Souris

Pour les groupes les plus exposés, trois semaines d'immobilisation du train arrière, six semaines d'entraînement à la course en montée et des récupérations de 30 minutes à 40 °C : 108 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement des biceps fémoraux. Toutes reçoivent aussi une injection intrapéritonéale de puromycine pour suivre la synthèse des protéines, et l'immobilisation entraîne une perte de masse musculaire des pattes postérieures. L'équipe veut savoir si la chaleur amplifie les effets de l'exercice sur le muscle, et le porteur envisage des retombées pour les athlètes, les personnes en rééducation, les sédentaires et les malades. Il écrit que l'immobilisation partielle rend le projet difficile à mener chez l'humain, et présente l'utilisation des souris comme une étape "obligatoire mais également extrêmement enrichissante du point de vue scientifique".

Objectifs

L’activité physique, en sollicitant la force musculaire, provoque l’augmentation de la masse musculaire (hypertrophie). Cette modalité d'exercice est recommandée lors de situations de perte de masse musculaire (atrophie), par exemple après une période d'immobilisation (alitement, pose d’un plâtre). Par ailleurs, l'exposition à certaines conditions environnementales spécifiques, tel que la chaleur, peut amplifier la prise de masse musculaire ou limiter sa perte. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets de la récupération musculaire en atmosphère chaude après une série d’exercices de course en montée chez des souris saines ou présentant une perte de muscle suite à une immobilisation

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'évaluer si la chaleur est bénéfique pour amplifier les adaptations musculaires à l’exercice, ce qui permettra d'envisager des perspectives non seulement pour les athlètes, mais aussi chez les personnes en réhabilitation post-blessure ou post-opération chirurgicale. Les populations sédentaires ou souffrant de pathologies métaboliques (e.g. diabète, insuffisance rénale chronique) ou de pertes de masse musculaire (cancers, vieillissement) bénéficieront également de perspectives d'intérêt. D’autre part, l’exercice couplé à la chaleur permettrait d’accélérer davantage la prise de masse musculaire chez les populations atrophiées.

Procédures

Pour la procédure aigüe, les animaux subiront deux à trois interventions : - groupe E : l’exercice physique (une séance de 1 heure) + injection sur animal vigile (5 secondes) - groupe E+C : l’exercice physique (une séance de 1 heure) + la récupération en milieu chaud (30 minutes à 40°) + injection sur animal vigile (5 secondes). Pour la procédure chronique, les animaux subiront une à quatre interventions : -groupe NS (pas d’immobilisation) : une injection (5 secondes) -groupe S (immobilisation) : immobilisation de trois semaines + injection (5 secondes) -groupe NS-E (pas d’immobilisation + exercice) : 6 semaines d’entraînement + injection (5 secondes) -groupe S-E (immobilisation + exercice) : immobilisation de trois semaines + 6 semaines d’entraînement + injection (5 secondes) -groupe NS-E+C (pas d’immobilisation + exercice + chaleur) : 6 semaines d’entraînement + récupération en ambiance chaude (30 minutes à 40°) + injection (5 s) -groupe S-E+C (immobilisation + exercice + chaleur) : immobilisation de trois semaines + 6 semaines d’entraînement + récupération en ambiance chaude (30 minutes à 40°) + injection (5 s)

Impact sur les animaux

Les stress auxquels seront soumis les animaux sont l’exercice physique, l'immobilisation, la chaleur et l’injection intrapéritonéale de puromycine. Les 3 séances de familiarisation permettront d’éduquer les souris au tapis de course. L'immobilisation du train arrière provoquera un déconditionnement des souris, avec une perte de masse musculaire, mais cela ne concerne que les pattes postérieures. Au niveau de la chaleur, le stress sera relativement court (30 minutes à 40°C) et l’hydratation sera ad libitum. Enfin, l’injection intrapéritonéale de puromycine durera 5 secondes. Il s’agit d’une injection dans le bas ventre de puromycine, permettant de suivre le taux de synthèse des protéines. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement également.

