Souris
Étude de l’efficacité d’un candidat médicament sur un modèle de fibrose hépatique induite par le tétrachlorure de carbone (CCl4) chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Trois injections par semaine d'un agent toxique qui détruit les cellules du foie, pendant six semaines, avec jusqu'à trois administrations quotidiennes du candidat médicament et jusqu'à trois prises de sang hebdomadaires, 1 380 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie reçoit le traitement par une pompe implantée chirurgicalement. Toutes sont tuées à l'issue, après une ponction sanguine dans le cœur sous anesthésie, pour prélever et analyser leurs organes. Le porteur écrit que le bien-être des souris "est une priorité" et décrit dans le même dossier une accumulation de liquide dans l'abdomen, une perte d'appétit, une baisse de mobilité et la mort possible des animaux dans les cas les plus sévères.
Objectifs
La fibrose du foie est la conséquence secondaire de maladies touchant le foie et correspond au remplacement de ces cellules saines par du tissu cicatriciel rendant le foie rigide et altérant son fonctionnement. L’exposition à divers facteurs, telles que la consommation excessive d’alcool et de certains médicaments, la présence de maladies virales du foie ou encore l’obésité et le surpoids favorisent le développement de cette pathologie. La fibrose du foie, si elle n’est pas traitée, peut évoluer en cirrhose ou à un cancer du foie. Les stratégies thérapeutiques actuelles visent à agir sur les maladies sous-tendant la fibrose du foie mais aucun traitement efficace n’existe à ce jour pour faire régresser le développement du tissu cicatriciel et donc de la fibrose. Il est donc nécessaire de pouvoir développer et tester de nouveaux médicaments permettant de soigner cette pathologie. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité de nouveaux médicaments dans le modèle préclinique de fibrose du foie induit par un agent toxique altérant spécifiquement le foie chez la souris. Cet agent provoque des mécanismes physiologiques similaires à ceux retrouvés chez les patients ayant une fibrose du foie. Il constitue donc un modèle préclinique de choix pour tester de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Le modèle de fibrose du foie induite par un agent toxique apparait comme un modèle élaboré permettant de reproduire la plupart des mécanismes impliqués dans la fibrose chez l’Homme. Ce dernier provoque spécifiquement la destruction des cellules du foie, que l’organisme tente de réparer en formant une cicatrice interne. Avec le temps, ces cicatrices s’accumulent et empêchent le foie de bien fonctionner. Grâce à ce modèle, de nouveaux médicaments peuvent être testés et il est possible d’identifier ceux qui pourraient réellement améliorer la santé, avant de les essayer chez l’Homme.
Procédures
Au cours de l’étude, les animaux recevront des injections répétées de l’agent toxique (durée d’environ 1 minute), à raison de trois fois par semaine pendant une période maximale de six semaines. En parallèle, le candidat médicament pourra être administré (durée de 1 à 5 minutes), jusqu’à trois fois par jour pendant un maximum de sept semaines, soit par injections, soit via l’implantation chirurgicale d’une pompe (intervention d’environ 15 minutes) permettant une libération continue du traitement. Des prélèvements sanguins seront effectués sur des animaux vigiles (environ 5 minutes), jusqu’à trois fois par semaine, afin d’assurer le suivi biologique, ainsi qu’un prélèvement terminal réalisé sous anesthésie (environ 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à plusieurs administrations dans l’abdomen d’un agent toxique provocant des dommages du foie et pouvant entrainer une irritation et une inflammation locale de l’abdomen. Cet agent peut induire des douleurs ou de l’inconfort. Dans les cas les plus sévères, il peut être observé une accumulation de liquide dans l’abdomen ou la mort des animaux. Une baisse de la mobilité des animaux tout au long du protocole peut être observée ainsi qu’une perte d’appétit et une baisse de l’hydratation entrainant une perte de poids. L’administration répétée de médicaments peut générer du stress, car elle nécessite une manipulation et une contention des animaux. Certains effets indésirables liés aux médicaments testés ou aux gestes techniques peuvent survenir, en particulier avec de nouvelles molécules. La chirurgie d'implantation de pompes délivrant le médicament testé peut être à l'origine d'une gêne, de douleur ou d'infection. Des prises de sang seront réalisées avec contention, ce qui peut entraîner un inconfort temporaire, du stress ou une douleur légère. En fin de protocole, les animaux subiront un prélèvement de sang directement dans le cœur effectué sur animaux anesthésiés.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever et analyser des organes
Remplacement
L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composés. Afin d’évaluer l’effet de candidats médicaments sur les marqueurs de l’inflammation et de fibrose des tissus du foie, le recours à un modèle animal est nécessaire. En effet, le modèle utilisant des cellules ne permet pas d’induire et d’étudier les répercussions dans un organisme biologique, ni d’évaluer les répercussions sur des indicateurs de maladie du foie libérés dans le sang, ou encore d’étudier la présence des nouveaux traitement dans l'organisme.
Réduction
Ce modèle expérimental consiste à provoquer une fibrose du foie chez la souris grâce à l’injection d’un agent toxique. Il est bien connu et fiable, ce qui permet d’obtenir des résultats reproductibles tout en utilisant moins d’animaux. Pendant l’expérience, des prises de sang sont réalisées pour mesurer des marqueurs indiquant si le foie est abîmé. Ces mesures servent à deux choses : 1/ mieux organiser les groupes d’animaux en répartissant les souris en groupes équilibrés selon leur niveau d’atteinte du foie, ce qui rend les comparaisons plus fiables, et 2/ suivre l’évolution dans le temps la progression de la maladie et l’effet des traitements sur les mêmes animaux, ce qui évite d’en utiliser davantage.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux bénéficient d’une période d’adaptation d’au moins 5 jours pour s’habituer à leur nouvel environnement. Leur bien-être est une priorité : ils sont surveillés attentivement afin de détecter et limiter toute douleur ou signe de stress. Des critères précis sont définis à l’avance pour intervenir si nécessaire. Les animaux sont hébergés en petits groupes (2 à 3 par cage) et disposent de plusieurs éléments pour s’occuper (morceaux de bois, papier, rouleaux en carton), renouvelés régulièrement pour éviter l’ennui. Toutes les interventions (comme les chirurgies) sont réalisées sous anesthésie et avec des traitements antidouleur. Les animaux sont également habitués à la manipulation et à leur environnement pour réduire leur stress. Après chaque injection du produit toxique, les animaux sont observés attentivement (notamment une heure après), puis contrôlés tous les jours pour repérer tout signe inhabituel. De la nourriture enrichie est mise à leur disposition pour éviter une perte de poids, et de l’hydratation peut être apportée si nécessaire. Les prélèvements sanguins et les injections (traitements, antidouleurs, hydratation) sont réalisés en respectant strictement les recommandations éthiques, avec des doses adaptées pour ne pas nuire aux animaux. Après chaque prise de sang, un apport en liquide est prévu pour compenser la perte. Si des effets inattendus apparaissent avec les nouveaux traitements, l’état des animaux est évalué avec une grille de suivi, et un vétérinaire est consulté afin d’adapter leur prise en charge. Enfin, les prélèvements de sang réalisés au niveau du cœur sont effectués sous anesthésie.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée en préclinique pour les modèles de fibrose du foie, dont elle constitue l’un des modèles de référence. Ceci permet de s’appuyer sur une abondante littérature et de comparer les résultats obtenus à un large ensemble de données existantes. Le développement de la pathologie est bien caractérisé, stable et reproductible dans cette espèce. Des souris âgées de 6 semaines minimum (entre 20-50g) seront utilisées en début de protocole car des souris dont le poids est inférieur à 20 g sont soumises à un plus grand risque de mortalité.
Evaluation en modèle murin d’antiviraux et candidats thérapeutiques contre les infections respiratoires virales humaines
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Tuées à l'issue parce qu'infectées et donc écartées de tout autre protocole, 1 240 souris vont être utilisées, dont 1 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une administration intranasale de virus sous anesthésie, puis un gavage quotidien pendant sept jours et une injection quotidienne pendant huit jours, avec une pesée chaque jour. Le porteur indique que les souris infectées développeront une perte de poids sur un à dix jours, une accélération du rythme respiratoire et une baisse d'activité, et que le gavage peut "très exceptionnellement" perforer l'œsophage. Les bénéfices annoncés, de nouveaux traitements antiviraux pour des patients humains, sont renvoyés au long terme, l'objectif immédiat restant de valider dose et durée de traitement chez la souris.
Objectifs
Plusieurs virus respiratoires humains parmi les plus courants ne disposent pas encore de traitements thérapeutiques ou prophylactiques adaptés et efficaces. Dans ce projet, nous souhaitons donc évaluer chez la souris la capacité de nouvelles molécules à traiter ou à prévenir plusieurs infections respiratoires virales lorsque ces traitements sont administrés après ou avant une infection maitrisée de l’animal. L’objectif de ce projet est : (1) D’évaluer l’efficacité antivirale de nouvelles molécules candidates ciblant la cellule hôte ; (2) De comprendre davantage les mécanismes de l’action antivirale de ces molécules candidates ; (3) D’évaluer l’efficacité théraupeutique ou prophylactique de combinaison de molécules candidates.
Bénéfices attendus
(1) Valider chez la souris l’efficacité antivirale, la dose, la durée de traitement pour une molécule candidate ; (2) Valider chez la souris l’efficacité antivirale, la dose, la modalité d’administration et la durée de traitement pour une molécule candidate administrée en combinaison avec une molécule antivirale classique. Les bénéfices attendus d’une combinaison de molécules sont (i) de réduire les durées de traitement et (ii) de réduire les doses de molécules administrées pour une efficacité antivirale conservée, (iii) de réduire le risque d’émergence de mutations de résistance aux antiviraux ; (3) Décrire et comprendre de nouveaux mécanismes d’action antivirale de molécules ; (4) A plus long terme, proposer de nouveaux traitements antiviraux pour des patients humains atteints d’infections respiratoires virales.
Procédures
- Pesée quotidienne et individuelle de chaque animal (animal vigile). 15 secondes par geste ; - 1 injection quotidienne pendant 8 jours successifs maximum par animal. 15 secondes par geste ; - Administration intranasale sous anesthésie générale. 1 fois par animal. 30 secondes par geste ; - 1 gavage quotidien pendant 7 jours successifs maximum par animal. 30 secondes par geste.
