Souris

1440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées ou une injection intraveineuse de lymphocytes, cette dernière pouvant provoquer une détresse respiratoire ou neurologique, avant d'être tuées pour prélever leur tissu adipeux brun. L'objet du projet est d'étudier le rôle de sous-populations de macrophages dans la production de chaleur par ce tissu. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal et qu'"aucune autre espèce" que la souris ne peut être utilisée.

Objectifs

Chez les mammifères deux types de tissu adipeux ont été identifiés : le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun. Ces deux tissus ont des fonctions très distinctes. En effet, le tissu adipeux blanc emmagasine de l’énergie sous la forme de triglycérides. Le tissu adipeux brun est impliqué dans la génération de chaleur, un processus appelé la thermogenèse adaptative. La thermogenèse adaptative est assurée par l’intermédiaire d'une protéine mitochondriale qui permet la génération de chaleur dans les adipocytes bruns. Cette protéine mitochondriale est exprimée de manière très spécifique par les adipocytes bruns. La chaleur ainsi générée est ensuite localement libérée et diffuse dans l’organisme par la circulation sanguine. Des recherches précédentes ont démontrées un rôle essentiel du système immunitaire dans la thermogenèse adaptive. La présence de plusieurs sous-populations de macrophage ont été mises en évidence dans le tissu adipeux brun. Cependant, le rôle des différentes sous-populations de macrophages reste à déterminer. Ainsi, nous souhaitons développer des modèles génétiques permettant de cibler spécifiquement et de réduire les sous-populations de macrophages dans le tissu adipeux brun. Nous analyserons la conséquence de ces réductions de populations de macrophages sur la physiologie du tissu adipeux brun et sur la thermogenèse adaptative. Un intérêt tout particulier sera porté sur l’impact des adipocytes bruns sur le développement de la réponse immune innée et adaptative.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir l'interaction entre les adipocytes thermogéniques et les cellules immunes. Nous espérons déterminer les fonctions des différentes populations de macrophages du tissu adipeux brun. En effet, ceci pourrait identifier des nouvelles cibles permettant de contrôler l'activité du tissu adipeux brun.

Procédures

Les interventions réalisées sur les animaux seront l’une des suivantes : des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant 4 jours suivies ou non de 3 autres injections la semaine suivante, ou une anesthésie suivi d'une injection intraveineuse. De plus, un prélèvement de sang sera effectué juste avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Des animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales répétées pendant deux semaines consecutives et une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection. Dautres souris seront soumises à une injection intraveineuse de lymphocytes, ce qui pourrait induire des signes de détresse circulatoire (atteinte de la fonction respiratoire ou neurologique).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever le tissu adipeux brun dans le but de l'analyser.

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement, les études in vitro seront réalisées sur des lignées cellulaires au lieu de cellules isolées à partir des animaux. Cependant, pour comprendre les fonctions des macrophages du tissu adipeux brun, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et entre les différents types cellulaires présents dans le tissu adipeux brun.

Réduction

Pour les élevages nous utiliserons des schémas de croisement qui permettent d’éviter la génération d’animaux inutiles. De plus, nous utiliserons les souris mâles et femelles. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.

Raffinement

Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Dans les différentes procédures, le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Il est important de préciser que les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Dans le cas d’injections intrapéritonéales répétées, nous effectuerons une rotation des sites d’injection et surveillerons quotidiennement l’aspect des sites d’injections. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (au moins une fois par semaine en fonction des procédures) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, nous étudions les macrophages du tissu adipeux brun et nous disposons déjà des modèles génétiques murins permettant l’expansion du tissu et la déplétion spécifique des différentes populations de macrophages. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée.

Seules dans leur cage pendant dix semaines, des souris mâles et femelles ont un accès intermittent au choix entre une bouteille d'alcool et une bouteille d'eau. D'après des études antérieures, la consommation augmente après deux à trois semaines, et le porteur prévient que les souris peuvent se déshydrater et que l'isolement "peut induire un stress". Au bout de ces dix semaines, chacune passe sous anesthésie trois séquences d'IRM, fonctionnelle, anatomique et de diffusion, soit 56 minutes, pour mesurer selon le sexe les effets de l'alcool sur la communication entre régions du cerveau. Les 120 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sont ensuite mises à mort pour des prélèvements d'organes.

Objectifs

Le trouble de consommation de l’alcool induit des modifications cérébrales complexes, se caractérisant par plusieurs stades associés à des adaptations spécifiques. En effet, une exposition prolongée et répétée à l’alcool peut être à l’origine d'altérations dans la communication entre les différentes régions du cerveau. Par ailleurs, des différences dans la vulnérabilité à la dépendance et à la toxicité de l'alcool entre les sexes ont déjà été mises en évidence à la fois chez l'Homme et dans des modèles de rongeurs. Ainsi l'objectif de cette étude est d'identifier par IRM dans quelle mesure les altérations de la communication cérébrale dépendent du sexe lors d'une consommation excessive et à long terme d'alcool. C'est pourquoi, après une consommation chronique de 10 semaines, des souris mâles et femelles sous exposition volontaire à l'alcool seront caractérisées par IRM multimodale afin de detecter les modification de la communication cérébrale. Ce projet tend donc à répondre aux questions suivantes ; quelles modifications cérébrales sont induites par la consommation d'alcool à long terme, quelles sont les différences d'altérations entre les sexes, et comment ces modifications peuvent être liées ou même prédire un comportement addictif ?

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude devraient contribuer à mieux comprendre les conséquences au niveau de la connectivité cérébrale dans l'addiction à l'alcool à long terme;, et l'influence du sexe dans les modifications observées. Ce projet devrait apporter une vue globale de la réorganisation du connectome chez les souris exposées à l’alcool, tout en permettant de cibler les aires cérébrales présentant des altérations spécifiques, et pouvant servir de cibles pour de futurs études translationnelles.

