Souris

1 344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées dès la vie intra-utérine à des additifs alimentaires ou à des pesticides contenant des nanoparticules, elles reçoivent ensuite une injection de toxine bactérienne qui peut perturber leur état général. Le porteur signale un stress lié aux manipulations, à la contention et à l'injection. Il affirme que le recours à l'animal est "nécessaire" pour obtenir cette exposition chronique dès l'utérus et qu'aucun modèle alternatif ne reproduit les interactions entre microbiote, intestin et réponse immunitaire.

Objectifs

Ce projet fait suite à un projet précédant qui a permis de montrer une perturbation du fonctionnement du système immunitaire intestinal et extra-intestinal lors d'une exposition à des nanoparticules (TiO2 et SiO2) avec notamment une altération des réponses fonctionnelles des cellules immunitaires. Pour déterminer si cela pourrait conduire à une perturbation de la réponse immunitaire à un challenge infectieux in vivo, nous étudierons la réponse de souris soumises à une infection à une toxine bactérienne lipopolysaccharidique (appelée LPS) après qu'elles aient été exposées de façon chronique à des additifs alimentaires ou à des contaminants de type pesticide contenant des nanoparticules.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mettre en évidence l’impact d'additifs et de contaminants de type pesticide sur les défenses immunitaires dirigées contre une infection de type bactérien. Il apportera des données utilisables pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et animale dans l'utilisation de ces additifs et contaminants. Cet impact pourra être pris en compte par les instances règlementaires afin de réguler l'exposition humaine aux nanoparticules inorganiques.

Procédures

Les animaux seront exposés aux additifs alimentaires ou aux contaminants de type pesticide contenant des nanoparticules à des doses encandrant l'exposition humaine. Puis, ils seront exposés au maximum 6 h à une toxine bactérienne délivrée par injection unique nécessitant une contention de quelques secondes des animaux.

Impact sur les animaux

La mise en oeuvre de nos procédures pourra générer du stress. Il sera atténué par l'habituation des animaux aux manipulations hebdomadaires (suivi de poids, observations). Ensuite, la contention et l'injection de toxine peut engendrer un court stress. La toxine peut perturber l'état général des animaux qui seront sous surveillance constante jusqu'à la fin de l'expérimentation.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés afin d'effectuer des prélèvements permettant d'étudier la réponse immunitaire contre la toxine bactérienne.

Remplacement

Le projet étudie les effets des nanomatériaux alimentaires contenus dans des contaminants de type pesticide sur la réponse à une infection après une période d’exposition périnatale et jusqu'à l'âge adulte,. L’utilisation du modèle animal est nécessaire afin d’avoir cette exposition chronique dès la vie in utero. De plus, l’étude portera sur les interactions microbiote-intestin et intestin-réponse immunitaire et aucun modèle alternatif ne permet de recréer toutes ces interactions. Du fait de ces 2 raisons majeures, le recours à l'animal est donc nécessaire.

Réduction

Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en collectifs (5 ou 3 par cages selon l'expérimentation) dans des cages contenant des abris et les femelles gestantes seront isolées (1 par cage) avec un enrichissement des cages (dispositifs de nidification en papier absorbant) afin d'améliorer leur bien-être. Les individus présentant une détérioration de l'état général (poil piqué, dos vouté, difficulté de mobilité, agressivité extrême) et/ou une perte de poids significative seront écartés de l'étude et des soins adaptés leur seront donnés. L'exposition à la toxine bactérienne peut perturber l'état général des animaux qui seront observés en continu jusqu'à leur euthanasie

Choix des espèces

La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote et l’intestin. Nous travaillerons avec la lignée C57bl/6J car nous avons déjà des résultats préliminaires concernant l’exposition des adultes aux additifs alimentaires. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte pour mimer une exposition périnatale et chronique à long terme.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dépourvues de poils, elles reçoivent des injections sous la peau et dans l'abdomen sous anesthésie gazeuse pour étudier comment le système immunitaire réagit aux cellules vieillissantes dites sénescentes. Le porteur qualifie les nuisances de légères, entre gêne liée à l'absence de poils, douleur d'injection et inconfort de la sédation. Il annonce que bloquer un sucre présent à la surface des cellules sénescentes pourrait relancer leur élimination par l'immunité, piste renvoyée à un stade ultérieur.

Objectifs

Ce projet fait partie d'une étude plus globale visant à comprendre comment le système immunitaire, c’est à dire l’ensemble de nos globules blancs, réagit face à des cellules âgées. Au cours du vieillissement, certaines de nos cellules rentrent dans un état dit de sénescence ou les cellules sont toujours vivantes mais incapables de se dupliquer et présentent un fort pouvoir inflammatoire. Il est proposé que ces cellules sénescentes s’accumulent avec l’âge et soient responsables de nombreuses maladies liées à l’âge et du cancer. Ce projet est basé sur une première étude démontrant un lien entre la surexpression d’un sucre particulier à la surface des cellules sénescentes et leur échappement au système immunitaire. L’objectif du projet est de déterminer si le blocage de ce sucre pourrait favoriser la réactivation des cellules immunitaires et donc l’élimination des cellules âgées. L’interaction et le dialogue entre les cellules sénescentes et les cellules immunitaires seront étudiés. La finalité de ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre le vieillissement pathologique en ciblant spécifiquement des molécules de surface associées aux cellules sénescentes. Cette approche pourrait être utile pour les patients dans de nombreuses maladies liées à l’âge incluant le cancer.

Bénéfices attendus

Par cette étude on s’attend à mieux comprendre comment le système immunitaire et les cellules sénescentes interagissent au cours du vieillissement. Plus largement, nous espérons mieux comprendre comment les cellules sénescentes s’accumulent dans nos tissus avec l’âge et comment elles modulent leur immunosurveillance. Notre projet pourra contribuer à terme au développement de solutions thérapeutiques contre les maladies liées à l’âge (maladie d’Alzheimer, fibrose pulmonaire, artériosclérose etc…) et le cancer et à l’augmentation de l’espérance de vie en bonne santé.

