ni par modélisation informatique, et qu'elle "nécessite" donc des animaux. Le RNT ne tranche ni entre le gavage et l'injection ni sur le nombre d'administrations, alors que trente-six souris seraient traitées dix jours de suite.

Objectifs

Le surpoids et l’obésité constituent aujourd’hui un problème majeur de santé publique. En 2022, ils touchaient plus de 2,5 milliards et 890 millions de personnes dans le monde et sont associés à de nombreuses maladies, dont le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires. Mieux comprendre leurs causes est essentiel pour développer de nouvelles stratégies de prévention et de traitement. L’obésité est une maladie complexe influencée par la génétique, l’alimentation et des facteurs environnementaux. Parmi eux, le microbiote intestinal, c’est-à-dire l’ensemble des bactéries vivant dans notre intestin, joue un rôle important. Ces bactéries interagissent avec l’organisme et participent à la régulation de nombreux processus biologiques. Un déséquilibre du microbiote est fréquemment observé chez les personnes atteintes de maladies métaboliques. Récemment, le gène que nous étudions a été identifié comme un récepteur du système immunitaire capable de détecter une molécule produite par des bactéries intestinales. Plusieurs études associent des variations de ce gène à l’obésité et au diabète de type 2. De plus, son expression est plus élevée chez des patientes obèses. Des données préliminaires chez la souris montrent également que l’absence de ce gène modifie la prise de poids et la régulation du glucose. Nous faisons donc l’hypothèse que ce récepteur joue un rôle clé dans la communication entre le microbiote intestinal et le métabolisme. Dans ce projet, l’objectif est de développer une méthode permettant de détecter dans le sang la molécule reconnue par ce récepteur. Des souris élevées sans microbiote seront utilisées pour établir et calibrer cette méthode, avant son application à des échantillons humains. À terme, cette molécule pourrait devenir un nouveau biomarqueur des maladies métaboliques. Cette étude vise à déterminer : 1-La quantité de la molécule produite par le microbiote présente dans la circulation sanguine selon le mode d’administration 2-L’impact de l’administration de cette molécule (et in fine l’activation du récepteur), sur la glycémie, la prise de poids et les dérégulations métaboliques.

Bénéfices attendus

Notre travail vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et des ligands bactériens et leur rôle dans la régulation de la glycémie, car sa dérégulation est un élément central du développement du diabète. Il est essentiel de poursuivre les recherches qui pourront permettre le développement de nouveaux moyens de lutter contre l’obésité et les maladies associées. Ce dosage pourrait dans un futur proche constituer en un nouveau biomarqueur des maladies métaboliques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes, réalisées exclusivement sur animaux vigiles : •Gavages: o Nombre maximal estimé : 11. o Ce total inclut : Soit une administration unique pour chacun des 216 animaux, soit maximum 10 actes (administration quotidienne sur 10 jours si cette voie est retenue) pour les 36 autres, auquel s’ajoute l’administration de glucose pour le test de tolérance. o Durée : Environ 10 secondes par geste de contention et d'administration. •Injections: o Nombre maximal estimé : 10. o Ce total inclut : Soit une administration unique pour chacun des 216 animaux, soit maximum 10 actes (administration quotidienne sur 10 jours si cette voie est retenue) pour les 36 autres. o Durée : Environ 5 à 10 secondes par geste (contention et piqûre). •Prélèvements sanguins : o Prélèvements à la joue : Chaque souris subit au maximum 2 prélèvements, 36 souris seulement 1 prélèvement. o Micro-prélèvements à la queue : Maximum 8 actes pour les 36 animaux concernés par le test de tolérance au glucose o Durée : 10 à 20 secondes à la joue ; 1 seconde à la queue. •Prélèvements de fèces : o Nombre total : 1 par animal. o Un prélèvement unique par animal en début de protocole pour contrôle de la stérilité. o Durée : Moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

-Gavages et injections : Les animaux subiront un stress modéré lié à la contention manuelle (environ 5 secondes). Pour les injections, une douleur légère, brève et transitoire est attendue lors de la piqûre. -Mise à jeun (6h) : Ce jeûne de courte durée peut induire une sensation de faim et un stress physiologique léger. -Test de tolérance au glucose : Stress léger de très courte durée et douleur brève lors de l’incision au bout de la queue pour les micro-prélèvements de sang (1 seconde). -Prélèvements de sang à la joue : Stress modéré durant 10 à 20 secondes lié à la contention et douleur liée à la piqûre. -Prélèvements de fèces : Stress très bref lié à la contention (

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin d’effectuer des prélèvements de tissus pour analyse biologique, histologique et moléculaire.

Remplacement

Cette étude de l’effet systémique d’activateurs du récepteur d’intérêt sur le métabolisme de l’hôte ne peut pas être réalisée en cultures cellulaires ni modélisée informatiquement. Elle nécessite donc l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des tests statistiques (12 animaux par lot) sans nécessité de répétition ultérieure de l’expérience.