Devenir

La totalité des animaux sera euthanasiée à l'issue de chaque procédure dans le but de prélever les biceps fémoraux pour l'étude des gènes et protéines jouant un rôle dans la régénération musculaire.

Remplacement

Ce projet nécessite une réalisation dans un environnement très contrôlé pour éviter des biais qui pourraient provenir de facteurs externes. De plus, nous souhaitons évaluer les effets de la chaleur, ce qui ne peut être contrôlé précisément que dans des conditions de laboratoire avec des animaux. L’immobilisation partielle est aussi une contrainte qui rend difficile la réalisation du projet chez l’homme. Dans le cadre de ces expérimentations très spécifiques, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux étant donné l’absence de modèle cellulaire permettant de mimer les effets corps entier de l’immobilisation sur l’ensemble des tissus d’intérêt ainsi que les effets des méthodes de prévention. De plus, ces expérimentations ne peuvent pas être directement réalisées chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc ici une étape obligatoire mais également extrêmement enrichissante du point de vue scientifique de par les résultats très précieux qu’elle génère.

Réduction

Le calcul a été effectué avec l’aide l’un logiciel de statistiques afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux tout en gardant la puissance statistique nécessaire à l’interprétation des résultats.

Raffinement

Pour l’activité physique et les tests réalisés sur tapis roulant, les animaux y sont préalablement habitués progressivement pour réduire le stress induit au changement d’environnement. Afin de réduire au maximum les nuisances sur le bien-être des souris, les animaux seront constamment surveillés au cours de la séance pour prévenir tout accident. Les procédures de suspensions du train arrière sont, elles, validées et optimisées, et des soins quotidiens sont réalisés pour prévenir toute complication. Les animaux seront hébergés par deux pour éviter l’isolement. Chaque procédure possède également des points limites et critères d’arrêts stricts en cas d’évènement potentiellement néfaste pour les animaux en ce qui concerne la douleur, le mal-être, etc. Les suivis quotidiens des animaux permettent d’identifier des signes de souffrance.

Choix des espèces

Le choix des souris a été fait car nous voulons utiliser le même protocole d’entraînement que les études qui montrent des adaptations similaires post-entraînement chez l’homme et chez la souris. De plus, comme chez l’homme, il a été montré que l’immobilisation induit une perte de masse musculaire chez la souris également. La souris Mus musculus a été privilégiée pour plusieurs raisons. Les espèces murines rat et souris sont des espèces se rapprochant de l'humain en ce qui concerne le système musculosquelettique. Les systèmes de dégradation et de synthèse protéique sont similaires chez l'homme et chez la souris bien qu'il existe des différences subtiles de typologie entre les deux espèces. Ainsi, les conclusions tirées de ces études chez la souris pourront être étendues chez l'homme. Les souris utilisées seront toutes des adultes de 8 semaines.

1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une injection virale dans l'hippocampe par stéréotaxie sous anesthésie, pouvant provoquer une perte de poids transitoire et une douleur de 24 à 48 heures, puis une perfusion intracardiaque terminale. L'objectif est de caractériser les modifications des astrocytes autour des vaisseaux et des neurones dans la maladie d'Alzheimer, le cerveau étant prélevé exsangue pour l'analyse. Le porteur affirme que l'expérimentation sur la souris est "essentielle" faute de pouvoir recréer in vitro les interactions cellulaires du cerveau.

