Souris
Rôle de la fibrine dans l’arrêt de la croissance du thrombus
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Sous anesthésie, des souris subissent soit un prélèvement de sang dans l'aorte abdominale, soit une thrombose provoquée selon l'un de trois protocoles, puis sont tuées sans avoir repris conscience. 928 souris vont être utilisées dans ces procédures sans réveil, parmi lesquelles des souris génétiquement modifiées, incapables de former un réseau de fibrine ou dépourvues de fibrinogène, comparées à des souris C57BL/6. Le porteur attend de ces expériences qu'elles aident à "mieux comprendre le rôle de la fibrine dans l'arrêt de la croissance du thrombus", sans annoncer d'autre retombée. Les trois protocoles de thrombose ne sont pas décrits, et le texte chiffre 120 souris pour le prélèvement de sang et 276 pour la thrombose, soit 396, sans dire à quoi correspondent les 532 autres.
Objectifs
Les plaquettes jouent un rôle clef dans la thrombose artérielle. Suite à la rupture d’une plaque d’athérosclérose dans une artère malade, les plaquettes adhèrent au site de lésion, s’activent et agrègent pour former un thrombus. Les plaquettes du thrombus permettent la formation d’un réseau de fibrine insoluble stabilisant le thrombus. Ce thrombus se fragmente ce qui pourrait permettre à nouveau l’adhérence de plaquettes au site de lésion et bloquer l’écoulement du sang. Ceci peut conduire à des pathologies ischémiques graves comme l’infarctus du myocarde ou l’accident vasculaire cérébral, qui représentent la première cause de mortalité dans le monde. Bien que l'interaction plaquettes-fibrine soit connue, le rôle de la fibrine dans la re-croissance du thrombus est encore inconnu. L'objectif de cette étude est d'évaluer le rôle négatif de la fibrine dans la re-croissance du thrombus.
Bénéfices attendus
Les résultats de ces expériences contribueront à mieux comprendre le rôle de la fibrine dans l’arrêt de la croissance du thrombus.
Procédures
Pour prélèvement de sang au niveau de l’aorte abdominale nous utilisons 120 souris au total et la durée de la procédure est 10 minutes. Pour les 3 modèeles différents de thrombose, nous utilisons 276 souris au total et la durée de la procédure est 30 minutes. Tous les gestes sont effectués sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
Les 3 modèles de thrombose et la procédure de prélèvement de sang sont des procédures sans réveil réalisées sous anesthésie. On pourra s'attendre à un impact sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée).
Devenir
À la fin du prélèvement de sang et des modèles de thrombose, tous les animaux seront euthanasiés car non réutilisables à l'issue du projet.
Remplacement
Dans cette étude, il est nécessaire d’avoir recours aux animaux : - In vitro : les plaquettes sanguines ne peuvent pas être cultivées et ne sont pas substituables. - In vivo : la thrombose est un processus complexe faisant intervenir de multiples acteurs cellulaires et moléculaires. Les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire toute la complexité de ces phénomènes. Les techniques de génie génétique ont permis de générer des souris FibAEK n’ayant pas la capacité de former des réseaux de fibrine. Et des souris ne présentant pas de fibrinogène circulant, donc incapable de former un réseau de fibrine.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires au projet a été calculé statistiquement et il permettra d'obtenir des résultats fiables et robustes.
Raffinement
L’utilisation de modèles d’animaux a été établie en raffinant au maximum les conditions de travail, afin de limiter leur angoisse, le stress et la douleur lors des manipulations. Les animaux seront placés dans leur cage en fonction des groupes expérimentaux deux jours avant le début de l’expérimentation. Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées par l’enrichissement des cages avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Les animaux, entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. Les animaux seront anesthésiés tout au long de l'étude. Une évaluation de la douleur pendant l’expérimentation sera effectuée par l’observation des points limites fixés pour chaque procédure expérimentale.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont largement répandus et maitrisés. Les techniques de mutagénèse dirigée ont permis de générer des souris FibAEK qui ne forment pas de réseau de fibrine et des souris KO fibrinogène ne présentant pas de fibrinogène circulant. Ces lignées sont parfaitement adaptées à cette étude et constituent un outil original et unique. Les mutations génétiques des souris FibAEK et KO fibrinogène n’induisent pas d’effet indésirable notable au vu du comportement des souris. Ces souris seront utilisées en comparaison de souris témoins C57BL/6. Des animaux adultes de 3 à 24 semaines seront utilisés dans ce projet. Cet âge correspond à la période permettant l’utilisation de souris pubères et ne présentant pas encore syndrome de vieillissement. Nous réaliserons des groupes homogènes en âge. Seule la procédure expérimentale 4 nécessite l’utilisation de souris d’environ 3 semaines afin de d’éviter la présence de lipides autour des vaisseaux sanguins et s’assurer de la reproductibilité du modèle de thrombose utilisé.
Cytokines inflammatoires et cardiopathie septique
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les expérimentateurs percent leur tube digestif sous anesthésie pour déverser les selles dans l'abdomen et provoquer une péritonite, puis suivent la défaillance cardiaque par échographie avant de prélever le cœur. Le porteur indique que l'infection peut provoquer stress, perte de poids et baisse de mobilité, et estime que garder ces souris en vie ne serait pas éthique vu la sévérité des procédures. Sur le remplacement, il affirme qu'étudier le tissu cardiaque lui-même est "indispensable" et que ni les essais en tube à essai ni la modélisation informatique ne peuvent mimer l'infection de façon fiable, ce qui rendrait "nécessaire" le recours à la souris.
Objectifs
Les infections sont des maladies extrêmement fréquentes et potentiellement graves. Dans leur forme la plus sévère (sepsis), l’inflammation provoquée par l’infection touche le corps entier et peut nuire au fonctionnement des différents organes, dont le cœur. Ce mauvais fonctionnement du cœur ne répond pas toujours au traitement par antibiotique. Il n’existe pas de traitement à ce jour qui traite spécifiquement l’inflammation responsable de la dysfonction du cœur au cours d’une infection sévère. Notre premier objectif est d’étudier cette dysfonction cardiaque induite par le sepsis. Pour cela, nous utiliserons un modèle d’infection sévère chez la souris. Les souris seront opérées sous anesthésie générale (elles seront endormies) afin de créer un petit trou dans leur tube digestif qui permettra aux selles de se déverser dans l’abdomen provoquant ainsi une infection appelée péritonite. Les souris ainsi infectées recoivent des anti-douleurs, et du liquide pour maintenir leur pression arterielle. Ce modèle a déjà été utilisé par plusieurs équipes et l’inflammation qu’il engendre provoque une dysfonction cardiaque similaire à celle observée chez l’homme. Nous pourrons ensuite caractériser le fonctionnement du cœur par échographie. Notre second objectif est d’étudier les paramètres de l’inflammation responsables de la dysfonction du cœur. Pour cela, les cœurs des souris infectées comme précédemment décrit seront prélevés et analysés après le décès de la souris et nous déterminerons quelles sont les protéines de l’inflammation qui sont exprimées à l’intérieur du cœur au cours de l’infection. Enfin, notre troisième objectif est de tester des traitements ciblant les protéines de l’inflammation qui auront été trouvées dans les cœurs des souris infectées. Nous injecterons aux souris infectées ces traitements par une piqure sous la peau et comparerons à des souris infectées traitées par placébo. Les points de comparaison reposeront sur l’analyse par échographie de la fonction du cœur et sur la survie des souris à l’infection.
Bénéfices attendus
Les infections sont très fréquentes en santé humaine et potentiellement graves avec un taux de décès élevé. Le décès peut être en lien avec des organes qui ne fonctionnent plus, dont le cœur, à cause de l’inflammation qui s’est propagée dans tout le corps et ce malgré un traitement antibiotique. A ce jour, aucun traitement spécifique n’existe pour soigner ce mauvais fonctionnement du cœur dû à l’infection. Notre travail permettra de mieux décrire cette dysfonction du cœur au cours de l’infection, de comprendre à quoi elle est due précisément et d’évaluer finement l’efficacité sur cette atteinte du coeur de traitements contre l’inflammation. En cas de résultats encourageants, notre étude ouvrira la porte à des études de ces traitements chez l’Homme
Procédures
Les souris sont opérées sous anesthésie générale. Elles sont endormies grâce à un gaz anesthésiant. La durée de la chirurgie est d’une dizaine de minutes. Une injection dans le ventre (intra-péritonéale) de médicament contre la douleur est réalisée avant la chirurgie et répétée toutes les 12 heures après pour les souris encore en vie. Dans la procédure qui teste les traitements, les souris les reçoivent soit par une injection dans le ventre soit par une prise orale, selon le mode de fonctionnement du médicament.
Impact sur les animaux
Les souris pourront ressentir une douleur après la chirurgie liée à l’ouverture du ventre. Celle-ci est prévenue par des médicaments contre la douleur qui sont systématiquement donnés. L’infection peut provoquer un stress, une perte de poids, une diminution ou augmentation de la température corporelle, une diminution de la mobilité des souris ou un défaut de leur toilettage. Les traitements seront administrés par injection dans le ventre ou sous la peau ou par la bouche. Les souris pourront ressentir un stress lié à la contention et une douleur liée à la piqûre.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure. En effet, il s’agit de procédures sévères, il ne serait donc pas éthique pour le bien être animal de les garder en vie.