Raffinement

Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux et cette étape sera pratiquée par des expérimentateurs entrainés à la contention et au gavage. Les animaux seront habitués à être manipulés tous les jours durant la phase d’adaptation afin de diminuer leur stress lors des prélèvements. Toutes les souris auront dans chaque cage un enrichissement de milieu par l’ajout d’un abri obscur en polycarbonate. Les souris seront 4 par cage pour éviter l’isolement. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Cela nous permettra d’intervenir rapidement et de façon appropriée si un problème survenait. Les équipements utilisés sont adaptés à la physiologie du petit animal telle que l’utilisation de lecteur de glycémie performant (rapide et nécessitant un volume de sang faible). Enfin, des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques en raison de ses réponses proches de l’homme et permettant une reproductibilité des résultats. Il s’agit également du modèle principal dans le cadre d’études en condition d’absence de microbiote. De plus les seules données de la littérature s’intéressant à la détection de la molécule que nous étudions utilisent ce modèle et nous servent donc de référence. Enfin, nous avons choisi de travailler sur des animaux adultes en fin de croissance afin de travailler sur des animaux, dont la réponse métabolique est stable et répétable.

Sept injections en huit jours, puis une ponction de sang par semaine pendant un mois et deux le même jour la dernière semaine : 786 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le projet compare les anticorps anti-plaquettes produits selon le contexte, transfusions répétées ou grossesse, en reproduisant chez la souris ce qui survient chez des patients transfusés et des femmes enceintes. Les souris utilisées sont génétiquement modifiées pour que leur nombre de plaquettes puisse être manipulé. Des petits de trois semaines à peine sevrés sont inclus parce qu'ils fournissent un volume de sang suffisant pour les analyses, et la mise à mort est justifiée par ce besoin de grands volumes de sang ou d'organes.

Objectifs

Les plaquettes sont des éléments essentiels qui, lors d’un saignement, permettent de le stopper en formant des caillots. La génération d’anticorps dirigés contre nos propres plaquettes sanguines) est problématique dans les maladies qui nécessitent une transfusion de plaquettes. En effet, la présence de tels anticorps chez le patient conduit à la destruction des plaquettes transfusées, qui a pour conséquence une inefficacité thérapeutique. La génération de ces anticorps peut également être observée chez la femme enceinte. Dans ce contexte, les plaquettes du fœtus présentent à leur surface des molécules provenant de la mère (« molécules du soi »), mais aussi celles du père (« molécules du non soi ») qui vont être considérées comme étrangères à la mère, et donc entrainer la production d’anticorps contre les plaquettes du foetus. Ceci peut entrainer une baisse du taux de plaquettes chez le nouveau-né, et favoriser l’apparition d’un état réfractaire plaquettaire chez la mère, si elle devait par la suite être transfusée. La probabilité d’apparition de ces anticorps, serait plus importante à partir de la troisième grossesse, la mère ayant déjà été exposée aux molécules du père lors d’une première grossesse. Nous savons à quel endroit sont produits ces anticorps, nous souhaitons à présent étudier si la quantité et le type d’anticorps produits chez la souris, va changer selon le contexte (grossesse ou transfusion de plaquettes étrangères). Pour cela, nous mimerons ce qui se passe chez l’Homme, en réalisant plusieurs transfusions de plaquettes, des plaquettes obtenues différemment, chez la souris, ou encore en suivant des femelles ayant eu plusieurs portées. Pour finir, nous étudierons également l’élimination des plaquettes, à la suite d’une transfusion faite aux femelles ayant eu plusieurs portées ou ayant été transfusées.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de comparer, le type et la proportion d’anticorps anti-plaquettes produits selon différentes situations. Le but étant par la suite, de pouvoir les bloquer grâce à un médicament chez des patients qui ont besoin d’être transfusés, mais ont déjà éliminé des plaquettes lors de transfusions auparavant.

Procédures

La souris vigile recevra 1 injection de 5 secondes pendant 4 jours consécutifs, suivies pour certaines, 4 jours après, d’une injection de 5 secondes pendant trois jours consécutifs. La souris vigile recevra 1 injection pendant 5 secondes avant le prélèvement de sang. La souris anesthésiée par inhalation, sera prélevée à la queue, 15 secondes, une fois par semaine, pendant 4 semaines, puis la 4ème semaine deux fois dans la même journée. La souris anesthésiée par inhalation, recevra une injection de plaquettes de 5 secondes, une fois pour certaines, et une fois par semaine pendant 4 semaines pour d’autres.

Impact sur les animaux

L’injection répétée réalisée sur animal réveillé peut entrainer un stress à la contention et une douleur au point de piqûre de l’aiguille de quelques secondes. L’injection d’anesthésiants, peut entrainer un stress à la contention, et une douleur au point de piqûre de l’aiguille de quelques secondes. Pour les procédures d’anesthésie, le rythme respiratoire peut être impacté : rythme modifié ou apnée. L'injection de plaquettes à l'animal n'a aucun effet sur sa santé, aucun choc anaphylactique et aucune inflammation n'apparaît.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, car nous aurons besoin soit d’un grand volume de sang, soit de prélever des organes.

Remplacement

Les évènements induisant la production d’anticorps anti-plaquettes que l’on souhaite étudier, ne peuvent éthiquement se faire chez les patients. En effet, il parait inenvisageable de pouvoir bloquer la production de plaquettes, afin de pouvoir transfuser au patient des plaquettes d’une maturation précise, ou encore de pouvoir transfuser des plaquettes fluorescentes, ou de pouvoir réaliser des gestes invasifs comme des biopsies d’organes tels que le foie ou la rate. Or, l’apparition de ces évènements ne peut avoir lieu qu’au sein d’un organisme vivant, suite à l’interaction de différents organes, et la mise en place de mécanismes complexes, qui n’existent pas encore autre que sur le vivant.

Réduction

Le nombre de souris utilisé dans cette étude est réduit au minimum et permet l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les effectifs ont été déterminés en amont par une approche statistique.