Impact sur les animaux
Les animaux infectés développeront des signes de pathologies respiratoires, caractéristiques des infections à virus respiratoires : une perte de poids sur une durée de 1 à 10 jours après administration intranasale de virus + une accélération du rythme respiratoire + une perte d’activité légère entre 2 et 7 jours après administration intranasale de virus. Les souris pourraient aussi subir des effets indésirables après la réalisation des gestes techniques de l’administration des molecules candidates par gavage ou par injection ou de l’administration d’anesthésiques par injection. Ces effets indésirables seraient des douleurs locales au site d’injection et de courte durée. Très exceptionnellement, le gavage peut induire une perforation de l’œsophage.
Devenir
Les animaux ayant été infectés et/ou traités, ne pourront pas être reutilisés dans d’autres protocoles. De ce fait, tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale.
Remplacement
Les étapes de sélection des molécules antivirales candidates sont réalisées en amont de ce projet sur des modèles alternatifs in vitro et ex vivo. Cette sélection minutieuse permet de sélectionner les molécules avec les meilleures potentiels efficacités antivirales avant leurs évaluations chez la souris. En effet, les interactions entre le virus et l’individu infecté sont beaucoup trop complexes pour être réduites à l’utilisation de tels modèles, ainsi le recours au modèle animal reste indispensable pour comprendre, caractériser et sélectionner les modalités thérapeutiques les plus prometteuses pour une utilisation chez l’Homme et une évaluation clinique.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés par groupe expérimental tiendra compte du nombre minimal d'animaux pour atteindre une relevance expérimentale, réaliser des tests statistiques et maintenir des groupes sociaux au sein de chaque cagée, en tenant compte des animaux consacrés aux prélevements terminaux. Dans la mesure du possible, les groupes contrôle d'animaux seront mutualisés pour réduire le nombre total d'animaux.
Raffinement
Suite à l’anesthésie générale profonde ou un geste d’administration, un suivi accru sera fait jusqu’à réveil et reprise d’activité de chaque animal. A partir de l’infection virale, chaque animal fera l'objet d'une surveillance pendant 10 jours successifs au rythme de 1 fois par jour, accrue à 2 fois par jour au besoin, des 5 paramètres déjà pré-établis prédictifs de l’atteinte des points limites (poids, toilettage, posture, activité, isolement). Les potentielles nuisances identifiées lors de la réalisation des procédures seront prises en compte pour le raffinement des prochains protocoles, incluant l’éventuelle réalisation d’une analgésie avant la réalisation de gestes potentiellement source de douleur.
Choix des espèces
Bien que les modèles expérimentaux in vivo pour l’étude des infections respiratoires se soient diversifiés ces dernières décenies, aucun de ces modèles ne réflètent complètement la pathologie et la réponse immunitaire chez l’humain. Pour cela, les souris restent les modèles sur petits animaux les mieux caractérisés dans le cas des infections par des virus respiratoires. A ce stade de notre projet, il n’y a pas de justification à l’utilisation d’un autre modèle animal sans une validation au préalable chez la souris. Adapté aux besoins de ce projet, la souris permet l’observation de signes cliniques liés à l’évolution de la pathologie respiratoire mais aussi de mesurer aisément les marqueurs de la réplication du virus et de l’inflammation dans les voies respiratoires. En plus, le modèle murin est parfaitement maitrisé depuis plusieurs années par les responsables et manipulateurs. Nos précédentes expérimentations ainsi que celles d’autres équipes ont montrés que des souris sevrées âgées de 4 à 8 semaines au début du protocole sont bien adaptées aux besoins de ce projet, puisque ce modèle permet non seulement l’observation de signes cliniques liés à l’évolution de l’infection respiratoire mais aussi de réaliser aisément les analyses nécessaires à ce projet.
Immunisations pour développement d’anticorps
- Production de routine
- Tests réglementaires
Rats : 22
Pour produire des anticorps commandés par des entreprises clientes, 1 118 souris et 22 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sévère pour 18 souris. Les immunisations vont de quatre à sept par animal, suivies d'un à deux prélèvements sanguins puis d'un prélèvement terminal, tous les individus étant tués pour récupérer sang, rate et ganglions. Le porteur affirme que les anticorps d'origine animale restent "indispensables" pour certains usages diagnostiques et thérapeutiques, tout en écrivant proposer d'abord à ses clients des options sans animaux. L'activité relève de la sous-traitance, le nombre d'animaux utilisés dépendant des commandes reçues, à raison de trois à cinq souris ou deux rats par cible demandée.
Objectifs
Nous utilisons des animaux dans le cadre de prestations en sous-traitance pour d’autres entreprises/partenaires qui utilisent les anticorps (1) dans leurs activités de recherche (2) pour le développement de tests de diagnostic, (3) pour la thérapeutique. Notre société utilise donc des animaux si nécessaire afin d’isoler et produire lesdits anticorps indispensables à la réalisation des demandes de nos clients en l’absence d’alternative satisfaisante (les options de remplacement ne faisant pas appel à l’animal disponibles leur étant proposées).
Bénéfices attendus
Bien que nous nous inscrivions dans une démarche de transition progressive, l’utilisation d’animaux pour la production d’anticorps reste indispensable pour certains cas spécifiques en l’état actuel de la technologie. Les besoins en anticorps d’origine animale ont des raisons bien précises, par exemple : -pour la production d’anticorps présents dans des médicaments sous AMM (autorisation de mise sur le marché) ou ATU (autorisation temporaire d’utilisation) en l’absence d’alternative satisfaisante. -Lorsque les anticorps utilisés pour des produits diagnostiques n’ont pas encore put être remplacées par des anticorps produits par des méthodes ne faisant pas appel à l’animal. -Les anticorps à façon utilisés en recherche restent indispensables par leurs spécificités, les immunisations sont en effet dirigées contre des cibles complexes où l’on n’a pas encore trouvé de substitution satisfaisante à l’utilisation d’animaux. Ce projet a pour objectif la production d’anticorps d’intérêt pour nos clients, lorsque ceux-ci ne sont pas disponibles par d’autres méthodes que l’immunisation initiale d’animaux.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements (1 à 2 prélèvements de sang (durée inférieure à 1 min) en cours de manipulation et un prélèvement terminal (durée inférieure à 1 min), tous avec anesthésie générale gazeuse) et à des injections (de 4 à 7 immunisations de 30 secondes chacune).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront être sujets à du stress lors des manipulations, à de possibles petites protubérances aux sites d’injection sous-cutané (possibles mais jamais observés avec les doses utilisés) et à une fatigue à la deuxième injection (réponse immunitaire forte). Ainsi que des douleurs légères lors des injections (piqure d'aiguille). Les additifs utilisés (dans les volumes et concentrations utilisés) ne présentent pas d’effets secondaires décelables. Les prélèvements de sang se font sous anesthésie générale et sont de courte durée (inférieur à 1 minute). Le temps de récupération des animaux entre les différentes étapes d’immunisation et de prélèvement nous impose un suivi au plus proche de l’animal selon comment celui-ci va répondre à l’expérimentation. Les animaux sont mis à mort en fin de protocole pour prélèvements de sang et d’organes.
Devenir
Les animaux seront mis à mort, car nous avons besoin de récupérer un maximum de sang ainsi que divers organes afin de garantir une efficacité maximale de nos expérimentations.
Remplacement
Des méthodes alternatives n’utilisant pas l’animal sont proposées aux clients en première intention cependant lorsqu’elles s’avèrent inadaptées et/ou trop peu efficaces alors les modèles rongeurs s’avèrent particulièrement bien adaptés aux demandes spécifiques de nos clients.
Réduction
Il n’est utilisé que le nombre d’animaux strictement nécessaire par projet afin de pallier les risques : 1-d’une réponse immunitaire trop faible des individus immunisés 2-du décès d’animaux en cours de protocole ce qui compromettrai le projet. Cela se traduit en pratique par l’utilisation de 3 à 5 souris (selon la spécificité de l’immunisation) ou 2 rats par cible. Le modèle animal n’étant utilisé que lorsque cela se justifie scientifiquement.
Raffinement
Les animaux sont anesthésiés lorsque cela est nécessaire et euthanasiés si les points limites (définis dans chacune des procédures) sont atteints. Si les doses injectées se révèlent trop agressives alors celles-ci sont diminuées. A la fin du projet, tous les animaux sont euthanasiés, la rate et/ou les ganglions des individus dont la réponse immunitaire est jugée la meilleure sont alors prélevés. Les animaux seront soignés et surveillés de manière fréquente par le personnel compétent.
Choix des espèces
Le développement d’anticorps est classiquement réalisé à partir de souris immunisées. Dans certains cas, l’utilisation de rats peut être préférable, notamment dans le cas où la cible ne fonctionnera pas chez souris. L'immunité des systèmes complexes présents chez les animaux ne pouvant pas toujours être remplacé par des systèmes autres. Les anticorps monoclonaux constituent un outil scientifique de choix pour mener à bien des projets R&D. La production d’anticorps nécessite l’utilisation d’animaux en l’absence d’alternative satisfaisante. Les animaux sont utilisés à l’âge de 7 à 9 semaines en début d’expérimentation, lorsque leur système immunitaire est le plus à même de répondre.
Etude de l’effet de la transplantation d’organoïdes adipeux bruns humains sur le métabolisme de la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Greffées sous la peau avec des organoïdes de graisse brune humaine, 120 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent l'injection de cellules sous anesthésie, deux injections de glucose ou d'insuline suivies de prises de sang à la queue, puis un passage en cage métabolique où elles sont isolées, sans enrichissement possible parce que le coton risquerait d'interférer avec les mesures. Le projet cherche à savoir si ces organoïdes modifient le métabolisme du glucose et la dépense énergétique, dans la perspective d'une thérapie cellulaire contre l'obésité. Le porteur classe l'ensemble en souffrance légère tout en indiquant que la greffe peut provoquer des douleurs modérées, et les souris sont tuées 37 jours après l'injection pour prélever tissu adipeux, pancréas et foie.