Remplacement
L’étude de la fonction du cœur chez l’Homme au cours des infections sévères a été déjà réalisée de manière aussi complète que possible avec des analyses non-invasives. Cependant, pour aller plus loin dans la compréhension de ce phénomène, il est indispensable d’étudier le tissu du cœur en lui-même, or cela n’est pas possible chez l’Homme. Il n’existe pas à ce jour d’expérience dans les tubes à essais ou de modélisations sur l’ordinateur qui pourraient mimer l’infection de manière fiable car celle-ci a plusieurs causes et se propage dans tous le corps mettant donc en jeu des mécanismes complexes. De plus, il n’est pas éthique de tester des médicaments directement chez l’Homme. Ces raisons rendent nécessaire le recours à des modèles animaux.
Réduction
L’ensemble des études déjà réalisées sur le sujet dans le monde sera étudié avant de débuter les expérimentations animales. Ainsi, tous les traitements déjà essayés et non-efficaces ne le seront pas à nouveau ce qui permettra de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Nous n’étudierons que les animaux mâles car il a été montré que la mauvaise fonction du cœur au cours de l’infection était plus fréquente chez eux. Ainsi, cela permettra de ne pas inclure des femelles qui pourraient ne pas présenter de dysfonction du cœur et donc ne pas être analysées dans la suite du travail. L’étude de la fonction du cœur se fait par échographie ce qui est non-invasif pour la souris. Ainsi, les échographies peuvent être répétées chez une même souris au cours du temps sans avoir besoin de la mise à mort ce qui permet également de réduire le nombre d’animaux. L’analyse de l’expression des protéines de l’inflammation dans le cœur lui-même est une technique performante qui détecte un grand nombre de protéines en utilisant un nombre très faible d’animaux. L’analyse préalable de ces protéines guidera les traitements qui seront ensuite testés : seuls les traitements dirigés contre les protéines exprimées dans le cœur des souris au cours de l’infection seront testés. Grâce à une analyse statistique, nous réduisons au minimum le nombre de souris utilisées tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs c'est à dire qui nous permettent de conclure de manière fiable sur le plan mathématique. Nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d’analyses possibles à partir d’un même animal. Tous les organes prélevés sont congelés pour pouvoir les réanalyser au besoin ultérieurement.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi c'est à dire avec des cotons pour jouer par exemple, avec une semaine d’adaptation avant l’expérimentation. Un suivi quotidien sera réalisé avant le début de l’expérimentation puis toutes les six heures dès que celle-ci aura commencé. La chirurgie est réalisée sur une souris anesthésiée.. La douleur post opératoire est systématiquement prévenue par l’administration d’un médicament contre la douleur avant la chirurgie et au bout de 12 heures. Les souris seront mises à mort si leur état se dégrade brusquement ou si elles présentent un état de souffrance. Une grille de score est prévue à cet effet qui sera également remplie toutes les heures dès le début de l’expérimentation.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme espèce animale pour réaliser les expériences de ce projet est pertinent car l’infection sévère chez la souris est très proche de celle chez l’Homme. Ce modèle est utilisé depuis de nombreuses années dans la littérature scientifique. Les souris utilisées seront des souris mâles car le mauvais fonctionnement du cœur au cours de l’infection sévère est plus fréquent chez les souris mâles. Ces souris seront des souris adultes de 8 à 12 semaines car nous nous intéressons à l’infection sévère chez les humains adultes
Evaluation de l’efficacité de composés d’intérêt dans des pathologies allergiques chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 1250
18 450 rongeurs, 17 200 souris et 1 250 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux subissent l'implantation d'un transpondeur, des prélèvements sanguins répétés dont des ponctions cardiaques et des gavages, dans des modèles d'allergie cutanée, alimentaire et d'anaphylaxie pour tester des composés. Le porteur indique que la stimulation par l'allergène peut provoquer une hypothermie, des atteintes respiratoires et cardiaques et une anaphylaxie "pouvant être mortelle". Tous les animaux sont tués à l'issue, le porteur affirmant qu'il n'existe "pas de modèles in silico ou in vitro" pour évaluer ces composés.
Objectifs
Ce projet consiste à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux composés dans des modèles d’allergie chez le rongeur. Les pathologies allergiques sont actuellement placées au 4ème rang mondial des maladies inflammatoires chroniques par l’OMS et selon les estimations statistiques réalisées la moitié de la population mondiale sera concernée d’ici à 2050. Il est donc primordial de poursuivre la recherche de nouvelle thérapies et l’évaluation de l’efficacité de ces traitements dans ce domaine. Ce projet visera particulièrement les allergies cutanées (urticaire, dermatite, …), alimentaires et généralisées telles que les anaphylaxies dont la prévalence a largement augmenté avec l’industrialisation mondiale. L’allergie est une pathologie complexe et multifactorielle, associée à un dérèglement du système immunitaire, nommée hyperréactivité, à l’égard de substances banales de l’environnement : les allergènes, conduisant à une perte de tolérance. L’allergie peut toucher de nombreux organes, néanmoins la peau et les muqueuses sont les tissus les plus souvent atteints de par leur interaction directe avec l’environnement. Elle se définit par une cascade d’événement qu'il est important d'identifier et de charactériser afin de développer des stratégies innovantes efficaces. Durant la première phase, dite de sensibilisation, l’individu est exposé pour la première fois à un allergène et va synthétiser des immunoglobulines E (IgE) spécifiques de cet allergène. La seconde phase, dite effectrice, induite lors de l’exposition secondaire ou chronique où l’individu pourra développer les symptômes d’une allergie (rougeurs, démangeaisons...). Des IgE seront produites et leurs interactions avec le récepteur FceRI permettront l’activation de cellules immunitaires innées telles que les mastocytes, basophiles, neutrophiles principalement retrouvées dans la peau, le tube digestif et les poumons. cette activation conduira à la libération très rapide de médiateurs pré-stockés tels que l’histamine, des leucotriènes ou des prostaglandines, responsables des symptômes engendrés dans les premières minutes de la réaction allergique : rougeurs, démangeaison, sécrétion et œdèmes. Puis la sécrétion de médiateurs lipidiques et protéiques permettra de soutenir cette inflammation locale qui peut à long terme être responsable d’altérations tissulaires et d’une anaphylaxie correspondant à une réaction allergique hyper-aiguë pouvant être mortelle.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels des pathologies allergiques ou anaphylactiques (utilisation d’anti-histaminiques, de bronchodilatateurs, injection intramusculaire d’adrénaline) réduisent les symptômes mais affectent peu la progression de la maladie. Les traitements biologiques récents sont plus efficaces mais très couteux et tous augmentent le risque d'infection. En outre ces traitements peuvent engendrer une immunogénicité et une perte d'efficacité due à la production d'anticorps neutralisants par le patient. Les procédures qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans les pathologies inflammatoires. A plus long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux : Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. Mesure de la température corporelle : Durée 1 minute sur animal vigile ou sous anesthésie générale, par le biais d'un transpondeur implanté ou via une sonde rectale pour rongeur, pourraient être effectuées toutes les heures au cours des 24 heures ou sur une durée de 15 jours suivant le challenge avec les antigènes. Implantation de transpondeur pour la mesure de la température : Durée 1 minute, sous anesthésie générale gazeuse ou par injection. Prélèvements de sang par voie retro orbitale au cours des procédures : Durée 30 secondes sous anesthésie générale gazeuse ou par injection. Via la submandibulaire : Durée 30 secondes sur animal vigile ou sous anesthésie générale gazeuse ou par injection. via la veine caudale : Durée 30 secondes sur animal vigile ou sous anesthésie générale gazeuse ou par injection. via ponction cardiaque : Durée 1 minute sous anesthésie générale gazeuse ou par injection. Les volumes et la fréquence des prélèvements seront généralement de 20 à 50 µl chez la souris et de 20 à 200 µl chez le rat. Le volume total prélevé n'excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place pouvant aller jusqu'à une semaine. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique), intrapéritonéale, sous-cutanée, par application topique ou via la veine caudale : Durée 30 secondes sur animaux vigiles. Administrations intraveineuses par voie retro orbitale : Durée 30 secondes Sous anesthésie générale (Isoflurane ou kétamine/xylazine).
Impact sur les animaux
Ces procédures peuvent engendrer une dégradation rapide de l’état de santé de l’animal pouvant se traduire par une modification du comportement animal (inactivité, absence de réaction aux stimuli, des vocalisations), une hypothermie, des atteintes respiratoires (angio-œdème, baisse de la fréquence respiratoire, baisse du volume courant, hypoxie), cardiaques (hypotension, tachycardie, vasodilatation, diminution de la perméabilité vasculaire), cutanées (érythème, œdème, épaississement de la peau), intestinale (diarrhée), une perte de poids. Ces effets surviennent suite à la stimulation avec l’allergène et s’établissent très rapidement (en quelques minutes ou heures). Les animaux seront également soumis à une anesthésie, des administrations et des prélèvements sanguins sous anesthésie générale qui peuvent constituer des nuisances.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des études. Les modèles décrits ne permettent pas la réutilisation des animaux.