Raffinement

Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : -Par l’acclimatation de nos souris à la pièce d'hébergement pendant deux semaines suite au sevrage ou à leur arrivée - Par l’habituation des animaux à l’expérimentateur et aux différents gestes, une fois par jour pendant 5 jours, la semaine avant le début de la procédure -Par l’hébergement en groupes sociaux. Les cages sont munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose + des bâtons de coton + de la frisure, afin de permettre aux animaux de réaliser un nid conformément à leurs besoins comportementaux -Par l'utilisation d'anesthésiants et d'analgésiques adaptés lors des différents gestes sur l'animal -Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante à 38°C lors des anesthésies, et pour son réveil, dans une boite thermostatée à 38°C - Des points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris car nous disposons des souris génétiquement modifiées qui nous permettent de modifier le nombre de plaquettes sanguines chez la souris. Les plaquettes sanguines de souris sont très proches au niveau fonctionnalité que celles de l’Homme. Nous utiliserons des souris de 7 à 20 semaines période où le nombre de plaquettes chez les individus est stable, et des petits de 3 semaines sevrés, pour pouvoir avoir un volume de sang suffisant pour nos analyses.

300 animaux sur 3 990 pourront être gardés en vie et renvoyés en hébergement hors étude après avis vétérinaire, les autres seront tués pour le prélèvement d'organes et de fluides. 3 300 rats et 690 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour mesurer les effets de candidats-médicaments commandés par des donneurs d'ordre. Certains reçoivent un cathéter intraveineux implanté à demeure sous anesthésie, portent une veste à capteurs jusqu'à dix-neuf heures, passent jusqu'à sept heures trente dans une enceinte respiratoire ou jusqu'à six heures dans une enceinte à diurèse sans eau ni nourriture, et subissent jusqu'à huit prélèvements sanguins par séance. Le porteur affirme qu'aucune alternative ne permet de mesurer ces effets sur un "organisme entier" et revendique la "nécessité" d'accéder à l'animal dans son entièreté.

Objectifs

Les études de pharmacologie de sécurité chez les rongeurs visent à évaluer les effets d'un candidat-médicament en développement sur les grandes fonctions physiologiques et sont des prérequis réglementaires précliniques permettant à un donneur d’ordre d'initier des études cliniques pour un candidat-médicament destiné à l'Homme. Selon le candidat-médicament, l’établissement utilisateur évalue la procédure à effectuer, sachant que plusieurs procédures peuvent être combinées au sein d’une même étude (par exemple : étude combinant l’évaluation des fonctions respiratoire et neurologiques). Chaque animal est traité par un placebo ou une dose de candidat-médicament selon la voie d'administration prévue chez l'Homme. Les effets du candidat-médicament sont évalués sur une fonction physiologique données (neurologique, respiratoire, gastro-intestinale, rénale ou cardiovasculaire) à l'aide de capteurs et de logiciels enregistrant, en continu, le signal physiologique (fonctions respiratoire et cardiovasculaire), de tests spécifiques (fonctions neurologiques) ou de prélèvements d'organes/fluides biologiques (fonctions gastro-intestinale et rénale) effectués à un ou plusieurs temps après traitement, et dont l'analyse génère des valeurs quantitatives caractérisant la fonction étudiée. Les valeurs des paramètres mesurés à chaque dose de candidat-médicament sont ensuite comparées à celles mesurées en placebo et permettent ainsi d'évaluer l'impact du candidat-médicament sur la fonction étudiée. Pendant la durée de la procédure, de la réception des animaux à leur sortie d'étude, leur état de santé est suivi quotidiennement a minima, leur poids est mesuré périodiquement et l'atteinte de points limites est étroitement surveillée, avec prise de décision vétérinaire rapide et appropriée en cas d'altération du bien-être animal. Des dispositions, compatibles avec l'atteinte des objectifs de l'étude, sont prises pour limiter tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile, par l'utilisation d'habituation à l'environnement expérimental et aux dispositifs d'enregistrement des fonctions physiologiques, de protocoles anesthésiques et analgésiques appropriés, ou par décision vétérinaire d'appliquer des soins, de diminuer les doses de candidat-médicament ou d'arrêter le traitement. En fin de procédure, selon les prérequis du protocole d'étude, les animaux peuvent être gardé en vie ou euthanasiés.

Bénéfices attendus

L'évaluation des effets fonctionnels d'un candidat-médicament en développement par un donneur d'ordre dans les études de pharmacologie de sécurité chez le rongeur est conduite selon des recommandations ("lignes directrices") internationales, et constitue une étape réglementaire avant la conduite d'essais cliniques avec ce candidat-médicament chez des volontaires sains ou des patients. Ces études visent à définir le profil des effets pharmaco-toxicologiques de candidats-médicaments sur certaines fonctions physiologiques (incluant les fonctions vitales) qui surviennent généralement dans les heures à jours suivant leur administration. L'identification des fonctions modifiées par le candidat-médicament - s'il est considéré par le donneur d'ordre comme pouvant progresser dans les phases cliniques - permettra la mise en place de procédures de suivi de ces mêmes fonctions ("monitoring") chez l'Homme (ex.: mesure de l'électrocardiogramme, de la tension artérielle ou de la fréquence respiratoire; examens neurologiques) et donc, de rendre les essais cliniques plus sûrs pour les volontaires ou les patients y participant. En relation avec les données collectées dans les études de toxicologie réglementaire, celles issues des études de pharmacologie de sécurité permettent aussi de définir la dose qui sera testée (avec une marge de sécurité) pour la première administration à l’Homme. Au final, ce projet contribuera au développement de nouvelles solutions thérapeutiques, prophylactiques ou diagnostiques sûres pour les patients. Il est envisagé que, sur une durée de 3 ans, entre 25 et 35 candidats-médicaments pourront être évalués.