Procédures

-Anesthésie gazeuse (2 minute 30 après induction) - 2 injections sous cutanées (en une fois, bilatérale pour tous les animaux, environ 1 min 30 par souris) sous anesthésie gazeuse et simultanément 1 injection intra péritonéale (1 fois pour tous les animaux ; environ 30 sec par souris) -2 administrations par injections intra péritonéales (2 fois par animal, 1 fois à J2 et 1 dois à J4) sur animal vigile (pour tous les animaux) (environ 2 min par souris)

Impact sur les animaux

Nos souris présentent une perte de poils totale provoquant potentiellement une gêne légère et subiront des injections sous-cutanées de produit non-irritant (2 injections/animal pour l’ensemble des animaux prévus) générant une douleur légère. La sédation par anesthésique gazeux (pendant environ 1 min 30 après induction à 2%) pendant quelques minutes est également source d’un léger inconfort.

Devenir

L’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des procédures car nous devons faire des analyses sur leurs tissus et leurs cellules.

Remplacement

Nous avons déjà observé dans des études précédentes que les cellules âgées dites sénescentes qui s’accumulent avec le vieillissement présentent des capacités inflammatoires très puissantes. Ces cellules sénescentes seraient à l’origine de nombreuses maladies liées à l’âge, y compris le cancer. Ceci serait possible par une capacité à modifier l’activité des cellules immunitaires innées, c’est-à-dire nos globules blancs qui jouent un rôle essentiel dans la surveillance de nos tissus. En exprimant à leur surface un sucre ayant un potentiel immunosuppresseur, les cellules âgées sont capables de bloquer complètement la fonction de nos globules blancs appelé NK ou cellules tueuses naturelles. Cette inhibition favorise l’apparition de fibrose pulmonaire ou de cancer avec l’âge. Nous souhaitons maintenant étudier l’interaction de ces cellules avec le système immunitaire global et plus précisément comment les cellules sénescentes arrivent à recruter localement les globules blancs et les bloquer dans leur fonction. Il n’existe malheureusement pas de bon modèle in vitro pour cela, la sénescence et le système immunitaire étant un processus intégré impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, ce projet nécessite une étude à l’échelle de l’organisme entier. Dés que les mécanismes seront identifiés, nous remplacerons les expériences chez l’animal par des expériences de co-cultures in vitro.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée avant d'initier ce projet pour s'assurer de la non-reproduction de résultats déjà publiés. Une étude statistique prévisionnelle nous permet également de prédire le nombre minimal d’animaux à inclure dans chaque groupe. Nous avons calculé précisément la grandeur de l’effectif (nombre d’animaux par groupe) nécessaire pour notre étude en fonction de l’estimation des effets biologiques attendus. Ainsi, nous avons pu réduire les groupes d’animaux au minimum possible tout en maintenant une puissance statistique nécessaire à la validation des résultats. Enfin, la maîtrise du protocole expérimental permet d’éviter les problèmes techniques et la perte d’animaux non désirée et donc de réduire au maximum la gêne et le nombre d’animaux nécessaires

Raffinement

Ces expériences ont été raffinées en tenant compte du bien-être animal et ainsi réduire à un niveau minimum le stress, la douleur, la souffrance, l’angoisse ou l’inconfort potentiel. Pour cela, nous utiliserons une série de mesures : -un double enrichissement (des maisons en coton et des bâtons à ronger) -séparation des cages d'expérimentation et d’élevage -suivi quotidien des animaux en expérimentation -injections sous anesthésie - analyses cellulaires sophistiquées après l’euthanasie des souris pour obtenir un maximum de résultats avec le minimum d’échantillons et d’animaux - une grille de score avec un score maximum et une liste de points limites adapté au modèle entrainant l'euthanasie immédiate. L’ensemble de ces mesures de raffinement vise à assurer le bien-être des animaux, éviter toute souffrance inutile et assurer des résultats scientifiques de qualité pour éviter tout reproduction expérimentale inutile liée à un défaut de design expérimental.

Choix des espèces

Nous utilisons un type spécial de souris comme modèle pour notre recherche car elle partage des similitudes avec les humains et a une durée de vie relativement courte. Chez la souris, nous pouvons étudier en détail comment les tissus se réparent et comment leur physiologie change. Cela nous aide à comprendre les différentes étapes des événements biologiques. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines. Ceci correspond à des animaux matures, pleinement formés et avec un système immunitaire innée fonctionnel. Ce modèle de souris est le meilleur choix car il nous permet d'étudier tous les processus impliqués dans les maladies liées à l'âge simultanément. Nous pouvons simultanément examiner les cellules immunitaires, les cellules sénescentes, la progression des maladies et l'expression d'une molécule spécifique appelée ganglioside. En utilisant ce modèle de souris, nous pouvons obtenir des informations précieuses sur les mécanismes des maladies liées à l'âge, ce qui pourrait nous aider à développer de meilleurs traitements et à améliorer la santé humaine

195 souris et 60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, ils subissent une chirurgie crânienne d'une heure, des injections dans l'abdomen et des tests comportementaux, certains étant imagés éveillés sous un microscope auquel ils doivent s'habituer. Le porteur signale une douleur post-opératoire, un risque d'infection de la cicatrice et, après administration de LPS, anorexie, baisse de locomotion, perte de poids et anxiété. Il affirme que l'usage d'animaux est "inévitable" pour comprendre l'activité des circuits neuronaux, la souris permettant en outre d'obtenir aisément des animaux génétiquement modifiés.

Objectifs

Le bon fonctionnement du cerveau repose sur l'interaction des différentes cellules du cerveau. L'objectif de ce projet est de étudier les différents types de cellules gliales et d’évaluer son rôle dans le comportement animal. Les cellules gliales qui comprennent les oligodendrocytes, les astrocytes et la microglie, sont des cellule spécialisée dont la fonction est d'entourer, de soutenir et d'isoler les cellules nerveuses (neurones) du système nerveux central (SNC), y compris le cerveau et la moelle épinière. La principale fonction des oligodendrocytes est la formation de la gaine de myéline, une membrane grasse qui permet d'isoler et de protéger les fibres nerveuses du cerveau et de la moelle épinière. Les astrocytes assurent une diversité de fonctions importantes, centrée sur le support et la protection des neurones. La microglie forme la principale défense immunitaire dans le système nerveux central. Nous étudierons les cellules gliales par des expériences d'imagerie, de biologie moléculaire et de comportement chez les rats et les souris. Nous étudierons aussi l’activité électrique des neurones et des cellules gliales.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.