Procédures

Les animaux seront soumis à : 1) un protocole volontaire d'accès intermittant au choix entre 2 bouteilles : alcool versus eau ; pendant 10 semaines 2) un examen IRM sous anesthésie incluant : un séquence d'IRM fonctionnel (16min), une séquence d'IRM anatomique (10min) et une séquence d'IRM de diffusion (30min). Par ailleurs, les souris seront hébergées individuellement pour toute la durée du protocole c'est-à-dire 10 semaines.

Impact sur les animaux

Le protocole de préférence de consommation de la solution d'alcool par rapport à l'eau par les souris est basée sur une action volontaire et non forcée. Des études précédentes chez la souris ont montré que le protocole induit une augmentation de la consommation après 2-3 semaines d’exposition. Cette consommation se stabilisent par la suite mais sa chronicité pendant 10 semaines reproduit le passage vers l’addiction à l’alcool, comme observées chez l’homme. Le protocole ne teste pas l’état de sevrage des souris car l’exposition à l’alcool n’est pas arrêté de manière prolongé, limitant ainsi les possibles nuisances. Les souris peuvent cependant présenter un état de déshydratation suite à la consommation excessive d’alcool. Ce protocole exige par ailleurs que les souris soient isolées ce qui peut induire un stress chez les animaux.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin d’effectuer des prélèvements d’organes d’intérêts.

Remplacement

Le modèle animal est, pour le moment, le seul modèle qui permet d’étudier dans son ensemble les phénomènes complexes mis en oeuvre dans l'addiction à l'alcool au niveau cérébrales à l'échelle du connectome. En effet ces atteintes sont multifactorielles, nécessitant un grand nombre d’acteurs, et toutes les conditions ne sont pas reproductibles fidèlement dans un modèle de culture cellulaire.

Réduction

Le nombre de souris est réduit au minimum d’animaux nécessaires afin d’assurer l’efficacité des tests et obtenir des résultats fiables en fonction des expériences réalisées. Le nombre d’animaux pour l’analyse des résultats a été calculé à l’aide de tests statistiques, amenant à 30 souris par groupe nécessaires pour analyser les résultats d'expérience IRM, conduisant à un total de 120 animaux

Raffinement

Le stress potentiellement engendré par la pratique expérimentale sera limité au maximum. Dans les cages d'hébergement, l'environnement sera enrichi par des carrés de coton pour l’édification du nid, des morceaux de bois pour que les animaux usent leurs dents, et des tubes pour fournir un abri. Durant l'examen IRM, le raffinement sera respecté par l'usage d'une anesthésie afin de réduire au maximum le stress de l'animal. La température et la respiration des animaux seront en permanence surveillées par un système de monitorage. En cas de chute de la température et/ou de la respiration non gérable, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM. Il sera alors placé dans une cage mise sous une lumière chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.

Choix des espèces

Pour ce projet nous utiliserons des souris mâles et femelles. Cette souche de souris est la plus utilisée dans l'étude du comportement lié à l'alcool. Les souris seront âgées de 8 à 10 semaines, étant l'équivalent de l'âge adulte chez l'Homme. A cet âge, les souris ont atteint leur taille et poids adulte, ce qui permet une meilleure reproductibilité des résultats.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation du gène Tshz3 présentée comme un modèle d'autisme, elles reçoivent une injection quotidienne pendant dix jours et passent trois tests comportementaux censés mesurer des stéréotypies, dont le RNT ne précise pas le protocole. L'objectif est de tester si un médicament utilisé dans la maladie d'Alzheimer réduit ces comportements répétitifs. Le porteur affirme que les troubles du spectre autistique "ne peuvent être étudiés qu'in vivo" et que des souris génétiquement modifiées sont "indispensables".

Objectifs

Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) sont diagnostiqués sur la base de troubles du comportement, notamment des déficits de la communication et des interactions sociales, ainsi que des comportements répétitifs (stéréotypies) avec des champs d’intérêts restreints. Les causes des TSA sont encore mal connues, mais plusieurs recherches ont établi que de mutations dans certains gènes sont impliquées. Plusieurs de ces gènes participent, d’ailleurs, au développement et au fonctionnement du cerveau. Nos travaux apportent un faisceau d’arguments convergents, à partir d’études menées chez l’homme et sur des modèles de souris, en faveur de l’existence d’un lien direct entre des mutations d’un gène et les TSA. En particulier, nos souris avec des mutations de ce gène montrent des comportements répétitifs (stéréotypies) qui miment ceux typiques des TSA. Notre hypothèse, basée aussi sur nos travaux précédents, est que ces comportements répétitifs soient dus à une réduction des niveaux d’une substance chimique sécrétée par les neurones d’une zone du cerveau nommée striatum, comme dans d’autres cas de comportements stéréotypés. A l’heure actuelle il n’existe pas des traitements médicamenteux généralisés pour les TSA, cependant certains des symptômes peuvent être pris en charge spécifiquement. Dans ce contexte, nous proposons d’utiliser nos souris afin tester si leurs comportements répétitifs peuvent être améliorés par un traitement qui vise à augmenter les niveaux de cette substance dans le cerveau. Dans ce cadre, nos objectifs principaux sont : 1. Effectuer des tests comportementaux permettant de mettre en évidence des stéréotypies et des comportements de type persévérant chez les souris mutantes, par rapport à leurs contrôles. 2. Tester si un traitement pharmacologique qui augmente les niveaux de cette substance est capable d’améliorer ces déficits comportementaux. Cela pourrait fournir des indications thérapeutiques pour le traitement des comportements stéréotypés, associés ou pas aux TSA.