Objectifs
Des résultats montrent que les organoïdes adipeux bruns issus de cellules souches pluripotentes induites humaines pourraient être potentiellement impliqués dans la résistance à l'obésité. De nouveaux résultats montrent que ces organoïdes, lorsqu'ils sont vascularisés, augmentent l'expression de protéines et pourraient avoir une application thérapeutique pour augmenter la dépense énergétique et diminuer la prise de poids en réponse à un régime hypercalorique. L'objectif du projet est d'étudier le potentiel de ces organoïdes de moduler l'homéostasie du glucose et énergétique. Pour cela, nous grefferons ces organoïdes dans des souris immunodéprimées et analyserons leur métabolisme du glucose et énergétique.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus au cours de ce projet nous permettront d’identifier in vivo de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d'améliorer la tolérance au glucose et à l'insuline, au cours l'obésité. Les organoïdes issus de cellules souches pourraient ainsi représenter une nouvelle approche de thérapie cellulaire pour le traitement de l'obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection de cellules sous la peau qui sera réalisée en condition stérile. Quatorze jours après, une injection de glucose et une prise de sang seront réalisées pour déterminer la glycémie. Trente jours après l’injection sous cutanée des cellules, la glycémie sera mesurée après injection d'insuline par un prélèvement sang. Trente-trois jours après l’injection sous cutanée, les animaux entreront en cage métabolique afin de mesurer leur dépense énergétique. L'animal étant seul dans sa cage, un enrichissement sera prévu pour son bien-être (maison à souris).
Impact sur les animaux
Les différents protocoles pourront engendrer un stress chez les animaux suite aux diverses manipulations ainsi que des douleurs légères. Bien que classiquement réalisée sur des souris, notamment en cancérologie, la greffe est susceptible d'induire des douleurs modérées chez les animaux et/ou des variations de comportements. Pour pallier ce risque, les animaux seront manipulés dans des pièces dédiées et calmes avec une surveillance quotidienne pour détecter le moindre signe de souffrance (blessure, posture ou comportements anormaux, perte de poids importante). LA GREFFE SERA REALISEE SUR DES ANIMAUX ANESTHESIES (ISOFLURANE) ET UNE CREME ELMA SERA APPLIQUEE SUR LE SITE D'INJECTION. LE POINT D'INJECTION SERA DESINFECTE AVEC DE LA VETEDINE. UNE FICHE PAR SOURIS SERA ETABLIE DANS LAQUELLE NOUS NOTERONS LES 5 PREMIERS JOURS (LE POIDS, LA TEMPERATURE PRISE PAR UN THERMOMETRE RECTAL) ET LEUR ETAT GENERAL (PILOERECTION, MOTRICITE, COURBURE DU DOS, ...). LORS DE LA REALISATION DES PRELEVEMENTS SANGUINS AU NIVEAU DE LA QUEUE NOUS FERONS UNE ANESTHESIE LOCALE AVEC LA CREME EMLA POUR FAIRE L'INCISION. LORS DU DERNIER PRELEVEMENT NOUS APPLIQUERONS DE LA VETEDINE POUR DESINFECTER L’INCISION. LORS DU PASSAGE EN CAGE METABOLIQUE CES ANIMAUX SERONT ISOLES. INFORMATIQUEMENT ON PEUT SUIVRE L'ACTIVITE DE L'ANIMAL DANS SA CAGE AINSI QUE DIFFERENTS PARAMETRES (PRISE DE NOURRITURE, DE BOISSON, ACTIVITE MOTRICE, ...). CES ANIMAUX AURONT EGALEMENT UN SUIVI VISUEL. IL EST DIFFICILE D'ENVISAGER DE L'ENRICHISSEMENT DANS CES CAGES METABOLIQUES (COTON, PAPIER, ...) CAR CE RISQUE D'INTERFERER AVEC LES PARAMETRES METABOLIQUES QUE NOUS VOULONS ETUDIER. NOUS POUVONS AJOUTER UNE MAISON A SOURIS MAIS CELA EST DECONSEILLE PAR LE FABRICANT (PROMETHION). LORSQUE LES ANIMAUX SONT EXPOSES AU FROID (PROCEDURE 5 : 4°C 4HR), SI NOUS OBSERVONS UNE BAISSE DE LA TEMPERATURE CORPORELLE EN DESSOUS DE 28°C, L'ANIMAL SORTIRA DU PROTOCOLE ET SERA PLACE SOUS UNE LAMPE CHAUFFANTE. POUR LES PROCEDURES 1 (INJECTION SOUS CUTANEE DE CELLULES HUMAINES CHEZ LES SOURIS NSG) ET 4 (ANALYSE DU METABOLISME EN CAGE METABOLIQUE) LE POURCENTAGE DE PERTE DE POIDS EST DE 20% CAR LES ANIMAUX PEUVENT PERDRE DU POIDS DU AU STRESS DE L'INTERVENTION CHIRUGICALE OU DU A L'ISOLEMENT DANS LES CAGES METABOLIQUES (OBSERVATION DANS DES PROJETS PRECEDENTS). DANS LE CAS DES PROCEDURES 2 ET 3 (IPGTT ET ITT) LE POURCENTAGE DE PERTE DE POIDS EST DE 15% DU A LA MISE A JEUN DES ANIMAUX POUR LA RELAISATION DE CES PROCEDURES.
Devenir
Le but de ce projet est de déterminer le rôle des organoïdes adipeux bruns humains vascularisés ou non sur le métabolisme énergétique dans un organisme entier. Les organoïdes en culture ne permettent pas de répondre à cette question. Pour cela nous avons choisi de suivre la glycémie en suivant ces paramètres sanguins après une injection de glucose ou d’insuline. L’usage des cages métaboliques nous permettra de définir le rôle de cette greffe sur le métabolisme énergétique de manière plus précise. A la fin du projet les animaux seront mis à mort pour prélever les tissus afin de réaliser des analyses des tissus métaboliques (tissu adipeux, pancréas, foie) et expression de gène dans le métabolisme énergétique.
Remplacement
Des expérimentations in vitro, réalisées sur les organoïdes, montrent des résultats très encourageants quant au rôle de la vascularisation dans la régulation du métabolisme mitochondrial. Toutefois ces modèles d'organoïdes, issus de lignées cellulaires souches, sont limités et ne permettent pas d'appréhender la complexité de l'organisme et d'étudier la communication inter-organe, qui peut jouer un rôle important au cours de la régulation de l'homéostasie du glucose et de l'obésité. Ainsi, l'utilisation de modèles de souris immunodéprimées permet d'évaluer, dans des conditions physiologiques et physiopathologiques, l'impact de cette nouvelle source de cellules, afin de mieux comprendre et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de l'obésité. L'ETUDE DU METABOLISME (ABSORPTION, ASSIMILATION) AU SEIN D’UN ORGANISME VIVANT NECESSITE UN SYSTEME INTEGRE DANS LEQUEL LES ORGANES COMMUNIQUENT ENTRE EUX. AUSSI LA GREFFE D ORGANOIDE EST NECESSAIRE POUR ETUDIER LA FONCTIONNALITE DE CES DERNIERS.
Réduction
Pour définir statistiquement le nombre d'animaux nécessaires, une étude de puissance basée sur les résultats obtenus précédemment est utilisée pour réduire au minimum le nombre d'animaux, permettant ainsi de déterminer le nombre exact d'animaux par expérimentation en fonction des paramètres recherchés.
Raffinement
Un suivi quotidien et une observation des animaux sont réalisés par les membres de l'équipe de l'animalerie dans laquelle les animaux sont hébergés. Les membres de l'équipe travaillant sur ce projet suivent également les animaux afin de garantir leur bien-être et minimiser au maximum leurs éventuelles souffrances. L'état général des animaux est évalué tous les jours par des observations quotidiennes et pesées hebdomadaires.
Choix des espèces
À la suite du développement de la culture d'organoïde en tissus adipeux bruns humains dans des conditions in vitro très contrôlées, nous voulons étudier le rôle de ces organoïdes au sein d'un organisme entier. Pour cela nous avons choisi un modèle murin immunodéprimé permettant de transplanter des cellules humaines, qui présente une pilosité et une absence de certaines cellules immunitaires. Les animaux seront commandés à l'âge de 6 semaines. Ces souris seront en acclimatation dans leur nouvel environnement durant 1 semaine. Elles recevront une injection d'organoïdes à partir de la septième semaine et seront mises à mort 37 jours après l'injection d'organoïdes.
evaluation du role des vesicules extracellulaires dans le syndrome de Sjogren
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une étude pilote de quatre-vingt-dix souris précède l'expérience principale, qui porte le total à 1 140. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront mises à mort. Le projet mesure l'effet de vésicules extracellulaires issues de lymphocytes B, de neutrophiles, de monocytes et de plaquettes sur le syndrome de Sjögren, maladie auto-immune qui touche entre 0,01 % et 0,3 % des adultes. Deux lignées servent à reproduire la pathologie, l'une dépendante des lymphocytes T, l'autre des lymphocytes B, mais les actes infligés à ces souris tiennent en une ligne, prélèvements de sang sur animaux vigiles ou endormis et injection intraveineuse, sans nombre ni fréquence.
Objectifs
Dans ce projet, nous souhaitons explorer le rôle des vésicules extracellulaires dans le syndrome de Sjögren (SjS). Le syndrome de SjS est une maladie rare, touchant entre 0,01% et 0,3% de la population adulte, mais reste la maladie auto-immune systémique la plus fréquente après la polyarthrite rhumatoïde (PR). Cette pathologie inflammatoire systémique affecte majoritairement les glandes salivaires, lacrymales et les muqueuses, lié à une infiltration des glandes correspondantes par des cellules immunitaires. Cependant, après analyse d’une cohorte de plus de 100 patients, il s’avère que d’autres cellules seraient activées pendant la maladie, mesurées par la génération de vésicules extracellulaires. Ces vésicules extracellulaires (lymphocytes T et B, plaquette, neutrophile, monocyte etc) sont abondantes dans les sérums de patients atteints de Sjogren comparés aux contrôle sain. Il est donc important d’évaluer leurs impacts sur la pathologie, déterminer leurs interactions avec les cellules et les organes. Axe 1. Evaluation des vésicules extracellulaires en circulation dans les modèles de souris du syndrome de Sjögren comparé à des souris wild type . Axe 2. Evaluation de l’impact des vésicules extracellulaires totale dans le syndrome de Sjögren Axe 3. Evaluation de l'impact des vasicules extracellulaires de lymphocyte B, neutrophiles, monocytes et de plaquettes dans le syndrome de Sjögren
Bénéfices attendus
Le choix d’utiliser le modèle de Sjogren TgIL14 et le modèle MRL/lpr a été basé sur la littérature, la présence d’autoanticorps (modèle MRL/lpr), la physiologie de la pathologie (TgIL14). Par ailleurs, le modèle MRL/lpr est « T-dépendant » alors que le modèle « IL14 » est « B-dépendant » ce qui permet de récapituler les principaux éléments de la physiopathologie du syndrome de Sjögren. Afin d’étudier le rôle des vésicules extracellulaires dans la physiologie du syndrome de Sjogren, nous avons décidé d’injecter des vésicules extracellulaires « totale » issues de souris atteintes de Sjogren mais aussi des vésicules extracellulaires de lymphocyte B, neutrophile, monocyte et plaquette issues de souris Sjogren. Il est complexe de modéliser les interactions des vésicules extracellulaires avec les cellules circulantes ou organes in vitro. C’est pourquoi l’axe 1 et 2 de cette demande éthique permettra d’évaluer dans un modèle murin, l’implication des vésicules extracellulaires dans le syndrome de Sjogren.