Procédures

- Le groupe A suivra: une chirurgie (1 heure). Deux semaines plus tard, les animaux recevront une injection intrapéritonéale et deux heures plus tard ils suivront un test comportemental (5 minutes). Le lendemain, elles recevront une deuxième injection et 2h plus tard elles seront exposées au deuxième test comportemental (5 minutes). - Le groupe B suivra: une injection intrapéritonéale (1 minute) et deux heures plus tard ils suivront un test comportemental (5 minutes). Le lendemain, ils recevront une deuxième injection (1 minute) et 2h plus tard ils seront exposés au deuxième test comportemental (5 minutes). - Le groupe C suivra: une chirurgie (1 heure). Deux semaines plus tard, les animaux suivront un test comportemental (10 minutes). Finalement les animaux seront euthanasiés (1 minute) et leur cerveau sera prélevé́. - Le groupe D suivra: une chirurgie (1 heure). Deux semaines plus tard, les animaux seront habitués à rester sur le microscope et ensuite l’activité́ neuronale sera imagée chez les animaux éveillés. Les séances d’imagerie dureront 30 minutes et elles auront lieu une fois par jour pendant 3 jours. A la fin de la dernière séance, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé́. - Le groupe E suivra: une chirurgie (1 heure) pour implanter une fibre optique sur leur tête. Deux semaines plus tard, les animaux suivront une deuxième chirurgie (1 heure). Deux semaines plus tard, les rats seront connectés au niveau de la fibre optique vers un système d’enregistrement de l’activité́ électrique et leur comportement spontané́. Chaque séance durera 20 minutes et chaque rat suivra 3 séances. A la fin de la dernière séance, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé́.

Impact sur les animaux

- Nuisances liées aux procédures chirurgicales : douleur post opératoires, risque mineur d’infection de la cicatrice, risque mineur de détérioration des implants crâniens - Nuisances liées à la connexion des animaux à la fibre optique : stress de la contrainte du maintien sous l’objectif du microscope auquel l’animal doit s’habituer - Douleur légère liée aux différents injections intrapéritonéales. L'administration de LPS aux animaux peut induire de l'anorexie, la diminution de la locomotion, la perte de poids et de l’anxiété.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses immuno-histologiques.

Remplacement

Pour comprendre l'activité des circuits neuronaux dans le cerveau, il est nécessaire de générer des données biologiques pertinentes. L'utilisation d'animaux est donc inévitable. Les souris et les sont les modèles animaux de prédilection pour les recherches dans ce domaine en raison de la structure anatomique et de la fonction bien définies de différents cortex corticaux. La souris est aussi l’espèce de rongeurs qui permet d’obtenir aisément des animaux modifiés génétiquement.

Réduction

L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les actes de préparation chirurgicaux, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Par an, 20 étudiants et 10 instructeurs suivront les projets décrits dans cette DAP. Dans ce context, lors de la formation, les instructeurs réalisent une démonstration de la procédure puis les étudiants auront l’occasion de pratiquer la procédure sous-couvert des instructeurs.

Raffinement

Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie, une installation tout au long des procédures chirurgicales de contrôle de la température par tapis chauffant. Les souris seront placées en cages de 4-5 souris et les rats de 2. Ils seront tous placés sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu (carrés de cellulose, maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher et/ou ronger) permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Les animaux opérés seront observés quotidiennement par l’expérimentateur pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les 4 jours suivant. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation (Annexe 1) incluant le poids de l'animal, l'état de la plaie, l'état du pelage, la mobilité de l'animal et les signes de douleur. Si l'animal présente un score entre 6 - 16, une seconde injection de carprofène s.c. sera effectuée et reconduite toutes les 24h si les signes persistent lors des observations suivantes. Si l’animal n’a pas repris de poids au bout de 4 jours, ou si des signes de souffrance sont observés, le traitement sera étendu de 2 jours supplémentaires. Si la récupération ne s’effectue pas bien et si le score des critères de la grille d’évaluation est supérieur à 11 durant 2 jours consécutifs l’animal sera euthanasié par l'expérimentateur par dislocation cervicale. Dans des cas très rares, les implants (fibre optique et le système de fixation) peuvent se détacher du crâne. Dans cette situation, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris et les rats sont les espèces de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de ces espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle cellulaire et aussi au niveau des circuits neuronaux. Nous utilisons le modelé souris qui est l'espèce de rongeur permettant d'obtenir aisément des animaux modifies génétiquement. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des procédures chirurgicaux.

3 696 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles gestantes reçoivent par voie intraveineuse un composé qui simule une infection virale pour déclencher une activation immunitaire, puis la descendance est mise à mort après sevrage pour prélèvements. Le porteur qualifie les modèles animaux de "puissants et indispensables" et signale une perte d'appétit et de poids transitoire ainsi qu'un comportement altéré dans les 24 heures suivant l'injection. Il affirme que les interactions entre système immunitaire, cellules gliales et neurones au cours du développement ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Objectifs

L’activation du système immunitaire au cours de la grossesse (activation immunitaire maternelle), par exemple par des virus communs comme le virus de la grippe, est un facteur de risque pour plusieurs troubles psychiatriques et neurologiques, en particulier l’autisme et la schizophrénie. Les animaux utilisés à des fins scientifiques sont des modèles puissants et indispensables pour étudier les liens entre activation immunitaire maternelle et altérations du développement cérébral chez la descendance. Les rongeurs dont la mère a reçu pendant la gestation un composé qui induit une activation immunitaire maternelle en simulant une infection virale, présentent des altérations des neurones qui sécrètent la dopamine. La dopamine est un neurotransmetteur notamment impliqué dans la physiopathologie de la schizophrénie. Cependant les mécanismes responsables des dysfonctions de ces neurones sont inconnus. Dans ce projet, nous tenterons d’identifier les mécanismes responsables des dysfonctions des neurones qui sécrètent la dopamine dans un modèle d’activation immunitaire maternelle chez la souris.

