Souris
Etude de l’induction de structures lymphoïdes tertiaires (TLS) par virothérapie dans des modèles syngéniques de souris porteuses de tumeur
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2484 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis des injections répétées de virus oncolytiques, par voie intratumorale, intranasale ou dans la muqueuse de la joue, avec un suivi des tumeurs par imagerie sous anesthésie. L'objectif est d'évaluer la capacité de ces virus à induire des structures lymphoïdes tertiaires et une réponse antitumorale, les retombées pour des patients atteints de cancer étant renvoyées à un éventuel développement clinique. Le porteur affirme que ces mécanismes ne peuvent être modélisés ni in vitro ni sur organoïdes et conclut qu'il est "primordial" de recourir à des souris pour observer l'interaction avec l'"organisme hôte".
Objectifs
Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) représentent une cible nouvelle dont le contrôle de la formation est devenu un enjeu immunothérapeutique. En effet, les TLS sont à l’origine du développement de réponses immunitaires adaptatives locales souvent favorables pour les patients atteints de certains cancers. Il a été montré que certaines molécules pouvaient être à l’origine de leur induction. Notre projet vise à évaluer la capacité de ces molécules, exprimées localement par des virus oncolytiques, à induire la formation de TLS. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des virus de la vaccine dont certaines souches ont déjà montré une capacité à induire des TLS. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer la capacité de nouveaux virus oncolytiques armés, à induire des TLS et à générer une activité anti-tumorale. Nous verrons dans un second temps, s’il est possible d’augmenter leur efficacité thérapeutique en les combinant avec une autre immunothérapie.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront de valider chez l’animal les effets thérapeutiques de ce nouveau traitement, en vue de le transposer ensuite chez l’humain dans le but final d’améliorer le pronostic vital de patients atteints de cancers. Si un effet probant est observé, les virus armés avec les chimiokines humaines pourront être générés dans l’entreprise collaboratrice, de sorte à poursuivre le projet vers un développement clinique. Si elle s'avère bénéfique, maitriser l'induction des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) dans le microenvironnement tumoral pourrait être une nouvelle voie de traitement des cancers. Les résultats issus de ce projet nous permettront aussi d'approfondir nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux et les molécules intervenant dans la néogénèse de TLS.
Procédures
Des tumeurs seront implantées chez les souris, par injection de cellules tumorales en sous-cutané, intrapéritonéal ou en intraveineuse. L’intervention n’aura lieu qu’une fois, durera moins d’une minute et sera réalisée sur souris vigile. Les tumeurs injectées par voie intra-muqueuse de la joue seront réalisées sur des souris anesthésiées une dizaine de minutes par injection de kétamine et xylazine. L’administration du traitement par voie intra tumorale des tumeurs sous-cutanées sera aussi réalisée sur souris vigile, ne durera pas plus d’une minute et sera répétée au maximum 3 fois (un jour sur deux). L’administration du traitement par instillation intranasale se fera sur souris anesthésiées et tenues à la verticale. L’opération durera environ 5 min par souris et sera répétée un jour sur deux pendant six jours. L’administration du traitement par voie intra-tumorale des tumeurs de la joue se fera aussi sur souris anesthésiées et sera répétée un jour sur deux pendant six jours. Le suivi de la croissance tumorale pourra se faire par imagerie IVIS à une fréquence de 2 fois par semaine. Pour cette opération les souris seront anesthésiées avec de l’isoflurane à 2 pourcent durant une quinzaine de minutes. Toute injection intra péritonéale d’anesthésiant ou de traitement sera réalisée sur souris vigile et durera moins d’une minute.
Impact sur les animaux
La douleur potentielle liée aux actes d’injections des cellules tumorales ou des virus oncolytiques se limitera à l'introduction de l'aiguille au site d'injection et aura lieu au maximum à 4 reprises par animal et par procédure. La contention des animaux peut procurer un stress ponctuel (quelques minutes). La croissance des tumeurs sous-cutanées ou intrapéritonéales pourra générer une gêne physique et des difficultés à la mobilité. La croissance des tumeurs pulmonaires orthotopiques pourra occasionner une gêne respiratoire. La croissance des tumeurs intra-muqueuses de la joue pourra générer une gêne physique et une difficulté à la prise alimentaire. Les anesthésies peuvent être associées à des risques d'hypothermie, d'hypoventilation ou encore d'arrêt cardio-respiratoires.
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées afin de prélever les tumeurs et d’analyser l’infiltrat immunitaire du microenvironnement tumoral après chaque procédure.
Remplacement
Nos travaux portent sur l’induction de structures lymphoïdes tertiaires au sein de tumeurs. Ce mécanisme fait intervenir plusieurs paramètres dynamiques et complexes (système immunitaire, vascularisation) qui ne peuvent pas être modélisés ailleurs que dans des modèles in vivo, pas même dans des modèles d’organoïdes. De plus, dans ce projet nous souhaitons valider de nouveaux virus oncolytiques candidats. Il est donc primordial d’utiliser des modèles in vivo afin d’appréhender leurs interactions potentielles avec l’organisme hôte.
Réduction
Avant d’être testés chez l’animal, les virus oncolytiques ont été caractérisés in vitro dans plusieurs lignées tumorales murines et humaines. Seuls ceux qui ont prouvé une activité efficace in vitro seront utilisés dans ce projet. Au sein d’une même expérience nous testerons plusieurs virus avec les mêmes groupes témoins, nous réduirons également le nombre d’animaux utilisés dans le groupe non-traités. Le suivi de la croissance tumorale dans le modèle pulmonaire orthotopique se fera par imagerie IVIS, ce qui permet de faire plusieurs mesures sur un même animal sans avoir à l'euthanasier. Des prélèvements pourront être fait sur les animaux destinés à être euthanasiés, avant et après euthanasie, afin d’évaluer en parallèle la pharmacologie des virus et des substances anti-tumorales utilisés et de réduire ainsi le nombre d’animaux nécessaire. Ce projet implique l'utilisation de 2484 souris maximum.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés (6 souris maximum par cage) et ne seront expérimentées qu'après une semaine minimum de stabulation. Notre structure possède un programme d'enrichissement (placement de nids végétaux et de tunnels en carton dans les cages) lors d'expérimentations supérieures à 15 jours. La stabulation sera conventionnelle (litière normale, cages ventilées individuellement, 6 animaux maximum par cage de type-IIL, température de 22 degrés plus ou moins 2 degrés, éclairage alterné jour et nuit 12h-12h de 6h-18h), et celles-ci recevront un régime alimentaire classique (nourriture Mucedola 4RF25 ou 21 ad libitum+eau par abreuvage automatique). Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs et animaliers pendant la durée de chaque expérience. Les animaux seront pesés deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. Les points suivants seront considérés comme limitants : tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire ; toute modification du comportement caractéristique d’une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos voûté) ; toute anomalie pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance : perte de poids supérieur ou égale à 20 pourcent du poids initial de l’animal, plaies et ulcères, fractures, détresse respiratoire ou tout signe d’essouflement, tumeurs sous-cutanées et intra-muqueuses excédent respectivement 2000 mm3 et 300 mm3. Les instillations intra-nasales (i.n.) et les injections intra-muqueuses (i.m.) seront réalisées sur des souris anesthésiées puis remises dans leur cage au moment du réveil contrôlé visuellement, avec une lampe chauffante pour maintenir leur température corporelle. L'injection par voie intraveineuse (i.v.) sera réalisée dans la veine caudale préalablement dilatée par frottement à l'éthanol 70 pourcent et exposition sous une lampe chauffante. L’analyse de la croissance tumorale sera réalisée par imagerie IVIS chez des souris anesthésiées par l’isoflurane 2 pourcent.
Choix des espèces
La souris fait partie des modèles expérimentaux les plus utilisés, il est actuellement possible d'avoir accès à un grand nombre de protocoles et de réactifs adaptés ce qui a permis de comprendre de nombreux mécanismes transposables à l'humain. Le système immunitaire humain possède de nombreuses similitudes avec celui de la souris et des travaux ont montré qu'il était possible d'observer des structures lymphoïdes tertiaires (élément primordial de nos recherches) chez la souris. Par ailleurs, les cellules immunitaires ont été exhaustivement caractérisées chez la souris: les marqueurs des cellules d'intérêts de cette étude sont connus et de nombreux réactifs sont disponibles. Les animaux seront reçus à l'âge de 12 semaines, car ce stade de développement correspond à des souris sevrées, de taille adulte et qui dispose d'un système immunitaire mature.
Etude du rôle des lymphocytes B dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer (1/2) et (2/2)_Amendement 1
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent cinq injections intraveineuses et sont soumises à quatre tests comportementaux non précisés, pour étudier le rôle des lymphocytes B. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable et ne décrit qu'un stress bref lié aux injections et aux contentions. Il justifie le recours à la souris par la disponibilité de lignées transgéniques reproduisant la maladie.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est d'étudier le rôle des lymphocytes B dans le développement et la progression de la maladie d'alzheimer.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou préventives pour ralentir et/ou limiter le développement de la MA.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections par voie intraveineuse (5 injections espacées de deux semaines) et des tests comportementaux (au nombre de 4). Chaque injection intra-veineuse durera au maximum une minute (préhension + immobilisation + injection).