Bénéfices attendus

Cette demande s’inscrit dans la suite de travaux précédents du demandeur et des autres responsables du projet. Nous avons identifié un gène dont la mutation est impliquée dans les troubles du spectre de l’autisme (TSA). Dan ce contexte, ce projet a pour objectif de tester des traitements pharmacologiques permettant de corriger des comportements stéréotypés chez la souris modèle des TSA dus à la mutation de ce gène.

Procédures

Ce projet comprend 2 types d’intervention : un traitement qui consiste en une injection une fois par jour sur une période de 10 jours ; 3 tests comportementaux (qui ne comportement pas de souffrances pour les animaux) pour détecter des comportements stéréotypés typiques des TSA : chaque test dure entre 15 et 20 min et sera effectué au 3ème et au 10ème jour de traitement.

Impact sur les animaux

Nuisances attendues : injections quotidiennes sur 10 jours, qui peuvent entrainer de la douleur au point de piqure ; tests de comportement répétés qui peuvent engendrer du stress ou de la fatigue.

Devenir

A la fin de la procédure, les souris ne seront pas utilisés pour d’autres expériences dans le cadre de ce projet ou d’autres projets de recherche. Par conséquent, toutes les 40 souris seront mises à mort.

Remplacement

Les méthodes in vitro ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des neurones du contexte physiologique. De plus, l’utilisation de souris vivantes est nécessaire pour tester l’efficacité du traitement pharmacologique visant à améliorer les stéréotypies.

Réduction

Nous nous efforçons d’utiliser le moins d’animaux possible (optimisation des conditions d’élevage, des croisements etc.), tout en veillant à ce que le nombre d’animaux utilisé soit représentatif. Cela a été estimé sur la base d’expériences antérieures, et grâce à des outils statistiques permettant de calculer le nombre de sujets nécessaires. Cela nous a fourni un nombre total de sujets = 18 (9 par groupe). Afin d’héberger les souris par groupes homogènes de 5 et compenser à une possible augmentation des écarts types due au traitement et à l’utilisation des deux sexes, nous avons choisi d’utiliser 10 animaux par groupe : 10 mâles mutantes et 10 mâles contrôle, ainsi que 10 femelles mutantes et 10 femelles contrôle, pour un total de 40 souris.

Raffinement

Les souris sont élevées en groupes sociaux de 5 animaux, dans des environnements enrichis par la présence d’objets (igloos en carton, « Nestlets » déchiquetables en fibre, briques en bois), au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques (température, humidité) et sanitaires sont strictement contrôlés. Les animaux sont examinés quotidiennement afin de vérifier l’apparition éventuelle de douleur/mal être et veiller à ne pas dépasser des points limites. Etant donné l’absence de procédures chirurgicales ou d’autres sources de douleur dans ce projet, nous n’utiliserons pas d’anesthésiques ou d’analgésiques.

Choix des espèces

Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) ne peuvent être étudiés qu’in vivo, car ils sont définis par des comportements caractéristiques (déficits dans les interactions sociales et mouvements répétitifs ou stéréotypés) qui nécessitent d’animaux vivants pour être mis en évidence. La possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées est indispensable pour reproduire les symptômes des TSA dus à la délétion d’un gène. Nous utiliserons donc ces souris pour des expériences visant à mettre en évidence des comportements stéréotypés, afin de tester l’effet d’un traitement pharmacologique, utilisé en clinique pour le traitement de la maladie d’Alzheimer. Notre hypothèse est que ce traitement peut restaurer la fonction d’une région du cerveau impliquée dans les TSA, le striatum, et ainsi améliorer les comportements stéréotypés qui caractérisent ces souris. L’âge des souris utilisées sera de 6 à 8 semaines au début de la procédure : cela a l’avantage d’avoir des animaux capables d’effectuer les tâches comportementales prévues dans la procédure expérimentale, tout en minimisant la durée de leur stabulation.

2880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie provoquant un infarctus par ligature définitive d'une artère coronaire, un quart d'entre elles ayant en plus la rate retirée, avec des injections de vésicules extracellulaires et des échographies sous anesthésie. L'objectif est de comprendre le rôle de ces vésicules dans la réparation du cœur après infarctus, les applications thérapeutiques restant renvoyées au long terme. Le porteur affirme que ces phénomènes complexes ne peuvent être recréés in vitro et que le modèle murin est "absolument nécessaire et indispensable".

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires et l’infarctus du myocarde en particulier sont l'une des premières causes de mortalité dans le monde. La compréhension des mécanismes impliqués dans cette maladie est nécessaire pour le développement de thérapies visant à améliorer la survie après infarctus et constitue ainsi un enjeu médical et sociétal majeur. La mort du tissu cardiaque infarci déclenche une réponse inflammatoire qui est essentielle pour la réparation cardiaque. Cette réponse inflammatoire repose sur la communication efficace entre les cellules inflammatoires et les cellules cardiaques. Lors d’un infarctus, les cellules cardiaques libèrent des fragments de leur membrane, les vésicules extracellulaires (VE). Ces VE exercent leur activité biologique par le transfert de leur contenu (protéines et acides nucléiques) vers des cellules cibles, ce qui en fait de véritables messagers intercellulaires. La composition de ces VE cardiaques ainsi que leur rôle dans la réponse inflammatoire et la réparation cardiaque est inconnu. Le but de notre projet est de définir les mécanismes moléculaires qui contrôlent cette communication intercellulaire par les VE cardiaques, leur rôle dans la réparation cardiaque après infarctus du myocarde. Divers modèles de souris génétiquement modifiées nous permettront d’analyser spécifiquement le rôle de ces VE. Les animaux subiront un infarctus du myocarde. L’analyse consistera à caracteriser la composition des VE cardiaques ainsi que leur rôle dans la réponse inflammatoire, la fonction et le remodelage du coeur après infarctus.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de définir les mécanismes de communication cellulaire qui controllent la réparation cardiaque lors de l’infarctus du myocarde. La caractérisation de ces mécanismes clés est essentielle au développement de stratégies thérapeutiques innovantes visant à favoriser la réparation du coeur infarci et ainsi favoriser la survie.

