Souris

700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris transgéniques modèles de maladie d'Alzheimer reçoivent une injection intracérébrale unique sous anesthésie, avec un risque d'hypothermie, d'arrêt cardio-respiratoire ou de douleurs post-opératoires. Une partie est tuée pour prélever le cerveau, l'autre tuée sans prélèvement pour l'entretien de la colonie. Le porteur cherche à savoir si moduler les lysosomes prévient la perte de neurones et affirme qu'aucune méthode autre que le modèle animal ne permet d'étudier cette dégénérescence.

Objectifs

Au cours de la maladie d’Alzheimer (MA), des pertes de neurones et de synapses se produisent dans des régions particulières du cerveau. Ces pertes sont bien corrélées à l’intensité des troubles cognitifs caractérisant la maladie. Cependant, le mécanisme des pertes neuronales reste mal connu. Des études ont montré une altération des lysosomes, de petits organelles intraneuronaux chargés de la dégradation des protéines. Notre objectif est de déterminer si les pertes de synapses dans la MA pourraient être dues à cette altération des lysosomes. Pour cela nous allons déterminer si des traitements modifiant le fonctionnement des lysosomes permettent de prévenir les pertes de neurones et de synapses dans un modèle murin de MA.

Bénéfices attendus

Les mécanismes des pertes de neurones et de synapses dans la maladie d'Alzheimer (MA) sont encore très mal connus, et ce projet a pour objectif de tester un mécanisme qui pourrait orienter vers une thérapeutique. En effet, ces études permettront de déterminer si une modulation du fonctionnement lysosomal est une cible thérapeutique envisageable contre la MA.

Procédures

Un élevage de souris transgéniques modèles de maladie d'Alzheimer présentant des pertes de neurones et de synapses sera effectué. Les souris auront une chirurgie consistant en une injection intracérébrale unique sous anesthésie générale, après avoir reçu l’injection en sous-cutanée d’un analgésique. L'analgésique sera également injecté en post-opératoire. Cette procédure durera une heure. Les souris seront euthanasiées en fin de période de maintien pour prélèvement et analyses.

Impact sur les animaux

Les souris APPxPS1-KI développent spontanément une pathologie neurodégénérative avec l'âge, mais elles seront euthanasiées avant l'apparition d'un phénotype dommageable. La contention des souris pour l'injection d'un analgésique avant et après la chirurgie ou avant l'euthanasie peut entraîner peur et stress. La chirurgie effectuée sous anesthésie générale comporte des risques associés à l'anesthésie (hypothermie, arrêt cardio-respiratoire). De plus, les souris pourraient souffrir de douleurs post-opératoires suite à la chirurgie.

Devenir

Une partie des animaux sera euthanasiée pour prélèvement du cerveau et analyses, et l'autre partie euthanasiée sans prélèvement (maintien de la colonie).

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet ces modèles animaux sont les seuls à permettre d’étudier la perte progressive de neurones et synapses adultes se produisant dans la maladie d’Alzheimer.

Réduction

Les 700 souris générées permettent (1) de renouveler les reproducteurs, (2) de réaliser les injections intracérébrales, et (3) de réaliser des analyses ne nécessitant pas de procédure expérimentale mais seulement la collecte de tissus après une procédure d’euthanasie. Le nombre d’animaux utilisés pour les injections intracérébrales (280) est réduit au maximum, la taille des groupes d’animaux ayant été établie pour obtenir une puissance statistique suffisante. Il sera en effet nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les méthodes sont choisies pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse : (i) les souris ont à disposition, comme élément d’enrichissement, des composants de nidification et des batonnets ; (ii) une surveillance quotidienne des paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie) est réalisée ; (iii) une surveillance quotidienne des animaux est effectuée, afin de détecter un état de stress ou de douleur. En cas de blessure, de pathologie, d’hypoactivité et de mouvement anormal, l’avis du vétérinaire sera demandé, et s'il le recommande les animaux seront euthanasiés afin d’éviter toute souffrance. Les souris sont anesthésiées durant la chirurgue, et nous administrons un antalgique en pré- et postopératoire pour éviter les douleurs post-opératoires suite à l’injection intracérébrale.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris transgéniques, modèle murin de maladie d'Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèles autres que les souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du projet. Les injections intracérébrales seront effectuées à 3 mois, avant que les pertes de neurones et de synapses ne soient observées chez les souris, et leurs effets seront analysés 3 mois après injection, quand ces pertes sont significatives. Les géniteurs seront utilisés entre 2 et 8 mois d'âge, période optimale pour la reproduction des souris.