Procédures

Ces études consistent généralement en une administration unique du candidat-médicament, pendant une durée de quelques secondes pour des administrations par les voies orale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse rapide, ou de quelques minutes pour les administrations par la voie intraveineuse dites en "bolus lent". Certaines administrations par voie intraveineuse peuvent également durer plusieurs dizaines de minutes à quelques heures, et nécessitent l'implantation chirurgicale, sous anesthésie générale gazeuse profonde et avec un protocole analgésique péri-opératoire adapté, d'un cathéter laissé en place de manière permanente dans une veine périphérique. Ce cathéter est relié à un dispositif externe de perfusion adapté aux rongeurs, permettant de connecter la seringue délivrant le candidat-médicament, tout en laissant l'animal libre de ses mouvements. Ce dispositif de perfusion intraveineuse est implanté sous anesthésie générale profonde, à une seule occasion, pendant la période d'acclimatation. Les administrations de candidats-médicaments sont suivies d’évaluation de leurs effets sur les paramètres neurologiques (évalués individuellement pendant un maximum de 15 minutes, à différentes heures après traitement), respiratoires (avec placement de chaque animal dans une enceinte dédiée jusqu'à 7,5 heures), urinaires (avec placement de chaque animal dans une enceinte à diurèse jusqu'à 6 heures). Les animaux dont la fonction cardiovasculaire est évaluée portent une veste avec capteurs intégrés jusqu'à 19 heures. Si requis par le protocole d'étude, un ou plusieurs prélèvements sanguins seront effectués, par ponction d'une veine superficielle chez l'animal vigile, suivant des modalités et un nombre définis par les besoins de l'étude (jusqu'à 2 occasions par étude, avec un maximum de 8 prélèvements par occasion), tout en respectant les recommandations éthiques de l'établissement utilisateur. Si le protocole d'étude requiert un prélèvement sanguin unique d'un volume dépassant ces recommandations, ce prélèvement est effectué chez l'animal en fin d'expérimentation, sous anesthésie générale gazeuse profonde, puis celui-ci est euthanasié. Si requis par le protocole d'étude, une ponction de liquide céphalo rachidien unique est effectuée chez l'animal en fin d'expérimentation, sous anesthésie générale gazeuse profonde, puis celui-ci est euthanasié.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent inclure (variables selon les individus) : Stress, inconfort ou douleur brève (quelques minutes) lors des administrations, prélèvements sanguins ou euthanasie au gaz carbonique. Les injections intraveineuses lentes peuvent nécessiter une contention en tube, après une période d'habituation. Sensation de chaleur et stress lors du placement en enceinte chauffante utilisée pour prélèvements de sang ou injections intraveineuses ne nécessitant pas de pose de cathéter à demeure. Anesthésie de quelques minutes - avec risque d’incoordination motrice au réveil - , pour prélèvements de sang ou autres fluides biologiques. Anesthésie suivie d’une douleur légère à modérée pendant quelques jours après la pose de cathéters intraveineux à demeure. Port d’un harnais ou d’un bouton métallique permettant la perfusion prolongée par voie intraveineuse sans contention, pouvant provoquer gêne à l'ambulation et au toilettage, grattage et/ou frottements. Connexion à un dispositif de "joint tournant" lors des perfusions intraveineuses de 30 min à 24 heures/jour, pouvant limiter les déplacements dans la cage d'hébergement. Restriction d’espace et absence d’aliment (eau disponible) dans l'enceinte dédiée aux mesures respiratoires jusqu’à 7,5 heures. Restriction d’espace sans accès à l’eau ni à l’aliment dans les enceintes pour collectes urinaires (jusqu’à 6 heures) ou les arènes d’observations comportementales (jusqu’à 10 min). Stress lié à l’hébergement individuel, notamment chez les souris mâles et les animaux porteurs de dispositifs de perfusion intraveineuse implantés à demeure. Effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés des candidats-médicaments.

Devenir

Si le protocole d'étude prévoit des prélèvements de tissus et d'organes pour analyses métaboliques, de biologie moléculaire, d'évaluations histopathologiques ou de prélèvements terminaux de fluides biologiques, une fraction ou la totalité des animaux nécessaire à ces analyses sera euthanasiée. Si le protocole d'étude ne prévoit pas de prélèvements nécessitant l'euthanasie des animaux, ceux-ci pourront être gardé en vie et retourner en zone d’hébergement hors étude suite à l’avis du vétérinaire avec l’évaluation de la gravité réelle des procédures subies.

Remplacement

Il n’existe pas actuellement d’alternatives à l’utilisation d’animaux qui permettent de déterminer la nature et l'amplitude des effets pharmacologiques de candidats-médicaments sur un organisme entier. Dans les études de pharmacologie de sécurité visant essentiellement à évaluer les effets de candidats-médicaments sur les fonctions physiologiques interdépendantes (en particulier, les fonctions vitales (neurologique, respiratoire et cardiovasculaire), il est nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par les lignes directrices édictées dans des recommandations réglementaires internationales.