Bénéfices attendus

Parmi les pathologies dont le risque est augmenté par l’activation immunitaire maternelle, la schizophrénie est une pathologie très courante (500 000 à 600 000 patients en France) directement associée à des altérations des neurones qui sécrètent la dopamine. Ainsi, preque tous les traitements pharmacologiques de la schizophrénie disponibles actuellement sont basés sur l’inhibition d’une molécule sur laquelle se fixe la dopamine. Ces thérapies traitent principalement les symptômes positifs (par exemple, les hallucinations et les délires) et la réponse aux médicaments antipsychotiques existants est très variable, avec environ 30 pour 100 des patients classés comme résistants au traitement. Le ciblage des voies de la dopamine dans la schizophrénie est issu de découvertes fortuites et n’est pas fondé sur une compréhension fine des dysfonctions sous-jacentes. Notre projet permettra de comprendre le lien entre un facteur de risque identifié de la schizophrénie (l’activation immunitaire chez la mère), des altérations des cellules immunitaires du cerveau (les cellules gliales), et les dysfonctions du système de la dopamine.

Procédures

Femelles gestantes vigiles : Une Injection de solution par voie intraveineuse (5 minutes). Femelles lactantes vigiles : Traitement antibiotique dans l’eau de boisson pendant 15 jours Puis après sevrage de la descendance : euthanasie selon une méthode réglementaire ou une chirurgie sans réveil permettant les prélèvements et analyses ultérieurs.

Impact sur les animaux

L’injection du composé mimant un virus induit une activation immunitaire, corrélée à une perte de poids d’environ 1 à 2 pour cent du poids total par rapport au poids des animaux témoins deux jours après l’injection, qui reflète une perte d’appétit liée à l’inflammation transitoire. Un stress transitoire est aussi attendu lors de la contention au moment de l’injection. Pendant la période transitoire d’activation immunitaire (c’est-à-dire dans les 24h après injection), il est attendu que les souris présentent un comportement modérément altéré, avec prise de nourriture amoindrie. Cependant, cette perte de poids ne persiste pas : dès le troisième jour après l’injection, les poids des souris ayant reçu le composé et celui des souris ayant reçu l’injection contrôle redeviennent similaires.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés selon des méthodes réglementaires pour des expériences de physiologie et de biochimie, ou après sevrage de la progéniture. Ces souris ne peuvent entrer dans de nouveaux protocoles d’expériences puisqu’elles ont reçu des injections dans le cadre du projet.

Remplacement

L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à des pathologies psychiatriques, nécessite d’avoir recours à des animaux. En particulier, les interactions complexes au cours du développement postnatal entre système immunitaire d’une part, cellules gliales et neurones dans le cerveau d’autre part, ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre de souris incluses dans le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Le nombre total d’animaux impliqués est de 3696.

Raffinement

Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximums et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. Dans tous les protocoles, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux utilisés par la mise en place de période d’accoutumance et l’emploi d’anesthésiants et antalgiques adaptés. L’évaluation de la souffrance sera basée sur un suivi quotidien (attitude corporelle, aspect du pelage, poids corporel) de sorte à administrer un traitement anti-inflammatoire/antalgique supplémentaire, ou sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites établis. L’animalerie est maintenue à une température constante entre 20 et 24 degrés avec un éclairage circadien (8 h / 20 h). Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et disposent d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce Mus musculus (souris) repose en premier lieu sur l’anatomie du cerveau de souris qui est très bien caractérisée, ainsi que sur le fait que les grandes étapes de développement du cerveau, les systèmes de neurotransmission et la répartition et la fonction des aires cérébrales sont bien conservés entre souris et être humain. Ces paramètres sont importants dans le contexte de l’étude de mécanismes impliqués dans des pathologies humaines. Les souris gestantes recevant une injection sont de jeunes adultes (8-15 semaines). Les souris soumises aux expériences pour l’étude du développement neuronal postnatal sont des souris juvéniles ou jeunes adultes (jour postnatal 15 à 100). Trois stades de développement seront étudiés : pic du turnover des synapses dans le cerveau en développement chez la souris juvénile ; stade adolescent auquel des changements résultant d’un changement du turnover des synapses se manifeste ; stade adulte pour étudier les conséquences à long terme.

186 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs greffent des cellules tumorales dans le cerveau, laissent croître une tumeur cérébrale suivie par une grille de points limites, puis pratiquent des séances d'IRM sous anesthésie jusqu'à deux heures et demie avant une mise à mort par perfusion intracardiaque. Le porteur décrit une douleur modérée liée à la croissance de la tumeur et une douleur légère liée à l'IRM. Il affirme s'être assuré de "l'inexistence d'approches alternatives in vitro" capables de reproduire le dialogue entre cellules tumorales et vaisseaux cérébraux.

Objectifs

L’agressivité du glioblastome, une tumeur cérébrale de haut grade chez l’homme, est liée à la présence de cellules cancéreuses souches et à leur résistance aux traitements. Ces cellules souches cancéreuses sont situées dans une niche où elles établissent des interactions privilégiées avec les cellules environnantes, notamment les cellules vasculaires. Des données précédentes de notre laboratoire ont permis de montrer que bloquer la communication entre cellules cancéreuses souches et les cellules vasculaires réduit la progression tumorale in vitro et in vivo chez la souris. Des études récentes sur cellules in vitro suggèrent que la communication entre cellules cancéreuses souches et cellules vasculaires dépend pour partie de l’expression de facteurs d’adhésion et par partie de la signalisation calcique. Il est nécessaire de valider ces résultats dans un modèle expérimental in vivo qui reproduit au mieux les conditions pathologiques. L'objectif de ce projet est de caractériser in vivo, par imagerie, les conséquences de ces mécanismes moléculaires identifiés in vitro. Dans un second temps, nous souhaitons évaluer d'une stratégie thérapeutique anti-tumorale prenant appui sur ces mécanismes moléculaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la communication entre cellules cancéreuses souches et cellules vasculaires et il permettra d'explorer comment la modulation pharmacologique de ces voies de communication favorise la régression tumorale. Cette étude devrait permettre de déterminer si le blocage de la communication entre les cellules tumorales et leur environnement réduit la progression des glioblastomes multiformes, des tumeurs cérébrales incurables chez l'homme (survie médiane actuelle de 15 mois).