Remplacement
A notre connaissance, il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent d’évaluer une potentielle efficacité thérapeutique de composés dans des pathologies allergiques. Seul un modèle animal peut permettre de mimer de manière séquentielle le développement de la pathologie et contenir tous les acteurs cellulaires et moléculaires nécessaires à ces diverses étapes.
Réduction
Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles rongeurs de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards réglementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront groupés dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire ou mis à mort selon les recommandations définis dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Le stress lié à la manipulation peut avoir un impact sur la réponse inflammatoire et immunitaire. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile.
Choix des espèces
La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rat et la souris. De nombreuses données sur les modèles d’allergie chez le rongeur existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l'avancement des projets (doses de l'agent allergènes, effets de molécules de références etc.) Adulte : Les données de la littérature indique clairement que les rats et les souris adultes représentent des modèles fiables pour l'évaluation de l'efficacité de composés dans le domaine des pathologies allergiques
Etude des mécanismes physiologiques et pathologiques de la myélinisation chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une lésion de la moelle épinière est induite chirurgicalement chez chaque animal sous anesthésie, suivie d'injections quotidiennes pendant 10 à 30 jours, pour étudier la réparation de la myéline et une piste thérapeutique contre la sclérose en plaques. Le porteur indique des nuisances liées à la chirurgie, hypothermie, hémorragie et douleurs post-opératoires, avec un point limite à 20 % de perte de poids. Toutes les souris sont euthanasiées pour des prélèvements post-mortem, le porteur décrivant le recours à l'animal comme "indispensable" pour valider les résultats obtenus sur cellules.
Objectifs
L’objectif de notre projet est d’identifier et déchiffrer de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la formation de la gaine de myéline autour des cellules nerveuses du système nerveux central (SNC) et périphérique, en condition physiologique et pathologique. Ce projet vise à étudier le rôle d’un récepteur membranaire, impliqué dans plusieurs mécanismes cellulaires, dans le contrôle de la synthèse de la gaine de myéline du système nerveux central et périphérique au cours du développement et à l’âge adulte, chez la souris. Dans un second temps, ce projet nous permettra aussi de montrer que ce récepteur est une nouvelle cible thérapeutique favorisant la réparation des gaines de myéline du SNC, chez la souris. La validation de cette cible ainsi que des composés sélectionnés sont des études très prometteuses, qui pourraient permettre de repositionner ces molécules actuellement utilisées dans d’autres pathologies, pour le traitement de maladies de la myéline.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’identifier de nouveaux mécanismes régulant la formation de la gaine de myéline autour des cellules nerveuses, lors du développement normal et dans des conditions pathologiques. Notre projet de sélection et de repositionnement de molécules thérapeutiques nous a permis de sélectionner 3 molécules avec un fort potentiel thérapeutique qui seront validées grâce à l’utilisation d’un modèle murin de lésions de la myéline, présentant des similitudes avec les lésions observées chez les patients. A terme, ces études permettront d'améliorer le traitement des lésions de la myéline chez les patients et de démontrer un rôle de ce récepteur dans les lésions de la sclérose en plaques.
Procédures
Nous utiliserons des souris afin de déterminer le rôle d’un récepteur membranaire qui semble impliqué dans le processus de myélinisation du système nerveux. Dans l’objectif d’étudier son rôle, au cours du développement et au cours du processus de réparation de lésions de la myéline, nous induirons de petites lésions de la moelle épinière chez la souris (une lésion par animal, sous anesthésie générale). L’analyse de ces lésions à différents temps permettra d’analyser l’impact de la protéine étudiée sur les différentes étapes du processus de réparation des lésions de la myéline. Nous utiliserons 560 animaux dans cette procédure expérimentale. La durée totale et maximale de cette procédure chirurgicale est de 30 minutes par animal et 30 jours post-chirurgie. Pour le groupe des souris inductibles, une injection d’un produit est nécessaire avant l’induction de la lésion (1X par jour pendant 5 jours par i.p. d’environ 5sec). Le groupe des souris sauvages recevra après la lésion une des molécules sélectionnées ou le véhicule seul (1X par jour par voie i.p, durée d’environ 5sec, ou par voie PO durée d’environ 5sec, pendant 10 à 30 jours). Pour la poursuite de l’étude, et pour tous les animaux, il est nécessaire d’obtenir des échantillons biologiques dans un état le plus proche possible de l’état physiologique. Cela implique d’éviter et de prévenir toute dégradation post-mortem.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont majoritairement liées à la chirurgie : hypothermie, hémorragie, risque anesthésique, douleurs post-opératoires. Un stress peut aussi être observé chez l’animal à cause de la contention quotidienne et de l’injection d’un produit. Il est notamment possible d’observer l’apparition d’hématomes dus à l’injection répétée de ce produit.
Devenir
Les prélèvements et analyses seront réalisés en post-mortem ; cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Comprendre le rôle d’un récepteur, exprimé par la cellule responsable de la formation de la gaine de myéline, dans le système nerveux central, nécessite l’interaction de plusieurs types cellulaires et un environnement spécifique en fonction du stade du développement. Ainsi, le recours à l’utilisation d’un modèle animal est indispensable afin de valider nos résultats déjà obtenus par des modèles cellulaires en dehors de l’organisme dans l’objectif de comprendre comment l’activité de ce récepteur impacte la myélinisation et la remyélinisation. Concernant la partie validation thérapeutique, une analyse bio-informatique et l’utilisation de lignées de cellules, nous ont permis de réduire notre liste de composés à tester et par conséquent le nombre d’animaux à inclure dans notre étude. Nos résultats préliminaires suggèrent un fort potentiel de remyélinisation des 3 molécules sélectionnées, actuellement en phase clinique dans d’autres pathologies.
Réduction
Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables. Nous prévoyons l’utilisation de 560 souris qui vont subir une procédure expérimentale modérée : - 280 pour notre procédure de démyélinisation focale afin d’évaluer l’effet régénératif dans les souris transgéniques. - 280 pour notre procédure de de démyélinisation focale afin d’évaluer la régénération de la myéline après traitement par des molécules pharmacologiques sélectionnées. Certaines variations expérimentales pouvant être observées dans ces deux modèles, le nombre d’animaux de chaque groupe est le minimum requis pour obtenir des données statistiquement significatives.
Raffinement
Les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage, bruit et espace) et les conditions d’enrichissements de l’environnement (maison et matériel papier-coton), d’alimentation et de soins quand nécessaires seront parfaitement contrôlées (directive européenne 2010/63/UE). Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous anesthésie et analgésie pendant toutes les interventions quand cela s’avérera nécessaire. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désigné. Ils seront stabulés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie définies par les normes européennes (soit 22°C +/-2° pour la température et entre 45 et 65% d’hygrométrie). De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi : animaux hébergés en groupe, nid en coton. Une alimentation adaptée est proposée aux animaux en croisement pour couvrir les besoins de la gestation et de l’allaitement. -Une période minimale de 7 jours d'acclimatation est respectée. - Plusieurs points limites visant à réduire la souffrance et/ou la détresse de l'animal sont respectés : - Apparence et position anormale : dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le côté, hypothermie au cours de la chirurgie (la température de l’animal étant monitorée durant l’acte) - Comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit, réduction de la mobilité - Perte de poids rapide ou progressive de 20 % (poids de référence pris le jour de la chirurgie) réalisée par pesée tous les jours pendant 5 jours puis 2 fois par semaine avant l'euthanasie - État de choc, léthargie, immobilité - Difficultés respiratoires. L'euthanasie de l'animal sera réalisée si l’on observe l’un de ces critères. Le vétérinaire désigné sera consulté en cas de complications ou effets indésirables constatés lors des procédures ou après celles-ci : présence de signes cliniques d’infection (ex: prostration, suppuration) afin de mettre en place les actions nécessaires.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix puisqu’en tant que mammifère, ses processus physiologiques se rapprochent de ceux décrits chez l’homme. Afin de comprendre le rôle d’un récepteur membranaire du facteur de croissance vasculaire dans la régulation de la myélinisation en condition physiologique et pathologique, il est nécessaire de réaliser des études in vivo, intégrant l’ensemble des interactions entre les différents types cellulaires et leurs environnements. Chez l’homme adulte, quand la gaine de myéline est endommagée ou détruite, un mécanisme de réparation se met en place afin de régénérer une nouvelle gaine de myéline afin de protéger les neurones de la dégénérescence. L’utilisation de modèles animaux, au stade équivalent (souris adulte), reproduisant certains aspects des pathologies démyélinisantes comme la sclérose en plaques, est indispensable pour évaluer la fonction de ce récepteur membranaire en contexte pathologique. Il existe aussi un ensemble d’outils (anticorps, lignées transgéniques permettant de tracer le devenir des cellules gliales) qui ont été développés principalement chez la souris. L’utilisation de la souris pour l’étude de ce récepteur au cours du développement du système nerveux et dans des conditions pathologiques est donc indispensable pour étudier le rôle de ce récepteur et identifier de nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique pour le traitement des pathologies de la myéline. Nous utiliserons des animaux des deux sexes afin d’éviter tout biais potentiellement lié au sexe dans notre étude.