Réduction

Lorsque la pharmacocinétique et/ou le mécanisme d'action du candidat-médicament le permet, les mêmes animaux peuvent être utilisés dans une même étude, dans le but d'évaluer, soit simultanément, soit séquentiellement, plusieurs fonctions physiologiques. Dans le cadre d'application de procédures de manière séquentielles, l'inclusion des animaux dans la seconde procédure suivant la première sera effectuée après un temps d'élimination du candidat-médicament de l'organisme suite à l'administration au cours de la première procédure, et après un examen clinique confirmant la capacité des animaux inclus dans la première procédure, à être inclus dans la seconde. Si l'étude requiert des prélèvements sanguins sur animal vigile et que la méthode analytique le permet, des microprélèvements de quelques dizaines de microlitres seront effectués chez les animaux en exploration fonctionnelle, évitant ainsi l'utilisation d'animaux satellites. S'il n'est pas attendu de différences pharmacologiques ou pharmacocinétiques notable entre mâles et femelles, et sauf avis contraire du protocole d'étude, ou justification d'une indication thérapeutique limitée à un seul sexe chez l'Homme, les études de pharmacologie de sécurité sont effectuées chez des mâles.

Raffinement

Rats mâles et femelles et souris femelles sont hébergés en groupes sociaux (sauf incompatibilité comportementale ou avec la procédure expérimentale) en cage sur litière, avec enrichissement adapté, augmenté en cas d’hébergement individuel. Les techniques limitant stress et inconfort seront privilégiées; les actes pouvant les engendrer seront réduits en nombre et durée au minimum nécessaire et réalisés sous anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté. Les rongeurs sont observés au moins une fois par jour pour rapidement détecter des signes cliniques et limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas d'atteinte du bien-être, un vétérinaire prendra des mesures rapides et appropriées (soins, arrêt momentané ou définitif du traitement…). Le stress de la manipulation est réduit par la procédure de gestion de faible stress. Etudes d'évaluation de la respiration par pléthysmographie: une habituation à l'enceinte de mesure en Plexiglas transparent (permettant aux animaux de voir et d'entendre leurs congénères et leur environnement) est effectuée par placement des animaux pendant 1 à 2 heures avant traitement (et en période de prétraitement, si requis au protocole d'étude). Etudes d'évaluation cardiovasculaire par veste connectée: en prétraitement, un fragment du tissu de la veste est déposé dans la cage d'hébergement pendant au moins 24 heures, puis les rats sont équipés de la veste seule (sans capteurs) jusqu'à 5 heures. Administration IV lente > 5 minutes: l'habituation au tube de contention est faite au moins 2 fois avant le premier traitement. Administration par voie orale et prélèvement sanguin en veine jugulaire chez rongeurs âgés ou peu manipulés: l'habituation à la manipulation est mise en place avant le premier traitement. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté. Si compatibles avec les objectifs de l'étude, des microprélèvements sanguins seront effectués, limitant ainsi le stress et facilitant la récupération. Le design de chaque étude sera détaillé dans le protocole d’étude et une évaluation éthique sera réalisée avant le démarrage. Le pH et l'osmolarité seront mesurés (ou communiqués par le donneur d'ordre) avant toute première administration par voie parentérale. Enfin, les volumes d'administration et de prélèvement de sang ont été établis selon des recommandations internes, elles-mêmes basées sur des recommandations éthiques (Diehl et al. (2001); J. Appl. Toxicol.).

Choix des espèces

Le choix de l'espèce animale dans les études visant à étudier les effets de candidats-médicaments sur les fonctions physiologiques est basé sur les recommandations réglementaires édictées dans des lignes directrices internationales, les informations concernant la distribution et l'élimination des candidats-médicaments dans l'organisme, leur mécanisme d'action après liaison à leur cible biologique, les données de la bibliographie scientifique, et les analogies des fonctions physiologiques entre l’animal et l'Homme. Selon les fonctions physiologiques susceptibles d'être modifiées par le candidat-médicament et de la population concernée par celui-ci, l’âge le plus adéquat sera sélectionné, cet âge pouvant varier de l’âge juvénile jusqu’à l’âge de maturité sexuelle. Ce choix de l'âge répond à l’ensemble des études réglementaires conduites chez l'animal et nécessaires à la conduite des essais cliniques avec un candidat-médicament chez l’Homme.