Procédures

Chaque animal va subir une procédure chirurgicale de 20 min au cours de laquelle un infarctus du myocarde expérimental est réalisé par ligature permanente de l’artère coronaire antérieure gauche. Un tiers de ces animaux seront injectés avec des VE purifiées (injection intracardiaque ou intraveineuse) afin d'évaluer le rôle des VE dans la réparation cardiaque. Un quart des animaux de ce projet sera préalablement splénectomisé. La splénectomie est une procedure chirurgicale de 10 minutes. Pour chacune de ces procédures, trois injections sous-cutanées d’analgésiques (50 µL, durée inférieure à 5 secondes pour chaque injection) sont prévues, dont une en préopératoire. A différents jours après l’opération, une échocardiographie non-invasive indolore sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse, d’une durée maximale de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Per-opératoire Inconfort au point d'injection. Douleur post-opératoire adequatement soulagée par des analgésiques. Post-opératoire L'etat de santé des souris sera suivi quotidiennement pour les 5 premiers jours puis de manière hebdomadaire par la suite. Toute dégradation de l'etat de santé (ex: douleur refractaire au tratiement antalgique, infections, insuffisance cardiaque) sera minutieusement evalué en rapport à une grille de points limites. Les traitements adéquats seront mis en place tant que les limites ne sont pas atteintes. Dès qu'une de ces limites est atteinte, les animaux concernés seront mis à mort immédiatement.

Devenir

Toutes les procédures de ce projet sont terminales et par consequent, les souris sont mises à mort.

Remplacement

Pour respecter le principe des 3R, nous avons évalué nos hypothèses in vitro avec des cultures de cellules cardiaques et de macrophages autant que possible avant de l’étudier dans un modèle murin. Cependant, ces modèles murins sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de l’infarctus du myocarde. En effet, ces événements sont des phénomènes complexes, que des modèles in vitro ne pourraient pas permettre de recréer. Nous voulons, in vivo, comprendre les différentes interactions cellulaires, mais également tissulaires qui sont mises en jeu au cours des phénomènes de réparation tissulaire consécutifs à une atteinte cardiaque. Ces modèles murins pré-cliniques sont également un préalable absolument nécessaire et indispensable pour la validation des stratégies thérapeutiques afin de les mettre en application chez des patients présentant un infarctus du myocarde.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à la complétion de ce projet a été calculé au plus juste ajusté par l’utilisation de tests statistiques déterminant la taille minimale des groupes expérimentaux. Le nombre d'animaux est ainsi calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait pour détecter un changement de 20% de la fraction d'éjection ventriculaire gauche par échocardiographie. Ces tests déterminent un nombre de 15 souris par groupe. Pour deux groupes, en supposant quelques problèmes de traitement des tissus et la mortalité inhérente à la procédure, nous estimons une taille de groupe de 15 animaux. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal : analyses échocardiographiques, anatomopathologiques, immunohistochimiques ainsi que des analyses des ARN, protéines et cellules cardiaques.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées pour les procédures et l’établissement de points limites adéquats. Les animaux seront élevés en cages enrichies avec maisonnettes, batônnets en bois et coton et avec eau et nourriture ad libitum dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Après la procédure chirurgicale, les animaux sont placés dans une cage de réveil chauffée et enrichie, sous surveillance jusqu’au réveil complet. Ensuite, les animaux retournent avec leurs congénères, dans une cage d’hébergement enrichie. La stratégie antalgique sera systématiquement poursuivie en post-opératoire pendant 48 heures. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les expérimentateurs confirmés pendant les 5 premiers jours post-opératoires, puis par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Pour l’infarctus du myocarde et l’échographie, les animaux sont placés sur une plaque chauffante thermorégulée dès l’induction de l’anesthésie.

Choix des espèces

Le choix des souris permet d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés. Les souris génétiquement modifiées permettront de comprendre le rôle des VE cardiaques dans le remodelage cardiaque après infarctus du myocarde. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 10 à 15 semaines, chez lesquelles le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité. En dessous de cet âge, la variabilité est accrue dans le remodelage et la survie fortement réduite à la suite d’un infarctus du myocarde.

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections sous-cutanées de deux antibiotiques, puis sont tuées par prélèvement intracardiaque sous anesthésie pour doser ces composés dans le sang. L'objet est de décrire la pharmacocinétique du céfépime et de l'enmétazobactam avant d'en tester l'efficacité, dans un projet ultérieur, sur un modèle de pneumonie à Klebsiella pneumoniae résistante. Le porteur indique que les doses ne sont pas toxiques et affirme que le recours à l'animal reste une étape "obligatoire et règlementaire".

Objectifs

L’objectif du projet est de caractériser la pharmacocinétique sanguine du céfépime (antibiotique) et de l’enmétazobactam sur une période de 8h post-injection, après deux administrations sous-cutanées. Cette caractérisation permettra d’évaluer le devenir de ces deux composés, depuis leur entrée jusqu'à leur élimination en fonction du temps et ainsi d’avoir les bonnes concentrations et fréquence d’administration pour en évaluer leur efficacité dans des modèles d’infection ultérieurement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de reconstruire les courbes pharmacocinétiques des deux composés (céfépime et enmétazobactam) sur 24h chez la souris et ainsi d’adapter les fréquences d’administration dans un modèle de pneumonie à Klebsiella pneumoniae résistant aux carbapénèmes afin d’y évaluer leur efficacité sur la diminution de la charge bactérienne pulmonaire.