1 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par voie intrapéritonéale cinq jours durant, des vecteurs viraux insérant des gènes, des chirurgies crâniennes sous anesthésie, puis sont fixées environ une heure, vigiles, pour des enregistrements électrophysiologiques pendant des stimulations. Le porteur mentionne des complications rares comme infections, douleurs chroniques ou baisse de température, et tue toutes les souris pour des prélèvements post-mortem. Cette recherche fondamentale sur les circuits du cortex vise à éclairer des maladies comme la schizophrénie ou l'autisme, le porteur affirmant qu'aucune lignée cellulaire ne reproduit la physiologie des neurones.

Objectifs

Les déficits cellulaires, les connexions et les circuits du cerveau sont responsables de nombreuses maladies graves telles que l'épilepsie, la schizophrénie, l'autisme et la dépression. Le cortex cérébral, qui est la partie du cerveau responsable des fonctions cognitives complexes, intègre les informations sensorielles. Cela se fait grâce à des interactions précises entre différents types de cellules du cerveau. Notre projet de recherche vise à comprendre comment ces cellules du cortex cérébral se connectent les unes aux autres et comment ces connexions contribuent aux changements dans le fonctionnement du cerveau, qui sont perturbés dans les maladies cérébrales. Nous nous concentrons en particulier sur une couche spécifique du cortex appelée couche superficielle 1 (L1), qui joue un rôle clé dans l'intégration des informations sensorielles et contextuelles. Les cellules spécifiques de cette couche, appelées interneurones L1, ont différentes caractéristiques structurelles et fonctionnelles. Cependant, nous ne savons pas encore comment ces différentes populations de cellules interneuronales contribuent à l'intégration des informations contextuelles avec les stimuli sensoriels. Nous avons découvert que de nombreux neurones de la couche L1 expriment un récepteur appelé récepteur cannabinoïde de type 1 (CB1), qui joue un rôle important dans les changements des connexions inhibitrices entre les cellules du cerveau. Ces changements pourraient avoir un rôle clé dans la transmission des informations contextuelles vers la couche L1 lors du traitement sensoriel. Nous supposons que les sous-groupes de neurones CB1-positifs et CB1-négatifs dans la couche L1 sont activés de manière différente par des informations contextuelles provenant de différentes voies du cerveau, ce qui influence la flexibilité du traitement sensoriel. Notre projet se concentre sur le cortex visuel des souris. Nous espérons que cette recherche nous aidera à mieux comprendre les mécanismes spécifiques des circuits neuronaux impliqués dans la perception sensorielle, ce qui pourrait conduire au développement de nouvelles thérapies pour le traitement des maladies cérébrales.

Bénéfices attendus

Les maladies du cerveau ont un impact important sur la santé, l'autonomie, l'éducation, l'emploi, la mobilité et les relations personnelles des individus, ce qui représente un fardeau considérable sur le plan social et économique. Il est crucial de comprendre les caractéristiques de base qui régissent les connexions entre les différents types de neurones dans le cerveau, tant dans des états normaux que pathologiques. En particulier, les problèmes liés au développement des circuits inhibiteurs du cortex cérébral sont impliqués dans des troubles neurologiques tels que la schizophrénie, la dépression et l'autisme. Cependant, nous avons encore beaucoup à apprendre sur l'organisation des microcircuits inhibiteurs, notamment dans la couche L1, aussi bien dans des conditions normales que dans des troubles. Nous espérons que ces études nous aideront à découvrir de nouvelles approches thérapeutiques pour ces maladies. En utilisant des souris génétiquement modifiées, nous pourrons cibler des types spécifiques de cellules et de réseaux, ce qui nous permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques des maladies du cerveau.