Impact sur les animaux
Nous n'attendons aucun effets indésirables sur les animaux car les animaux développeront une maladie modérée. Dans ce modèle bien caractérisé, les souris développent une maladie grave à l'age de 12 mois et donc bien après la période de leur utilisation dans notre étude. Tous les animaux seront mis à mort à l'age de six mois maximum. En revanche, les animaux pourront développer des effets indésirables au cours des injections et des contraintes liées aux test comportementaux. Ces effets indisérables seront de l'ordre de l'angoisse et du stress de courte durée lorsque les animaux seront immobilisés pour être injectés par voix intra-veineuse ou lorsque les animaux seront placés dans des environnements différents et multiples pour les tests comportementaux. Nous avons alors établi des points limites afin de limiter au maximum ces éffets indésirables.
Devenir
AMENDEMENT: Les animaux que nous utilisons développent spontanément une maladie grave à l'age de 12 mois. Tous les animaux seront donc utilisés et mis à mort au plus tard à l'age de 6 mois.
Remplacement
L'objectif de ce projet est de mettre en évidence le rôle des cellules B dans un modèle expérimental de la maladie d'Alzheimer. Le projet met en jeu des explorations comportementales sur animal vigile qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.
Réduction
Pour respecter le principe de réduction, le nombre de souris utilisées sera réduit à son minimum (analyses de paramètre multiples pour chaque souris et utilisation de tests statistiques adaptés). L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique.
Raffinement
Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupées dans un milieu enrichi. Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
Les tests de comportement étant la méthode de choix pour tester l'efficacité d'une voie thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer, nous avons besoin d'utiliser un organisme vertébré pour nos expériences in vivo. Le modèle souris est un bon modèle pour les raisons suivantes : - Plusieurs lignées transgéniques murines modélisant la maladie d'Alzheimer existent et sont disponibles commercialement. - Nous disposons de nombreux outils spécifiques de la souris (sondes pour hybridation in situ, immunohistologie). - La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont particulièrement adaptées à ce projet. Les souris adultes agées de 6 semaines seront utilisées.
Toxicité aiguë par voie orale, cutanée et par inhalation. Lignes directrices de l’OCDE n°423, 402 et 436
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1400
1 400 souris et 1 400 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont gavés, exposés par voie cutanée sous pansement pendant 24 heures ou placés en contention jusqu'à quatre heures pour une exposition par inhalation, afin de déterminer la dose de substances chimiques qui doit être considérée comme létale. Le porteur indique que l'exposition peut provoquer des effets locaux et systémiques faisant souffrir les animaux, la mortalité observée conditionnant la poursuite des études. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative reconnue sur le plan réglementaire, ces études in vivo étant "indispensables".
Objectifs
Les industriels doivent montrer qu’ils maîtrisent les risques de l’exposition aux substances chimiques qu’ils utilisent et/ou souhaitent mettre sur le marché pour répondre aux exigences réglementaires (règlementations REACH, CLP, Biocides, etc.). Les tests qui s’avèrent nécessaires pour en caractériser les dangers doivent être réalisés suivant les lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour les essais de produits chimiques. L’objectif de ces études est d’évaluer la toxicité aiguë de l’exposition par voie orale, cutanée et par inhalation à des substances chimiques chez le rongeur (rats ou souris). Suivant des signes de toxicité, la mortalité et la morbidité observées après l’exposition aux substances, elles permettront de les catégoriser selon le Système Général Harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques et de déterminer dans quelle gamme de doses elles doivent être considérée létale.
Bénéfices attendus
Ces études renseigneront sur les effets sur la santé de l’exposition aiguë par voie orale, cutanée et par inhalation à des substances chimiques pour répondre à des requis réglementaires ou des questionnements sanitaires.
Procédures
A réception les animaux seront identifiés par un marquage à la queue, puis manipulés au moins 2 fois par semaine, au maximum tous les jours, pour être pesés et observés au plan clinique. Toxicité orale aiguë : Ils seront mis à jeun de la veille du traitement jusqu’à 3 à 4h après pour les rats, et de 3 à 4h avant le traitement jusqu’à 1 à 2h après pour les souris. Pour le traitement, les animaux seront maintenus vigiles manuellement en contention (< 3 min) et gavés avec la solution d’essai. Suivant les modalités d’administration de la substance, une ou plusieurs contention et gavage seront pratiqués. Toxicité cutanée aiguë : Pour la tonte, ils seront maintenus vigiles manuellement en contention (< 3 min) et rasés à l’aide d’une tondeuse dédiée aux petits animaux. Pour une manipulation plus aisée, ils pourront au préalable être anesthésiés. Pour le traitement, les animaux seront maintenus vigiles manuellement en contention (< 3 min) et la substance appliquée au niveau de la zone rasée du dos et du flanc. Elle sera maintenue en contact avec la peau au moyen d'un pansement de gaze poreux et d’un sparadrap non irritant et un bandage entourant le corps de l’animal pendant 24h. Ils pourront pour cela être placés en contention au moyen de tubes dédiés. Ils seront dans ce cas, préalablement à l’exposition, habitués à la contention en étant stabulés dans les tubes jusqu’à 30 min par jour durant 3 jours consécutifs. Après l'exposition, ils seront maintenus vigiles manuellement en contention (< 3 min) et la zone exposée essuyée à l’aide d’un papier absorbant imbibé d'eau ou d’un solvant approprié pour éliminer tout résidu de substance. Toxicité aiguë par inhalation : Préalablement à l’exposition, les animaux exposés en mode « nez seul » seront habitués à la contention en étant stabulés dans les tubes jusqu’à 30 min par jour durant 3 jours consécutifs. Durant l’exposition, les animaux seront placés individuellement pendant (au maximum) 4h dans des loges dans une enceinte d’exposition en mode « corps entier » ou maintenus en contention dans des tubes en mode « nez seul ». Après exposition, suivant les objectifs de l’étude, les animaux pourront être soumis à une mesure de la température rectale. Ils seront pour cela maintenus vigiles manuellement en contention durant quelques minutes (< 5 min).
Impact sur les animaux
Toxicité orale aiguë : Préalablement au traitement par voie orale, les animaux seront mis à jeun. Réalisé sur animaux vigiles, le gavage et la contention manuelle nécessaire pour le réaliser constituent un stress pour les animaux. Une régurgitation de la solution d’essai pourra également être observée au moment ou suite au gavage. Toxicité cutanée aiguë : Préalablement au traitement cutané, les animaux seront rasés au niveau du dos et du flanc. La tonte et la contention manuelle nécessaire pour la réaliser, si elle est pratiquée sur animaux vigiles, constituent un stress pour les rongeurs. De plus, la présence du pansement et, le cas échéant, le placement en tube de contention durant 24h après exposition pourra gêner les animaux, impacter leur mobilité et constituer un stress. Toxicité aiguë par inhalation : En cas d’exposition « nez seul », la contention imposée par le placement dans les tubes constitue un stress pour les animaux, car ils seront durant cette période immobilisés et ne pourront se nourrir et s’abreuver. La mesure de la température rectale, si elle est réalisée, constitue également un stress. Dans les 3 types d’études, la manipulation des animaux pourra modifier leurs réactions à la préhension et leur niveau d’activité pendant et après l’exposition à la substance, et une légère perte de poids pourra être observée dans les jours qui suivront. L’exposition à la substance pourra également induire des effets locaux (notamment cutanés, oculaires et au niveau des muqueuses) et systémiques (notamment gastro-intestinaux et respiratoires) susceptibles de faire souffrir les animaux. Des signes cliniques anormaux pourront être observés et leur physiologie être affectée.
Devenir
Conformément aux lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques, tous les animaux seront mis à mort selon une méthode autorisée au temps de sacrifice défini à l’issue de chaque procédure.
Remplacement
Il n’existe pas actuellement de méthodes alternatives à l’expérimentation animale qui permettent seules de déterminer la toxicité aiguë de substances suite à une exposition par voie orale, cutanée ou par inhalation et qui soient reconnues d’un point de vue réglementaire. Les études in vivo sont pour cette évaluation indispensables. Concernant le choix des animaux, le projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°423, 402 (utilisation de rats ou de souris femelles, ou de mâles si des informations sur la toxicité de la substance le justifient) et 436 (utilisation de rats mâles et femelles, ou uniquement d’un des deux sexes si des informations sur la toxicité de la substance le justifient) à l’âge adulte et de souches couramment utilisées en laboratoire.