Procédures

L’injection des composés se fera par voie sous cutanée. Les doses administrées sont non toxiques pour les animaux. Les souris seront ensuite soumises à un prélèvement intracardiaque (d’une minute) sous anesthésie fixe. La profondeur de l’anesthésie est vérifiée par pression des voutes plantaires.

Impact sur les animaux

L’effet indésirable principal ici est lié à la douleur légère et de courte durée générée par deux injections (l’une pour l’administration des composés puis la seconde pour l’administration de l’anesthésie fixe)..

Devenir

Tous les animaux seront mis afin de doser les différents composés étudiés.

Remplacement

Le céfépime est un antibiotique de la famille des bêta-lactamines. Cependant, le céfépime peut être hydrolysé par des β-lactamases à spectre étendu (BLSE) telle que l’OXA-48. La principale stratégie pour restaurer l'efficacité des β-lactamines est l'utilisation d'inhibiteurs de β-lactamase. Le but est de trouver la meilleure combinaison capable d’avoir une activité antibactérienne efficace contre ces BLSE. Dernièrement, des études in vitro et in vivo ont démontré une activité intéressante chez des Entérobactéries multi résistantes. La mesure de l’efficacité de cette combinaison (céfépime + enmétazobactam) ne peut se faire sans avoir recours au modèle animal ce d’autant que certains échecs de traitement ne peuvent être anticipés autrement et que les aspects liés à la pharmacocinétique de ces nouvelles molécules ne peuvent être évalués autrement. Pour l’heure, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux hypothèses a été réduit à 3 par groupe grâce à l’expérience acquise lors d’études précédentes. Compte tenu de la variabilité attendue sur les dosages chez la souris, trois souris par point sont nécessaires pour mener à bien cette étude – Aucun test statistique sera appliquée sur les résultats de dosage.

Raffinement

Un gros travail bibliographique a été réalisé en amont de cette étude afin de s’assurer que la dose utilisée ne soit pas toxique pour les animaux. Il s’agira d’une étude sans infection où aucune toxicité n’est attendue. De plus un enrichissement du milieu (jouets en plastique, igloos en carton) sera utilisé et une surveillance accrue sera également réalisée pour cette étude. Des critères d’arrêts de l’étude ont été définis afin d’assurer le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les souris représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la pharmacocinétique. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée pour la mise au point du modèle d’infection pulmonaire à Klebsiella pneumoniae dans d’autres projets. Souris de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-22g (même poids que pour les précédentes études).

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de sclérose latérale amyotrophique, elles reçoivent des injections intraveineuses et intracrâniennes de molécules, puis passent chaque mois pendant dix-huit mois une batterie de tests locomoteurs (rotarod, grip test, marche sur planche à trous, open field) et une mesure de force musculaire sous anesthésie. L'objectif est de tester la correction de la faiblesse musculaire, aucun traitement n'existant pour cette maladie. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de disposer d'un modèle animal car aucun système cellulaire ne reproduit les troubles de la locomotion à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la correction des altérations locomotrices et de la force musculaire chez des souris modèles d’une maladie humaine musculaire, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA, ou maladie de Charcot), pour laquelle il n’existe pas de traitement. Cette pathologie est due à une anomalie de l’ADN qui entraine une perte des neurone moteurs, aboutissant in fine à un affaiblissement des muscles squelettiques. Ayant précédemment identifié le mécanisme de cette mort neuronale, nous souhaitons désormais développer une approche thérapeutique pour cette maladie. Plus précisément, nous souhaitons injecter en intraveineux différentes molécules thérapeutiques, que nous avons précédemment validées en modèle cellulaire, dans des souris adultes modèle de cette maladie, et ceci afin d’étudier la correction du phénotype neuromusculaire de ces animaux. Pour cela nous effectueront une batterie de test non invasif de la locomotion et une mesure de la force musculaire de ces animaux chaque mois sur une période d’environ un an. Nous espérons que cette approche nous permettra d’ouvrir une piste thérapeutique pour cette maladie.

Bénéfices attendus

Nous avons besoin de modèles animaux pour développer une approche thérapeutique pour la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), car il n’existe pas de modèle in vitro ou de système cellulaire pour étudier la correction de la neurodégénérescence, de la faiblesse musculaire et les altérations de la locomotion caractéristiques de ces pathologies. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour étudier cette maladie. Enfin, l’analyse de la correction de la faiblesse musculaire dans ce modèle murin a un véritable intérêt pré-clinique pour développer et tester des pistes thérapeutiques pour cette maladie neurodégénérative.

Procédures

1 – Les injections en intrapéritonéale, notamment d’agents anesthésiques, requièrent moins d'une minute. 2 - Les injections en sous cutané, notamment d’agents analgésiques, requièrent moins d'une minute. 3 – Une injection intraveineuse de virus adéno associé (AAV) requiert entre 30 secondes et 1 minute par animal. 4 - Une injection stéréotaxique intra-crâniales d’une molécule thérapeutique requiert entre 5 et 7 minutes par animal. 5 – L’analyse de la locomotion se fait par une batterie de tests non invasifs réalisés chaque mois et ceci sur une période de 18 mois. Ces tests s’étalent sur une durée de 10 à 15 jours selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal. 6 – La mesure de la force musculaire est réalisée en 4 à 8 minutes sous anesthésie gazeuse. Cette mesure est répétée chaque mois (mais en décalage de 10 à 15 jours avec les tests locomoteurs) et ceci sur une période de 18 mois. En conclusion, chaque animal recevra à l’âge de deux mois une injection intraveineuse rétro-orbitale sous anesthésie gazeuse (entre 30 secondes et une minute), puis trois semaines plus tard une injection sous cutanée d’un analgésique et une injection intrapéritonéale d’anesthésiques suivie d’une injection stéréotaxique intra-crâniales d’une molécule thérapeutique (d’une durée de 5 à 7 minutes). Un mois après cette injection intra-crâniale, le phénotype de cet animal sera suivi par une batterie de tests locomoteurs non invasifs (rotarod, grip test, bar test puis rotarod) répartis sur 10 à 15 jours, puis deux semaines après le dernier test, nous effectuerons une mesure de leur force musculaire sous anesthésie gazeuse en 4 à 8 minutes. Ces tests locomoteurs et mesure de force seront répétées environ chaque mois sur une période de 18 mois.