Procédures
prélèvements de sang sur animaux vigiles et endormis, injection en intraveineuse
Impact sur les animaux
Les seuls effets indésirables que les animaux peuvent ressentir seront liés aux manipulations lors des injections. Ces gestes seront effectués par du personnel compétent. Une attention particulière et un monitoring sera effectué sur les souris recevant les vésicules extracellulaires.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux.
Remplacement
Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L’implication des vésicules extracellulaires dans une pathologie nécessite l’évaluation sur un modèle vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisante. Nous avons au préalable évalué in vitro le statut d’activation des plaquettes chez l’homme (cohorte de patient atteint du syndrome de Sjogren et de donneur sain). Afin de réduire le protocole, une étude pilote sera réalisée avant l'étude principale, dont les résultats seront utilisés pour l’axe 1, 2 et 3 utilisera (20+70) 90 souris afin d’optimiser et d’évaluer les quantités de vésicules extracellulaires que l’on peut extraire et produire. Dans l’étude principale, des groupes contrôles ainsi que plusieurs groupes de souris permettront par la suite de répondre à l’hypothèse de travail, le détail des groupes est abordé. Considérant une variance hypothétique maximale de 16%, le nombre minimal d’animaux nécessaire a l’observation d’une difference significative pour une mesure unique, si elle existe, est de 10 par groupe experimentale (a
Raffinement
Le bien-être animal est au cœur de cette étude. Nous veillerions à ce que l’hébergement des animaux leur permettent d’avoir un enrichissement (avec paille, bois, coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les contraintes subies par les animaux sont faibles. Il s’agit d’une étude de vieillissement avec une manipulation réduite des animaux (prise de sang en veine saphène ou caudale et/ ou injection de médiateurs lipidiques en intrapéritonéale). Les souris seront observées quotidiennement et lorsqu’une souris atteint un point limite, elle sera mise à mort. Dans notre étude nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique puisque nous étudions les médiateurs lipidiques dont l’expression est modulée par ces produits.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de l’impact physiopathologique de pathologie inflammatoire comme le syndrome de Sjögren. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier notre hypothèse de travail. Qui plus est, plusieurs de nos analyses reposent techniquement sur la cytométrie en flux, méthodologie qui requière un nombre conséquent de cellules issues d’organes immunitaires. Ce type d’expériences rend impossible l’utilisation d’organismes comme le poisson zèbre ou la drosophile. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Ce modèle est donc adapté à l’étude de dérégulations hémostatiques humaines. Les souris utilisées seront de 6 mois. Elles ont toutes un stade de développement complet.
Evaluation chez la souris de l’efficacité pharmacologique de plantes connues des tradipraticiens au Cameroun sur les cancers.
- Recherche appliquée
- Cancers
Greffées sous la peau de cellules tumorales, puis gavées deux fois par semaine pendant trois semaines au maximum, 75 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour mesurer le volume des tumeurs. Le projet teste des plantes utilisées par les tradipraticiens au Cameroun, dans l'idée de valider celles qui auraient un effet antiprolifératif et d'ouvrir un accès aux soins à des patients qui ne peuvent pas payer la chimiothérapie. Le porteur écrit que ces plantes ne causeront aucun effet indésirable chez les souris parce que des humains en consomment déjà, tout en admettant que la tumeur sous la peau peut gêner leurs déplacements. Sur treize plantes déjà testées en culture cellulaire, quatre paraissent intéressantes, et ce sont ces résultats qui servent à justifier le passage à l'animal par groupes de cinq.
Objectifs
La prise en charge des cancers est différente dans le monde. En fonction du développement des pays, l’accès aux soins y est différent. Ces dernières années L’OMS encourage l’intégration de la médecine traditionnelle dans le système de soins conventionnels dans les pays en voie de développement. En Afrique, les traitements de référence comme la chirurgie et la chimiothérapie sont proposées, mais de façon limitée car l'accès à ces soins est hors de prix. De ce fait, les patients auront souvent un accès plus facile à d’autres traitements, issus de la médecine traditionnelle. La médecine traditionnelle au Cameroun utilise des plantes, souvent associées entre elles, pour aider ou remplacer les traitements anticancéreux. Or celle-ci propose des traitements, variable d’un praticien à un autre, dans certains cas sous forme de plantes ingérées ou d’infusion et dont l’efficacité est fondée sur des niveaux de preuve faible, au regard de nos mode d’analyse. La seule donnée issue de cette médecine est la non toxicité de ces plantes, y compris conjuguées entre elles, car elles sont utilisées depuis de très nombreuses années, sans toxicité rapportée. Déterminer un effet antiprolifératif d’une des plantes utilisées permettrait de la sélectionner et ainsi d’orienter cette médecine et de diffuser un savoir plus solide. Notre but est de pouvoir diffuser des informations confirmant un effet scientifique observable de certaines de ces plantes pour aider à l’utilisation de la pharmacopée traditionnelle au Cameroun et permettre l'accès aux soins au plus grand nombre.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de pouvoir identifier une ou plusieurs plantes connues des tradipraticiens au Cameroun et les reconnaitre comme étant efficaces scientifiquement dans le traitement du cancer afin qu’ils puissent mieux traiter les patients qui n’ont pas les moyens de payer le traitement conventionnel.
Procédures
Les souris seront soumises à une injection au niveau de la peau de cellules tumorales (10sec), puis 2fois par semaine à une administration par voie orale du traitement (10secondes) durant maximum 3 semaines. A la fin, les souris seront soumises à une injection au niveau de la peau d'analgésique (10sec).
Impact sur les animaux
Les animaux recevront une injection sous la peau de cellules cancéreuses à J0 puis deux administration par voie orale par semaine. Ils seront manipulés 2 fois par semaine pour le suivi de la croissance tumorale afin de mesurer le volume tumoral. Ces manipulations peuvent engendrer du stress aux animaux. Aussi, la croissance de la tumeur sous la peau peut engendrer une gène pour se déplacer. Il n'y a pas d'effets indésirables attendus sur les animaux traités par les plantes puisque ces plantes sont déjà utilisées chez les hommes.
Devenir
Ils seront mis à mort à la fin de la procédure car ce sera la fin de la procédure expérimentale et cela permettra d'évaluer la croissance tumorale et donc l'efficacité des traitements.
Remplacement
Plusieurs expériences in vitro sont en cours et ont déjà mis en évidence un éventuel effet anti-prolifératif de 4 plantes. En effet, sur les 13 plantes testées in vitro pour le moment, 4 plantes semblent intéressantes.
Réduction
Afin de diminuer le nombre d’animaux au minimum, nous utiliserons 5souris par groupe. Notre modèle expérimental est conçu pour mettre en évidence de manière robuste l'efficacité du traitement et permettre d'obtenir des résultats fiables à partir de 5 animaux seulement. Aussi, afin de diminuer le nombre d'animaux également, nous avons choisi d'effectuer ces expériences uniquement sur des femelles, d'autant plus que nous utilisons une lignée de cancer ovarien et du sein.
Raffinement
Les souris auront une période d'acclimatation de 7 jours minimum. Différents points limites spécifiques ont été défnis et seront surveillés.
Choix des espèces
Il s’agit de souris immunocompétentes (BALB/c) ou C57BL/6 car les 3 lignées de cellules cancéreuses utilisées sont espèce dépendante. Ce type de souris est utilisé largement dans la recherche en cancérologie pour sa capacité à développer des tumeurs après injection des cellules cancéreuses. Les souris seront utilisées à l’âge de 7-8 semaines pour ne pas interférer avec les processus de vieillissement. Cet âge permet aussi d’augmenter le taux de prise de greffe tumorale, ce taux diminue avec l’âge.
Impact de l’Obésité sur la Maturation Cardiaque et la Fonction Diastolique chez les souris juvéniles/ »adolescentes » EU2/2
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
965 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Mises sous régime gras et sucré dès le vingtième jour de vie, elles subissent une échocardiographie sous anesthésie, un prélèvement à la queue par semaine, puis deux tests métaboliques comportant chacun neuf ponctions de sang en deux heures, avant un cathétérisme du ventricule qui passe par la dissection de la carotide. Le porteur signale qu'une anesthésie mal conduite peut tuer la souris ou la réveiller en cours d'opération, et qu'une lésion des vaisseaux voisins de la carotide peut provoquer une hémorragie. Les mères, arrivées avec leurs petits de quinze jours, sont tuées dès le sevrage parce qu'elles sont trop âgées pour entrer dans l'étude.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque est une maladie grave et fréquente. L’une de ses formes, l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée (ICFEp), concerne aujourd’hui plus d’un patient sur deux et pourrait représenter jusqu’à 80 % des cas d’ici 2035. Cette pathologie touche principalement les femmes âgées et se caractérise par une altération de la relaxation du cœur, sans modification de sa capacité de contraction. À ce jour, il n’existe aucun traitement curatif ou préventif efficace, en grande partie en raison d’une compréhension encore limitée des mécanismes biologiques impliqués. L’obésité constitue un facteur de risque majeur de l’ICFEp, près de 80 % des patients étant en surpoids ou obèses. Or, la prévalence de l’obésité augmente fortement chez les enfants et les adolescents. Pourtant, l’impact d’une obésité précoce sur le développement du cœur et sur le risque ultérieur d’insuffisance cardiaque demeure peu étudié. Nos travaux récents ont mis en évidence, chez la souris, une phase de développement cardiaque jusque-là méconnue, survenant après le sevrage, entre le 20ème (P20) et le 60ème jour (P60) de vie. Cette période est marquée par l’apparition de structures spécifiques au sein des cellules musculaires cardiaques, essentielles à la maturation de la fonction de relaxation. Leur altération ou leur absence est associée à une dysfonction diastolique conduisant au développement d’une ICFEp. De manière originale, nous avons montré que ces structures sont régulées selon le moment de la journée, suggérant un lien étroit entre développement cardiaque et horloge biologique. Nous avons également identifié un dimorphisme sexuel de ce développement, influencé par les hormones féminines, pouvant contribuer à la plus forte prévalence de l’ICFEp chez les femmes. La période P20–P60 chez la souris correspondant à l’adolescence et au début de l’âge adulte chez l’Homme, ce projet vise à étudier comment l’obésité perturbe le développement cardiaque durant cette fenêtre critique et augmente le risque de dysfonction cardiaque précoce. L’objectif est d’identifier des marqueurs précoces ouvrant la voie à de nouvelles stratégies de prévention et de traitement.