Réduction
Le nombre d’animaux qui sera utilisé suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques. Une analyse des données bibliographiques disponibles sur la substance et ses analogues sera réalisée préalablement à l’étude pour déterminer la dose initiale à tester parmi les niveaux prédéfinis par la ligne directrice, la plus proche de celle qui devrait a priori permettre de la catégoriser (choix justifié par des données toxicologiques sur la substance) ou la plus pertinente pour limiter le nombre d’animaux utilisés (dose définie par la ligne directrice en cas d’absence d’informations). Pour l’évaluation de la toxicité aiguë par voie orale et par inhalation, le taux de mortalité et le nombre d’animaux moribonds déterminent la poursuite des études. Pour l’évaluation de la toxicité aiguë par voie cutanée, la gravité des signes anormaux sera évaluée par rapport à un mode opératoire interne défini sur la base de données bibliographiques et données historiques du laboratoire. L’occurrence de signes de toxicité et le taux de mortalité déterminent la poursuite de l’étude. Pour les 3 types d’études, seule une analyse descriptive des données sera réalisée.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux seront enrichies pour favoriser leur bien-être. Ils seront hébergés préférentiellement à plusieurs par cage (par dose) pour leur socialisation. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier et du matériau en bois à ronger seront également disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Les animaux seront observés attentivement au plan clinique dans les heures qui suivront le traitement, et jusqu’à ce que leur bon état de santé soit avéré. Des points limites et des actions correctives spécifiques au projet ont été définis. En cas de pathologie pouvant être soulagée (anomalies externes), un traitement médicamenteux pourra être administré s’il n’interfère pas avec les objectifs de l’étude. Des critères supplémentaires à ceux listés dans la présente demande pourront être définis au cas par cas suivant les informations toxicologiques disponibles sur la substance étudiée. Le cas échéant, ils seront indiqués dans le protocole de l’étude. En particulier dans l’étude de toxicité cutanée aiguë, les animaux pourront être anesthésiés avant d’être tondus pour limiter le stress de la manipulation. Dans les études de toxicité aiguë par voie cutanée et par inhalation, en cas de mise en contention durant l’exposition, des tubes semblables à ceux utilisés pour l’exposition des animaux seront disposés dans les cages d’hébergement pour leur permettre de se cacher et se familiariser avec le dispositif d’exposition. Au préalable, les animaux seront habitués à la contention imposée par le placement dans les tubes en y étant stabulés jusqu’à 30 min par jour durant 3 jours consécutifs. Les tubes seront tapissés de matériaux absorbants pour assurer le confort des animaux. Après chaque jour d’habituation, de la nourriture sera déposée dans leurs cages d’hébergement en guise de récompense.
Choix des espèces
Ces expérimentations seront réalisées chez le rongeur car sa physiologie est largement connue et car il constitue un modèle de prédiction des effets toxicologiques reconnu par la réglementation (cf. Document d'orientation de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°39). Ce projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°423, 402 et 436, d’utilisation du rat ou de la souris, de souches communément utilisées en laboratoire pour la réalisation de ces études, d’animaux adultes (âgés au moment de l’exposition de 8 à 12 semaines), d’un poids de ± 20% du poids initial moyen des animaux traités au préalable, et de femelles nullipares et non gravides le cas échéant.
Influences des gènes Cdkn1a et Cdkn2a sur les déficits cognitifs observés dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Génétiquement modifiées pour développer la maladie d'Alzheimer, elles subissent un test de reconnaissance d'objets puis le test de la piscine de Morris, qui les oblige à nager, pour étudier le rôle de la sénescence cellulaire dans les déficits de mémoire. Le porteur reconnaît que la nage forcée est stressante et présente un risque d'hypothermie et de fatigue. Il justifie le recours à la souris par la "nécessité" d'un organisme vivant proche de l'humain.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer résulte d'une lente dégénérescence des neurones. Elle se caractérise par des troubles de la mémoire, de l'orientation dans le temps et dans l'espace. Le patient perd progressivement son autonomie. Bien que plusieurs hypothèses aient été avancées, les causes exactes de la maladie restent complexes. Ces dernières années, la recherche a montré un intérêt croissant pour l'étude des cellules sénescentes. Les cellules sénescentes sont des cellules qui ont définitivement cessé leurs activités initiales ainsi que leur multiplication. Elles restent cependant très actives et produisent des protéines qui peuvent être nocives pour le tissu cérébral. La sénescence cellulaire est un des mécanismes naturels du vieillissement, mais elle peut devenir pathologique si les cellules sénescentes s'accumulent. Des recherches ont montré un lien entre l'accumulation des cellules sénescentes et la maladie d'Alzheimer chez l'Homme et la souris. Cependant, les mécanismes par lesquels la sénescence contribue aux symptômes de la maladie d'Alzheimer ne sont pas clairs. Pour tenter de comprendre le rôle de la sénescence dans la maladie d'Alzheimer, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées capable de développer la maladie d'Alzheimer. Chez ces souris, nous empêcherons la production de p21 ou de p16, deux protéines impliquées dans l'activation de la sénescence cellulaire. Nous examinerons l'effet de l'inhibition de l'une ou l'autre de ces protéines sur les capacités de mémoire et d'orientation spatiale des animaux.
Bénéfices attendus
En bloquant la production de ces protéines, nous espérons réduire, modifier ou retarder les symptômes associés à la maladie d'Alzheimer. Comme p16 et p21 semblent jouer des rôles distincts, nous pensons que la perte de chaque protéine entraînera des changements spécifiques.
Procédures
À 4 mois, l'ensemble des animaux seront soumis à deux tests comportementaux. Le premier, le test de reconnaissance d'objets, il n'induit pas de stress et dure 5 jours consécutifs. Le second, la piscine de Morris, d'une durée de 15 jours, est considéré comme provoquant une légère nuisance. Pendant les six premiers jours, 4 sessions de 90 secondes sont organisées par jours. Les jours 7, 14 et 15 une session de 60 secondes par jours est organisée.
Impact sur les animaux
La réalisation du test de la piscine de Morris implique de faire nager les souris. Les souris savent nager spontanément mais l’eau n’est pas leur élément favori. Ainsi le test est considéré comme stressant. Les nuisances potentielles sont le risque d’hypothermie et la fatigue due à la nage.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés après 15 jours de tests. Les cerveaux seront prélevés pour l'analyse des marqueurs de sénescence cellulaire de la maladie d'Alzheimer.
Remplacement
L'utilisation d'un modèle animal, ici la souris, se justifie par le fait que les anomalies observées (altération de la mémoire) nécessitent un modèle vivant suffisamment proche de l'Homme.
Réduction
Pour assurer la fiabilité des tests statistiques, il faut utiliser au moins 16 animaux par groupe. Au total, il y aura 8 groupes d'animaux. Nous utiliserons donc 128 animaux. Nous utiliserons 64 femelles et 64 mâles.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement du début à la fin de l'expérience. Si les animaux montrent des signes de souffrance, d'inconfort ou de douleur, ils seront exclus des tests et traités ou euthanasiés en fonction de leur état. Les animaux seront habitués au manipulateur avant les tests et seront gardés en groupes d'au moins deux individus. Ils auront un accès illimité à la nourriture et à la boisson. Un nid sera placé dans leur cage. Pendant l'essai en piscine de Morris, les souris seront surveillées par caméra. Les individus présentant des signes de fatigue seront retirés de la piscine. Pendant l'intervalle entre les essais (15-20 minutes), l'animal sera séché et placé sous une lampe chauffante pour une période de repos.
Choix des espèces
La compréhension des mécanismes physiopathologiques et moléculaires des maladies neurodégénératives nécessite l'étude d'un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Il n'y a donc pas d'autre méthode que l'étude chez l'animal. La souris est une espèce physiologiquement proche de l'homme chez laquelle il est possible d'effectuer des manipulations génétiques afin d'obtenir un modèle de pathologies humaines. De plus, les études sur le modèle humain sont limitées, contrairement au modèle murin qui permet d'accéder à différents tissus et différents stades de la pathologie. Pour ce projet, des souris mâles et femelles seront utilisées à partir de l'âge de 4 mois. Cet âge correspond à l'apparition des symptômes chez la souris.
Evaluer l’efficacité thérapeutique d’un nouveau traitement contre les complications des radiothérapies cérébrales sur un modèle murin
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
321 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation cérébrale sous anesthésie puis des administrations intranasales et des tests de mémoire et de locomotion sur six mois, pour évaluer des vésicules issues de cellules souches contre les troubles cognitifs de la radiothérapie. Le porteur indique que l'irradiation peut provoquer des difficultés à se déplacer et un amaigrissement, et l'administration nasale un écoulement et une tête penchée. Il présente ce modèle comme le plus utilisé en préclinique et renvoie les bénéfices pour les patients à une thérapie future.