Procédures

- greffe intracrânienne de cellules tumorales (sous anesthésie) (animalerie 1) - croissance d'une tumeur intracérébrale (suivi par grille de points limites spécifiques, animaleries 1 et 2) - IRM (sous anesthésie, durée 2h30 maximum, animalerie 2) - administration de médicaments au maximum une fois par jour pendant moins de 14 jours (animaleries 1 et 2) - euthanasie par perfusion intracardiaque sous anesthésie très profonde (animaleries 1 et 2)

Impact sur les animaux

- La greffe intracrânienne de cellules tumorales, conduite sous anesthésie, engendre une douleur modérée - La procédure expérimentale d'IRM, qui sera utilisée pour caractériser la tumeur, engendre une douleur légère et est conduite sous anesthésie. La phase terminale est réalisée sous anesthésie profonde (procédures sans réveil) - la croissance tumorale engendre une douleur modérée et fait l'objet d'un suivi et d'une grille de points limites particulière.

Devenir

Le tissu cérébral des animaux utilisés dans ce projet est analysé par histologie pour mettre en correspondance les analyses à l'échelle cellulaire et les observations réalisées dans les images in vivo. Pour réaliser ces analyses, tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Nous nous sommes assurés de l'inexistence d'approches alternatives in vitro qui pourraient être utilisées pour reproduire l'interaction entre cellules tumorales et cellules vasculaires cérébrales. Cette recherche n'a pas identifié de solution in vitro alternative pour notre étude. En effet les méthodes in vitro basées sur la culture cellulaire ne présentent pas les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : au final 20 animaux par groupe et 9 groupes sont prévus, pour un total de 180 souris sur 5 ans. Pour obtenir ces 20 animaux par groupe, nous avons pris en compte i) les problèmes d'implantation/croissance tumorale (15 pourcent), ii) les problèmes lors de l'imagerie (20 pourcent, principalement du au mouvement, risque à compter deux fois puisque l'imagerie est faite avant et après traitement sur chaque animal). Des groupes de 12 animaux complets (i.e. avec toutes les données IRM avant et après) seront suffisant pour obtenir une démonstration statistique. Ce chiffre a été obtenu suite aux calculs effectués dans G-Power (www.gpower.hhu.de) pour un size-effect de 1.25. Pour obtenir ces 12 animaux, et en considérant le risque maximal (12x1.15x1.2x1.2), 20 animaux seront donc commandés par groupe. De plus 6 souris servirtont à la mise au point la procédure d'implantation tumorale.

Raffinement

L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur (critères pris en compte : prostration, renfoncement des yeux, arrêt du nettoyage du pelage). Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). L'environnement sera enrichi selon le programme mis en place par l’animalerie. Suite au transport, qui sera réalisé part un transporteur agréé, les animaux auront une semaine d'acclimatation avant le début des expériences.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. En effet, le cerveau de souris permet une analyse neuroanatomique de haute résolution concernant les réseaux cellulaires et vasculaires. Sa taille est compatible avec la microdissection d’aires cérébrales d’intérêt permettant des analyses biochimiques ou moléculaires. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les animaux seront adultes, pour travailler sur un cerveau mature et stable.

1 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs greffent des cellules cancéreuses de côlon sous la peau, administrent chaque jour un composé par gavage puis des anticorps par injection dans l'abdomen, et suivent la croissance de la tumeur. Le porteur reconnaît que les tumeurs peuvent se développer vite et générer inconfort, perte de mobilité, malnutrition ou déshydratation. Il indique réaliser des essais in vitro quand c'est possible mais conclut qu'étudier l'interaction entre les molécules et le système immunitaire dans son ensemble impose le recours à la souris.

Objectifs

Le carcinome colorectal est le deuxième type de cancer avec le plus haut taux de mortalité dans les pays développés. La résection chirurgicale est actuellement le traitement de choix. Cependant, environ 30 % des patients avec un envahissement ganglionnaire développent une récidive locale ou des métastases à distance dans les 5 ans suivant la chirurgie et meurent de la maladie. Les travaux des dernières années ont formellement établi le lien entre croissance tumorale et qualité de la réponse immunitaire. L’immunothérapie, par inhibiteurs de point de contrôle immunitaires (ICI), a révolutionné la prise en charge des patients atteints de certains cancers très avancés ou métastatiques. Au lieu de cibler directement les cellules cancéreuses comme c’est le cas de la chimiothérapie, des thérapies ciblées ou de la radiothérapie, les inhibiteurs de point de contrôle immunitaires ciblent le système immunitaire du malade, dont ils lèvent les freins pour que certaines cellules du système immunitaire puissent détruire les cellules cancéreuses. Malheureusement ces traitements ont des limites. Ainsi, face à la résistance des traitements actuels proposés, l’intérêt des inhibiteurs de l’enzyme NADPH Oxydase 1 (NOX1) pour ces types de cancers est une voie de traitement envisagé. En effet, l'expression de cette enzyme dans les cellules cancéreuses favorise la croissance tumorale et l'apparition des métastases dans plusieurs cancers, dont le cancer du colon. Il a été montré que l'inhibition de l’enzyme NADPH Oxydase 1 module la composition des cellules immunitaires associées aux tumeurs dans le cancer colorectal en favorisant le recrutement de cellules immunitaires/inflammatoires et ainsi la diminution de la croissance tumorale. L’inhibition de l’enzyme NADPH Oxydase 1 est donc une nouvelle stratégie thérapeutique potentielle pour traiter le cancer du colon en particulier en association avec les inhibiteurs de point de contrôle immunitaires tel que l’anti-PD1.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus dans ce modèle pourraient fournir une alternative de traitement chez les patients souffrant de cancers qui ne répondent aujourd'hui pas bien aux immunothérapies et dont les récidives sont importantes.