Impact sur les animaux

Nous souhaitons étudier une maladie neurodégénérative et neuromusculaire touchant les adultes, et ceci en utilisant un modèle animal ; nous nous attendons donc à l’éventuelle apparition d’altérations locomotrices et/ou d’une faiblesse musculaire chez ces souris. Il est à noter que les tests locomoteurs que nous utiliserons pour évaluer l’apparition de ces altérations sont classiques, non invasifs et sans douleur. De même, il est à noter que la mesure de la force musculaire se fait sous anesthésie. Concernant le nombre d’animaux étudié, des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera la dose et la nature de molécule thérapeutique. Ainsi, compte tenu de notre projet d’analyser 3 doses de traitements de 5 molécules (4 thérapeutiques et une molécule contrôle), sous deux conditions (contrôle ou pathologique), nous estimons que l’étude de 360 animaux sur 3 à 5 ans est nécessaire.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus (muscle, cerveaux, etc.) pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie neurodégénérative et neuromusculaire causée par une mutation génétique, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. De plus, nous avons établi précédemment que le modèle souris est un bon modèle animal d'étude de cette maladie.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir les doses de molécules thérapeutiques à injecter, les temps d'analyses et que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera la dose et la nature de molécule thérapeutique et compte tenu de notre projet d’analyser 3 doses de traitements de 5 molécules (4 thérapeutiques et un contrôle), sous deux conditions (contrôle ou pathologique), nous estimons que l’étude de 360 animaux sur 3 à 5 ans est nécessaire.

Raffinement

Afin de diminuer le stress et la douleur liées à la mesure de la force musculaire par stimulation électrique et aux injections intraveineuses et intracérébrales ; ces procédures expérimentales se font toutes sous anesthésie. Les point limites seront alors déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après l'injection de l'animal (changement du comportement (akinésie, prostration, paralysie), réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure d'injection seront arrêtés si ces points limites sont atteints.

Choix des espèces

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie neurodégénérative et neuromusculaire causée par une mutation génétique, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. Enfin, nous allons étudier des approches thérapeutiques sur le comportement locomoteur et la force musculaire chez des souris adultes, en effet la maladie que nous étudions touche les adultes. Enfin, nous suivrons le comportement locomoteur et la force musculaire de ces animaux sur une période de 18 mois. Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la maladie étudiée.

614 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines par voie rétro-orbitale sous anesthésie, puis une chimiothérapie ou un placebo, avant d'être tuées pour prélever moelle osseuse, rate et thymus. L'objectif déclaré est de comprendre les mécanismes de rechute et de chimiorésistance des leucémies aiguës lymphoblastiques T, dont les bénéfices pour les patients restent renvoyés au long terme. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" d'évaluer ces mécanismes dans des modèles vivants et que les cellules leucémiques ne survivent pas assez longtemps in vitro.

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies malignes agressives au pronostic réservé, notamment en cas de rechute. Elles représentent 15 à 30% des leucémies aiguës de l'enfant et de l'adulte. Les polychimiothérapies récentes ont permis d'améliorer le pronostic des leucémies aiguës, cependant 20 à 30% des patients atteints de LAL-T présentent une rechute le plus souvent réfractaire aux thérapeutiques conventionnelles et conduisent au décès des patients dans 60% des cas. Le statut mutationnel de certains gènes semble être un facteur important de ces rechutes résistantes aux thérapies. Les cellules souches leucémiques jouent également un rôle essentiel dans la progression et la rechute des leucémies. Par leur propriété d'auto-renouvellement et de quiescence, les LSC sont capables d'échapper à la chimiothérapie de 1è ligne et de régénérer le contingent leucémique, faisant le lit de la rechute. L'étude de ce compartiment cellulaire s'inscrit donc dans la continuité de ce projet, et fait l'objet ici de cet amendement. Identifier les mécanismes à l'origine de la rechute et l'acquisition d'une chimiorésistance est essentiel pour améliorer le pronostic de ces patients. Pour mener à bien ces objectifs il est dès lors indispensable d'évaluer leur impact dans des modèles vivants, seuls garants d'une reproductibilité dans ce contexte de pathologie maligne ou le micro environnement joue un rôle décisif. Dans cette perpsective, la souris immunodéprimée constitue le modèle animal le plus adapté. Par ailleurs, les cellules leucémiques de patients sont fragiles et ne peuvent être maintenues suffisamment longtemps in vitro pour y mener des tests thérapeutiques. Il est en revanche largement décrit dans la littérature scientifique que la souris est un bon modèle d'expansion des cellules leucémiques humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'étendre nos connaissances sur les mécanismes à l'origine de la rechute de LAL-T et comprendre les altérations moléculaires responsables de l'acquisition d'une chimiorésistance. A terme, ce projet contribuera à la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques afin d'améliorer les chances de guérison des patients atteints de LAL-T.