Elevage de lignées de souris à phénotype dommageable permettant l’étude du cancer colorectal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
340 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie transférée vivante vers un autre site pour expérimentation. Le projet déclare la création et l'élevage d'une lignée à phénotype dommageable qui développe spontanément des polypes intestinaux, pour étudier le cancer colorectal. Le porteur indique que les individus présentent après cinq mois des signes d'anémie, une perte de poids et des prolapsus, et qu'ils sont utilisés avant cet âge. Sur les 340 souris, 220 sont dédiées à l'élevage et à la maintenance de la lignée et 120 forment des cohortes transférées vers un autre site dans le cadre d'une "utilisation continue", le porteur affirmant qu'il n'existe "aucun modèle de substitution".
Objectifs
Nous souhaitons comprendre la séquence des événements impliqués dans les premières phases de l’initiation tumorale, impliquant l’utilisation de souris développant des lésions adénomateuses précoces de l'intestin. Cette saisine vise uniquement à déclarer la création et l'élevage de cette lignée. Cette lignée de souris combinera 3 modifications génétiques, permettant de comprendre comment l'inactivation d'un gène requis pour l'activation du système immunitaire peut diminuer le développement de polypes intestinaux.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet la génération de modèles d'études inédits, permettant de comprendre comment certaines cellules épithéliales peuvent participer à la mise en place d'un environnement propice à la tumorigenèse intestinale, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Aucune intervention invasive hors des actes à des fins d'élevages ainsi que dans le cadre de la prise en charge d'un phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Les animaux possédant l'un des 3 gènes modifiés vont développer, au cours de leur vie, des polypes intestinaux de manière spontanée. L'expérience acquise sur cette lignée montre que les individus ne présentent que peu ou pas de d'effets indésirables durant les 4 premiers mois de leur vie. A termes, à partir de 5 mois d'âge, les nuisances peuvent être les suivantes: signe d'anémie, perte de poids, et, de manière plus tardive, apparition de prolapsus.
Devenir
Les individus seront utilisés uniquement à des fins d'élevages avant 5 mois (220 au total), afin de générer des cohortes qui seront utilisées sur un autre site (120). Les animaux générés dans le cadre de cet élévage seront par la suite transférés sur un autre site pour expérimentation (cadre d'une utilisation continue).
Remplacement
Les questions posées dans le cadre de ce projet (séquence des événements impliqués dans les premières phases de l’initiation tumorale) impliquent l’utilisation de modèles murins reflétant au mieux la physiologie d’un point de vue intégrée. Il est en effet crucial pour nous de comprendre quelles sont les interactions entre les différentes populations cellulaires, les différents compartiments tissulaires ainsi que le microbiote intestinal. Il n’existe à ce jour aucun modèle de substitution, et l’utilisation de souris reste la seule alternative à notre problématique.
Réduction
Sur la base de nos données acquises lors d'un précédent projet, des cohortes expérimetales de 20 souris contrôle et 20 souris test seront requises pour réaliser 3 expériences indépendantes, portant le nombre d'animaux à produire à des fins expérimentales à 120 (40 x 3). Il faut ajouter à ce nombre les individus nécessaires pour la création de la lignée et son maintien (110), et anticiper d'éventuels croisements requis pour la suite de nos projets (110) . Ainsi, nous déclarons un total de 340 souris a utiliser dans le cadre de ce projet.
Raffinement
La principale stratégie de raffinement consistera à utiliser les animaux le plus précocement possible, jusqu'à 5 mois maximum, phase durant laquelle les individus ne présentent pas d'effets délétères majeurs. Des critères d'évaluations et des points limites visant à détecter les premiers signes avant-coureurs de l'évolution de l'état des souris seront mis en place lors de l’élevage.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour notre projet, puisque disposant d’un appareil digestif et d'un système immunitaire présentant de nombreuses similitudes avec l’homme. L'un des gènes modifié utilisé dans ce projet mime la perte de fonction du gène le plus fréquemment muté dans le cancer colorectal humain. Ce modèle de souris transgéniques sera donc utilisé pour nous permettre de tester au mieux nos hypothèses. Les animaux dédiés à la maintenance et l’amplification des colonies seront utilisés entre 8 et 22 semaines, âge auquel les souris ne présentent pas d'effets indésirables drastiques.
Effet des milieux de culture de la fécondation in vitro sur l’activité métabolique de l’œuf et le phénotype adulte chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 420 femelles donneuses sont tuées pour collecter leurs ovocytes et 180 receveuses subissent une chirurgie de transfert d'embryons d'une heure, pour comparer des milieux de culture de fécondation in vitro. Le porteur indique une douleur modérée liée au transfert chirurgical et un stress léger lié aux manipulations. Toutes les souris sont euthanasiées à l'issue, le porteur affirmant que seuls des animaux peuvent fournir les gamètes nécessaires.
Objectifs
Nous enregistrerons par imagerie dès la fécondation les signaux du fonctionnement de l’œuf de souris nécessaires au développement embryonnaire en fonction du milieu de culture dans lequel ils sont incubés. Nous évaluerons après transfert d’embryons dans une souris receveuse les taux de naissance ainsi que les croissances des animaux issus des œuf incubés selon les différents milieux. Ce qui permettra d’établir une correspondance entre le fonctionnement de l’œuf, la croissance des animaux adultes et la composition du milieux de culture utilisé. Les objectifs sont : 1. Enregistrer dès la fécondation, les signaux déclenchés dans l’œuf et liés à son métabolisme qui provoquent le développement embryonnaire. Puisque ces signaux sont connus pour être sensibles à la modification du microenvironnement , nous les utilisons comme des indicateurs du fonctionnement de l'œuf en fonction de la composition du milieu de culture. 2. Obtenir des naissances et enregistrer les taux ainsi que les croissances des animaux jusqu’à l’âge adulte issus d’œufs incubés suite à la fécondation in vitro avec un milieu de culture.
Bénéfices attendus
L'impact à long terme des techniques d'assistance médicale à la procréation (AMP) demeure un sujet de préoccupation de santé publique important car les mécanismes inducteurs, issus des manipulations in vitro, sont encore mal compris. L'unique contrôle qualité des milieux destinés à l'AMP dénommé MEA (Mouse Embryo Assay) consiste à vérifier qu'au moins 80% des embryons de souris cultivés durant 72-96 h dans ces milieux atteignent le stade blastocyste. Nous allons compléter ce contrôle chez la souris en utilisant l’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes et en analysant dans ces conditions l’impact sur l’activité de l’œuf au moment de la fécondation et à long terme chez l’animal adulte. Mieux comprendre l’impact de certains composants des milieux de culture afin d’optimiser leur formulation permettra d’augmenter le taux de développement de l’embryon jusqu’au terme et d’obtenir des animaux en bonne santé.
Procédures
Les souris donneuses d’ovocytes (420) auront 2 injections à 48h d’intervalle, durée quelques secondes. Les souris receveuses (180) auront 2 injections, durée quelques secondes. Chaque souris receveuse aura une chirurgie, durée 1 heure.
Impact sur les animaux
Stress léger relatif aux différentes manipulations des souris. Douleur modérée relative au transfert chirurgical d’embryons et douleur légère liée à la piqure lors des injections.
Devenir
La mise à mort des femelles donneuses est nécessaire pour collecter les ovocytes. En fin de procédure, après le sevrage des souriceaux, les souris receveuses ayant mis bas pour la première fois, ne pourront pas avoir un second transfert d’embryons. Elles seront euthanasiées.
Remplacement
Seul des animaux peuvent être utilisés pour fournir des gamètes et donc permettre le formation d’œufs et le développement d’un nouvel individu complet.
Réduction
Dans cette étude nous avons calculé le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des données suffisanteset avoir une bonne estimation statistique de la variabilité des réponses. Afin de réduire au maximum le nombre de receveuses utilisées, les receveuses accouplées qui ne seront pas utilisées seront gardées au repos et réutilisées 10 jours après.
Raffinement
Les méthodes expérimentales ont été choisies pour limiter tout stress et éviter toute souffrance lors des interventions sur les animaux. Avant chaque transfert chirurgical d’embryons, un traitement analgésique sera donné pour éviter toute douleur avant l’intervention. Puis un mélange anesthésique/analgésique sera administré afin de prévenir la douleur durant toute l’intervention chirurgicale. Le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe dans un environnement enrichi (cabane en cellulose et papier de ouate) et l’application de critères d’arrêts de l'expérience permettent de garantir le bien-être des animaux. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance et de mettre en œuvre des traitements appropriés ou de décider d’une euthanasie, en accord avec la cellule bien-être animal de l’installation expérimentale.