Objectifs
La radiothérapie dans le traitement des tumeurs cérébrales peut conduire à la mort de cellules non tumorales comme les cellules des vaisseaux sanguins et les neurones. En effet, 50% à 90% des patients traités par radiothérapie pour des tumeurs du cerveau présentent dans les 6 mois après traitement des troubles neurologiques avec des troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes. De nouveaux traitements permettraient d’améliorer leur qualité de vie. Dans ce projet, nous allons évaluer l’efficacité thérapeutique des vésicules extracellulaires issues de cellules souches mésenchymateuses pour limiter les impacts de la radiothérapie. Les cellules souches mésenchymateuses sont un type de cellules souches très utilisé en médecine dite régénérative. Elles ont la capacité de se renouveler pour créer des cellules spécialisées capable de réparer la fonction d’un organe. Elles sont prélevées chez une personne à partir de la moelle osseuse ou de la graisse corporelle. Elles sont mises en culture puis administrées à l’Homme. Cependant, cette stratégie thérapeutique cellulaire a ses limites telles que la transplantation autologue (prélèvement et administration chez la même personne) des cellules souches mésenchymateuses. Cette technique limite le nombre de patients pris en charge en raison du temps nécessaire à la mise en culture des cellules souches mésenchymateuses. On note surtout une efficacité diminuée en fonction de l’âge et de facteurs de risques associés (hypertension, cholestérol). Les cellules peuvent être aussi inutilisables si elles ont été irradiées lors du traitement par radiothérapie. Des études ont démontré que l’effet thérapeutique des cellules souches mésenchymateuses serait majoritairement lié à des vésicules extracellulaires qu’elles sécrètent. Elles sont produites en grand nombre par les cellules souches mésenchymateuses suite à leur activation par des facteurs stimulants. Une production de vésicules extracellulaires in vitro permet de s’affranchir des limites liées à l’utilisation des cellules souches mésenchymateuses via le patient. Les vésicules extracellulaires sont stockées et conservées sous forme lyophilisée simplifiant leur administration. Les vésicules extracellulaires seront injectés par voie non-invasive intra-nasale et permettront de limiter la destruction des vaisseaux sanguins (qui est observée après exposition aux rayonnements ionisants) et pourraient donc limiter le développement des troubles cognitifs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices que ce projet pourrait apporter sont multiples tels que : - une nouvelle thérapie non-invasive (administration intranasale) - une réduction des troubles cognitifs (troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes) - une amélioration de la qualité de vie des patients vis-à-vis des troubles cognitifs
Procédures
- Irradiation cérébrale sous anesthésie générale : 10 min - Administration intranasale sous anesthésie générale : environ 5 min par administration - Tests comportementaux sur animal vigile (un test par jour pour une durée de 10 et 5 min pr évaluer la mémoire, 3 min pour évaluer la locomotion) réalisés 4 fois sur une période de 6 mois - Analyse échodoppler sous anesthésie générale : 10 min. - Prélèvement sanguin 1 fois sous anesthésie générale avant la mise à mort : 15 secondes. - Perfusion intracardiaque sous anesthésie générale : 15 minutes
Impact sur les animaux
Pour les irradiations, les animaux étant anesthésiés pour limiter les mouvements, il peut y avoir un effet des anesthésies répétées et les effets potentiels de l’anesthésie sur les variables physiologiques telles que l’hypothermie, l’hypotension, l’hypoxie. Pour les administrations, même si les animaux sont légèrement anesthésiés, il est possible de noter un inconfort transitoire après l’administration. Pour les transports, il peut être noté un stress chez les animaux suite aux changements des conditions environnantes. Après irradiation, un animal peut développer des difficultés à se déplacer et/ou une apparence extérieure piloérection, dos rond ou amaigri Après injection intranasale, les effets indésirables peuvent être un écoulement nasal important et/ou une tête penchée, difficultés à se déplacer, amaigrissement Le transport des animaux peut également conduire à du stress et de l’angoisse conduisant à un amaigrissement
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements des structures cérébrales.
Remplacement
Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles précliniques (modèles animaux). De plus, les modèles in vitro (culture isolée de cellules en boîte de pétri) ne permettent pas d’évaluer le réseau vasculaire ni les troubles cognitifs. Par conséquent l’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour valider notre approche thérapeutique.
Réduction
Les modèles d’expérimentation animale présentent une certaine variabilité de réponse. De plus le retour d’expérience des médecins, chercheurs et biostatisticiens déterminent qu’un nombre de 12 ou 15 animaux dans chaque groupe expérimental est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes afin de valider notre nouvelle thérapie.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés minium 7 jours avant le début des manips. Les animaux seront hébergés par groupe de 4 animaux par cage, des maisons, du coton et du carton seront présents dans chaque cage. Les cages de transports seront autoclavées et des lingettes de produit désinfectant seront utilisées pour éviter la contamination des animaux. Le modèle murin d’irradiation cérébrale (15Gy, dose unique, collimateur variable, sarrp) étant un nouveau modèle développé et utilisé, nous n’avons pas de retour précis concernant les nuisances attendues. Cependant, les animaux seront observés quotidiennement sur leur comportement, leur aspect extérieur et pesés de façon hebdomadaire pendant toute la durée des expérimentations. Après irradiation, si un animal présente des difficultés à se déplacer et/ou une apparence extérieure piloérection, dos rond ou amaigri (pesée hebdomadaire) : des croquettes humidifiées ou du gel de transport seront déposés dans la cage. Transport: des frisottis et du gel de transport sont ajoutés dans les cages de transport des animaux si un animal montre des signes de souffrances (locomotion, isolement, apparence) lié au stress du transport, il sera euthanasié par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Le modèle murin (15Gy, dose unique, collimateur variable, sarrp) sélectionné pour ce travail est le plus pertinent puisqu’il est le plus utilisé dans les études précliniques. De plus, il a déjà été démontré après irradiation localisée du membre inférieur gauche que l’injection d’EV-CSM au niveau musculaire améliorait le processus de néovascularisation et la cicatrisation cutanée. Enfin, nous maîtrisons, chez la souris, les techniques et les équipements afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires (anticorps) et cognitifs indispensable pour démontrer l’efficacité de notre traitement. Le modèle murin permet de diminuer la quantité de CSM ou VE-CSM injectés en intranasal et réduire les couts expérimentaux. Les animaux seront utilisés entre 8/12 semaines, correspondant au stade adulte. Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge qui pourrait modifier les paramètres étudiés.
Impact de la diversité morphologique du complexe cranio-mandibulaire des rongeurs sur les mouvements masticatoires.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Rats : 3
Cochons d'Inde : 3
Hamsters de Chine : 3
Gerbilles de Mongolie : 3
Autres rongeurs : 48
63 rongeurs de six espèces (souris, rats, cochons d'Inde, hamsters, gerbilles et autres rongeurs) vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Chaque animal subit sous anesthésie l'implantation de billes métalliques contre le crâne et la mandibule, puis des séances d'exposition aux rayons X pour filmer les mouvements de mastication, avant d'être tué et disséqué. Le porteur présente une recherche fondamentale sur la diversité morphologique des rongeurs et son lien avec des espèces fossiles. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de capturer ces mouvements chez l'animal vivant.
Objectifs
Le projet a pour but de documenter et de comparer la diversité morphologique cranio-mandibulaire des rongeurs afin de comprendre comment cette dernière influence les mouvements de la mâchoire durant la mastication. Nous cherchons à mettre en évidence des patrons de covariations entre des caractères anatomiques (ostéologiques, musculaires et dentaires) et fonctionnels afin de comprendre comment l’anatomie contraint ou favorise les mouvements de la mâchoire dans l’espace et dans le temps.
Bénéfices attendus
L'étude intégrative de la covariation morphologique des complexes ostéologiques, musculaires et dentaires et son impact fonctionnel sur les mouvements masticateurs en utilisant des données issues de mêmes individus est un concept original non-exploité dans la littérature. Les résultats attendus par ce projet nous permettront d'améliorer notre compréhension des dynamiques évolutives de la diversification des rongeurs et de mettre en évidence si l'évolution de ces structures (conjointes ou isolées) ont joué un rôle clé dans le succès évolutif de ce groupe. Enfin, ces données serviront a posteriori à la réalisation de modèles biomécaniques permettant de reconstruire les mouvements masticateurs possibles à partir des crânes d'espèces fossiles morphologiquement et phylogénétiquement proches de celles proposées dans ce projet.
Procédures
Tous les animaux (n = 63) subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie globale afin d'implanter des marqueurs radio-opaques (billes métalliques d'un diamètre < 1mm et d'un poids de 0.00026g) contre le crâne et la mandibule des animaux à l'aide d'une aiguille. La durée de la chirurgie est estimée entre 30 et 45 min. De plus, les animaux seront exposés aux rayons X lors de la procédure de capture des mouvements masticatoires via cinéradiographie. Ces mouvements ne sont pas impactés par la chirurgie dû au faible taille et poids des marqueurs. Cette intervention se déroulera lors de sessions de 2h maximum durant lesquelles l'animal sera exposé aux rayons X par intervalles de 6 secondes, pour une durée cumulée totale de 90 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux sont mis à jeun la veille de l’analyse. Une anesthésie chirurgicale de courte durée (moins de 30 min) est réalisée pour insérer les billes. Un antalgique post implantation des marqueurs est administré comme suggéré par le vétérinaire référent et re-administré si nécessaire (douleur prolongé). Une légère perte de poids potentielle suite à l’anesthésie peut être observée. - 10 examens d’imagerie (acquisition en cinéradiographie) pour une durée cumulée totale de 90 secondes en vigile et sans contention pendant qu’ils mangent leurs aliments habituels. Les animaux peuvent subir un stress suite à leur acquisition et à la modification de leur lieu de vie. L’anesthésie réalisée pour insérer les marqueurs risque de causer des légères troubles d'alimentation (et donc une légère perte de poids éventuelle le lendemain de l’implantation) ainsi que des douleurs faibles mais contré par l’analgésique. Ceci n’impacte en aucun moment les mouvements normales des mâchoires et donc les données scientifiques. Après leur rétablissement les animaux seront de nouveaux sujets à un stress lors de leur manipulation pour les acquisitions de données de cinéradiographie (environnement inhabituel, bruit du générateur à rayon X). Les animaux seront euthanasiés à la fin de l'expérimentation pour être CT-scanné ce qui est essentiel pour pouvoir lier anatomie et mouvement au niveau individuel.