Bénéfices attendus
L’étude de l’impact d’un régime obésogène sur la maturation du cœur au cours de la transition adolescence–jeune adulte permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la perturbation du développement normal de la fonction cardiaque en situation pathologique. Ces connaissances sont particulièrement pertinentes dans un contexte où les régimes alimentaires riches en graisses et en sucres, de type « fast-food », sont de plus en plus répandus chez les adolescents. Les résultats de ce projet contribueront à l’identification de mécanismes précoces associés à la dysfonction cardiaque (ICFEp), susceptibles d’améliorer le diagnostic précoce et d’orienter une prise en charge plus personnalisée, en tenant compte des différences liées au sexe ainsi que des variations biologiques dépendantes du moment de la journée. À plus long terme, ces travaux pourraient participer à l’élaboration de stratégies de prévention visant à réduire le risque de développer une ICFEp à l’âge adulte.
Procédures
Dans le 1er établissement utilisateur, la 1ère intervention sur l’animal au 20ème jour de naissance est une anesthésie sous anesthésie gazeuse pour l’échocardiographie cardiaque. Ensuite, entre le 20ème (P20) et le 40ème (P40) jour de naissance, il y a un prélèvement à la queue sur animal vigile une fois par semaine (moins de 15sec chaque prélèvement). A P40, 2 tests métaboliques (espacés chacun d’une semaine) sont réalisés chez la souris. Cela implique, 1 injection d’insuline (moins de 15 sec) ou 1 injection de glucose (moins de 15 sec) en injection intrapéritonéale à l'aide d'aiguille 30G et neuf prélèvements à la queue pour chaque test selon la cinétique suivante : 15 minutes avant l’injection puis au moment de l’injection puis 15 min après l’injection et ainsi de suite toutes les 15 minutes jusqu’à 120 minutes (un total de 9 prélèvements). Au 60ème jours de naissance, l'échocardiographie nécessite une anesthésie gazeuse et une chirurgie est réalisée impliquant une injection intrapéritonéale avec une aiguille de 30G d’analgésie et 1 une injection sous cutanée au niveau du cou d'anesthésique à l'aide d'une aiguille de 30G. Dans le second établissement, l’euthanasie des souris implique, de la même manière, une injection d’analgésie (moins de 15 sec) au niveau de la cage thoracique en sous cutanées à l'aide d'une aiguille de 30G.
Impact sur les animaux
Lors de la mise sous régime à P20 : modifications digestives (diarrhée, constipation), modification comportementale (légère léthargie). Lors des échocardiographies doppler ou pendant le cathétérisme ventriculaire : une mauvaise gestion de l'anesthésie pourrait entrainer soit la mort prématurée de la souris ou, au contraire, un réveil de cette dernière en cours de chirurgie. Par ailleurs, lors de la dissection de la carotide commune lors de la cathétérisation, il est possible de léser des vaisseaux adjacents entraînant une hémorrhagie légère et un risque d'inconfort. Les effets indésirables potentiels liés aux expérimentations métaboliques : stress de jeûne limité à 2h avant les tests in vivo pour normaliser la glycémie, inconfort et douleur liés à l'injection d'insuline ou glucose (une fois, durée max 15 sec), inconfort et douleur lors des prélèvements sanguins à l’extrémités de la queue et au niveau mandibulaire.
Devenir
À l’issue de chaque procédure expérimentale, les animaux sont tous euthanasiés. Lorsqu'il est nécessaire, un prélèvement du cœur est effectué à des fins d’analyses cellulaires et moléculaires sous anesthésie profonde et analgésie, puis une méthode secondaire réglementaire d'euthanasie est utilisée pour la mise à mort. Les petits arrivant à 15 jours de naissance, ils sont avec leur mère qui est euthanasiée dés le sévrage. En effet, ces femelles sont trop âgées pour entrer dans notre étude.
Remplacement
Ces investigations doivent être réalisées sur des modèles animaux vivants, car elles nécessitent l’étude du cœur en fonctionnement. En particulier, l’impact d’un régime obésogène initié à l’adolescence (20 jours après la naissance) sur la fonction diastolique à l’âge adulte (60 jours après la naissance) ne peut être évalué que dans un organisme vivant, compte tenu de la complexité des mécanismes de développement cardiaque impliqués. Les altérations structurelles et fonctionnelles associées à l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée (ICFEp), ainsi que l’influence de facteurs environnementaux tels que l’alimentation ou l’alternance jour/nuit, ne peuvent être étudiées à l’aide de modèles alternatifs. Elles nécessitent à la fois des analyses fonctionnelles in vivo et, lorsque requis, un prélèvement cardiaque permettant un accès direct au tissu et à l’architecture des cellules contractiles cardiaques.
Réduction
L’équipe a développé une méthode de prélèvement cardiaque optimisée permettant de préserver au mieux l’architecture des cardiomyocytes, notre centre d’intérêt dans ce projet, et d’analyser un même échantillon par plusieurs techniques complémentaires. Cette approche optimise l’utilisation des animaux en permettant d’obtenir, à partir d’un seul animal, différents types de données structurales et fonctionnelles. Par ailleurs, l’utilisation de techniques d’imagerie fonctionnelle non invasives, telles que l’échocardiographie Doppler, permet de réaliser un suivi longitudinal de la fonction cardiaque, et ce avant le prélèvement terminal du tissu si nécessaire. Ainsi, un même animal peut être utilisé successivement pour des analyses fonctionnelles in vivo et pour des analyses tissulaires post-mortem. Ces stratégies expérimentales permettent de maximiser l’exploitation des données obtenues, de réduire le nombre d’animaux utilisés au strict nécessaire et de garantir une analyse statistiquement robuste et une évaluation complète de l'architecture cardiaque et de sa fonction, tout en tenant compte des différents facteurs biologiques étudiés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées conformes à la directive 2010/63/UE, dans le respect des cinq libertés fondamentales. Des enrichissements du milieu (papier, carton, tunnels) sont fournis afin de favoriser la construction de nids, l’expression des comportements naturels, l’activité physique et les interactions sociales. Un test des pièces d’hébergement des animaux est effectué tous les 3 mois pour garantir leur statut sanitaire SPF. Une grille de suivi (grille de scoring de notre projet), élaborée en collaboration avec les zootechniciens, permet une surveillance régulière de l’état de santé des animaux et une adaptation rapide des conditions expérimentales si nécessaire, afin de limiter au maximum toute douleur, souffrance ou détresse (analgésie et anesthésie ont été définies pour éliminer toutes douleurs).
Choix des espèces
La souris constitue un modèle particulièrement pertinent pour nos études en raison de sa forte similitude avec la physiologie humaine, notamment pour les processus cardiaques. En effet, notre équipe a mis en évidence l’impact du jour et de la nuit sur la fonction cardiaque chez l’Homme et la souris, justifiant l’utilisation de ce modèle pour étudier les mécanismes sous-jacents à cette fonction et ses altérations. Par ailleurs, la majorité des travaux portant sur l’impact du sexe sur le fonctionnement cardiaque et sur l’impact de l’obésité ont été réalisés chez la souris, fournissant un cadre méthodologique et conceptuel solide. Ce modèle nous permet donc de poursuivre des recherches en cohérence avec la littérature existante et de capitaliser sur des données validées. Enfin, les techniques employées dans ce projet ont été optimisées pour la souris, garantissant la fiabilité et la reproductibilité des résultats obtenus. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement selon les objectifs spécifiques de chaque expérience, afin d’évaluer les effets du régime obésogène sur le développement et la fonction cardiaque. Au 20ème jour après la naissance, le cœur est encore en pleine maturation. Des processus essentiels, tels que la formation et la structuration des cardiomyocytes sont alors actifs. Ce stade est crucial pour étudier l’impact de facteurs environnementaux précoces, notamment alimentaires, sur le développement du cœur. Comme montré par notre équipe, ce stade de développement est déterminant pour la fonction cardiaque adulte. Au 60ème jour après la naissance, correspondant au jeune adulte, le cœur a terminé son développement structural et fonctionnel. Ce stade permet d’évaluer les conséquences du régime obésogène instauré précocement sur la fonction cardiaque et sur l’architecture des cardiomyocytes à l’âge adulte.
Rôle des plaquettes dans les lésions rénales associées au diabète après arrêt de la circulation sanguine
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune passant cinq semaines entre l'induction d'un diabète et une opération qui prive ses deux reins de sang pendant vingt-deux à vingt-cinq minutes. Le diabète est provoqué par des injections répétées d'un composé qui détruit le pancréas, avec hyperglycémie, soif et urines abondantes, perte de poids et risque d'hypoglycémie. L'ouverture de l'abdomen et le clampage des vaisseaux rénaux entraînent une prostration, une fatigue importante et des douleurs post-opératoires que le porteur reconnaît malgré l'analgésie. Toutes seront tuées sous anesthésie après un prélèvement sanguin terminal, pour comprendre pourquoi les patients diabétiques opérés du cœur développent quatre fois plus souvent une insuffisance rénale grave.