Choix des espèces
La souris est l’espèce modèle idéale pour ce projet car la durée de gestation est très courte (19-20 jours) et la croissance des animaux rapide (sevrage à 4 semaines). Cette rapidité permet de mettre en évidence des relations entre des changements qui ont lieu pendant la fécondation et leurs conséquences à l'âge adulte. Les lignées de souris utilisées dans ce projet sont des lignées de référence par rapport à nos précédentes études Les souris seront utilisées dès l’âge de 6 semaines, maturité sexuelle pour les femelles.
Caractérisations dosimétriques et radiopathologiques des brûlures radiologiques induites par des rayonnements X chez la souris : impact du volume irradié, de la localisation, de l’énergie et de la répétition des expositions
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
2 466 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Elles reçoivent une irradiation aux rayons X sur la patte arrière qui provoque des brûlures radiologiques, décrites comme un "protocole sévère" par le porteur, avec un suivi journalier au pic lésionnel. Le porteur indique un point limite de mise à mort à 20 % de perte de poids et classe 1 794 animaux en souffrance sévère. Toutes les souris sont tuées pour prélever les tissus, l'étude étant justifiée par les surexpositions accidentelles dans les domaines médical, industriel et militaire et le modèle in vivo décrit comme "indispensable".
Objectifs
Bien que l’utilisation des rayonnements ionisants dans le domaine médical, industriel ou militaire soit majoritairement maitrisée, des surexpositions accidentelles peuvent se produire. Lorsque ces surexpositions dépassent un certain seuil de dose à la peau, elles peuvent entrainer un syndrome cutané radio-induit se traduisant par l’apparition d’érythème, de desquamation ou de nécrose tissulaire, musculaire voir osseuse dans les cas les plus sévères. Lorsque ces accidents de surexpositions impliquent des sources de rayonnements X de basses énergies (
Bénéfices attendus
Au-delà de l’acquisition de nouvelles connaissances scientifiques, ce projet contribuera améliorer la prédiction du risque de complications lié aux surexpositions accidentelles impliquant des rayonnements X de basses énergies ainsi qu’à enrichir l’expertise de l’institut dans ce domaine. En particulier, il permettra, à partir d’un modèle expérimental pré-clinique, d’avoir une analyse dosimétrique in vivo et de caractériser les spécificités radiopathologiques des brûlures radiologiques pour les rayonnements X de basses énergies. Ce projet permettra également d’améliorer la compréhension des effets « volume de tissu exposé » et « énergie des rayons X utilisés».
Procédures
Pour les animaux que nous garderons 6 mois, une imagerie doppler (non invasif) une fois par semaine sous anesthésie gazeuse (durée de 10 minutes maximum ; maximum 24 sessions d'imagerie par animal). Sur ces mêmes groupes, des prélèvements à l’œil seront réalisées avec un capillaire sous anesthésie gazeuse afin de réaliser une analyse longitudinale de la formulation sanguine. Ces prélèvements seront réalisés au temps suivant : 0 (avant l’irradiation), 7jours, 14 jours, 21 jours, 1 mois, 2 mois, 3 mois, 4 mois, 5 mois et 6 mois post-irradiation : soit 7 prélèvements maximum. Tous les autres prélèvements seront réalisés post-mortem.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet les animaux vont développer des brûlures radiologiques au niveau de la patte arrière. Ce protocole sévère, nécessite une vigilance particulière en particulier au pic de la lésion. Sur la base de notre précédent projet, des résultats obtenus et le recul sur ce modèle, un suivi journalier sera effectué entre 7 jours et 30 jours après l’exposition (pic lésionnel). Les animaux seront également pesés deux à trois fois par semaine. Une perte de poids supérieure à 20% du poids initial ou une perte de poids supérieure à 15% entre deux pesées entrainent la mise à mort de l'animal afin de limiter ses souffrances. Des signes de souffrance manifestes, en plus de la lésion localisée, comme la piloérection, une perte de mobilité ou la prostration de l’animal sont également des points limites adaptés. De plus, nous considérons qu’une souris isolée du reste du groupe est un signe de souffrance et un point limite suffisamment précoce.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir collecter les tissus pour les analyses.
Remplacement
Dans le but de caractériser de nouveaux modèles d’exposition chez la souris d’un point de dosimétrique et radiopathologique, l’utilisation d’un modèle « in vivo » demeure indispensable au bon déroulement des projets scientifiques mais le nombre de souris utilisé sera réduit autant que possible. Les utilisations d’animaux dans le cadre de ce projet seront tracées (date, projet concerné, informations sur les animaux, devenir des animaux, type d’irradiation).
Réduction
Ce projet prévoit l’utilisation de 2466 souris sur 5 ans. Le nombre d’animaux utilisé correspond au minimum nécessaire pour effectuer des tests paramétriques statistiques, avoir une bonne évaluation et quantification de la dose à l’os, une bonne caractérisation radiopathologique de l’effet des rayonnements et prendre en compte la variabilité inter-individuelle. Pour cela, il est nécessaire d’avoir un minimum de 6 à 8 animaux par groupe en fonction des expérimentations.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux seront adaptées aux procédures réalisées afin de limiter le plus possible le stress et la souffrance de l’animal. Les souris seront hébergées en groupe et dans un environnement enrichi. Lors des irradiations, des anesthésiques et analgésiques seront utilisés et une surveillance des animaux sera mise en place après les irradiations. Le bien-être animal sera également évalué en réalisant des pesées, des photos des lésions et un scoring lésionnel ainsi que la mise en place de points limites adaptés. Ce protocole sévère, où des brûlures radiologiques vont être développées au niveau du membre inférieur nécessite une vigilance particulière. Sur la base de notre expérience, de notre précédent projet, des résultats obtenus et le recul sur ce modèle, un suivi journalier sera effectué entre 7 jours et 30 jours après l’exposition correspondant au pic de la lésion. Des croquettes pourront également être déposées au fond de la cage avec de l’eau gélifiée afin de faciliter l’alimentation des animaux si des souris perdaient beaucoup de poids durant le pic lésionnel.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé pour les études physiologiques. De plus, le modèle de lésions musculo-cutanée radio-induites a été précédemment caractérisé sur une autre installation de l’institut utilisant des rayonnements X de haute énergie et basse énergie (cf. résultats précédents). C’est également un modèle utilisé en routine à l’IRSN. Pour les besoins de ce projet, des animaux adultes seront utilisés (8-10 semaines). Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge. De plus, en vieillissant, les souris C57BL/6J ont tendance à développer des comportements agressifs.
Etude du rôle des récepteurs à peptide RFamide dans la modulation de la nociception et de la douleur à l’aide de souris knockout des différents récepteurs RFamide
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris knockout subissent des modèles de douleur avec tests d'immersion et de pression de la queue, test de Von Frey, plaque froide et chirurgies, pour étudier le rôle de récepteurs dans la nociception. Le porteur indique que la douleur infligée interdit toute réutilisation, chaque animal étant tué à l'issue de sa procédure, les effets attendus incluant un abaissement du seuil douloureux et des inflammations aux points d'injection. Il décrit le modèle murin comme "incontournable" en neurosciences et le travail sur "l'animal entier" comme "indispensable".
Objectifs
La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs. Par contre, leurs effets indésirables sont nombreux, dont notamment la tolérance analgésique caractérisée par une diminution au cours du temps de l’effet du traitement nécessitant une augmentation des doses pour soulager le patient. La prise chronique d’opiacés entraîne également le développement d’une hypersensibilité à la douleur. Il y a donc des points communs entre l’hypersensibilité induite par les opiacés et le développement de l’hypersensibilité induite par les douleurs chroniques. Nos résultats récents indiquent que des récepteurs spécifiques sont impliqués dans ces phénomènes. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques peu ou pas caractérisées jusqu'à présent. Pour ce faire, nous avons récemment généré des lignées de souris modifiées génétiquement afin de présenter une déficience pour chacun de ces récepteurs spécifiques. L’étude de ces lignées nous permettra de mieux comprendre l’implication de chaque récepteur dans la modulation de la perception de la douleur et le développement de l’hyperalgésie. Ainsi nous pourrons envisager le développement de nouveaux traitements de la douleur plus sûrs et présentant moins d’effets secondaires que les traitements existants. Le même projet est déposé dans deux établissements utilisateurs pour des raisons de disponibilités d’équipements scientifiques dont le planning des utilisations n’est pas connu à ce jour. Toutefois, le nombre d’animaux annoncé : 2900, sera utilisé sur l’ensemble des deux établissements.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, les résultats de ce projet, combinés aux résultats obtenus par l’approche pharmacologique, permettront d’affiner le rôle de chacun de ces 6 récepteurs ainsi que des ligands endogènes (molécules naturellement synthétisées par les neurones et pouvant s’y fixer), dans la modulation de la perception de la douleur et le développement de l’hyperalgésie. Ils pourraient permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur.