Devenir
A l'issue de la procédure "Acquisition des données des mouvements masticateurs", tous les animaux seront euthanasiés afin de procéder à la dissection de leur complexe masticateur puis de scanner le crâne et la mandibule pour reconstruire les mouvements masticatoires individuels en 3D.
Remplacement
Aucune méthode alternative de modélisation biomécanique ne permet de substituer l'utilisation d'animaux vivants pour capturer les mouvements masticateurs effectifs en lien avec la morpho-anatomie crânienne et musculaire.
Réduction
La large gamme d'espèces sélectionnées pour ce projet a été déterminée afin de considérer un spectre morphologique, taxonomique et écologique suffisant pour répondre aux questions macro-évolutives de notre projet. Le nombre d'animaux (n = 63) a été réduit au maximum en utilisant 3 individus par espèce afin de capturer un aperçu de la variation morpho-fonctionnelle de notre structure d'intérêt au sein d’une espèce mais en permettant de comparer a l’échelle interspécifique (moyennes par espèce sont utilisées pour les analyses comparatives).
Raffinement
Les animaux se trouveront dans un environnement adapté à leurs besoins (dimensions de la cage, récréation, nourriture, température et cycle jour/nuit) en fonction de l'espèce considérée et pendant toute la durée de l'acquisition des données expérimentales. Les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi, avec un substrat pour faire leur nid et des objets à ronger. Les cages seront individuelles hormis pour les espèces sociales. Les animaux recevront une dose d’anti-inflammatoire pour prévenir la douleur des insertions sous cutanées des billes. Au cours de la chirurgie d’implantation des marqueurs, les animaux seront sous anesthésie générale et placés sur un tapis chauffant thermo-régulé pour éviter la perte de chaleur. Ils seront ensuite placés en chambre de réveil thermostatée et surveillés attentivement. Au moins deux à trois jours de récupération sont prévus suite à cette manipulation avant de débuter la cinéradiographie. Si les animaux montrent des signes de douleur l’analgésie sera prolongé (jamais observé sur plus de 3 ans d’expérience avec ce type d’implantation). Les boîtiers dans lesquels ils seront placés pendant cette procédure seront adaptés à la taille de l'animal et offriront des zones d'abri pour diminuer leur stress durant l'expérimentation. Une surveillance accrue des animaux par un personnel compétent est prévue afin d'adapter les temps de rétablissement post-chirurgie pendant toute la durée du projet et diminuer la souffrance animale. Les animaux seront euthanasiés immédiatement après l’acquisition des examens rayons X. Les points limites définis dans le projet seront strictement suivi limitant ainsi toute souffrance animale possible.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies permettent de capturer un maximum de variation morphologique et de régime alimentaire sur un large spectre systématique au sein des rongeurs ; donc de permettre de répondre aux questionnements macro-évolutifs et morpho-fonctionnels de ce projet. Des animaux adultes seront utilisés pour minimiser la variation en lien avec les changements morphologiques et fonctionnels qui ont lieu au cours du développement de l’animal jusqu’à sa maturité. Ce choix permet d'optimiser la détection de la variation entre espèces et est un des principes clé pour réaliser des analyses comparatives en biologie évolutive.
Discrimination de l’impact des ILC (innate lymphoid cells) et des Th17 sur la réponse Immunitaire antitumorale après traitement par cisplatine chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la patte puis des injections de chimiothérapie, pour distinguer le rôle de deux types de cellules immunitaires dans la réponse au cisplatine. Le porteur indique que la tumeur peut réduire la mobilité et l'alimentation, provoquer une perte de poids et des nécroses cutanées. Il affirme que la complexité du cancer ne peut pas être appréhendée in vitro et renvoie les retombées pour les patients au long terme.
Objectifs
Si l’impact des chimiothérapies sur les cellules tumorales est connu, les conséquences d’un tel traitement sur les cellules du système immunitaire restent cependant à découvrir. Nos données préliminaires montrent qu’une chimiothérapie peut attirer le système immunitaire dans la tumeur permettant ainsi une meilleure efficacité du traitement contre le cancer. Ce projet consiste à étudier le rôle de 2 types de cellules immunitaires dans la réponse à une chimiothérapie afin de discriminer leur importance individuelle. Pour cela, deux types de souris génétiquement modifiées, ne possédant pas l’une ou l’autre des cellules d’intérêt seront comparées à des souris ayant les deux types de cellules et l’on observera l’efficacité de la chimiothérapie sur la croissance tumorale dans ces différentes souris ainsi que l’évolution du système immunitaire au sein de la tumeur. Cela nous permettra de comprendre l’importance de nos deux cellules immunitaires d’intérêt dans l’efficacité de la chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Une augmentation de la réponse immunitaire au sein même de la tumeur via l'augmentation de la présence du système immunitaire pourrait avoir d'importants impacts dans le ralentissement de la croissance tumorale. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.
Procédures
Sous anesthésie générale par isoflurane, les animaux subiront 1 injection sous cutanée de 1 minute, 10 jours plus tard, au maximum 3 injections Intrapéritonéale (IP) de 1 minute, réparties sur une semaine et certaines souris auront également 2 Intra veineuse (IV), de 1 minute chacune environ, espacée de 3 jours, la première injection IV ayant lieu le même jour que la première injection IP.
Impact sur les animaux
Les animaux vont être soumis au maximum à 2 injections IV de 1 minute, 1 injection sous-cutanée de 1 minute et 3 injections IP de 1 minute, sous anesthésie, répartie sur plusieurs jours. Les administrations IV et SC ne sont pas connues pour être particulièrement douloureuses. L’injection des tumeurs en sous-cutané dans la patte des souris pourrait diminuer la mobilité des souris ainsi que leur capacité à se nourrir. De ce fait, il est possible qu’un effet indésirable de cette expérimentation soit une perte de poids. En réalisant des injections en sous-cutané, il est possible d’observer la formation de nécroses cutanées. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs, rates et ganglions.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.
Réduction
Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon en raison de la taille des groupes.
Raffinement
Chaque animal sera examiné et pesé 3 fois par semaine. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections SC (cellules tumorales) et IP (traitements) seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.
Choix des espèces
Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature. Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation de par l’utilisation de souris génétiquement modifiés. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme.
Evaluation non-invasive de la fonction cardiaque chez un modèle murin d’amylose
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Sur douze mois, elles subissent chaque mois une échographie sous anesthésie, une dépilation, une injection intraveineuse et un prélèvement rétro-orbitaire, pour suivre l'apparition d'une amylose cardiaque et tester une molécule. Le porteur classe ces atteintes en gravité légère, tout en indiquant que le prélèvement rétro-orbitaire peut provoquer des hématomes voire une cécité. Il affirme que les modèles cellulaires ne reproduisent pas la complexité de la pathologie et qu'il faut la "totalité de l'organisme".
Objectifs
Les amyloses sont des maladies caractérisées par l’accumulation de protéines aux structures tertiaires instables, conduisant au mauvais repliement de ces protéines qui s'agrègent sous forme de dépôts amyloïdes. Ces fibrilles amyloïdes peuvent se former dans quasiment tous les tissus et organes ; le rein et le coeur (dans 70% des cas chez l’homme), le foie et le système nerveux périphérique. Il n’y a pas de signes cliniques véritablement spécifiques connu pour un diagnostic précoce de l’amylose. Toutefois, les conséquences liées à l’infiltration des fibrilles conduisent à une défaillance progressive du fonctionnement des organes associés à d’importantes lésions avec une mise en jeu du pronostic vital. Les difficultés de diagnostic de cette pathologie sont liées non seulement à sa rareté, mais aussi au fait que les symptômes associés sont communs à de nombreuses autres pathologies plus fréquentes. Le seul critère de certitude pour le diagnostic à ce jour est l’histologie qui requiert une biopsie. Il existe plus d’une trentaine de formes d’amylose dont le typage dépend de la protéine constituant les dépôts amyloïdes. Les traitements des amyloses actuellement visent à éliminer la cause de la production de la protéine pathologique, mais ne sont pas capables d’éliminer les dépôts déjà présents sur les organes. Nos objectifs sont les suivant : 1- d'identifier les signes précoces de dysfonction cardiaque par échographie avant l'apparition d'un phénotype dommageable de l'amylose sénile. 2- de tester une molécule thérapeutique qui pourrait améliorer la fonction cardiaque pendant la progression de la maladie.