Pour produire directement dans le corps des cellules immunitaires modifiées censées attaquer les tumeurs, 1 770 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement d'organes et de tumeurs. Chacune reçoit des injections dans la tumeur sous anesthésie, au moins six prises de sang et cinq séances d'imagerie, pendant que la tumeur grossit. Le porteur ramène ces atteintes à un inconfort modéré et transitoire, et décrit la croissance tumorale comme une gêne progressive. Les souris seront mises à mort dès qu'un volume tumoral maximal sera atteint, seuil dont le RNT ne donne pas la valeur.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier une nouvelle approche de traitement du cancer visant à activer directement, dans l’organisme, certaines cellules du système immunitaire pour qu’elles reconnaissent et détruisent les cellules tumorales. Contrairement aux méthodes actuelles, qui nécessitent de modifier ces cellules en laboratoire avant de les réinjecter, cette stratégie permettrait de produire ces cellules directement dans le corps, de façon plus simple et potentiellement plus rapide. Les travaux seront réalisés chez la souris, dans des modèles de tumeurs, afin de reproduire au mieux certaines situations observées chez l’humain. Dans un premier temps, l’objectif est de vérifier que cette approche permet bien de produire ces cellules immunitaires modifiées dans l’organisme, et qu’elles sont capables de fonctionner correctement. Les chercheurs étudieront notamment leur capacité à reconnaître et attaquer les cellules tumorales, leur répartition dans le corps, leur durée de présence, ainsi que leur tolérance par l’organisme. L’état de santé des animaux sera suivi attentivement afin de détecter d’éventuels effets indésirables. Dans un second temps, l’efficacité de cette approche sera testée sur différents types de tumeurs. Les stratégies les plus prometteuses seront sélectionnées, puis éventuellement combinées avec d’autres approches visant à renforcer la réponse immunitaire. L’efficacité du traitement sera évaluée en suivant l’évolution des tumeurs et la capacité des cellules immunitaires à pénétrer dans celles-ci. Ce projet permettra de mieux comprendre le potentiel de cette nouvelle approche et de déterminer si elle pourrait, à terme, contribuer au développement de nouveaux traitements contre les cancers, en particulier les tumeurs solides.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de mieux comprendre et évaluer une nouvelle approche de traitement du cancer, qui consiste à produire directement dans l’organisme des cellules capables de reconnaître et de détruire les cellules tumorales. Cette stratégie pourrait représenter une alternative aux méthodes actuelles, qui sont plus complexes et nécessitent de manipuler les cellules en laboratoire avant de les réinjecter au patient. Les résultats attendus permettront tout d’abord de vérifier que cette approche fonctionne réellement, c’est-à-dire que ces cellules sont bien produites dans le corps et qu’elles sont capables d’agir contre les tumeurs. Le projet permettra également d’identifier les approches les plus efficaces parmi plusieurs options testées, et de mieux comprendre leur comportement dans l’organisme, notamment leur répartition, leur durée de présence et leur tolérance. Dans un second temps, l’efficacité de cette stratégie sera évaluée sur différents types de tumeurs, afin de confirmer son potentiel dans des situations variées et proches de la réalité des cancers humains. Certaines combinaisons de stratégies pourront aussi être testées pour voir si elles permettent d’améliorer encore les effets du traitement. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer au développement de nouvelles formes d’immunothérapie plus simples à mettre en œuvre, potentiellement plus accessibles et moins coûteuses que les traitements actuels. Il pourrait également ouvrir la voie à de nouvelles solutions pour traiter les tumeurs solides, pour lesquelles les options restent aujourd’hui limitées.

Procédures

Injection intra tumorale sous anesthésie : 2 x 5 minutes = 10 minutes Manipulation pour mesures et pesées sur animaux vigiles : 2 x 1min / semaines Prélèvements de sang sur animaux anesthésiés : 6 prélèvements de sang minimum x 2 min = 12 minutes Imagerie sur animal anesthésié : 5 mesures minimum x 10 min = 50 min

Impact sur les animaux

Les procédures réalisées dans ce projet peuvent entraîner un inconfort modéré et transitoire chez les animaux. Les injections et les prises de sang répétées peuvent générer un stress passager. L'activation du système immunitaire induite par le traitement peut provoquer une légère baisse d'activité ou une perte de poids temporaire. Dans les expériences impliquant des tumeurs, la croissance de celles-ci peut entraîner une gêne progressive. Des phénomènes inflammatoires liés à l'activation des cellules immunitaires modifiées sont également possibles. L'ensemble de ces effets sera surveillé attentivement tout au long de l'étude, et des mesures adaptées seront prises dès l'apparition de tout signe de détresse.

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés car des organes/tumeurs seront récupérés.

Remplacement

Les méthodes alternatives, telles que les modèles cellulaires ou informatiques, ne permettent pas de répondre aux questions posées par ce projet. En effet, étudier comment des cellules immunitaires modifiées se développent, se déplacent et agissent dans l'organisme nécessite un système vivant complet. Les interactions entre les différentes cellules du système immunitaire, les organes et les tissus ne peuvent pas être reproduites en laboratoire ou par simulation informatique. L'utilisation d'un modèle animal est donc indispensable pour évaluer l'efficacité et la tolérance de cette approche dans des conditions physiologiques réalistes.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été calculé de manière à obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum leur utilisation. Dans un premier temps, de petits groupes de 5 animaux sont utilisés pour identifier rapidement les approches les plus efficaces et éliminer celles qui ne fonctionnent pas. Dans un second temps, des groupes de 10 animaux sont constitués pour évaluer l'efficacité du traitement sur des tumeurs, un effectif nécessaire pour tenir compte de la variabilité biologique de ces modèles. Cette approche progressive permet de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire à chaque étape du projet.

Raffinement

Les procédures expérimentales ont été conçues afin de réduire au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les manipulations (injections, prélèvements sanguins, imagerie) seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, selon des protocoles standardisés. Les prélèvements sanguins respecteront les volumes et fréquences recommandés. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie adaptée afin de limiter le stress et les mouvements. Dans les modèles tumoraux, une surveillance clinique régulière sera mise en place, incluant le suivi du poids, de l’état général et du comportement. Des points limites stricts seront appliqués, notamment en cas d’atteinte d’un volume tumoral maximal ou d’altération de l’état général. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation (5 par cages) , avec enrichissement du milieu (tunnel et frisotis + ajout d’un morceau de bois à ronger si nécessaire).

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus adaptée à ce projet car elle est largement utilisée en recherche sur le cancer et le système immunitaire, et de nombreux outils scientifiques sont disponibles pour ce modèle. Les tumeurs utilisées sont spécifiquement compatibles avec les souris employées, ce qui permet de les étudier dans un organisme avec un système immunitaire intact et fonctionnel, proche des conditions réelles. Des souris jeunes adultes, âgées d'environ 7 semaines, seront utilisées. Cet âge correspond à un système immunitaire pleinement mature, garantissant des résultats fiables et reproductibles. Dans la première partie du projet, les animaux seront âgés d'environ 11 semaines en fin d'expérience. Dans la seconde partie, impliquant des tumeurs, la durée de suivi sera adaptée à la vitesse de croissance des tumeurs étudiées.