Objectifs

Le système nerveux central, dont fait partie le cerveau, est composé de plusieurs types cellulaires : les neurones, mais également les cellules gliales dont les astrocytes. Ces derniers sont reconnus comme des acteurs essentiel à la physiologie et impactés dans de nombreuses pathologies. Ils interagissent avec les vaisseaux sanguins et participent à la régulation des fonctions vasculaires, comme l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique, ainsi qu’avec les neurones et régulent le message nerveux. Ces deux interfaces et leurs fonctions sont perturbées dans la maladie d’Alzheimer. Ce projet a pour but de caractériser la nature moléculaire des changements des fonctions astrocytaires périvasculaires et périneuronales dans la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle des astrocytes dans les alérations vasculaires et neuronales liées à la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les interventions sous anesthésie générale (30 minutes d'intervention) sont utilisées dans ce projet sur un même lot d’animaux. 1) Injection virale par stéréotaxie : animaux sous anesthésie générale sont opérées. Un virus de type AAV ( adenovirus associé) permettant de colorer les astrocytes est injecté dans l’hippocampe par stéréotaxie. Cette chirurgie n’est réalisée qu’une seule fois. Ces interventions entrainent des effets modérés (possible irritation de la plaie). Une observation particulière des animaux est réalisée dans les jours suivants et l’application des points limite permet de limiter la nuisance et la souffrance des animaux. 2) Perfusion intracardiaque (3 semaines après la première intervention): Réalisée sous anesthésie générale, cette intervention est sans réveil. Elle dure environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les souris subiront une injection intracérébrale de virus de type AAV (adénovirus associé) qui peut entrainer des effets modérés par exemple une perte transitoire de poids et une douleur pendant 24/48h. Une observation particulière des animaux dans les jours suivants et l’application des points limites permettent de limiter la nuisance et la souffrance des animaux.

Devenir

L'euthanasie des animaux sous anesthésie générale est nécessaire pour les analyses histologiques. Ces analyses nécessitent que les vaisseaux sanguins ne contiennent plus de sang car sa présence interfère avec l'expérience d'immunofluorescence.

Remplacement

L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe tel que le cerveau. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Pour l’ensemble des questions traitées, il faut obtenir les observations sur au minimum 5 réplicas biologiques pour chaque génotype et à chaque stade. Ce nombre est un minimum pour intégrer dans notre étude la variabilité entre les animaux. C’est un pre-requis dans l’ensemble des publications de travaux scientifiques. Elle est particulièrement cruciale pour l’étude de modèle murin de la maladie d'Alzheimer qui peut légèrement varier d’un individu à un autre. Ce chiffre est un minimum qui tient compte de la variabilité connue intrinsèque au modèle APPPS1. En effet, la formation des plaques amyloides peut varier d’une souris à l’autre pour un même stade. On realisera une analyse statistique en vérifiant la normalité des données et l’absence de différence entre les animaux de même génotype. En cas de non normalité, les tests non paramétriques seront utilisés. Pour réduire la sur-utilisation des animaux possiblement liée à la chirurgie, les expérimentateurs sont formés et supervisés de façon adéquate. Une attention particulière est portée à la stérilité de tous les instruments et de l'environnement.

Raffinement

Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Certaines procédures pouvant induire une légère douleur, celle-ci est anticipée par l’administration d’anesthésiques et d’analgésiques. Les animaux subissant des interventions feront l'objet d'une surveillance accrue pendant l'intervention et les jours suivants et d’éventuels soins supplémentaires (application d’analgésique supplémentaire) sont apportés en fonction de ces observations. Pour toutes les procédures, des points limites spécifiques ont été définis basés sur l'apparence physique (manque de toilettage, poil ebouriffé), la mobilité des animaux (prostration), l'absence de lésion ou saignement, la présence d'un nid dans la cage. Dans nos expériences ou une anesthésie profonde est réalisée, la qualité de l'anesthésie sera systématiquement contrôlée par l'absence de reflexe réponse au pincement de la patte.

Choix des espèces

La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Nous avons identifié 50 marqueurs à tester au cours de la progression de la maladie d’Alzheimer à 1 mois, 3 mois (stade sans dépôts amiloides) 6 mois (stade intermédiaire), 9 mois et 1 an (stade présentant des dépots amyloides).

126 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies d'environ une heure, sources de stress, de douleur et de perte de poids, puis des tâches locomotrices avec enregistrement de l'activité de neurones par électrodes, un jour sur deux pendant six semaines. L'objectif est de caractériser le rôle des neurones corticospinaux dans la motricité des pattes postérieures, le cerveau étant prélevé à l'issue. Le porteur affirme que ces neurones sont "impossibles à reconstituer" en culture cellulaire et à modéliser numériquement.