Bénéfices attendus
L'apparition de l'amylose cardiaque se produit avec l'âge et est associée à un risque accru de développer une insuffisance cardiaque. L'identification de marqueurs précoce de la maladie et le développement de nouvelles cibles thérapeutiques est un enjeu majeur pour la santé de nos ainés. Il est crucial de poursuivre la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques afin d'améliorer la santé et la survie de nombreux patients. Les données générées seront publiées, et ainsi seront à la portée de la communauté scientifique et médicale
Procédures
L'état de santé des animaux sera suivi au quotidien. Des analyses mensuelles par échographie, sous anesthésie mais non invasives, permettront d'analyser la fonction cardiaque. Le stress subi par les animaux se limite à la dépilation (1min) et à la préhension par l'expérimentateur pour une courte période (15min/animal). Les injections en intraveineuse et le prélèvement retro-orbitaire seront réalisés une fois par mois pendant 12 mois sous anesthésie gazeuse. A la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés afin de prélever le cœur et réaliser des analyses histologiques et moléculaires.
Impact sur les animaux
Le développement de l’amylose chez les souris ne constitue pas un phénotype dommageable (sauf après 18 mois). Le stress subi par les animaux durant l'échographie se limite à la préhension par l'expérimentateur pour une courte période. La dépilation peut induire une irritation, une brûlure et nécessite un bon nettoyage. L’injection intraveineuse et le prélèvement retro-orbitaire peuvent provoquer des hématomes voire une cécité dans le dernier cas. A la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés afin de prélever le coeur et réaliser des analyses histologiques et moléculaires
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasies à l'issue de chaque procédure.
Remplacement
Les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité de la pathophysiologie des amyloses. D’autre part, l’approche thérapeutique que nous souhaitons tester a principalement pour objectif de cibler les dépôts amyloïdes et de stimuler la réponse immunitaire face à ces dépôts, nécessitant de cette façon la totalité de l’organisme pour pouvoir étudier l’efficacité de notre traitement.
Réduction
Nos procédures d'imagerie sont non invasives, ce qui nous permet de réaliser un maximum d’expériences sur un minimum d’animaux. A l'aide de tests statistiques, nous avons estimé que des groupes comprenant 16 animaux sont nécessaires. Lors de cette étude et dans un souci de réduction, chaque animal est utilisé pour mesurer plusieurs caractéristiques (physiologiques, histologiques, biochimiques et moléculaires) du développement de la pathologie. Des tests statistiques seront employés pour comparer les groupes. Le suivi longitudinal, où chaque animal est son propre contrôle, par imagerie non-invasive de la fonction cardiaque permettra d’explorer son évolution dans le temps, dès l’apparition des premiers signe de la maladie. Nous limiterons donc le nombre d’animaux à utiliser. Les souris seront randomisées et l'analyse se fera en aveugle.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être (contrôle de la température et de l’hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence d’enrichissement, change régulier des litières, eau et nourriture à volonté, surveillance quotidienne des animaux). Toutes les procédures seront réalisées de façon à limiter le stress et la souffrance des animaux (anesthésie et antalgique en cas de douleur). Les souris seront surveillées quotidiennement par nos soins et du personnel qualifié pour détecter le moindre signe de souffrance de l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluations et points limites) sera strictement respecté, et effectué régulièrement en concertation avec l'équipe de zootechnie.
Choix des espèces
L’amylose avec en particulier une atteinte rénale et cardiaque, a déjà été reproduits avec succès chez la souris. Le développement des pathologies est un processus complexe et intégré qui est mieux reproduit dans un modèle animal qu'in vitro. Les études in vivo chez la souris répondent mieux au potentiel thérapeutique de la cible même si elles ne présagent pas des résultats qui vont être obtenus dans d’autres espèces ou en clinique. Ces études sont indissociables des approches complémentaires in vitro, notamment sur cellules humaines. Nous utiliserons des animaux adultes (mâles et femelles) âgés de 2 à 12 mois, car la vitesse d'apparition de la maladie et des lésions associées est relativement lente.
Etude des mécanismes régulant l’homéostasie musculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une section définitive du nerf sciatique d'une patte sous anesthésie, qui provoque une atrophie et une perte de force du membre, pour étudier la régulation des connexions entre le cerveau et le muscle. Le porteur décrit une chirurgie modérément invasive et affirme que la souris peut continuer à se déplacer sur ses quatre pattes. Il conclut que l'étude ne peut être conduite que sur un "organisme entier", aucun modèle in vitro ne reproduisant la communication entre motoneurones et muscle.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment est régulée la maintenance des connections cerveau-muscle. Le muscle squelettique est le plus grand organe du corps humain, il représente 40 à 50% du poids corporel. Il est essentiel pour la mise en mouvement du squelette, le maintien de la posture, la respiration, la thermogenèse et la régulation du métabolisme des lipides et des glucides. Cette capacité à bouger et à respirer nécessite une communication entre le cerveau et le muscle. Elle a lieu via des synapses hautement spécialisées qui contrôlent la contraction musculaire. Un dysfonctionnement de ces connections est la cause de faiblesse musculaire, d’atrophie musculaire voir de paralysie et est impliqué dans plusieurs pathologies telles que les myasthénies ou la sclérose latérale amyotrophique. Comprendre comment est régulé la formation et la maintenance de ces synapses est donc d’un grand intérêt.
Bénéfices attendus
Des dysfonctionnements de connections verceau-muscle sont observées dans différentes maladies neuromusculaires. L’apport de connaissances fondamentales est un prérequis pour comprendre la physiopathologie des maladies neuromusculaires et permettre le développement de thérapie à plus long terme.
Procédures
Les animaux subiront deux injections : une sur animal vigile pour l’anesthésie générale (durée une minute) et une sur animal anesthésié pour l’analgésie per et post-opératoire (durée une minute). Les animaux subiront une intervention chirurgicale d’une durée de 15 minutes pour réaliser une section définitive du nerf sciatique d’une seule patte. En de douleur post-opératoire, les animaux pourront recevoir une autre injection pour l’analgésie (durée 1 minute).
Impact sur les animaux
Une chirurgie de dénervation de la patte postérieure gauche sera réalisée. Cette dénervation conduit à une atrophie des muscles de la patte observable à partir de 14 jours, donc à une perte de force musculaire sur le membre. Comme la souris est quadrupède, cette intervention ne l’empêche pas de se déplacer, de grimper dans la cage et de s’alimenter. La technique de dénervation définitive est une chirurgie modérément invasive et parfaitement maitrisée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation afin de collecter tous les muscles squelettiques des pattes postérieures. Ces tissus prélevés serviront pour les analyses de biologie moléculaire et d’histologie pour décrypter les acteurs moléculaires responsables de l'homéostasie musculaire.
Remplacement
Cette étude ne peut être conduite que sur un organisme entier car il est actuellement impossible de reproduire in vitro le système complexe de communication entre les motoneurones et le muscle. La souris est le modèle idéal pour cette analyse car les processus étudiés sont très conservés au cours de l’évolution en particulier chez les mammifères.
Réduction
Un effectif de n=20 animaux par point de collecte sera suffisant pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Après obtention des résultats expérimentaux, les données seront analysées à l’aide d’un test statistique non paramétrique. L’ensemble des muscles des deux pattes postérieures seront collectés. La patte droite non dénervée servira de contrôle contralatéral.
Raffinement
Pendant toute la chirurgie, les animaux seront sous anesthésie générale et locale, coussin chauffant pour éviter l’hypothermie. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux afin d’éviter tout dessèchement de l’œil. Après la chirurgie les animaux recevront pendant 3 jours un traitement analgésique et antalgique. Pour une meilleure récupération après l’anesthésie générale, les animaux seront stabulés une nuit en armoire chauffante. Afin de faciliter l’accès à la nourriture et l’eau derrière l’intervention chirurgicale, des croquettes et de l’eau gélifiée seront déposés sur le sol de la cage. Pendant les 5 jours suivant l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés individuellement quotidiennement afin de vérifier la bonne cicatrisation de la suture, et de traiter la douleur avec des antalgiques adaptés en cas de besoin ou d’euthanasier l’animal en cas de souffrance non jugulée, appréciée par des critères de signes cliniques, d’aspect et de comportement. Toutes les souris de la même cage seront opérées le même jour afin de maintenir le groupe social.
Choix des espèces
Le modèle murin permet le développement d’animaux génétiquement modifiés conduisant à l’obtention de modèle dans lequel un ou plusieurs gènes peuvent être rendus non fonctionnels. De plus, le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin permet donc des explorations moléculaires, cellulaires, tissulaires et fonctionnelles. Les souris seront utilisées à l’âge adulte mature entre 12 et 13 mois car le laboratoire étudie les mécanismes régulant l'homéostasie musculaire. L’âge de 12 mois représente à peu près le milieu de la vie pour une souris.
Effet de l’exercice physique sur la santé mentale en lien avec les désordres nutritionnels.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Rendues obèses par un régime gras dès le sevrage, elles sont soumises à un test de coordination motrice, à des prélèvements sanguins et à l'isolement, pour évaluer si l'exercice volontaire réduit des comportements dépressifs. Le porteur indique que le régime provoque surpoids, fatigue et troubles de la glycémie, et que l'isolement est source de stress. Il affirme que cette approche intégrée ne peut pas être reproduite in vitro et renvoie les retombées, une meilleure efficacité des antidépresseurs, à un usage futur.