Procédures
Gestes techniques subit par animal selon la procédure et le groupe auquel il appartient : PE1 : Injection composé x4 (10 secondes) / 10 tests Tail Immersion Test (TIT) d’une durée de 30 secondes / 10 tests Tail Pressure Test (TPT) d’une durée de 30 secondes PE2 : Injection composé x 10 (10 secondes) / 15 tests TIT (30 secondes) / 15 tests TPT (30 secondes) PE3 : Injection composé x1 (10 secondes) / 10 tests TIT (30 secondes) / 10 tests TPT (30 secondes) PE4 : Injection composé x1 (10 secondes) / 16 tests TIT (30 secondes) / 16 tests TPT (30 secondes PE5 : Chirurgie (20 minutes) / Injection composé x2 (10 secondes) / 15 tests du Von Frey (20 minutes) / 15 tests de la plaque froide (5 minutes) PE6 : Chirurgie (5 minutes) / Injection composé x2 (10 secondes) / 10 tests du Von Frey (20 minutes) / 10 tests du plantar (15 minutes) PE7 : Groupe 1 : Injection x1 (10 minutes ) / 11 tests TIT (30 secondes) / 11 tests TPT (30 secondes) Groupe 2 : Injection (10 minutes ) / 11 tests TIT (30 secondes) / 11 tests TPT (30 secondes)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont l’abaissement du seuil douloureux, l’apparition d’inflammation / œdème / infection au niveau des points d’injection ou des sutures chirurgicales, comportements anormaux, problème de locomotion, d’alimentation.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Aucune réutilisation d'animaux n'est possible du fait des modèles de douleur subit par les animaux qui mettraient en cause les résultats d'une nouvelle procédure si elle était réalisée.
Remplacement
L’étude du rôle des récepteurs à peptide RFamide dans la modulation de la nociception et de la douleur n’est réalisable que sur l’animal entier car il n’existe pas, à ce jour, de modèles in vitro permettant de réaliser ce travail. De plus, cette étude a pour but de compléter l’évaluation de différentes molécules ciblant les récepteurs à peptide RFamide sur la modulation de la nociception chez la souris. La combinaison des résultats obtenus par les approches génétiques et pharmacologiques permettra ainsi de conclure de manière plus convaincante quant à l’implication des différents récepteurs RF-amide dans la modulation de la douleur.
Réduction
En raison de la variabilité dans les différentes expériences prévues et de nos résultats antérieurs, le nombre d’animaux est limité à 10 par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les tests effectués sont compatibles avec le bien-être de l'animal ce qui permet de réduire l’effectif. Les expériences seront menées sur les mâles et étendues aux femelles dans les modèles de douleur les plus pertinents.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi, et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente dans un établissement agréé de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et après concertation auprès de la structure chargée du bien-être animal. Dès que cela est possible, les gestes douloureux sont réalisés sous anesthésie générale, accompagnées d’une analgésie locale et sur tapis chauffant afin d’améliorer le confort de l’animal. Le réveil se fait individuellement en cage propre sous lampe chauffante.
Choix des espèces
Les objectifs du projet consistent à étudier le rôle des récepteurs RFamide dans la modulation de la nociception et de la douleur. Pour ce faire, il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. A leur arrivée au laboratoire, les souris sont âgées de 6 semaines avec un poids allant de 25 à 30 grammes. Les animaux sont soumis aux procédures expérimentales à partir de 8 semaines ce qui correspond à l’âge de la maturité sexuelle et d'un développement complet du système nociceptif.
Evaluation de nouvelles thérapies immunologiques par imagerie dans le modèle d’hypersensibilité retardée chez la souris
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
8 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une réaction inflammatoire est provoquée par une injection de sensibilisation puis une injection intradermique dans la voûte plantaire, entraînant un œdème douloureux de la patte et des difficultés d'appui. Le porteur indique cinq à sept examens d'imagerie sous anesthésie pour tester des composés contre l'eczéma de contact, la dermatite atopique ou le psoriasis. Toutes les souris sont euthanasiées en fin d'étude, le porteur décrivant l'imagerie sur animal vivant comme le moyen "incontournable" d'évaluer ces composés.
Objectifs
L’objectif du projet est de reproduire, chez la souris, un modèle d’hypersensibilité retardée survenant chez l’Homme correspondant à une réaction inflammatoire locale aigue, en vue de l’évaluation de composés pour le développement de traitements dans des pathologies inflammatoires de la peau. Le modèle de réponse d’hypersensibilité retardée est utilisé de manière standard en Immunologie car il permet d’évaluer la réponse immunitaire à l’injection ou au contact d’une molécule identifiée comme corps étranger par l’organisme. Ce modèle permet ainsi d’évaluer l’impact thérapeutique de composés permettant de réduire la réaction immunitaire inflammatoire consécutive à une seconde exposition avec ce même antigène. L’approche envisagée n’est pas spécifique d’une pathologie donnée mais plus tôt des voies mécanistiques conduisant à des pathologies liées à l’exacerbation de l’immunité locale chez le patient. Ce projet permet de caractériser les modifications de la réponse immunitaire induite par les composés testés. Il permet de caractériser leur cinétique de distribution et d’élimination dans l’organisme étudié (la souris), la cinétique d’action et l’efficacité de ces mêmes composés par imagerie non invasive, en vue de la sélection de candidats médicaments pour préparer leur évaluation chez l’Homme en clinique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. A court terme ce projet permet d’identifier le potentiel thérapeutique de molécules ciblant la réaction inflammatoire locale aigüe en vue de développements de traitements dans l’eczéma de contact (crèmes métaux polluants), la dermatite atopique, le psoriasis arthritique... L’approche par imagerie permet de suivre les paramètres de distribution, d’élimination ; le mécanisme d’action du composé sur l’inhibition du système immunitaire et d’évaluer l’efficacité du traitement contre la réaction inflammatoire produite en permettant une investigation de plusieurs paramètres simultanés de façon non invasive et longitudinale sur les mêmes animaux. L’approche permet donc ainsi de diminuer le nombre d’animaux testés par rapport à une approche conventionnelle nécessitant des prélèvements de tissus répétés pour obtenir des informations équivalentes. A plus long terme, les données générées sur ce modèle permettront d’augmenter les connaissances scientifiques sur les processus immunologiques impliqués dans diverses pathologies inflammatoires humaines et feront l’objet de publications seront partagés avec la communauté scientifique. Les données générées permettront de sélectionner des composés et supporter leur évaluation en phase clinique pour contribuer à la constitution des dossiers d’autorisations de mise sur le marché de ces nouveaux médicaments. L’approche par imagerie permettra potentiellement d’envisager l’évaluation de méthodes comparables dans le diagnostic ou le suivi de pathologies inflammatoires chroniques ou un bénéfice/risque serait plus envisageable (Arthrites, syndrome de l’intestin irritable, maladie de Crohn…).
Procédures
Chaque animal reçoit deux injections de la molécule induisant la réponse inflammatoire. (Une première injection, dite de sensibilisation, à la molécule inflammatoire (antigène) complexée à un adjuvant est pratiquée dans la zone dorsale par voie sous cutanée. Cinq jours après, une injection intradermique de l’agent inflammatoire seul est pratiquée sous anesthésie dans la voute plantaire d’une patte postérieure. Les composés évalués pour leurs activité anti-inflammatoire dans le modèle, sont administrés par voie intraveineuse, ou intrapéritonéale, ou sous cutanée ou par voie orale. Les animaux sont injectés avec les agents de contraste d’imagerie par voie intraveineuse, ou intrapéritonéale ou sous-cutanée, et sont soumis aux examens d’imagerie.Chaque administration/injection de composé est réalisée environ en 1 minute. Ils sont anesthésiés à chaque prise d’image (5 à 7 examens d’imagerie par étude espacés sur 10 jours). Chaque prise d’image dure de 1 à 10 minutes maximum en fonction de la modalité d’imagerie mise en œuvre (nucléaire ou optique), et en fonction de la nature du traceur employé. Le volume de l’inflammation de la patte injectée sera mesuré au pied à coulisse sous anesthésie tout au long de l’étude. (Compter 1 minute pour la mesure). La durée de l’anesthésie est de 5 à 15 minutes en anesthésie gazeuse pour chaque prise de vue, de façon à permettre l’installation de l’animal dans l’appareil sous le champ de la caméra, la prise de vue et la mesure de l’œdème.
Impact sur les animaux
La première injection d’induction de sensibilisation à l’antigène permet de sensibiliser le système immunitaire de la souris pour lui permettre de reconnaitre la molécule étrangère. Le complexe étant visqueux l’injection sous-cutanée s’effectue en deux points sous anesthésie gazeuse pour limiter les effets de volume et l’irritation. Cinq jours après, l’injection du même antigène que celui utilisé pour la sensibilisation (sans adjuvant) est pratiquée par voie intradermique dans la voute plantaire d’une des pattes postérieures, sous anesthésie gazeuse. L’antigène sera reconnu par le système immunitaire de la souris sensibilisée qui réagira en développant une réaction inflammatoire jusqu’à l’apparition d’un œdème au site de la seconde injection dans les 24 heures. La phase aigüe de l’inflammation est maximale à 24h, elle se traduit par un gonflement et une rougeur du pied qui diminue spontanément dans le temps. L’inflammation génère une certaine douleur qui peut conduire à des difficultés d’appuis ou de locomotion de façon transitoire. Les injections de produits testés ou d’agents d’imagerie, ainsi que et des prélèvements sanguins répétés peuvent provoquer un inconfort léger à modéré et de courte durée.