Procédures

Après une semaine d’acclimatation, l’injection des cellules cancéreuses de colon se fait en sous la peau (en bas du dos) sous anesthésie gazeuse (1 minute maximum). Le premier jour de traitement, les animaux sont pesés avant l’administration quotidienne de véhicule (contrôles) ou de composé par voie orale avec une sonde de gavage adaptée (10 secondes, 10 mL/kg maximum). Les animaux seront pesés deux fois par semaine pour que le volume administré soit représentatif de l’évolution de leur poids corporel. Le traitement par voie orale permettra de fortement contrôler la dose administrée aux souris en fonction de leur poids individuel. 4 jours après le début du traitement, les souris reçoivent une injection d’anticorps contrôles ou d'anticorps thérapeutique (10 secondes) en intra-péritonéal, puis deux fois tous les deux jours (3 doses au total) ou deux fois par semaine durant toute l’étude en fonction du composé testé. La croissance et la taille tumorale seront surveillées tout au long de l'expérience (mesures deux fois par semaine, 10 secondes) comparées entre les souris traitées et les témoins non traités, révélant un potentiel effet global du composé sur la prolifération des cellules cancéreuses.

Impact sur les animaux

Les deux actes principaux effectués au cours de l’étude sur les animaux sont : - Le traitement par voie orale - Les injections : sous la peau de cellules cancéreuses et les intra-péritonéales pour les traitements avec anticorps et/ou le contrôle Des nuisances peuvent être induites par l’administration des produits pharmaceutiques et les effets potentiellement toxiques de ces composés. Les tumeurs sont généralement bien tolérées mais elles peuvent aussi se développer très vite et générer un inconfort ainsi qu'une perte de mobilité. Cette perturbation de la locomotion peut induire une malnutrition ou une déshydratation.

Devenir

Le prélèvement de la tumeur, des organes et la quantité de sang nécessaire aux analyses justifient la mise à mort des animaux.

Remplacement

Les progrès de la technologie permettent en permanence le remplacement des animaux par d'autres modèles dans la science expérimentale. Ces évolutions sont évidemment souhaitables et, chaque fois que possible, nous réalisons des essais in vitro appropriés pour identifier les composés actifs présentant le plus grand potentiel d'application thérapeutique. Cependant, nous étudions les effets des molécules qui interagissent avec le stroma tumoral et l'effet que cela a sur différents axes du système immunitaire murin, en vue du traitement des maladies humaines. Ces interactions se produisent entre différents tissus et organes et sont également susceptibles d'être influencées par la présence de tumeurs en croissance et, en tant que telles, elles ne peuvent pas encore être reproduites in vitro nécessitant d'effectuer des recherches in vivo.

Réduction

Un composé de l’entreprise a déjà été testé dans ce modèle de cancer chez la souris. Nous ciblerons dans ce projet plus spécifiquement la NADPH Oxydase 1 (NOX1) avec des molécules adéquates issues de nouveaux projets, aux propriétés optimisées. Nous avons utilisé les données de croissance tumorale décrites dans la littérature avec ce modèle pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des différences significatives dans la croissance tumorale entre les groupes témoins et traités. Lorsque les tumeurs seront récoltées, l’échantillon sera optimisé pour répondre aux questions posées. Les tests statistiques qui seront utilisés nous permettront de démontrer l’efficacité de nos molécules par rapport à un contrôle ou encore un potentiel effet-dose.

Raffinement

Les composés testés seront administrés par voie orale. Cette technique est rapide et nécessite une contention courte. Un volume maximal de 10mL/kg leur sera administré. Après réception des animaux, ils seront placés dans des cages où des carrés de ouate seront mis à leur disposition pour la construction de leur nid. Un dôme rouge au minimum sera aussi présent afin que les animaux puissent se cacher. Leur comportement de rongeur sera encouragé par la présence d’un bâton de bois dur par animal. La nourriture et l’eau seront en libre accès tout au long de l’étude. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière obscurité (12h - 12h), d’une température (20 - 24°C) et d’une hygrométrie (45 - 65%) contrôlés en permanence. Les animaux seront monitorés à chaque traitement (tous les jours) pour la surveillance de signes cliniques éventuels et vérifier l'absence de souffrance. En fonction de leur évaluation, les mesures à prendre sont définies avec notre vétérinaire désigné. Le vétérinaire pourra être contacté en cas de besoin afin d'adapter au mieux les soins, par exemple si les observations ne correspondent pas à des signes attendus et que la procédure de soins n'est alors pas arrétée. La mort n'est pas une limite acceptable et tout signe clinique ou ensemble de signes grave et non soignable, tout signe de souffrance non supprimable, ou correspondant aux points limites définis, menera à l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

L’espèce animale la plus couramment utilisée comme modèle en oncologie est la souris. Sa petite taille, sa grande fécondité en font un animal de choix pour les laboratoires. De plus, le développement de nombreuses souches a permis d’obtenir des lots d’animaux génétiquement très similaires, facilitant ainsi les études comparatives. Les modèles murins ont notamment permis de déterminer les grands principes de la chimiothérapie Nous utiliserons donc des souris de 8 à 10 semaines. Ces animaux ne nécessitent pas d’ajuster des doses ou de prendre des dispositions particulières liées au jeune âge ou au contraire à l’âge avancé.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent pendant 90 jours une eau chargée en nanoplastiques de polystyrène, la moitié recevant en plus une alimentation riche en sucre et en graisse, avec mises à jeun répétées, gavages et prises de sang à la queue. Le porteur signale le stress lié à la contention, au gavage et à l'isolement en cage individuelle pour recueillir les fèces. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'étudier la toxicité intestinale sous stress nutritionnel ni la communication entre intestin et foie, ce qui justifierait le recours à la souris.