Objectifs
L’obésité entraine une inflammation chronique qui altère la santé physique et mentale. Elle favorise notamment la dépression et réduit l’efficacité des antidépresseurs, renforçant ainsi l’intérêt de trouver des stratégies alternatives de traitement et d’en comprendre les mécanismes d’action. Dans ce contexte, l’activité physique est une option prometteuse. Ce projet collaboratif vise à déterminer si l’exercice volontaire peut réduire les comportements dépressifs dans un modèle de dépression inflammatoire (souris sous régime enrichi en graisses). Les mesures seront réalisées dans différents tissus afin d’appréhender l’impact de l’exercice sur les signalisations inter-organes, qui sont rarement prises en compte dans ce contexte. L’objectif sera ainsi d’obtenir une vision intégrée des mécanismes reliant les effets de l’exercice sur la santé mentale et de tester la pertinence de l’exercice dans le cadre d’une médecine personnalisée ciblant la dépression liée à des déséquilibres nutritionnels.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer la connaissance des mécanismes impliqués dans l’effet de l’exercice physique sur la santé mentale en lien avec les désordres nutritionnels. La réduction de l’inflammation par l’activité physique pourrait augmenter l’efficacité des traitements antidepresseurs chez les personnes souffrant d’obésité. Dans une optique de valorisation, nous vérifierons aussi les modifications du microbiote en réponse au régime obésogène et à l’activité en lien avec les comportements dépressifs pour renforcer les connaissances sur l’axe microbiote-cerveau en lien avec l’activité physique. Ce projet constitue donc une étape essentielle au développement de stratégies thérapeutiques innovantes dans le domaine de la dépression.
Procédures
Tous les animaux subiront des tests non-invasifs pour caratériser leur croissance, leur composition corporelle, leur activité physique et leur état de stress ou dépression. Nous réaliserons sur animal vigile 3 petits prélèvements de sang (2 gouttes à chaque fois) espacés d’un mois, pour effectuer le dosage du sucre et du lactate dans le sang. Voie et volumes respectant les recommandations. En fin de procédure, l’animal sera anesthésié par injection (voie et volume respectant les recommandations - durée 5 secondes).
Impact sur les animaux
Les animaux sous régime enrichi en graisse présenteront des symptômes similaires au cas d’obésité chez les humains (mobilité réduite et fatigue à cause du surpoids, problèmes de régulation du taux de sucre dans le sang). L’ensemble des animaux pourront subir du stress lié à l’isolement et lors de la réalisation du test de coordination motrice.
Devenir
Pour mener une étude intégrée et identifier les mécanismes d’interaction liant dépression, inflammation, obésité et activité physique, nous devons prélever de nombreux tissus et réaliser des analyses moléculaires à l’issue de la procédure.
Remplacement
Notre procédure intégrée vise à identifier les mécanismes pouvant relier activité physique et réduction de l’état dépressif des animaux ce qui ne peut pas être réalisé in vitro. Il n'est pas encore possible de recréer de manière physiologique la communication inter-organes que nous souhaitons étudier puisque c’est l'impact de l'activité physique sur le métabolisme à travers la connexion des tissus hépatique, musculaires et nerveux via la circulation sanguine que nous observons. De plus, il est impossible d'observer les phénomènes dépressifs sur des cellules en culture. Les approches cellulaires pourront dans un deuxième temps présenter un intérêt pour aller décortiquer les bases biologiques et neurobiologiques des effets que nous aurons observés dans cette première partie plus globale.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel de statistique et des résultats précédents pour le calcul du nombre minimal d’animaux nécessaires dans ce projet. Nous utiliserons un logiciel pour la répartition aléatoire des animaux en lots en nous basant sur leur composition corporelle et leur glycémie. Nous profiterons de cette procédure pour prélever les fèces des animaux afin d’évaluer les modifications du microbiote en réponse au régime riche en graisse et à l’activité physique en lien avec les comportements dépressifs. Ces analyses conduites dans un second temps nous permettrons de renforcer les connaissances sur l’axe microbiote-cerveau en lien avec l’activité physique et de déposer une demande de projet future. Les données collectées concernant la croissance, la composition corporelle et l’activité physique viendront alimenter notre base de données et pourront servir ultérieurement.
Raffinement
La nourriture enrichie en graisse étant plus friable que la nourriture standard, nous ajouterons un bâtonnet de bois à ronger dans la cage afin de prévenir la croissance continue des incisives des souris. Pour le change et la réalisation des tests comportementaux, les animaux seront déplacés à l’aide d’un tunnel de contention auquel ils seront habitués afin de réduire le stress. Les animaux seront préalablement habitués aux différents tests. Nous utiliserons de la poudre hémostatique pour arrêter les éventuels saignements lors de la mesure de glycémie. Pour la surveillance des animaux et plus particulièrement des obèses, nous utiliserons une grille de suivi adaptée avec des points limites. Nous avons défini des points limites ainsi que la conduite à adopter pour chaque situation pour éviter toute souffrance à l'animal.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris mâles et femelles nourries dès le sevrage avec une diète enrichie en graisses (60% de lipides) et qui seront donc en situation d’obésité à leur arrivée. La même diète sera poursuivie pour ces animaux pendant toute la durée de la procédure. Nous avons choisi ce modèle car il est proche de l’obésité humaine sur le plan des causes, et permet de contrôler le degré d’obésité grâce à la durée et la période d’exposition à la diète riche en graisses. Tout comme ce qui est rapporté chez l’Homme, ce modèle est également associé à des troubles métaboliques et au développement d’une inflammation, qui jouent ensemble un rôle majeur dans les conséquences de l’obésité sur la santé physique, mais également mentale, en particulier les symptômes de dépression. Pour avoir des animaux développant le syndrôme métabolique (obésité, troubles de la glycémie) et dépressif, nous utiliserons des animaux ayant suivi un régime obèsogène pendant 12 semaines. Ce régime étant dispensé chez notre fournisseur à partir de l’âge de 4 semaines, nous commanderons donc des animaux âgés de 16 semaines à réception.
Evaluation du potentiel thérapeutique d’une molécule impliquée dans l’homéostasie énergétique chez un modèle murin de dystrophie musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quarante sont dystrophiques et dix sont des témoins, et toutes subissent des injections intraveineuses en contention vigile, des mesures de fonction cardiaque, des électromyogrammes et des mesures de force musculaire sous anesthésie, pour tester une molécule associée à une restauration de la dystrophine dans la myopathie de Duchenne. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable", les modèles in vitro ne rendant pas compte selon lui de la dégénérescence progressive. Les bénéfices pour les patients sont renvoyés au long terme, en complément d'outils de thérapie génique en développement.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique à transmission récessive liée au chromosome X due à l’absence de la protéine dystrophine. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse), une inflammation, de la fibrose et une perte de masse et de force musculaire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Parmi les approches de thérapie génique, la restauration de la protéine dystrophine est la plus prometteuse. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques sont confrontées à des limites comme la dégénerescence des fibres musculaires dystrophiques et la perte du bénéfice thérapeutique. Dans cette optique, notre molécule représente un bon candidat car il a déjà été prouvé que ce traitement renforce l'intégrité musculaire. Nous proposons donc une thérapie combinée associant la restauration de dystrophine et notre molécule afin de maintenir un environnement musculaire plus propice à la réexpression de la dystrophine.
Bénéfices attendus
Nous attendons comme bénéfices à court terme, chez les souris dystrophiques, une amélioration du phénotype dystrophique lorsque les souris sont traitées avec la combinaison molécule d’intérêt et restauration de dystrophine comparé au traitement restauration de dystrophine seul. A long terme, nous projetons d’utiliser cette molécule comme traitement utilisable chez le patient atteint dystrophie musculaire de Duchenne en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs types d'interventions: - Injection intra veineuse (1 minute) (sans anesthésie) dans le laboratoire collaborateur. Prélèvements de sang (20 secondes) (1 fois en fin de procédure pour chaque animal) (avec anesthésie). Les animaux seront soumis à des mesures fonctionnelles : -Mesures de composition corporelle (2 minutes) (1 fois) (sans anesthésie). Evaluation de la fonction cardiaque (échocardiographie) (10 minutes) (1 fois) (avec anesthésie). Electromyogrammes (20 minutes) (1 fois) (avec anesthésie et analgésie). Mesures de contractilité musculaire (20 minutes) (1 fois) (avec anesthésie)
Impact sur les animaux
Lors de l’injection en intraveineuse par voie caudale, l’animal vigile placé dans un appareil à contention prévu à cet effet, ressentira un stress et une douleur/inconfort équivalent ou supérieur à l'introduction d'une aiguille. Lors du transport entre les deux laboratoires et à l’arrivée dans leur nouvel environnement, les animaux pourront subir un stress dû aux mouvements des cages de transport, lorsqu'ils seront transférés dans leur nouvelle cage, pendant les premiers jours après leur arrivée et si l’alimentation n’est pas identique. Lors des mesures de composition corporelle, l’animal subit un stress pendant l’immobilisation de 2 minutes dans le cylindre de contention. Au cours des procédures d’évaluation de la fonction cardiaque et des procédures de mesure de force, les animaux subissent un stress au moment de la contention et lors de l’administration de l’anesthésie (gazeuse ou piqure en intrapéritonéal).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. L’utilisation d’un modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne est indispensable car les modèles in vitro ne peuvent rendent compte de la dégénerescence progressive observée au cours de cette maladie. Ce modèle dystrophique est celui qui est signalé dans les directives pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne car il s’agit du modèle le plus approprié car bien caractérisé. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.