Objectifs
Le diabète est une maladie très fréquente qui fragilise les vaisseaux sanguins de nombreux organes, en particulier les reins. Nous avons observé, à partir d’une cohorte de 11 000 patients opérés de chirurgie cardiaque, que les patients diabétiques ont quatre fois plus de risque de développer une maladie rénale sévère nécessitant une dialyse après l’intervention, à cause de l'arrêt de la circulation sanguine associée à cette chirurgie. Beaucoup d’entre eux évoluent ensuite vers une maladie rénale chronique, ce qui affecte profondément la qualité et l’espérance de vie des patients, et représente un lourd fardeau pour le système de santé. Actuellement, aucun traitement ne permet de prévenir la survenue d'une maladie rénale post-chirurgie cardiaque chez ces patients. Notre projet vise à comprendre pourquoi le diabète augmente autant ce risque. Nous nous intéressons particulièrement aux plaquettes, dont le rôle est de stopper les saignements. Ces cellules jouent aussi un rôle très important dans l’inflammation. Nous étudierons comment le diabète modifie leur fonctionnement et quels mécanismes pourraient jouer un rôle dans l’aggravation des lésions rénales lorsqu’un rein subit un épisode d’ischémie/reperfusion. Pour répondre à cette question, nous mènerons deux approches complémentaires : Une étude chez l’humain, basée sur nos observations cliniques, pour analyser les caractéristiques des patients diabétiques et mieux comprendre les mécanismes en jeu. Une étude expérimentale chez la souris, dans laquelle nous induirons un diabète puis une lésion rénale d’ischémie-reperfusion. Nous évaluerons la fonction rénale, l’activation des plaquettes, ainsi que l’inflammation et la fibrose (cicatrisation anormale) du rein. Nous utiliserons également des souris génétiquement modifiées afin d’altérer spécifiquement certaines fonctions des plaquettes. Cela nous permettra de déterminer précisément leur rôle dans l’aggravation des lésions rénales en contexte de diabète. À terme, ce projet permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour protéger les reins des patients diabétiques, réduire le recours à la dialyse et améliorer leur qualité et leur espérance de vie.
Bénéfices attendus
Les complications rénales aiguës après chirurgie cardiaque sont fréquentes et particulièrement sévères chez les patients diabétiques. À ce jour, il n’existe pas de stratégie spécifique permettant de réduire ce risque accru. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’aggravation des lésions rénales en contexte de diabète, en particulier le rôle des plaquettes. L’identification des voies plaquettaires impliquées pourrait ouvrir la voie au développement de stratégies thérapeutiques ciblées. À terme, ces travaux pourraient contribuer à réduire la sévérité des complications rénales chez les patients diabétiques exposés à une chirurgie cardiaque.
Procédures
(1) Une partie des animaux sera soumise à une induction de diabète par injections répétées d'un composé chimique qui détruit le pancréas. (2) Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine les deux reins pendant 22–25 minutes sous analgésie et anesthésie. Ce protocole a une durée de 40 minutes. (3) Prélèvement de sang sur souris vigile, au niveau de la joue (30 secondes environ). (4) Prélèvement de sang terminal, < 1 min, sous anesthésie générale, sur un plateau chauffant ; suivi de l’euthanasie par une méthode réglementaire en vue des différents prélèvements et analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
L’induction du diabète par injections répétées d’une substance chimique détruisant le pancréas entraîne une augmentation du taux de sucre dans le sang associée à une augmentation de la soif et des urines, une perte de poids ainsi qu’une altération modérée de l’état général. Les injections répétées peuvent provoquer un stress transitoire lié à la contention et à la manipulation. Une hypoglycémie transitoire peut survenir dans les heures suivant les injections ; afin de prévenir une hypoglycémie sévère, une solution de sucre sera mise à disposition dans les cages pendant la période d’induction. Des variations individuelles de la réponse au traitement peuvent être observées. L’induction d’une maladie rénale par chirurgie entraîne une altération transitoire de l’état général et une prostration liée à une fatigue importante. La procédure chirurgicale repose sur une ouverture chirurgicale de l’abdomen permettant d’accéder aux reins, suivie de la pose de pinces temporaires sur les vaisseaux sanguins apportant du sang aux reins afin de suspendre temporairement la circulation sanguine. Malgré une prise en charge optimale de l’analgésie, des douleurs post-opératoires peuvent survenir : (1) douleur liée à la chirurgie (anesthésie, analgésie, incision cutanée médiane, ouverture des plans musculaires, pose des clamps, sutures) ; (2) complications potentielles liées à l’anesthésie (difficultés respiratoires, modifications du rythme cardiaque, baisse de la température corporelle) ; (3) altération de l’état général avec perte de poids et déshydratation ; (4) stress lié aux manipulations répétées (surveillance clinique, pesées). Ces nuisances ne peuvent pas être totalement évitées, car l’induction du diabète et la chirurgie sont indispensables pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Un suivi clinique rapproché et des mesures adaptées seront mis en œuvre afin de limiter au maximum la douleur et la souffrance des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée. Les différents prélèvements nécessaires pour les analyses sont réalisés après constatation de la mort par une personne expérimentée. Durée de la procédure 5 semaines.
Remplacement
En raison notamment de la complexité du tissu rénal et de sa circulation (dizaines de types cellulaires), ainsi que de la fragilité des plaquettes, et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organes en culture (organoïdes), l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative basée sur des cultures cellulaires (in vitro) pour analyser l’évolution de la défaillance chronique progressive d’organes.
Réduction
Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer la variabilité entre individus de la maladie rénale avec ce protocole. Afin d’obtenir des résultats robustes pour détecter des différences entre groupes et garantir la reproductibilité des résultats, des effectifs de 10 animaux par groupe sont nécessaires. Le calcul des effectifs a été réalisé à l’aide du module statistique du site EDA (Experimental Design Assistant), en prenant comme paramètre principal le débit de filtration glomérulaire (capacité du rein a filtré dle sang). Chaque procédure sera répétée deux fois sur des cohortes indépendantes. Le nombre total d’animaux utilisés est de 400 souris. Les analyses statistiques seront réalisées avec des tests adaptés.
Raffinement
Les nuisances seront réduites au maximum grâce à des mesures de raffinement adaptées. Les conditions d’hébergement respectent la réglementation en vigueur pour la souris. Les animaux sont surveillés quotidiennement par du personnel qualifié. Leur bien-être est assuré par un environnement enrichi comprenant une litière adaptés, des objets (morceaux de bois) à ronger et un abri dans chaque cage. Les actes chirurgicaux sont réalisés sous anesthésie et avec une prise en charge de la douleur avant et après l’intervention. Les souris sont placées en couveuse pendant le réveil puis replacées dans leur cage d’origine. De la nourriture gelifiée est également mise à disposition pour faciliter l’alimentation. En dehors d’une courte période d’isolement de deux heures en couveuse (nécessaire pour préserver des dispositifs de mesure de la fonction rénale), les animaux restent dans leur cage d’origine, dans leurs groupes habituels. Une surveillance quotidienne de l’état général et de la motricité est réalisée, avec une pesée régulière tout au long du protocole. Des points limites ont été définis (perte de poids, paralysie, saignements, prostration, altération du pelage, infection post-chirurgicale). Les injections sont réalisées avec des aiguilles fines afin de limiter la douleur et le risque de saignement. Les complications liées à l’anesthésie (troubles respiratoires, arrêt cardiaque, baisse de température) sont limitées par une surveillance adaptée et l’utilisation d’un plateau chauffant.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car : - modèles d’ischémie/reperfusion bilatérale et de diabète bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire ; - nombreuses données relatives au projet déjà disponibles dans la littérature scientifique, plus que dans d’autres espèces ; - possibilité de tester l’implication des plaquettes et des protéines d’intérêt dans cette étude grâce à des modèles de souris génétiquement modifiées. À l’âge de 8 semaines, ces souris sont adultes et leurs reins fonctionnent bien. Des animaux jeunes sont utilisés pour éviter l’accumulation de graisse autour des vaisseaux du rein, afin de faciliter la procédure chirurgicale.
Caractérisation d’une thérapie génique AAV-shARN sur un modèle murin de myopathie liée au gène Dnm2
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Les souris de ce projet portent une mutation du gène Dnm2 qui leur inflige une faiblesse musculaire généralisée, une atrophie et une perte de poids, dans une forme sévère de la maladie. 348 d'entre elles vont être utilisées, 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 108 un niveau modéré. Dès le sevrage, elles reçoivent sous anesthésie des injections intramusculaires, intraveineuses et intrapéritonéales d'un vecteur viral, puis passent chaque semaine un test de suspension, un test d'agrippement et une mesure de force, la pose d'électrodes sous la peau pouvant enflammer le muscle tibial antérieur et l'injection rétro-orbitale entraîner des troubles de la vision. Le porteur écrit qu'à sa connaissance le phénotype myopathique n'est associé à aucune douleur, et toutes les souris seront tuées sous anesthésie pour la collecte de leurs organes.
Objectifs
Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients atteints, et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point un traitement curatif en évaluant une approche thérapeutique génique en à l’aide de vecteur viraux qui seront injectées avant et après l’apparition des premiers signes afin de pouvoir évaluer l’efficacité du traitement d’anticiper (= empêcher le début de la maladie) et d’invertir la maladie (= guérir les souris déjà malades).
Bénéfices attendus
Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires.
Procédures
Une injection intramusculaire et intraveineuse, d’une durée maximale de 30 secondes, sous anesthésie, sera réalisée une fois chez l’animal sevré (3 ou 4 semaines d’âge). Une injection intrapéritonéale d’une durée maximale de 30 secondes sera réalisée une seule fois chez l’animal. Des tests de comportement peu invasifs, qui permettront d’évaluer les performances et les capacités motrices de l’animal (test de suspension, test d’agrippement, test de mesure de force in vivo), ainsi que des pesées de l’animal, seront réalisés une fois par semaine chez l’animal vivant, dès le sevrage.
Impact sur les animaux
Les animaux porteurs de la mutation présentent une perte de poids, une faiblesse musculaire généralisée et une atrophie musculaire par rapport à des animaux contrôles. À notre connaissance, il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. Les approches thérapeutiques par modulation génique visent à augmenter la force musculaire des animaux. Mais des effets secondaires indésirables peuvent être attendus. En revanche, lors de la soumission à l’effort ou par stimulation électrique, le phénotype des souris devient observable et quantifiable pendant l’analyse. La pose sous-cutanée des électrodes et l’injection intramusculaire peuvent provoquer une inflammation du muscle tibial antérieur. L’injection intrapéritonéale peut provoquer une douleur dans la cavité péritonéale. L’injection rétro-orbitale peut entraîner des difficultés de vision.
Devenir
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures, car notre projet nécessite la collecte d’organes afin de compléter l’analyse histologique et moléculaire.