Objectifs

Après une exposition orale, le tractus gastro-intestinal est la première barrière physique et biologique contre les contaminants environnementaux. Les nanoparticules de plastique (NPL) sont des polymères organiques synthétiques de taille inférieure à 1 micromètre. Ils peuvent être composés de polyéthylène (PE), polystyrène (PS), polypropylène (PP), polychlorure de vinyle (PVC), polyuréthane (PUR) et polyéthylène téréphtalate (PET). Les NPL auxquels nous sommes exposés via l'alimentation ou l’environnement ont été très peu étudiés dans un contexte toxicologique ciblant la sphère digestive. Les connaissances sur les interrelations entre l’ingestion de nanoplastiques et la modulation de la fonction barrière de l’intestin (épithélium/mucus/microbiote) sont peu nombreuses, l’essentiel des travaux décrits à ce jour ont été réalisé en utilisant des organismes marins comme modèle d’étude. Les seules études chez les mammifères ont très récemment été décrites chez la souris. Elles ont, par ailleurs, été réalisées avec des modèles NPL commerciaux dont le processus de synthèse et la présence d’additifs sont méconnues. Les résultats obtenus confortent toutefois l’hypothèse d’une altération des fonctions gastro-intestinales, avec une modulation de la sécrétion de mucus, des dommages sur la barrière épithéliale et l’établissement d’un déséquilibre de la flore intestinale sur ce modèle. En outre, la fonction barrière intestinale peut être fragilisée chez des sujets sains nourris avec un régime gras et sucré de type occidental qui présentent notamment une perméabilité intestinale accrue. En plus des effets connus de ce type d'alimentation, la fragilisation de la fonction barrière n’est malheureusement pas assez prise en compte dans les diverses études toxicologiques alors qu’une partie importante de la population consomme ce type d'alimentation. Ce projet a donc pour but d’étudier les effets d'une exposition orale à des NPL modèles traçables, synthétisés sans additifs et ayant une surface imitant chimiquement celle des débris ayant séjournés dans l’environnement (particules vieillies). L’objectif est de caractériser leur effet sur la sphère digestive et hépatique sur une barrière intacte ou fragilisée par l'alimentation pour détecter une potentialisation/synergie d’effets délétères.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de cette étude contribueront à l’évaluation de la toxicité intestinale des particules nanoplastiques présentes dans l’alimentation de la population. De plus, cette étude mimant l’exposition au plastique dans un contexte d’une alimentation « occidentale », permet également d’évaluer les conséquences des particules sur un système digestif fragilisé. Sur le long terme, cette étude participe à l’évaluation de la sécurité des aliments contenants de nanoparticules plastiques et aide les législateurs à faire évoluer l’utilisation du plastique dans le domaine de l’alimentation.

Procédures

Lors de l'exposition subchronique, tous les animaux de ce projet reçoivent le traitement à tester dans l’eau de boisson pendant 90 jours et la moitié des animaux reçoit une alimentation riche en sucre et en graisse. Les animaux sont mis à jeun pendant 4 à 6 h, gavés et du sang est prélevé à la queue pour effectuer les différentes mesures (glycémie et perméabilité intestinale) en début et en fin d'exposition. Chaque mise à jeun est séparée d’une semaine minimum de récupération. Le gavage sera fait d’un geste expert et très rapide (10 secondes) avec une sonde métallique à bout arrondi adaptée à la taille de la souris. Les animaux sont ensuite anesthésiés via une injection en intra-péritonéale qui est un geste maitrisé par les expérimentateurs et d'une durée de 10 secondes, et ensuite euthanasiés pour effectuer les prélèvements nécessaires.

Impact sur les animaux

Le gavage lors des tests de tolérance au glucose et des mesures de perméabilité intestinale peut engendrer un stress dû à la contention de l’animal et un inconfort dû à l’introduction de la sonde dans l’œsophage. La prise de sang au niveau de la queue lors des tests de tolérance au glucose et des mesures de perméabilité intestinale peut engendrer un stress chez les animaux. La mise à jeun des animaux avant les mesures de perméabilité et des tests de tolérance au glucose peut engendrer un stress chez les animaux. Lors du prélèvement de fèces, un stress dû à la mise en cage individuelle des animaux peut également être engendré.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure pour réaliser des prélèvements destinés à des dosages biochimiques et des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet nécessite des modèles impliquant la prise en compte de la barrière intestinale, la flore intestinale et de l’impact de l’alimentation dans toute sa diversité. Ainsi, seule une approche faisant appel à un modèle animal nous permettra d'explorer la complexité des interactions entre les nanoplastiques de polystyrène et les différents acteurs de la barrière intestinale (épithélium/mucus/microbiote) fragilisée ou non par une alimentation occidentale, et des conséquences/interrelations avec la fonction hépatique. Aucun modèle alternatif ne permet d’étudier la toxicité sous stress nutritionnel. Aucun modèle alternatif ne permet d’étudier la communication inter-organe (axe intestin-foie).

Réduction

La procédure 1 permet de choisir le modèle de nanoplastiques de polystyrène le plus pertinent en testant 2 modèles de nanoplastiques marqués différemment (marqueur fluorescent ou métallique). Cette étude pilote permettra de réduire le nombre d’animaux en choisissant le meilleur modèle de nanoplastique au préalable et de mettre au point les techniques de détection. Les expérimentations sont basées sur la comparaison de 4 groupes. Les effectifs seront déterminés et vos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront hébergés collectivement au calme dans des conditions normalisées et suivis quotidiennement pour leur apporter tous les soins nécessaires. Leur milieu sera enrichi en buchettes de peuplier pour satisfaire leur besoin de ronger ainsi que de coton. Après une période 7 jours de repos pour qu’ils récupèrent du transport et s’habituent à leur nouvel environnement, ils seront manipulés régulièrement pour être habitués à la contention afin d’être pesés (1 fois par semaine), gavés et pour la prise de sang (4 fois sur la durée totale de l’exposition lors des tests de tolérance au glucose et des mesures de perméabilité). Le jour de l’expérimentation (10 à 15 jours après l’arrivée) les souris seront exposées aux particules via l’eau de boisson afin de limiter leur stress. Toutes les mesures ont été prises pour réduire l’inconfort (période d’acclimatation, habituation) et prévenir toute douleur ou anxiété susceptible d’être subie par les animaux (détection de toute anomalie ou apparition de mal être). Une période de récupération de minimum 1 semaine sera respectée entre la mesure de la perméabilité intestinale et le test de tolérance au glucose afin de minimiser le stress des animaux. L’état général des animaux et le comportement sera contrôlé quotidiennement et la prise de poids sera suivie afin de pouvoir déceler tous les signes anormaux de comportement, de souffrance et d’inconfort. Si une perte de poids supérieure à 10% de son poids initial, posture particulière dans la cage comme la prostration, les poils hérissés, la vocalisation sont observés alors l’animal sera retiré de l’étude et le cas échéant euthanasié si son état est jugé critique par la vétérinaire référente. Afin de suivre l'état général des animaux, des fiches d'observations seront mise en place pour uniformiser le suivi.