Procédures

1/ Injection de cellules leucémiques ou pré-leucémiques par voie rétro-orbitale après anesthésie générale (temps estimé < 10min par souris). Surveillance clinique et/ou biologique au moins bi-hebdomadaire et adaptée à l'état clinique des souris. 2/ Traitement des souris immunodéprimées après prise de greffe par de la chimiothérapie conventionnelle classiquement utilisée dans le cadre du traitement des leucémies aiguës humaines et comparaison avec un groupe recevant un placebo (La durée et fréquence du traitement dépendra de la molécule utilisée : quotidien à hebdomadaire pendant une durée inférieure à 6 semaines).

Impact sur les animaux

Le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet est évalué à 450 souris sur 5 ans. Pour réduire ce nombre, nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique des résultats grâce aux données collectées au cours d'expériences précédentes. Un nombre de 64 souris supplémentaires seront nécessaires pour l'amendement de ce projet, sans extension de sa durée (soit 2 années restantes). Nous serons particulièrement attentifs au bien être des animaux. Afin de réduire au maximum le risque de souffrance, les souris seont traitées dès que le taux d'infiltration sanguin leucémique sera compris entre 2 et 20% (évaluation en cytométrie en flux de façon hebdomataire via un prélèvement mandibulaire). Un tel taux d'infiltration est habituellement atteint entre 4 et 12 semaines post-greffe. Durant les protocoles expérimentaux, un suivi quotidien la première semaine, puis bi-hebdomadaire des animaux sera mis en place afin de surveiller les signes évocateurs d'une douleur. Afin de préserver le bien-être animal, nous détecterons les points limites qui conduiront à leur mise à mort (CF Points limites adaptés détaillés dans les procédures expérimentales). Concernant l'amendement, le temps de prise de greffe attendu dans les souris syngéniques est similaire au modèle de xénogreffe faisant l'objet du projet initial. En revanche, les souris utilisées pour cet amendement sont moins immunodéprimées que les souris initiales et la greffe étant syngénique, le risque potentiel pour l'animal est moins élevé pour les procédures relatives à cet amendement. Par ailleurs, aucune prédisposition à une toxicité particulière de ce modèle pré leucémique pour l'animal n'est attendue dans des conditions d'hébergement. Nous serons particulièrement attentifs au bien-être des animaux et appliqueront les mêmes règles de surveillance et d'éthique que précédemment, avec une surveillance interne quotidienne du personnel de l'animalerie.

Devenir

Mise à mort de l'animal à l'issue de chaque procédure pour récupération des tissus biologiques (moelle osseuse, rate, thymus)

Remplacement

Les expérimentations ayant pour objectifs de déterminer les mécanismes de résistance à la chimiothérapie ne peuvent pas être réalisées in vitro du fait de la forte mortalité des cellules leucémiques et doivent nécessairement être conduits in vivo dans des leucémies xénogreffées et amplifiées chez l'animal. Par ailleurs le modèle des lignées cellulaires n'est pas un reflet exact de la biologie des leucémies aiguës et ne peut donc pas être considéré comme un équivalent moléculaire fiable dans ce contexte. Pour la même raison, dans cet amendement, l'étude de la transformation leucémique de cellules immatures transduites avec un oncogène humain (ici TLX3) ne peut être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de ce projet est évalué à 450 souris sur 5 ans. Pour réduire ce nombre, nous avons estimé (par test paramétrique) la taille des échantillons permettant une analyse statistique des résultats grâce aux données collectées au cours d'expériences précédentes. Concernant l'amendement, un nombre de 64 souris RAG2-/-gc-/- supplémentaires seront nécessaires à ce projet, sans extension de sa durée (2 années restantes). Ce nombre a été calculé en prenant en compte une probabilité proche de 100% de prise de greffe (modèle syngénique), afin d'élaborer un nombre suffisant de tumeurs et 1è et 3è génération (8 souris d'une première génération puis 4 souris de seconde génération (par première génération) puis 2 souris de 3è génération (par seconde génération)).

Raffinement

Nous serons particulièrement attentifs au bienêtre des animaux. Les souris immunodéprimées seront élevées dans un environnement répondant à un statut sanitaire de type EOPS ou SOPF et ne présenteront donc pas de phénotype dommageable dans ces conditions. Les cages sont ventilées et enrichies à l'aide de cotons, bout de bois et tunnels, afin de répondre aux besoins des souris (nidification, entretien des dents, jeux). Celles-ci seront également maintenues en communauté (2 à 5 souris par cage), en accord avec leurs besoins sociaux. Nous avons défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille de score que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale. Un suivi visuel quotidien des animaux sera mis en place par un personnel qualifié de l'animalerie. La manifestation de tout signe évoquant une douleur définie par les points limites préalablement évoqués sera particulièrement surveillée. Le volume des injections et des prélèvements sera réduit au minimum possible. Afin de limiter la douleur, l'injection des cellules leucémiques se fera sous anesthésie gazeuse par isoflurane (induction 4,5%, entretien 2,5-3%, durée totale d'environ 2 minutes). Le suivi de la leucémie sera réalisé à partir de la 3ème semaine suivant l'injection des cellules leucémiques humaines par des prélèvements sanguins (

Choix des espèces

Les modèles de xénogreffe de leucémies chez la souris sont connus et bien décrits dans la littérature scientifique, ce qui permet de nous assurer une efficacité maximale dans la réalisation de ce projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes, âgées entre 7 et 15 semaines. C'est la fenêtre d'injection qui premet d'avoir un taux idéal de greffe d'après les données de la littérature, en permettant de réaliser la procédure d'injection dans de bonnes conditions. Ce modèle de xénogreffe est particulièrement applicable à notre étude, car il permet de récapituler l'éventail des signes cliniques de la maladie et de modéliser sa progression.