Remplacement
Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture, car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe, et encore moins celle d’un organisme entier. En effet, seul le modèle animal permet d’étudier, d’une part, la maladie dans sa globalité et, d’autre part, l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de la thérapie.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum leur utilisation. Une étape préalable permettra de sélectionner uniquement les molécules les plus efficaces et les moins toxiques, évitant ainsi de tester des candidats non pertinents chez l’animal. Le protocole est conçu pour réduire le nombre d’animaux grâce à une étude pilote qui permet de sélectionner le meilleur candidat avant l’étude principale. De plus, plusieurs mesures seront réalisées sur les mêmes animaux au cours du temps, ce qui évite la création de groupes supplémentaires. Enfin, les prélèvements réalisés en fin d’expérience permettent de regrouper les analyses et d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Si des difficultés de locomotion surviennent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal lors de ses déplacements. Une session de familiarisation précédera chaque test pour réduire le stress. Toutes les immobilisations utiliseront une anesthésie gazeuse rapide. La zone d'injection sera surveillée pendant 3 jours pour observer sa couleur et son gonflement, afin de prévenir toute infection. Pour la mesure de la force musculaire, les souris seront sous anesthésie générale profonde afin de les immobiliser et de prévenir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Cet acte est sans réveil. Durant la procédure, les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et seront monitorées en permanence. Des points limites ont été définis et seront appliqués au cours de l’étude.
Choix des espèces
Le projet vise à évaluer l’efficacité d’une nouvelle stratégie thérapeutique dans un modèle murin de myopathie centronucléaire. Des expériences sont réalisées chez la souris, ce modèle présentant de fortes similitudes avec la pathologie humaine au niveau musculaire, tant sur le plan structurel que fonctionnel et moléculaire. Nous utilisons des modèles murins déjà développés au laboratoire, reproduisant les principales caractéristiques de la myopathie centronucléaire, notamment une forme sévère de la maladie. Ces animaux présentent une faiblesse musculaire et des anomalies histologiques comparables à celles observées chez les patients. L’utilisation de ces modèles, déjà caractérisés et publiés par notre équipe, garantit la continuité et la reproductibilité scientifique du projet. Deux approches thérapeutiques seront étudiées. Dans le cadre d’une stratégie dite de « réversion », le traitement sera administré à partir de 3 à 4 semaines d’âge, après le sevrage. À cet âge, le phénotype myopathique est déjà établi, permettant d’évaluer la capacité du traitement à améliorer une pathologie installée. Les injections seront réalisées par voie intramusculaire ou intraveineuse. Dans le cadre d’une stratégie de « prévention », le traitement sera administré très précocement, entre 1 et 2 jours après la naissance (P1–P2), par voie intrapéritonéale. Les myopathies centronucléaires étant des pathologies congénitales, une intervention précoce pourrait limiter, voire prévenir, l’installation des anomalies musculaires. Les animaux traités seront suivis jusqu’à l’âge de 8 semaines afin d’évaluer la fonction musculaire, le poids corporel et les caractéristiques histologiques du muscle. Pour certaines cohortes traitées par voie intraveineuse, un suivi prolongé jusqu’à 52 semaines sera réalisé afin d’étudier la stabilité et le maintien de l’effet thérapeutique dans le temps.
Étude de nouvelles approches thérapeutiques contre la drépanocytose chez des souris Townes
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Quatre-vingt-dix souris atteintes de drépanocytose vont courir sur tapis roulant une heure par jour, cinq jours par semaine, pendant quarante séances. 215 souris au total sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de sang et de muscles. Le RNT décrit chez les patients des crises vaso-occlusives déclenchées par l'effort physique, avec des douleurs musculaires intenses, et ne retient de ces courses forcées qu'une "fatigue et détresse modérée". Les souris utilisées ont une espérance de vie raccourcie, une anémie chronique et une fonction musculaire diminuée, et subissent en plus deux explorations de quatre-vingt-dix à cent cinq minutes sous anesthésie générale.
Objectifs
Avec plus de 7 millions de personnes atteintes dans le monde, la drépanocytose, aussi appelée anémie falciforme, est la maladie génétique héréditaire la plus répandue. Cette pathologie des globules rouges, pour laquelle il n'existe actuellement aucun traitement efficace, est due à une mutation génétique provoquant une déformation des globules rouges qui, de forme biconcave à l’état normal, vont prendre l’aspect d’une faucille. Les globules rouges falciformes, qui sont plus rigides que les globules rouges normaux, vont avoir tendance à se bloquer dans les microvaisseaux conduisant ainsi à des crises vaso-occlusives lors d’un effort physique. Ces crises causent des dysfonctionnements dans tous les organes avec notamment des douleurs musculaires intenses et des difficultés respiratoires pouvant mettre en jeu le pronostic vital des patients. Par ailleurs, la fragilité accrue des globules rouges falciformes provoque leur destruction en excès, aboutissant à une anémie chronique (c’est-à-dire un faible taux de globules rouges dans le sang) associée à une réduction de l’oxygénation tissulaire.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à améliorer la fonction musculaire chez un modèle murin de la drépanocytose. Sachant qu’il n’existe encore à l’heure actuelle aucun traitement curatif contre cette pathologie, ce projet est une première étape indispensable avant d’envisager une application clinique.
Procédures
1) Tous les animaux (n=215) réaliseront sous anesthésie générale un protocole totalement non invasif consistant en une phase d’exercice-récupération. Ce protocole (d’une durée de 90 à 105 min) sera réalisé deux fois à 3 jours d’intervalle, 2) Les souris soumises à l’entrainement en endurance (n=90) réaliseront 40 sessions de course sur tapis roulant (durée d’une heure, 5 jours par semaine). 3) Les traitements pharmaceutiques contre la drépanocytose seront administrés dans l'eau de boisson (pour l'hydroxyurée) et dans la nourriture (Mitapivat). 4) Pour tous les animaux (n=215), des prélèvements de sang et de certains muscles seront réalisés sous anesthésie générale (en semaine 10 de manière à laisser aux muscles le temps de récupérer d’un point de vue métabolique et fonctionnel après leurs explorations) immédiatement avant leur euthanasie.
Impact sur les animaux
1/ Les courses sur tapis roulant pourront engendrer une fatigue et une détresse modérée. 2/ Les explorations RMN pourront provoquer un stress léger de l’animal pendant les phases d’induction de l’anesthésie et de réveil. 3/ Les molécules administrées sont déjà utilisées dans le cadre clinique et ne cause aucun effet nuisible. 4/ Des souris atteintes de drépanocytose seront utilisées dans ce projet. Les conséquences connues de cette pathologie sur la vie de ces animaux sont une espérance de vie raccourcie de quelques mois, une moindre fertilité, une anémie et une réduction de la fonction musculaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés après les expérimentations car des prélèvements de sang et de certains muscles seront nécessaires pour réaliser des dosages biochimiques et des analyses histologiques complémentaires à nos enregistrements RMN.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de tester chez un modèle murin de la drépanocytose humaine si la supplémentation chronique en hydroxyurée ou en Mitapivat, combinée à un entrainement en endurance produit des effets bénéfiques par le biais d’une action synergique. Les critères métaboliques et fonctionnels que nous allons étudier sont de types physiologiques, et ne sont donc pas reproductibles avec des cultures de cellules musculaires. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.
Réduction
Notre approche non invasive offre la possibilité d’explorer les animaux de manière longitudinale ce qui permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés. Le recours aux techniques RMN réduira également le nombre d’animaux utilisés car elle permettra d’obtenir pour chaque animal des mesures du métabolisme énergétique dans différentes conditions (repos, activité musculaire, récupération post-activité) au cours d’un seul examen, contrairement aux techniques classiques de biochimie qui auraient nécessité de sacrifier des cohortes d’animaux à différents temps pour chacune de ces conditions afin de réaliser des dosages métaboliques sur biopsies musculaires. Ainsi, notre approche nous permettra de limiter le nombre d’animaux à 215.
Raffinement
Les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage) en milieu adapté (armoires ventilées maintenues à température constante et éclairage alterné) et enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation (coton), d’abris en plastique permettant aux animaux de se cacher, et de bûchettes de bois destinées à être rongées. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières sera effectué une fois par semaine. Par ailleurs, l’utilisation de nos techniques sur animaux anesthésiés par inhalation gazeuse permettra, du fait de leur caractère non invasif et totalement indolore, de réduire le stress. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal. A la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale induite par inhalation gazeuse afin de réduire au maximum leur douleur et leur détresse. Il est également important de préciser qu’une fois arrivés dans nos locaux, tous les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 3 semaine avant le début des expérimentations.
Choix des espèces
Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui soit proche de l’Homme et qui soit génétiquement modifiable. Pour toutes ces raisons, le choix de travailler chez la souris, qui présente l’avantage d’être de petite taille et facilement manipulable, est entièrement justifié. Les souris utilisées seront âgées de 5 mois au début de l’étude, lorsqu’elles présentent une masse musculaire suffisante pour l’étude du métabolisme énergétique, de l’oxygénation et de la fonction musculaire avec nos méthodologies. L’évolution ontogénique de l’hémoglobine étant terminée après 3 semaines dans ce modèle de souris, ces animaux représenteront bien un modèle de drépanocytose chez l’adulte.
Comparaison des effets anti-leucémiques des cellules CAR-iNKT versus CAR-T dans un modèle de leucémie aigue myéloïde EU1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
166 souris privées d'une partie de leur système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées au plus tard quatre-vingts jours après la greffe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une irradiation corporelle totale de 2 Gy, une à deux injections de cellules leucémiques humaines et une injection intrapéritonéale par semaine, et 130 d'entre elles sont saignées trois fois. La progression tumorale attendue entraîne une baisse d'activité, une perte de poids et des tumeurs abdominales, le porteur écrivant que les souris ne seront pas gardées au-delà de ce délai pour leur éviter de souffrir. Il qualifie ce modèle de "mondialement reconnu" et d'"indispensable" pour valider toute étude préclinique de thérapie cellulaire humaine.
Objectifs
Ce projet porte sur l'utilisation des lymphocytes T natural killer invariant (iNKT), des cellules immunitaires capables de cibler et de détruire naturellement les cellules cancéreuses associées à la leucémie. En ajoutant une molécule ciblant la tumeur (le CAR) aux iNKT, on leur confère une meilleure capacité à cibler spécifiquement les cellules cancéreuses et à s'activer plus efficacement après le contact avec celles-ci. Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde, où la greffe de moelle est le seul traitement curatif, mais malheureusement inaccessible à tous les patients, les approches de thérapie génique impliquant des cellules CAR sont en développement. Les premières études chez l'homme ont montré des réponses prometteuses mais de courte durée, nécessitant une optimisation. Une alternative envisagée est l'utilisation de cellules immunitaires moins susceptibles de s'épuiser dans le temps. Les lymphocytes iNKT se présentent comme des candidats potentiels dans ce contexte, offrant ainsi une piste intéressante pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la leucémie.