Choix des espèces

La souris C57BL/6 J (mâle et femelle) est la souche pour laquelle les outils ont été développés et adaptés au laboratoire et représente un modèle pertinent pour étudier la physiopathologie digestive. Les souris mâles et femelles utilisées seront âgées de 6 semaines à la réception, afin d'une part de faire des observations sur des souris adultes, et d'autre part de pouvoir comparer notre étude à la littérature existante.

330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dix servent à entraîner un geste d'injection, les autres reçoivent un virus porteur d'un gène puis subissent une batterie de huit tests, dont la suspension pour la force musculaire, le tapis roulant et la barre crantée pour la coordination, l'immersion de la queue en bain-marie et la plaque chauffante pour la sensibilité. Le porteur annonce une "preuve de concept thérapeutique" et une "étape essentielle vers les essais cliniques", bénéfices renvoyés à un stade ultérieur, pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Il affirme qu'une étude sur cellules ne "pourrait pas se suffire à elle-même" car les effets sur l'organisme entier et la force musculaire y seraient impossibles à évaluer.

Objectifs

Le but de ce projet est de consolider une preuve de concept thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles de souris. La maladie se manifeste dans l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par une faiblesse musculaire et des anomalies de gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression du gène impliqué dans la maladie pour tenter d'atténuer les symptômes musculaires et nerveux. Nous réaliserons cette modulation par des techniques d’injections de virus adéno-associés, couramment utilisés dans la recherche médicale.

Bénéfices attendus

Le succès de ce projet fournira une première stratégie thérapeutique pour certaines formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, et constitue une étape essentielle vers les essais cliniques. Ce travail pourrait être bénéfique pour le traitement d’autres formes génétiques de CMT si un lien moléculaire ou mécanistique entre les différentes formes est découvert. Ce projet permettra également de déterminer si une myopathie coexiste avec la neuropathie chez les patients.

Procédures

Une partie des animaux (10) sera utilisée pour un entrainement à une technique d’injection. Les autres animaux (320) seront injectés (durée d’injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés. 80 animaux seront injectés entre le 3ème et 5ème jour après la naissance et 240 animaux seront injectés à 4 semaines. Entre 7 et 9 semaines, les animaux seront soumis à une série de 8 tests comportementaux : - test de suspension (durée 3x60s) pour évaluer la force musculaire ; - déplacement sur tapis roulant (max 60s) et – déplacement sur une barre crantée (10x30s environ) pour évaluer la coordination motrice ; -test d’immersion de la queue en bain-marie (3x20s max en tout), -mesure de réactivité sur plaque chauffante (3x30s max en tout) et -mesure de réactivité cutanée (4x30s par animal) pour évaluer la sensibilité ; -mesure de l’activité électrique musculaire, sous anesthésie générale (procédure d'une demi-heure) pour évaluer la conduction nerveuse ; et, -mesure des propriétés contractiles musculaires in situ, sous anesthésie générale (procédure d’une heure, sans réveil) pour évaluer la force musculaire développée.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Le second modèle utilisé dans cette étude présente des défauts histologiques au niveau du nerf à 24 jours. Le phénotype général des souris n’a pas été décrit et aucune douleur n’a été reportée chez ces animaux. Les tests phénotypiques (de suspension, de déplacements et de sensibilité) peuvent engendrer un stress physique chez l'animal. Les injections peuvent entrainer une réaction inflammatoire. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale de même que la mesure de force musculaire in situ.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 ou 9 semaines après caractérisation comportementale, les tissus affectés seront prélevés pour étude histologique.

Remplacement

Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.

Réduction

Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 10 souris par sexe et par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage et leur souffrance sera évaluée quotidiennement : capacité à se retourner/à se mouvoir, couleur de la peau. Après le sevrage, les animaux seront hébergés à plusieurs par cage, la qualité de l’air sera assurée par une ventilation et la température sera maintenue constante. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson/nourriture. La litière sera changée hebdomadairement afin de maintenir les animaux au propre et au sec. La pesée des animaux sera réalisée 1 fois par semaine. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. La zone d'injection sera observée quotidiennement (couleur/gonflement) pendant les 3 jours suivant l'injection afin de prévenir l’apparition d’une infection. Afin de réduire le stress lié à certaines expériences, une session de familiarisation avec le matériel sera effectuée. Pour la mesure d’électromyographie, l’animal aura une anesthésie gazeuse tout au long de la procédure afin de supprimer le stress lié à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale et celle-ci sera contrôlée à l’aide d’une sonde rectale. Un produit sera appliqué pour prévenir le dessèchement oculaire. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. De même lors des mesures de force, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, la température de l’animal sera maintenue par une plaque chauffante, sa respiration surveillée et l’animal sera mis à mort avant son réveil pour prélèvement et analyse des tissus. En cas de douleur au cours de l’étude, un analgésique sera administré. En revanche, si l’animal devait réaliser des tests sensitifs, les antidouleurs risquant de perturber les résultats aux tests, il sera mis à mort prématurément.

Choix des espèces

Afin de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’évaluer les effets d’une thérapie, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure des muscles et des nerfs, les deux tissus principalement touchés, est trop différente. D’une part, une étude sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation des bénéfices sur la structure des fibres nerveuses et musculaires, sur le la coordination motrice, la conduction nerveuse et la force musculaire seraient impossible à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression du gène d’intérêt, nous testerons différentes conditions d’une thérapie génique (prévention ubiquitaire, réversion ubiquitaire et réversion tissu-spécifique). Nous étudierons les effets de ces injections à 8 ou 9 semaines, car à cet âge le phénotype de la maladie est exprimé (défauts histologiques des tissus et structurels), ainsi nous pourrons savoir assez tôt si les différentes modulations sont bénéfiques.