Devenir
Les souris sont euthanasiées en fin d’étude. Le sang et organes d’intérêt peuvent être prélevés pour analyses. Si les points limites sont atteints en cours d’étude, les souris sont euthanasiées pour raison éthique de façon anticipée.
Remplacement
Les études d’imagerie permettent de documenter le devenir du composé testé dans le corps d’un animal vivant et de valider les propriétés thérapeutiques des composés à l’échelle du corps entier, pour préparer le protocole d’évaluation des composés sélectionnés dans les phases cliniques en vue de l’obtention de l’autorisation de mise sur le marché d’un nouveau traitement chez l’homme. Actuellement, l’utilisation d’animaux vivants reste le moyen incontournable de montrer les relations pharmacocinétique-pharmacodynamie, le devenir (bio distribution), la tolérance et l’efficacité du candidat médicament dans un organisme complexe car, aucune méthode substitutive fiable d’évaluation in vitro ou in silico d’une molécule ne permet de répondre à toutes les interactions in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est préalablement basé sur les publications scientifiques. Ensuite, sur la base des données historiques expérimentales, un biostatisticien est consulté pour optimiser le nombre d’animaux à utiliser en fonction de l’objectif et du design de l’étude (nombre de groupes d’animaux, type de comparaisons et répétitions), du nombre et de la variabilité des paramètres mesurés, de la modalité d’imagerie mise en œuvre, et de l’importance des effets à mettre en évidence. Les méthodologies statistiques sont appliquées pour proposer une analyse des données appropriée afin de mener les études pour répondre à l’objectif fixé en réduisant au maximum les biais expérimentaux avec un minimum d’animaux. Les techniques d’imagerie permettent l’étude longitudinale des paramètres reflétant l’impact du produit testé sur la réponse inflammatoire induite pour chaque animal, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les études par rapport aux études traditionnelles.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe de 4 à 5 par cage et un enrichissement spécifique est donné aux souris : un abri en carton, une litière en cellulose standardisée et douce type « Alpha dri ® » est utilisée pour faciliter la locomotion, de la nourriture et un gel hydratant sont apportés en supplément directement dans la cage dès le démarrage de l’étude. - Les anesthésies gazeuses sont employées : lors des injections sous cutanées du complexe antigène/ adjuvant (2 x 50µl en sous cutané) pour tenir compte de la viscosité importante du complexe, lors des injections intradermiques dans la voute plantaire, lors de la mesure de l’œdème inflammatoire au pied à coulisse permettant de limiter la douleur générée par la pression exercée sur le site inflammé. - Les sessions d’imagerie s’effectuent sous anesthésie gazeuse (ou fixe) pour garder l’animal immobile et sans stress le temps de la prise d’image. Les autres examens complémentaires sont réalisés juste avant ou immédiatement à la suite des prises d’images pour bénéficier de cette anesthésie. Après chaque anesthésie, Les animaux sont suivis jusqu’au réveil en armoire ventilée chauffante ou chauffé à 23°C pour optimiser les conditions de réveil. - Le recours à l’imagerie pour l’évaluation de la bio distribution des composés testés et l’évaluation de l’impact du traitement sur la réponse inflammatoire à l’aide de biomarqueurs d’imagerie constituent un raffinement en soi puisqu’il permet de générer des informations spécifiques de la réponse au traitement de façon non invasive tout au long de l’étude, de façon répétée sur les mêmes animaux, en limitant le recours à des prélèvements de tissus à intervalles réguliers nécessaires sans cela. - A ce jour, le modèle de référence est le modèle proposé. Selon les résultats obtenus, on pourra ensuite tenter de raffiner le modèle en utilisant des adjuvants moins réactifs ou une autre voie d’injection pour atténuer les effets secondaires, mais en conservant la réponse immunitaire équivalente dans son mécanisme d’action. L’apparition de trois signes cliniques notables (dos vouté, déshydratation, blessure, abcédation au point d’injection dorsale, stéréotypies, pelade…), ou d’un seul signe clinique sévère (perte de poids ≥ 20%, ou ≥ 15% 3 jours de suite, automutilation, plaie, infection, nécrose) entraine l’arrêt anticipé de tout ou partie de l’étude en accord avec le directeur d’étude et le vétérinaire responsable.
Choix des espèces
Le modèle d’hypersensibilité retardée chez la souris est documenté et décrit dans la littérature est standardisé et largement utilisé. Ce modèle fait appel à une réponse cellulaire inflammatoire cutanée dont le mécanisme est comparable à celle qui se développe chez l’Homme au contact d’agents inflammatoires. Par ailleurs, la facilité d’utilisation, la compatibilité avec les méthodes d’imagerie non invasives nucléaires et optiques, la compatibilité avec l’étude des composés sur des effectifs relevant d’un point de vue statistique, la disponibilité des modèles humanisés exprimant les cibles thérapeutiques d’intérêt, et de souris transgéniques exprimant un reporteur d’imagerie d’intérêt, et la faible variabilité de réponse attendue d’un animal à l’autre par rapport à d’autres espèces permettent de tester plus de traitements et de sélectionner ceux qui génèrent des effets plus robustes et reproductibles sont autant d’avantages qui nous ont conduit à choisir la souris comme modèle. Les souris adultes sont utilisées dans ce projet pour mimer la pathologie chez les patients adultes car l’immunité varie fortement en fonction de l’âge.
Surexpression de DNM2 par croisement génétique pour le traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth liée à DNM2.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil ou de gravité modérée. Elles subissent des tests comportementaux, suspension à une grille retournée, tapis roulant et barre crantée, puis une mesure de force musculaire sous anesthésie sans réveil, pour tester une modulation génétique de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Le porteur indique que le modèle ne présente aucun signe de douleur au départ mais que la modulation du gène peut provoquer une faiblesse musculaire. Toutes les souris sont tuées à huit semaines pour une étude histologique, le porteur affirmant qu'une étude sur cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même pour évaluer force et coordination.
Objectifs
Le but de ce projet est de développer une preuve de concept thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles de souris. La maladie se manifeste dans l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par une faiblesse musculaire et des anomalies de gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression du gène impliqué dans la maladie pour tenter d'atténuer les symptômes musculaires et nerveux. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique.
Bénéfices attendus
Cette étude va permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques à l’origine de la maladie, causant des défauts à la fois dans le tissu musculaire et dans le tissu nerveux. Ce projet pourrait également conduire à une preuve de concept thérapeutique pour une maladie aujourd’hui incurable.
Procédures
Une partie des animaux (14) sera utilisée pour évaluer le phénotype des souris transgéniques (analyses purement observatoires de la naissance à 8 semaines). Une partie sera utilisée uniquement pour les croisements (21 ou 42). L’autre partie des animaux (entre 80 et 160 en fonction des résultats obtenus) seront soumis à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire et la coordination motrice. Pour évaluer leur force générale, leur durée de suspension à une grille retournée sera mesurée (durée 3x60s). Pour évaluer leur coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant (max 60s) et une barre crantée (10x30s environ). Pour évaluer la force musculaire développée, la mesure des propriétés contractiles se fera sous anesthésie générale (procédure d’une heure, sans réveil).
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Pour les animaux transgéniques, la modulation d’expression du gène d’intérêt peut engendrer une faiblesse musculaire, nous effectuerons une étude de phénotype dommageable. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force générale, le fait d’être suspendu à une grille engendre du stress physique chez l’animal.
Devenir
Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 semaines après caractérisation comportementale. Une étude histologique des tissus affectés sera ensuite effectuée.
Remplacement
Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 10 souris par sexe et par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement quotidiennement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. Après le sevrage, les animaux seront hébergés par groupe de 2 à 5 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. La température sera maintenue constante et un cycle de 12 heures jour/nuit sera respecté. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. La litière sera changée hebdomadairement afin de maintenir les animaux au propre et au sec. La pesée des animaux sera réalisée 1 fois par semaine. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Si les animaux transgéniques sont très faibles, de la nourriture en gel leur sera procurée. La plupart des tests réalisés sur les animaux dans cette étude sont non invasifs, ce qui limite la probabilité d’apparition de douleur. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. En cas de douleur observée au cours de l’étude, un analgésique sera administré (buprénorphine à différentes doses selon l'intensité de la douleur). L'étude sera stoppée prématurément si nécessaire pour éviter des douleurs aiguës pendant de longues périodes.
Choix des espèces
Afin de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’évaluer les effets d’une thérapie, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure des muscles et des nerfs, les deux tissus principalement touchés, est trop différente. D’une part, une étude sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation des bénéfices sur la structure des fibres nerveuses et musculaires, sur le la coordination motrice et la force musculaire seraient impossible à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression du gène d’intérêt, nous ferons un croisement génétique de souris et nous étudierons les effets de ce croisement à 8 semaines, car à cet âge le phénotype de la maladie est exprimé (défauts moteurs et structurels), ainsi nous pourrons savoir assez tôt si la modulation de ce gène est bénéfique.