Procédures

Toutes les souris seront injectées avec du tamofixen par voie intrapéritonéale (IP) au stade adulte (3 min/animal) pendant 5 jours. Une partie des souris transgéniques recevra une insertion de gènes au stade adulte en utilisant des vecteurs viraux. Toutes les souris seront recevront un traitement anti-douleur (3 min/animal). Les souris sont anesthésiées pour les chirurgies (30-40 min/animal). Une autre partie des souris recevra une insertion de gènes en utilisant des vecteurs viraux couplé à un système qui permettra soit l’imagerie soit les enregistrement électrophysiologiques (40 à 60 min /animal). Pour les enregistrements en électrophysiologie, les souris seront préparées sous anesthésie (pendant 15 min) puis réveillées pour être vigiles au moment des stimulations qui engendrent des activités neuronales, sujets de nos études. Les enregistrements nécessitent la fixation de l’animal pendant environ 1h, des séances d’habituation sont prévues pour préparer l’animal (1h). Toutes les souris seront injectées avec une injection d’un anti-inflammatoire par voie sous-cutanée (3 min/animal) et anti-douleur (3 min/animal), 30 min après seront anesthésiées pendant toute la durée de la chirurgie (30-40 min/animal). Une autre partie de souris transgéniques adultes subiront insertion de gènes par vecteurs viraux, et couplé à un système qui permettra soit l’imagerie soit les enregistrement électrophysiologiques. Toutes les souris seront injectées avec une injection d’un anti-inflammatoire par voie sous-cutanée (3 min/animal) et anti-douleur (3 min/animal), 30 min après seront anesthésiées pendant toute la durée de la chirurgie (30-40 min/animal). Pour les enregistrements électrophysiologiques, le jour de l'expérience, les souris seront brièvement anesthésiées (15 min/animal) et une électrode à haute densité sera descendu pour permettre l'enregistrement électrophysiologique. Le jour de l’euthanasie tous les souris seront injectées avec l’analgésique (3 min/animal) 10 min avant l’euthanasie (3 min/animal).

Impact sur les animaux

Le génotype des souris que nous utilisons n'a pas été associé à des effets indésirables connus sur les animaux. En général, nos interventions sont bien tolérées par les souris et n'affectent pas leur apparence ou leur comportement général. Cependant, il peut arriver très rarement que certaines complications se produisent, telles que des infections, des douleurs chroniques (visibles par une prostration, un mauvais ou un manque de toilette, une posture voutée), des saignements pendant les chirurgies ou une baisse de température pendant la procédure. Bien que beaucoup plus rares, il est également possible que les fils utilisés lors des chirurgies se détachent. L'injection intrapéritonéale de tamoxifène doit être réalisée sur une période de 5 jours. Ces injections sur 5 jours peuvent provoquer un certain stress lié à la manipulation de l'animal et des réactions locales possibles. Il est possible que l'administration d'injections pendant 5 jours consécutifs entraîne une légère perte de poids chez l'animal. Cependant, dans les heures qui suivent la chirurgie, il est possible que l'animal présente une réduction de l'activité spontanée. L'expérience de stimulation visuelle nécessite que l'animal soit éveillé et maintenu immobile, tandis que plusieurs essais de stimulations visuelles lui sont présentés. Cela nécessite une période d'adaptation à l'environnement d'enregistrement. Lors des deux premières séances, les animaux peuvent présenter des signes de stress tels que la présence de déjections sur le tapis roulant circulaire. Cependant, ces signes diminuent au fur et à mesure des séances à mesure que l'animal s'habitue à son environnement. Il est important de surveiller attentivement les souris tout au long de ces procédures et de signaler tout problème ou changement anormal à l'équipe de recherche.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasies en fin d’experience. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Il n’y a pas d’autres alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car des modèles adéquats du circuit cortical contenant le nombre, les types et la localisation appropriés de récepteurs dans les réseaux excitateurs et inhibiteurs ne sont pas disponibles. L'objectif de nos expériences est de découvrir les actions des gènes, des neuromodulateurs et des médicaments sur les circuits neuronaux dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie des neurones des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, De plus, il n'existe aucun modèle remplaçant l'utilisation d'animaux qui permettrait d'étudier les propriétés du reseau dans le cerveau entier d’un animal vigile.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (n = 1650) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux recevront les injections virales seront implantés pour l'électrophysiologie ou l’imagerie simultanément afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur le même animal. Toutefois, les avantages de la réutilisation des animaux seront mis en balance avec les effets négatifs sur leur bien-être, en tenant compte du cumul sur toute une vie de l'animal. En outre, notre expertise dans l'entraînement des souris à être fixé par la tête dans l'installation d'imagerie ou d'électrophysiologie réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon, et donc la signification statistique, dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton, kraft et maisonnettes) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. La préférence pour les procédures non invasives par rapport aux procédures invasives est prise en considération et, lorsque des interventions invasives sont nécessaires, les directives appropriées en matière d'anesthésie/analgésie seront suivies, auprès du comité interne de l'institution, chargé de la prise en charge du Bien-être animal (strutucture chargée du bien-etre animal) . Les animaux auront à manger et à boire à volonté. Des croquettes adaptées à la gestation et à l’allaitement seront mise à disposition pour les animaux en accouplement. Des points limites sont mis en place et sont respectés pour limiter toute souffrance aux souris utilisées