1 996 souris vont être utilisées, chacune ne subissant qu'une contention de trente secondes pour recevoir des bactéries ou une molécule inhibitrice, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection qui suit peut provoquer une gêne respiratoire, un dos voûté, une prostration et une perte de coloration de la peau, chez des souris adultes comme chez des souriceaux de deux jours. Toutes seront tuées pour le prélèvement de leurs organes, et le sexe des nouveau-nés sera lu sur des tissus prélevés après leur mise à mort. Le porteur reconnaît que la manipulation des souriceaux peut conduire la mère à les rejeter ou à ne plus les nourrir.

Objectifs

Le sepsis est une réponse immunitaire dérégulée entraînant un dysfonctionnement organique potentiellement mortel. Malgré les connaissances actuelles et les progrès de la prise en charge médicale, le sepsis demeure la principale cause de décès dans la plupart des unités de soins intensifs du monde et ne dispose pas de traitements efficaces. Cette réponse immunitaire dérégulée touche particulièrement les nouveaux-nés pour des raisons qui restent encore peu connues. Il est donc urgent de mieux caractériser les mécanismes cellulaires qui régulent les différents aspects responsables du déclenchement et du développement du sepsis et ses complications à long terme. Nos travaux ont montré le rôle essentiel de cellules immunitaires appelées macrophages dans le maintien des tissus. Dans ce projet, nous étudierons la réponse de ces cellules dans des modèles murins d’infection bactérienne, principale responsable du sepsis chez l'adulte et le nouveau-né. Puis en utilisant des souris qui ne possèdent pas ces macrophages nous examinerons leur implication dans le dysfonctionnement des tissus associés au sepsis. Ce projet permettra d’ameliorer nos connaissances sur les mécanismes responsables du déclenchement et du développement du sepsis et d’identifier de nouvelles cibles pour des applications thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables du déclenchement et du développement du sepsis (une réponse immunitaire dérégulée) et à terme de proposer de nouvelles options thérapeutiques pour les patients souffrants de sepsis.

Procédures

Dans ce projet les animaux vigiles seront soumis à des contentions pour leur administrer des bactéries (30 secondes, 1 fois) ou de molecules inhibitrices (30 secondes, 1 fois).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. L'infection pourrait induire des comportements d’une gêne ou d’une souffrance (gêne respiratoire ou poils hérissés ou dos voûté ou mobilité réduite ou absence de toilettage ou prostration chez la souris adulte ou perte de couleurs du la peau chez la souris adulte et nouveau-née. La manipulation des souriceaux peut également induire un stress chez les souriceaux et la mère qui peuvent mener au rejet par la mère et/ou absence d'alimentation chez le nouveau-né.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour réaliser les analyses nécessaires à notre étude.

Remplacement

Les mécanismes responsables du déclenchement et du développement de la réponse immunitaire dérégulée (sepsis) et le dysfonctionement des organes associés au sepsis reposent sur un ensemble de changements cellulaires et moléculaires complexes induits par une infection qui sont étroitement influencés par le système immunitaire. A ce jour, il n’existe donc pas d’autre alternative intégrée, comparable à l’utilisation des souris pour l’étude in vivo de ces mécanismes conduisant au sepsis et de l'implication du systeme immunitaire dans ce processus, nous permettant de remplacer l'utilisation des modèles de souris.

Réduction

Dans un but de réduction, nous proposons de faire des études "pilotes" pour definir les conditions (dose de bactérie et cinétique de la réponse des macrophages) afin de sélectionner une dose et un temps après infection pour prélever les tissus et répondre à notre objectif scientifique. Pour les procédures utilisant des souriceaux, nous utiliserons toute la portée et tous les sexes. Le sexe des souriceaux sera determiné sur des tissues prélevés après leur euthanasie.

Raffinement

Après infection, les souris adultes et nouveau-nées seront remises dans leur cage et surveillés toutes les heures jusqu’à 8 heures post infection et deux fois par jour (le matin et l'après-midi) pour les temps 24 et 48 postinfection par les personnes en charge de l'expérimentation. Les cages seront déposées sur des tapis chauffant pour éviter l'hypothermie qui peut survenir suite à l'infection Pour les souris adultes, nous déposerons de l'eau gelifiée et les croquettes alimentaires sur la litière de la cage pour s'assurer de l'hydratation et l'alimentation des animaux. Pour les souriceaux, les infections par seront faites en utilisant des seringues très fines et précises pour injecter de petits volumes. Le sexe des souriceaux sera determiné sur des échantillons de tissus prélevés sur animal euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle d'étude de l'infection bacterienne in vivo et du sepsis. De plus, les systèmes de défense et en particulier, les réponses des macrophages de l'hôte vis à vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. De plus les modèles murins utilisés sont déjà établis dans notre institut de recherche. Les animaux utilisés seront soit des souriceaux nouveau-nés de 2 jours soit des souris adultes agées de 8-12 semaines pour étudier l'implication des macrophages dans les mécanismes responsables du déclenchement et du développement de la réponse immunitaire dérégulée (sepsis) chez le nouveau-né et l'adulte.