1500 souris et 450 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des administrations répétées de composés chimiques ou biologiques par diverses voies, avec des prélèvements sanguins pouvant atteindre 20 % du volume circulant et jusqu'à une vingtaine d'interventions par semaine, pour évaluer la toxicité de candidats médicaments sur des rongeurs génétiquement modifiés au niveau du système immunitaire. Le porteur indique que les effets attendus vont de la perte de poids aux atteintes rénales, hépatiques ou immunitaires liées à la souche et au produit testé. Il affirme que ces études réglementaires "nécessitent encore" l'animal et ne peuvent pas être réalisées in vitro.

Objectifs

Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires, et peuvent également être des études règlementaires. Elles peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire...) ou les profils d’immunotoxicité, afin d'établir la pertinence de ces effets observés chez le rongeur en comparaison avec l'humain, avec pour objectif d'assurer la santé des patients humains. Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. L'efficacité d'un composé peut également être testée sur un modèle pathologique ou un animal transgénique, ici des animaux génétiquement altérés au niveau du système immunitaire. Il est attendu d'utiliser en moyenne 30 rats ou 50 souris par étude et de réaliser jusqu'à 15 études rat et 30 études souris sur la durée du projet (soit environ 3 études rat/an et 6 études souris/an).

Bénéfices attendus

Le développement de composés pharmaceutiques ou chimiques requiert des explorations in vivo chez le rongeur ainsi que des études réglementaires à proprement parler. Ces études peuvent être demandées par les autorités réglementaires, pour affiner ou mettre en place des conditions expérimentales, ou pour répondre à des questions de sécurité, ou pour explorer les mécanismes d’action. Ces études peuvent donc servir à affiner les expériences en amont des études réglementaires qui devront être réalisées par la suite, en permettant de limiter le nombre global d'animaux utilisés dans le développement d'un produit. Elles peuvent aussi directement contribuer à assurer la sécurité non-clinique des médicaments en comprenant mieux leurs mécanismes.

Procédures

Les animaux sont traités, par différentes voies (principalement orale et injection intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse) de façon journalière ou hebdomadaire (ex : composés biologiques), avec le produit d’intérêt. La durée des administrations est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 30 minutes maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses chez le rat. La durée des études peut être courte (un jour) ou longue [en général de 1, 3 ou 6 mois pour les études règlementaires].. Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur : -Prélèvements multiples: -jusqu’ à 7,5% du sang total circulant peut être prélevé en 24h sans récupération - jusqu’ à 10% du sang total circulant peut être prélevé en 24h avec 7 jours de récupération - jusqu’ à 15% du sang total circulant peut être prélevé en 24h avec 2 semaines de récupération - jusqu’ à 20% du sang total circulant peut être prélevé en 24h avec 3 semaines de récupération -Prélèvement unique: maximum 15% du volume sanguin circulant Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min).. Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse, n’excédant pas 18h est aussi possible.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - au phénotype dommageable de la souche utilisée (ex : sensibilité aux infections opportunistes...) ; - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), à l’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) ; - aux effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés.

Devenir

Les études de toxicologie incluent souvent une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus. De plus, les animaux ayant un phénotype dommageable pendant les études ou bien se développant avec l’âge, aucun animal ne sera gardé à l’issue de ces études.

Remplacement

L’évaluation de la toxicité de candidats médicaments selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux, et ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro. Il n’existe pas encore de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité des organismes vivants, et en particulier des réponses immunitaires. De plus, certaines études ne peuvent pas être réalisées dans des souches sauvages ou transgéniques à phénotype non- dommageable qui ne sont pas adaptées à la recherche de mécanismes d’action ou d’un effet toxique spécifique (ex : immunotoxicité…). Un animal transgénique ou exprimant certaines caractéristiques ou déficiences dans le système immunitaire représente parfois un meilleur modèle pour l’évaluation d’un produit.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude: un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses de toxico-/pharmacocinétique ou pharmacodynamie, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, nombre de doses testées, criblage de plusieurs produits, etc. Pour les études à objectif règlementaire, le nombre d’animaux est précisé dans les lignes directrices correspondantes. En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés...) et que la douleur ne peut pas être suffisamment limitée à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Prélèvements sanguins : Des techniques de prélèvement (ex : veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire...) sont utilisées quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements peuvent être réalisés sous anesthésie pour éviter stress, douleur ou inconfort, comme par exemple les administrations intramusculaire, intra-articulaire ou intra-vésicale Les animaux sont hébergés conformément à la Directive 2010/63 avec enrichissements. En général l’hébergement est groupé mais peut être individuel si un protocole expérimental particulier le requiert ou si des problèmes de comportements antisociaux sont anticipés chez certains animaux (notamment les souris mâles âgées de plus de 6 semaines); dans ce cas, ce choix devra être dûment argumenté. Des portoirs ventilés pourront être utilisés selon le phénotype dommageable, le cas échéant après avis du vétérinaire sanitaire.

Choix des espèces

Le choix du rongeur est justifié par : - les objectifs de l’étude : disponibilité d’un modèle de maladie, rongeurs utilisés pour d’autres études précliniques, présence du récepteur pour le composé, données de pharmacocinétique, pharmacodynamie, modèle de déficience dans un gène ou d’un mécanisme d’intérêt, - la comparaison possible avec d’autres études dans ces espèces, - la quantité de données disponibles sur la souche, - des aspects pratiques de manipulation, - sa place dans la phylogénie (l'utilisation de rongeurs sera privilégiée, en première intention, plutôt que celle du chien, du porc ou du primate). Les animaux ont en général 6 à 8 semaines d’âge en début de traitement, correspondant à un âge de croissance, selon les recommandations générales de la règlementation. L’âge peut varier en fonction des objectifs de l’étude (par exemple animaux juvéniles de moins de 6 semaines, matures de plus de 8 semaines, âgés...).