Choix des espèces

Les propriétés de base des microcircuits neuronaux chez la souris sont similaires à celles d’autres mammifères. Actuellement seulement les modeles murins nous permettent de visualiser les types d’interneurones que nous voulons étudier. Les approches expérimentales multiples réalisées chez la souris permettent une analyse complète allant du comportement jusqu’à l’activité d’un seul neurone. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. De plus, chez la souris, la période de gestation est courte et les portées sont importantes, permettant de produire suffisamment d’animaux pour plusieurs expériences à partir de peu de fondateurs. Le développement du cerveau est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Nous maitrisons suffisamment les techniques proposées dans ce projet pour réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour nos expériences. Les lignees que nous utiliserons ne présentent pas de phenotype dommageable. Des animaux adultes seront utilisés pour toutes les procédures (entre P35 et P150). Toutes les procédures nécessitent des interventions chirurgicales qui ne peuvent être pratiquées que sur des animaux adultes. Nos animaux sont identifiables par tatouage des phalanges et un petit prélèvement de l’extrémité de la queue est nécessaire à leur génotypage.

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur induit une maladie d'Alzheimer par injection intracérébrale d'un peptide amyloïde, administre une molécule chaque jour par voie intrapéritonéale, puis évalue la mémoire par le labyrinthe en Y, le test d'évitement passif avec un stimulus aux pattes, la reconnaissance du nouvel objet et le test du Hamlet. Toutes les souris sont ensuite tuées pour des analyses biochimiques post-mortem. Le porteur affirme le modèle murin "indispensable" et "seul recours in vivo" pour observer l'effet de la molécule sur la mémoire.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer l'effet de la Fluoroethylnormemantine (FENM) à long terme sur des modèles de rongeurs de la maladie d'Alzheimer (MA). Une étude préliminaire a démontré l'efficacité supérieure de la FENM en comparaison de la Mémantine (médicament utilisé pour la prise en charge des patients atteints par la MA). Cependant l'effet de la Mémantine est connu pour son manque d'éfficacité dans le temps et ses nombreux effets secondaires. C'est pourquoi la FENM a été testée en comparaison de la Mémantine dans un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer sur 2 mois de traitement. Contrairement à la Mémantine où après 1 mois de traitement son efficacité est nulle, la FENM maintient le processus de mémorisation des animaux traités et cela même après un arrêt de traitement. Afin de compléter ses résultats et dans l'objectif d'un développement clinique de la molécule, la FENM sera administrée sur deux modèles de rongeurs de la MA après un traitement à la mémantine pour juger de sa supériorité dans le temps par rapport au médicament de référence. De plus l'efficacité de la FENM sera évaluée après un traitement à long terme dans un milieu reproduisant les comportements naturels des animaux afin cette fois-ci d'évaluer la mémoire spatiale et topographique des animaux (mémoire faisant appel à notre orientation dans un environnement) des animaux, expérience jamais encore étudiée.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de préciser les effets pharmacologiques "in vivo" à long terme d'une molécule neuroprotectrice très efficace sur les modèles précliniques de la maladie d'Alzheimer. Ces informations apporteront des précisions importante quant au futur développement clinique de cette molécule de nouvelle génération.