Réduction
Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité. Pour tous les groupes expérimentaux et toutes les méthodes d'analyse, 5 à 10 animaux est le nombre d'échantillons nécessaire pour obtenir une analyse statistique fiable. Néanmoins, considérant une forte hétérogénéité chez les souris dystrophiques, des groupes de 10 souris par condition seront nécessaires pour permettre une analyse statistique fiable, pour éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et pour éviter de les répéter. De plus tous les muscles et une majorité des organes de la souris seront prélevés. Au total, nous prévoyons d'utiliser 40 souris dystrophiques et 10 souris contrôle. La taille des effectifs sera été établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats
Raffinement
Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Elles consistent en un contrôle quotidien des cages, un changement régulier, un nombre réduit d’animaux par cage et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage. Pour limiter la souffrance et l'angoisse, les procédures qui le nécessiteront seront réalisées sous anesthésie et sous analgésiques. Au cours des différentes procédures, la température des souris est maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante ou sous lampe radiante. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Nous procèderons à l'euthanasie compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de choix pour la caractérisation de l’homéostasie musculaire. Cette espèce permet de combiner les études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. Le modèle de souris dystrophique utilisé dans ce projet combinent l’avantage du modèle murin dystrophique et l’avantage d’avoir les mitochondries marquées, ce qui sera très utilie pour mener à bien notre projet. Nous utiliserons des animaux âgés de 4 semaines en début de procédure et de 16 semaines en fin de procédure. L’intérêt est de traiter les animaux à un stade précoce de la maladie dès la fin du sevrage. Le démarrage du traitement dès que possible à 4 semaines permettra d’évaluer la capacité de notre molécule à ralentir la progression de la maladie.
Etude de l’expression de la SELENOT et effets du peptide PSELT dans la régulation périphérique et centrale de l’homéostasie énergétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
365 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 245 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et diabétiques par un régime gras, elles subissent l'implantation de mini-pompes, des traitements par un peptide sur environ deux mois et jusqu'à dix prélèvements sanguins, pour étudier une protéine anti-oxydante et son application au traitement de l'obésité. Le porteur affirme que seul un modèle mammifère intégré, chez l'"animal entier", permet de comprendre ces effets. Les retombées thérapeutiques annoncées sont renvoyées à de possibles perspectives futures.
Objectifs
La SELENOT est une nouvelle thiorédoxine impliquée dans le contrôle du stress du reticulum endoplasmique (RE) des cellules neuroendocrines. Elle est notamment impliquée dans la production de la proopiomélanocortine ou POMC et de l’insuline, suggérant que cette protéine anti-oxydante pourrait jouer un rôle dans le maintien de l’homéostasie énergétique et qu’un défaut de son activité pourrait contribuer au développement de l’obésité et ses comorbidités. En effet, il est maintenant bien établi que le cerveau obèse est stressé et que le stress du RE dans l'hypothalamus joue un rôle central dans la résistance à la leptine et le développement de l'obésité. Récemment, l'hypothèse selon laquelle le stress du RE dans l’hypothalamus est causalement lié à la résistance à la leptine et à l'obésité a été étayée par de nombreuses preuves expérimentales. En effet, lors d'un régime riche en graisses (high fat diet, HFD) chronique, les neurones hypothalamiques développent un stress du RE qui induit une résistance à la leptine et à l'insuline, et conduit à un gain de poids. L'effet anorexigène de l'alpha-MSH, peptide dérivé de la POMC, joue un rôle déterminant dans le contrôle de l'équilibre énergétique et du poids corporel. Ces données ont permis d’établir que le développement des neurones POMC et la maturation de la POMC en alpha-MSH sont altérés par le stress du RE qui est associé à l'obésité, entraînant une diminution de la production et de la sécrétion d'alpha-MSH, le régulateur central de l'homéostasie énergétique. Ces observations suggèrent que les neurones POMC pourraient être avantageusement ciblés pour le traitement des dysfonctionnements des neurohormones causés par le stress du RE et associés à l'obésité. L'identification d'un agent unique capable de cibler ce processus physiopathologique dans des tissus contrôlant le métabolisme tels que l'hypothalamus et le pancréas est un objectif majeur. Dans ce contexte, il est donc important d’étudier les variations de l’expression de la SELENOT dans l’hypothalamus de souris suite à un régime HF et de déterminer les effets du peptide en dérivant, le PSELT et quelques analogues (3 autres peptides analogues modifiés chimiquement pour supprimer, contrôle, ou améliorer l’activité) au cours de l’obésité et du diabète de type 2 associé car ces recherches pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, pour la première fois, de répondre à la question de la régulation de l’expression hypothalamique de la SELENOT, nouvel acteur potentiel dans la régulation centrale et périphérique du métabolisme énergétique et de l’application thérapeutique du PSELT pour le traitement de l’obésité associée au diabète de type 2. Cette étude a l’avantage d’aborder, en parallèle, les effets du PSELT aussi bien en périphérie que dans le cerveau en condition physiologique et physiopathologique.
Procédures
Les 4 procédures correspondant au test de sécrétion d'insuline, préparation d'explants, prélévements de tissus et biodistribution du PSELT) dureront 2-4 h (sécrétion d'insuline et biodistribution du PSELT). Des prélévements de sang seront effectués à partir de la queue des animaux vigiles comme décrit dans les différentes procédures (10 maximum par animal sur une demi-journée, chacun des prélévements prendra moins d'une minute). L'implantation de mini-pompes Alzet sera effectuée sur souris anesthésiées et toutes les précautions d'usage seront suivies pour minimiser la douleur. Au total, l'intervention durera 10 min par souris. Les mini-pompes Alzet sont implantées pour des traitements d'un mois. Les traitements avec administration intrapéritonéale des peptides dureront environ 2 mois.
Impact sur les animaux
Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. Les analyses d'expression de la SELENOT ne présentent pas de difficulté supplémentaire pour l'animal et le traitement par le peptide PSELT n'a pas montré d'effets indésirables ou de nuisancs chez la souris dans d'autres études antérieures de l'équipe. Par conséquent, nous n'attendons pas de manifestations particulières chez les animaux qui seront utilisés dans ces études.
Devenir
Les souris utilisées pour les tests physiologiques seront maintenus en vie pour le suivi des analyses postérieures aux différents tests. A la fin de ces différents tests, ces animaux seront mis à mort. Les animaux prévus pour des prélévements d'organes ou de grande quantité de sang seront mis à mort.
Remplacement
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, les effets du PSELT dans la dérégulation de l’homéostasie énérgétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2 et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’homme.
Réduction
En accord avec des expériences antérieures et pour limiter le nombre d'animaux utilisés, les processus physiologiques étudiés seront analysés sur des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. L’effectif des groupes d’animaux pourra être diminué à 10 lors des études concernant la régulation de la SELENOT tout en conservant des données statistiquement fiables. De plus, les procédures, n’impliquant pas d’effet néfaste à long terme, pourront être menées successivement sur les mêmes animaux intercalées avec des périodes de repos de 5 jours au cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués. D'autre part, plusieurs analogues peptidiques seront examinés d'abord in vitro dans des cultures de neurones hypothalamiques (lignée mHypo-POMC) pour leur activité neuroprotectrice et activatrice de la production de POMC avant de sélectionner quelques analogues qui seront étudiés chez la souris obèse. Cette approche réduira sigificativement le nombre d'animaux qui seront utilisés.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum leur souffrance éventuelle. Ainsi, dans le cas de procédures ayant un impact sévère sur l’animal des mesures permettant de palier le handicap généré seront mises en place. Par exemple, l’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur sera traitée par des analgésiques (buprénorphine (0.1 mg/kg)). C’est notamment le cas lors de l’implantation de mini-pompes Alzet après laquelle les souris seront étroitement surveillées pour prévenir l’apparition de tout signe de mal-être. Enfin, certaines procédures nécessitant des prélèvements de structures (ex : explants hypothalamiques et analyse de l’expression hypothalamique de SELENOT et autres marqueurs du stress du RE) sont classées sans réveil.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, les effets du PSELT dans la dérégulation de l’homéostasie énérgétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2 et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’homme. Des souris seront étudiées d'une part parce que les mécanismes de l'obésité et du diabète ont été largement étudiés chez cette espèce dont la physiologie présente certaines similitudes avec celle de l'homme et parce que des modèles transgéniques appropriés peuvent aisément être obtenus chez cette espèce. La souris présente plusieurs avantages en élévage: coût d'entretien réduit et forte performance en reproduction. Des souris adultes seront utilisées car nous souhaitons comprendre les mécanismes de l'obésité et du diabète chez le sujet adulte principalement.