Une solution censée améliorer la digestion des fourrages chez les ruminants, les lapins et les chevaux d'élevage passe d'abord par 144 souris. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gavées par sonde orogastrique pendant 21 jours, avec des prélèvements de selles deux fois par semaine. Chacune est hébergée seule, en cage sur grille, pour permettre la mesure individuelle de ce qu'elle ingère et excrète. Toutes seront tuées puis autopsiées, et le porteur affirme que les effets du produit ne s'évaluent que sur un organisme "pris dans sa globalité".

Objectifs

L’objectif général du projet est l’amélioration de la digestibilité des fibres chez les monogastriques ainsi que chez les polygastriques. En effet, ce processus, réalisé par un microbiote spécialisé hébergé dans le tractus digestif des individus mono ou polygastriques est essentiel à la nutrition et au bien-être digestif de l'hôte. Les fibres, apportées sous forme de fourrages frais (herbe pâturée), secs (foin) ou ensilés sont un composant essentiel des rations ingérées dans une grande diversité de systèmes d’élevage quel que soit le modèle animal ciblé (ovins, bovins, caprins, equins, lapins...). Le microbiote responsable de cette digestion est remarquablement efficace du fait de la production d’une large gamme d’enzymes (cellulases, hémicellulases) capables d’hydrolyser les polysaccharides complexes présents dans les fourrages, permettant la conversion en composés énergétiques majeurs (acides gras volatils ou à chaine courte) utilisables par l’animal hôte. Cependant, de nombreux facteurs (composition de la ration, stress environnemental…) peuvent réduire la capacité de ce microbiote à assurer sa fonction fibrolytique. Notre objectif est donc basé sur le développement de stratégies nutritionnelles permettant d’améliorer la digestibilité des fibres afin de compenser ce déficit.

Bénéfices attendus

Ce travail doit permettre de mettre en évidence le bénéfice de l'apport d'une fraction microbienne sur l'augmentation de la capacité de leur hôte à dégrader et digérer les fibres issues de sa ration.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 types d'intervention au cours de ce projet : 1) Le gavage orogastrique et sa répétition (21 jours) pendant le développement du projet peuvent être source de stress, lié à la contention de l'animal et de blessure lors de l'introduction de la sonde d'intubation. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute) ainsi que le risque de blessure, 2) le prélèvement de selles chez l'animal qui peut, également, être source de stress lié à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (2 fois pas semaine) et la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités.

Impact sur les animaux

L'objectif de ce projet étant d'optimiser le potentiel de dégradation fibrolytique de l'animal, l'apport fractions microbiennes provenant de bactéries connues pour cette activité de dégradation fibrolyitque et exemptes de bactéries vivantes, n'entrainera aucune nuisance pour la santé de l'animal cependant, le geste technique du gavage orogastrique et sa répétition pendant le déroulé du projet peuvent être source de stress, lié à la contention de l'animal et de blessure lors de l'introduction de la sonde d'intubation. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute) ainsi que le risque de blessure. De la même façon, le prélèvement de selles chez l'animal peut être source de stress lié, également, à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (2 fois par semaine) et de la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités. Enfin, l'hébergement en cage individuelle et sur grille peut également source de stress pour les animaux, cette situation fera l'objet d'une évaluation attentive et sera atténuée par la capacité conservée de l'animal à visualiser/sentir ses congénères et par des grilles adaptées pour les souris . Pour toutes ces interventions, un arbre décisionnel est appliqué lorsqu'un point limite apparait.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure, puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.

Remplacement

L’impact de l'apport de fractions microbiennes sur l'augmentation des capacités fibrolytiques des herbivores mono et polygastriques nécessite le recours à un modèle in vivo pour atteindre notre objectif. Les effets bénéfiques potentiels de ces produits ne peuvent être évalués que sur un organisme pris dans sa globalité et dans un premier temps sur un modèle murin.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au strict nécessaire pour observer des effets statistiquement significatifs. Les animaux utilisés sont des souris mâles et femelles conventionnelles, qui seront hébergées dans les conditions réglementaires au sein de l'installation. 3 séries d’expérimentations seront réalisées sur ce modèle murin. Chaque expérience sera constituée de 2 lots de 24 souris conventionnelles (12 femelles et 12 mâles par lot) : - un lot de 24 souris TEST qui recevra par gavage orogastrique les fractions microbiennes - un lot de 24 souris TEMOIN qui recevra par gavage orogastrique l'équivalent en volume d'un tampon isotonique. De plus, les tissus prélevés seront soient analysés pour répondre au questionnements scientifiques proposés par le projet, soient conservés pour de futures analyses, non préalablement prévues dans le cadre du projet, et qui pourraient complémenter les résultats obtenus. Ainsi, 144 souris au total seront utilisés pour ce projet

Raffinement

Les procédures, nécessitant un raffinement de leur exécution pour limiter leur impact sur les animaux, sont les gavages orogastriques ainsi que les prélèvements de selles. Celles ci seront réalisées par des zootechniciens formés et expérimentés qui permettront de limiter la durée de la procédure par animal (moins d'une minute pour le gavage et les prélèvements de selles). De plus, avant la première intervention, une habituation à la contention sera réalisée prélalablement par ces zootechniciens permettant ainsi de diminuer le stress suceptible d'être occasionné par ce geste technique. Les animaux font l'objet d'une surveillance quotidienne pour détecter, réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse.

Choix des espèces

Les souris seront agées de 10 semaines à leur arrivée au sein de l'établissement utilisateur, ce stade de développement, jeune adulte, est optimal pour des études de digestibilité des fibres et correspond aux animaux cibles de la stratégie nutritionnelle (stade adulte)