Procédures

3 procédures au sein de ce projet concerneront une administration d'un peptide, ou de l'eau distillée, dans le ventricule droit des animaux par injection intra-cerébro-ventriculaire (ICV). Cette procédure sous anesthésie générale ne dure pas plus d'une minute, et se réalise une seule fois sur les animaux en début de procédure. Pour les tests de comportement, le labyrinthe en Y (8 min) (procédures 1-4), le test d'évitement passif (2 fois 5 min), le test du nouvel objet (3 fois 10 min) (procédures 1 à 3) et le test du Hamlet (2 semaines d’entrainement à 4h/jour pendant 10 jours et 2 fois 10 min pour le probe test (test de mémoire topographique, procédure 4 seulement)) seront réalisés au cours des procédures. Lors de l'apprentissage dans le test d'évitement passif les animaux reçoivent un stimulus non douloureux au niveau des pattes. Toute variation importante de la sensibilité aux stimulus conduit à l'arrêt de la procédure. Afin de traiter ces animaux, une injection intrapéritonéale quotidienne (tous les jours, 24h d'intervalle) sera réalisée sur la durée de la procédure expérimentale (ne dépassant pas 2 mois). En fin d'expérience les animauxseront euthanasiés et les échantillons seront prélevés pour analyses biochimiques.

Impact sur les animaux

Concernant le modèle pharmacologique induit par l'injection intra-cérébro-ventriculaire de peptide amyloide, la procédure d'injection peut induire du stress chez l'animal. Les animaux utilisés subiront deux autres types de stress modéré : une injection intrapéritonéale quotidienne et, un test d'évitement passif permettant d'évaluer la mémoire à long terme. Pour cela, un léger stimulus non douloureux sera produit au niveau des pattes de la souris. Les effets attendus sont un retardement des effets néfastes de la MA notamment sur les différents types de mémoires (court terme, long terme, spatiale et orientation dans un environnement soit topographique) sans effet secondaire.

Devenir

A la fin de chaque procédures les animaux seront euthanasiés afin de recupérer le matériel biologique permettant des analyses biochimiques post-mortem.

Remplacement

Afin de déterminer l'efficacité de la FENM, les tests doivent se faire « in vivo » en vue d’un éventuel développement clinique. De plus, l’utilisation de modèles murins de la MA pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la MA. Les approches in silico ou in vitro ou ex vivo ne permettent pas d’étudier l’effet de la molécule FENM sur le comportement des animaux notamment sur la mémoire spatiale de travail ou mémoire topographique ou de reconnaissance. Il est aussi impossible de voir les potentiels effets indésirables de la molécule. A ce jour, afin d’envisager un développement clinique aucune autre alternative que l’animal ne peut être envisagé.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux les doses administrées aux animaux se baseront sur les doses efficaces observées sur un modèle aigu de la MA précédemment obtenus au laboratoire. Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe) sauf pour l'une des procédure où nous pensons reproduire les résultats obtenus précédemment sur un fond génétique différent . Pour cela 6 souris/groupe sont nécessaires à l'étude. Une veille bibliographique sera également prise en compte tout au long du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de concentrer un maximum d’échantillons et éviter ainsi de relancer des expérimentations.

Raffinement

De la naissance jusqu’à la fin de vie des animaux les procédures d’injections seront peu douloureuses avec une administration par voie intra-péritonéale. Pour les injections intra-cérébro-ventriculaires, une injection d'analgésique sera administrée afin de palier la douleur. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. Afin de suivre les animaux une feuille de bien-être, avec des points limites sera accessible à l’animalerie et complété par l’expérimentateur lorsque tout comportement suspect (plaie, lésions cutanées, agressivité, stéréotypie, apathie, convulsions, …) sera remarqué par celui-ci. Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des copeaux de coton et des bâtons en bois et des cabanes en carton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid.

Choix des espèces

Le modèle souris est adapté aux protocoles comportementaux et déja utilisé dans les expériences antérieures au laboratoire. Les doses et mode d'administration sont donc connus. Les animaux seront étudiés à l'âge de 5 semaines qui correspond à l'âge adulte pour le modèle pharmacologique et aussi à partir de l'âge de 4 mois, âge auxquels les symptômes de la MA apparaissent dans le modèle transgénique.