Formation interne des équipes de recherche aux administrations, prélèvements et chirurgies sur les modèles rats et souris
- Formation professionnelle
Rats : 750
2 750 rongeurs, 2 000 souris et 750 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet forme les équipes aux administrations, prélèvements et chirurgies, avec jusqu'à trois gestes par séance et deux tentatives autorisées en cas d'échec. Le porteur indique que les chirurgies entraînent l'euthanasie de tous les animaux concernés et qu'un entraînement préalable a lieu sur "animaux factices". Aucune connaissance n'est produite, l'objet étant l'acquisition et l'entretien de gestes techniques, le porteur affirmant qu'il est "indispensable" que le personnel se forme et s'entraîne régulièrement.
Objectifs
Le projet regroupe l’ensemble des techniques pour lesquels les personnels des laboratoires de recherche peuvent être formés. Il s’agit de techniques d’administrations, de prélèvements, ainsi que de chirurgie (en complément et à la suite de la formation règlementaire de chirurgie). La formation sera encadrée et réalisée par des personnes compétentes et expérimentées et fera l’objet d’une attestation de formation après validation de maitrise du geste technique. La mise en œuvre du geste technique dans le cadre d’une procédure expérimentale d’un autre projet ne sera possible qu’après cette validation.
Bénéfices attendus
Afin de réaliser les projets de recherche utilisant des animaux dans de bonnes conditions et en respectant les 3 R’s, il est indispensable que le personnel mettant en œuvre les procédures soit correctement formé (formation règlementaire initiale suivi d’un tutorat), mais également qu’il s’entraine régulièrement. Ce projet participe à cette formation et cet entrainement.
Procédures
Toutes les formations s’effectuent sous tutorat d’une personne formée et compétente. Différents prélèvements, injections ou chirurgies seront effectuées dans le respect de la règlementation et des bonnes pratiques en vigueur. Tous les actes d’administration et de prélèvement s’effectuent en quelques minutes et en respect de l’animal. Les animaux pourront être soumis à 3 gestes maximum par séance de formation. Les animaux pourront être gardés pendant une semaine de formation. Une réutilisation des animaux pour un deuxième geste technique sera permise dans certains cas. En cas d’échec lors d’une administration ou d’un prélèvement, un second essai peut être autorisé par l’encadrant sur le même animal, mais pas au-delà. (Nombre de tentatives = 2 maximum)
Impact sur les animaux
Il n’y a pas d’effets indésirables attendus avec les administrations et/ou les prélèvements, hormis le stress possible lors de la contention et l’inconfort transitoire pouvant se produire à la suite des gestes. De plus, les animaux seront observés quotidiennement. De plus, en cas de chirurgie, une anesthésie et une analgésie adaptées seront mises en œuvre, ainsi qu’un suivi post opératoire. Tout signe de prostration 48h post chirurgie entrainera l’euthanasie de l’animal.
Devenir
Les règles de réutilisation des animaux sont clairement décrites. Dans le cas des chirurgies, tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Une collecte d’échantillons post-mortem sera envisagée.
Remplacement
La formation des gestes techniques nécessite un apprentissage sur animaux vivants sous la supervision d’une personne compétente. En complément des formations règlementaires (niveau concepteur, applicateur ou chirurgie) l’entrainement pratique reste un élément clé pour acquérir les bons gestes à développer par la suite pour garantir le raffinement des procédures expérimentales que le technicien ou le chercheur aura à mettre œuvre. Un entrainement sera proposé au préalable sur animaux factices.
Réduction
La formation pratique sera précédée des formations règlementaires (niveau concepteur, applicateur ou chirurgie) et des documents qualité seront étudiés avant toute mise en pratique (Mode opératoires ou fiches reflexe). Tous les moyens seront mis en œuvre pour réduire le nombre d’animaux, à savoir recherche et développement de modèles alternatifs, réalisation de plusieurs gestes sur un même animal, collecte d’organes pour formation ex vivo. Dans la mesure du possible les animaux surnuméraires des élevages internes seront prioritairement utilisés. Un entrainement sera proposé au préalable sur animaux factices.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages ventilées et enrichies, dans un environnement contrôlé en température et hygrométrie. L’alimentation et l’eau seront proposés à volonté et la litière est également adaptée à la procédure (cellulose en post opératoire). Tous les prélèvements le nécessitant se feront sous anesthésie générale. Toutes les chirurgies se feront sous anesthésie générale ; l’analgésie et la réhydratation des animaux sera assurée lors de la chirurgie ainsi qu’en post-opératoire. Les animaux seront surveillés deux fois par jour par du personnel compétent et formé. La maitrise de la contention sera vérifiée avant tout essai de technique d’administration réalisée sous contention.
Choix des espèces
Les projets réalisés dans nos laboratoires ont recours aux rongeurs de laboratoire (rats et souris). Ces projets mettent en jeu différentes techniques. Les animaux utilisés seront au stade adulte. Si pour les besoins d’un projet particulier des animaux plus jeunes ou âgés doivent être utilisés pour la formation préliminaire, cette utilisation particulière sera également tracée.
Formation aux techniques d’administration et de prélèvement sur souris et rats.
- Formation professionnelle
Rats : 200
800 rongeurs, 600 souris et 200 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil ou de gravité légère. La moitié des animaux passe sous anesthésie sans réveil, l'autre subit des gestes sur animal vigile, pour entraîner du personnel aux techniques d'administration et de prélèvement. Aucune connaissance n'est produite, l'objet étant la vérification et le maintien de compétences. Le porteur indique que ces animaux sont "de réforme", surnuméraires d'élevages, et conclut que le recours aux animaux est "indispensable".
Objectifs
Ce projet est un projet éducatif qui intègre différentes techniques d'administration et de prélèvement dont les utilisateurs peuvent avoir régulièrement besoin. Ces formations s'adressent aux concepteurs et aux personnels appliquant des procédures expérimentales et/ou souhaitant s'entrainer pour un ou des gestes techniques. Ces techniques sont utilisées à la demande des utilisateurs et ils doivent en avoir le besoin dans le cadre de leur projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permet pour les personnes n’ayant jamais pratiqué ces techniques de se former et de s’entrainer avant l’expérimentation ; pour les personnes n’ayant pas réalisé ces techniques récemment de se remettre à niveau. Pour cela elles sont encadrées et conseillées par des personnes maitrisant les gestes.
Procédures
Les animaux soumis à des procédures sans réveil de type administration ou prélèvement de substance sont sous anesthésie générale et sous analgésie adaptée tout au long de la procédure (Durée de la séquence : 20 minutes maximum). Pour les administrations et le prélèvement en vigile, les animaux auront au maximum 1 séance d’entrainement (durée de chaque séquence 5 minutes).
Impact sur les animaux
En théorie, les animaux étant mis à mort à la fin des expériences et ces expériences étant effectuées sous anesthésie et analgésie, aucune nuisance particulière n’est attendue pendant ces phases du projet. Néanmoins, concernant les administrations à l'aide d'une aiguille, les animaux peuvent subir un léger stress et une douleur très légère suite à la piqûre. Concernant les gavages par voie orale, une douleur, un stress ou un inconfort léger peut être ressenti par les animaux.
Devenir
Ces animaux sont des animaux de réforme issus d’élevages qui ne peuvent donc être replacés, les procédures étant sans réveil ou de sévérité légère avec mise à mort à la fin.
Remplacement
Cette demande d’autorisation de projet a pour objectif de former les concepteurs et les personnels appliquant des procédures expérimentales souhaitant s'entrainer pour un ou des gestes techniques. Nous n'avons pas les moyens techniques, à ce jour, pour remplacer cette formation par des méthodes in vitro ou artificielles. L’utilisation d’animaux est donc indispensable.
Réduction
Dans l’objectif de réduire le nombre d’animaux, les apprenants réaliserons plusieurs gestes sur un même animal. Le sexe ou la lignée génétique de l'animal, n’a aucun impact pour les gestes effectués. Ainsi nous priorisons les animaux de réforme. Ce sont des animaux surnuméraires, n'ayant pas été inclus dans les projets pour lesquels ils étaient destinés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en animalerie par groupe sociaux avec de l’enrichissement (tunnel, frosottis, papier craft...). Afin de réduire au maximum la souffrance, la douleur et l’angoisse de l’animal lors des gestes techniques, les animaux sont sous couverture anesthésique et analgésique chimique ou gazeuse adaptée. Du personnel qualifié suit la profondeur de l’anesthésie et la qualité de l’analgésie pendant l’acte. Des tapis chauffants permettent de maintenir la température corporelle de l’animal.
Choix des espèces
La souris et le rat sont les modèles d'étude des utilisateurs de l'animalerie. Ces derniers souhaitent donc légitimement être formés et/ou se ré entrainer sur ces modèles. L’utilisateur ne pourra être formé que sur la technique d’intérêt de son étude et dans l’espèce concernée. Les animaux sont utilisés à partir de 4 semaines et jusqu'à une 30aine de semaines en fonction des mises à mort programmées dans l'animalerie (animaux de réforme issus des élevages).