Bénéfices attendus
Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde (LAM), les thérapies génétiques sont toujours en développement. Cependant dans la leucémie aiguë lymphoïde (LAL) elles sont déjà utilisées en clinique avec des résultats très probants. Il est possible d'explorer de nombreuses voies d’optimisation de ces thérapies, notamment en changeant leur base cellulaire. L’utilisation d'un sous-type de lymphocytes rare et naturellement anti-tumoral, les iNKT, permettrait une meilleure action directe contre les cellules tumorales avec une double action : la modification génétique et l'efficacité naturelle de la cellule. De plus, les iNKT ont aussi un effet contre les cellules empêchant l'action du système immunitaire. Ils peuvent aussi activer ce dernier, par leur production importante de molécules d’activation. Le développement de CAR-iNKT serait une très bonne opportunité d’amélioration des approches par cellules CAR.
Procédures
-Une radiothérapie corporelle totale de faible dose (2 gy) de chaque animal soit 166 souris -Une injection intra-veineux (IV) sur animal vigile, une seule fois en début d’expérience pour 18 souris, deux injections pour 148 souris. -Une injection intra-péritonéal (IP) sur animal vigile, une fois par semaines pour toutes les souris soit 166. -Un prélèvement de sang sur animal vigile, pour les animaux des tâches 2 et 3 soit 130 animaux à J21, J42 et J63 après injection des cellules leucémiques.
Impact sur les animaux
La piqure d'aiguille pour l’injection et le prélèvement entraîne une douleur légère de courte durée. L'administration de cellules tumorales entrainera une diminution de l’activité, une perte de poids, et possiblement le développement de petites tumeurs en intra-abdominal dans les trois premières semaines sans traitement.
Devenir
Les souris étant partiellement dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animale, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injections, ni en cas de point limite atteint.
Remplacement
Nous continuons à réaliser des expériences en laboratoire sur des modèles cellulaires pour valider la fonctionnalité des cellules humaines, et de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. Le projet est essentiellement basé sur la recherche d’efficacité et des meilleures conditions d’administration des cellules, ce qui ne peut pas être déterminé sur cellules, et ce qui permettra de prévoir les conditions des essais cliniques.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris pour chaque étape du projet au minimum nécessaire pour les études statistiques, en se basant sur des expérimentations antérieurs ainsi que sur la littérature, et en calculant le nombre nécessaire sur la base de logiciel adequats. Nous avons aussi réuni des expérimentations afin de mutualiser les contrôles. Ainsi, au maximum 166 souris seront utilisées. L'utilisation de l'imagerie par bioluminescence avec anesthésie permet d'obtenir des données sur la progression tumoral sans sacrifice de l'animal. Suite à la mise à mort certains organes seront récupérer ainsi que du sang pour des analyses complémentaires.
Raffinement
Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement (buchette en bois, frisure de papier Craft et coton) avec maximum 4 à 5 individus par cage dans un secteur spécifiquement adapté pour leur état immunitaire déficient. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation sera utilisé. Des points limites sont mise en place.
Choix des espèces
La souris permet l’élaboration d’un modèle de greffe de cellules humaines, car cette souris dépourvu de système immunitaire ne rejete pas les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire humaine. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires sur le contrôle anti-leucémique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées entre 8 et 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe des cellules humaine est meilleure dans cette période de vie.
Irradiation de rongeurs sur une plateforme préclinique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
Rats : 400
La plateforme vend un service d'irradiation à des équipes qui n'ont pas d'irradiateur, et ce projet sert à couvrir réglementairement les animaux venus d'autres établissements pendant leur passage. 4 000 souris et 400 rats y seront irradiés, une à cinq fois, corps entier ou zone ciblée, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, éveillés ou sous anesthésie jusqu'à trente minutes. Le porteur indique qu'ils retournent ensuite dans leur animalerie d'origine, où ils poursuivent les protocoles de leur établissement de rattachement. L'irradiation sert aussi à empêcher le rejet de cellules greffées pour fabriquer des modèles murins de cancers humains, technique que le porteur présente comme un moyen de réduire le nombre d'animaux.
Objectifs
La plateforme propose un service d’irradiation de rongeurs de laboratoire qui comprend la mise à disposition des équipements pour les utilisateurs autorisés ou la réalisation par le personnel de la plateforme, d’irradiations corps entier ou de zones ciblées selon les besoins du demandeur. Dans ce contexte, la plateforme peut accueillir temporairement des animaux extérieurs à l’établissement utilisateur dont elle dépend ; ce projet a pour objectif de couvrir réglementairement ces animaux durant la période d’irradiation sur la plateforme. Ces animaux sont inclus, d’autre part, dans des demandes d’autorisation de projet rattachées aux établissements d’expérimentation dont dépend le concepteur du projet et demandeur de la prestation. Les chercheurs utilisent l’irradiation soit comme sujet d’étude direct pour comprendre les effets cellulaires et moléculaires des radiations avec ou sans co-exposition chimique ou comme outil pour créer par exemple, après transplantation cellulaire, des modèles murins de cancers humains affectant les cellules sanguines. Dans ce cas, l’irradiation permet d’éviter le rejet des cellules greffées. La technique de greffe de moëlle osseuse est utilisée pour réduire le nombre d’animaux et amplifier les animaux modèles de cancers. La plateforme s’engage à réaliser les irradiations seulement si les animaux sont inclus dans une demande d’autorisation de projet qui a reçu un avis favorable de la part du Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche et de l’espace.
Bénéfices attendus
La plateforme, dotée de personnel qualifié et habilité à accueillir temporairement des animaux provenant d’établissements extérieurs, constitue un outil structurant permettant de réaliser des irradiations pour des équipes extérieures qui n’ont pas accès en interne à des irradiateurs. En assurant la traçabilité des autorisations, le suivi des animaux irradiés et la mise à disposition d’équipements d’irradiations, elle favorise la production de données robustes, indispensables pour étayer les futurs développements. Les bénéfices à court terme sont de permettre la réalisation des irradiations nécessaires au bon déroulement des projets accueillis sur la plateforme et les bénéfices à long terme, seront apportés par les projets dans lesquels les animaux irradiés sont utilisés.
Procédures
Irradiation sur animaux vigiles (1 à 5 irradiations, durée 10 minutes maximum) ou animaux anesthésiés (1 à 5 irradiations, 15 minutes) Une Anesthésie sur certains animaux (durée maximale de 30 minutes, 1 à 5 anesthésies)
Impact sur les animaux
Légère perte de poids dans les jours qui suivent l’irradiation sous anesthésie, stress lié aux manipulations
Devenir
A la fin des procédures, les animaux retournent dans leur animalerie d’origine.
Remplacement
Les projets reçus sur la plateforme d’irradiation ont reçu un avis favorable du comité d’éthique de leur établissement et une autorisation du MESRE. Les concepteurs ont démontré l’impossibilité actuelle de remplacer les animaux pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Cependant, les systèmes in vitro sont utilisés en amont des projets in vivo. Ils permettent ainsi, dans un premier temps, d’explorer de manière contrôlée et mécanistique les réponses moléculaires et cellulaires aux rayonnements. Ils offrent la possibilité d’identifier finement les voies de signalisation impliquées, de caractériser les altérations précoces et de déterminer des gammes de doses d’irradiation à tester in vivo. De même, les stratégies thérapeutiques sont d’abord évaluées dans des modèles cellulaires ou à l’aide d’organoïdes tumoraux, permettant d’étudier la radiosensibilité des cellules tumorales, l’effet de nouveaux traitements ou l’impact de certaines combinaisons thérapeutiques sous irradiation. Ces approches permettent de sélectionner les conditions expérimentales les plus pertinentes (doses d’irradiation, concentrations des agents thérapeutiques) avant toute expérimentation in vivo, contribuant ainsi à limiter l’utilisation d’animaux et en ciblant plus précisément les hypothèses biologiques à tester. Elles contribuent également à définir des mécanismes spécifiques difficiles à isoler dans un organisme entier, et à comparer différentes conditions expérimentales. Néanmoins, dans le domaine des effets des rayonnements ionisants, les études in vivo demeurent indispensables. En effet, elles seules permettent de prendre en compte la complexité de l’organisme dans son ensemble, notamment les interactions entre les tissus ou organes, entre la tumeur et son environnement ou encore la distribution dans l’organisme des agents thérapeutiques ainsi qu’étudier les effets à long terme impossibles à mettre en œuvre in vitro.
Réduction
La plateforme accueille uniquement les animaux nécessaires aux expériences autorisées par les établissements de recherche. Le nombre d’animaux est planifié en fonction des besoins scientifiques de chaque projet et des autorisations administratives. Les expériences sont conçues pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, par exemple en suivant plusieurs paramètres sur un même animal au lieu d’en utiliser plusieurs.
Raffinement
Toutes les procédures sont conçues pour minimiser l’inconfort et le stress des animaux. Les irradiations sont réalisées sur des animaux vigiles ou sous anesthésie, et sont de courtes durées. Le maintien de la température corporelle est assuré si nécessaire. Les animaux sont surveillés avant, pendant et après l’irradiation, et tous les signes d’anomalie sont immédiatement signalés au vétérinaire. Des points limites ont été définis pour préserver le bien-être animal et les animaux retournent toujours dans leur animalerie d’origine après la procédure d’irradiation.
Choix des espèces
La plateforme ne permet d’irradier que des rongeurs. La souris est le modèle animal le plus fréquemment utilisé : cette espèce est très utilisée par exemple, pour l’étude des effets sur les tissus des irradiations à moyenne ou forte dose corps pour tester de nouveaux traitements ou dans des gammes de doses faibles à modérée pour étudier la senescence et le remodelage vasculaire. Il existe également de nombreux modèles murins qui miment les cancers et permettent de tester de nouvelles thérapies combinées à la radiothérapie. Le modèle rat est le modèle de référence en toxicologie de l’inhalation dans la littérature. Pour les irradiations, les animaux utilisés sont généralement des animaux jeunes adultes, dont la physiologie et le métabolisme sont stables, ce qui permet d’obtenir des données fiables et reproductibles sur les effets tissulaires et moléculaires des irradiations. L’utilisation d’animaux adultes garantit également une taille et une morphologie compatibles avec le positionnement précis requis par les irradiateurs, ainsi qu’avec l’anesthésie et le suivi post-procédure.