Objectifs

Le projet vise à caractériser le rôle des neurones corticospinaux dans la motricité des pattes postérieures de la souris. Ces neurones transmettent des informations depuis le cortex moteur vers la moelle épinière ; nos expériences chez l’animal anesthesié démontrent que ces informations sont à la fois motrices (pour la contraction du muscle) et sensorielles (pour filtrer les informations sensorielles pertinentes pour le mouvement, comme la proprioception qui renseigne sur la position du corps). Nous cherchons maintenant à caractériser le rôle de ces neurones dans une situation physiologique, chez l’animal éveillé libre de ses mouvements. Plus pécisément, nous avons pour objectif de : 1) analyser les conséquences de perturbations de cette voie (activation ou inhibition) sur les comportements moteurs des souris, 2) identifier les neurones corticospinaux en enregistrant leur activité électrique grâce à des électrodes, , et corréler leur activité avec le comportement observé, 3) caractériser les autres cibles de ces neurones, en plus de la moelle épinière, qui peuvent médier certains des comportements observés.

Bénéfices attendus

La voie corticospinale est atteinte dans plusieurs pathologies (sclérose latérale amyotrohique, lésion traumatique de la moelle épinière, etc.) sans que l’on sache précisément son rôle en situation physiologique. Notre projet permettra de caractériser l’activité de ces neurones dans le cadre d’un comportement moteur, et ainsi de poser des hypothèse sur les conséquences de leur atteinte en situation pathologique.

Procédures

Les animaux subiront soit une chirurgie unique durant environ 1,5 heure, soit deux chirurgies à 2 semaine d'écart, chacune durant au plus 1 heure. Au minimum une semaine après la dernière chirurgie, les animaux effectueront des tâches comportementales de locomotion fine. Ces tâches durent une dizaine de secondes et sont répétées pendant un maximum de 30min, un jour sur deux, pendant 6 semaines. Au maximum chaque animal sera donc testé pendant 9 heures.

Impact sur les animaux

Les chirurgies entrainent inévitablement un stress et des douleurs chez la souris. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les sutures peuvent aussi entrainer une gêne ou des démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et, très rarement, à endommager sa cicatrice. Cette gêne disparait également en quelques jours. Les tests comportementaux envisagés peuvent également être source de stress pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.

Remplacement

Le projet porte sur les neurones corticospinaux, qui sont parmi les plus longs de l’organisme, allant du cortex à la partie lombaire de la moelle épinière. Ils sont impossibles à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doivent être intacts pour pouvoir être étudiés. Ils sont impossibles à modéliser numériquement car leurs cibles sont encore méconnues. Nous devons donc recourir à l’animal pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Les mesures pour réduire le nombre d’animaux ont été étudiées en adéquation avec le projet. Le nombre d’animaux utilisé a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement valides. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et produire des résultats spécifiques de genre.

Raffinement

Les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire et la température de l’animal est maintenue grâce çà un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. Les yeux sont hydratés avec un gel oculaire. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

L’étude de la communication entre le cortex et les circuits locomoteurs spinaux requiert l’utilisation de mammifère. La souris est un modèle largement utilisé dans l’étude du cortex moteur, et des comportements locomoteurs. De plus, de nombreuses connaissances sont établies sur l’organisation des projections corticospinales chez la souris. Animaux utilisés à partir de 30 jours après la naissance, car c’est l’âge à partir duquel la voie de communication entre le cortex et la moelle a fini son développement

8 385 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le virus Zika par injection, certaines par voie intracrânienne sous anesthésie, puis exposées sous anesthésie à des piqûres de moustiques, et peuvent perdre jusqu'à 30 % de leur poids avec apathie et paralysie partielle. L'objectif est d'étudier le rôle de la génétique de l'hôte dans l'infection et la transmission du virus, les souris étant tuées car porteuses d'un pathogène dangereux pour l'humain. Le porteur affirme que ces phénomènes se développent au niveau de l'"organisme entier" et que la souris permet des analyses génétiques "puissantes".

Objectifs

L’objectif global de ce projet est d’étudier le rôle de la composition génétique de l’individu dans sa sensibilité à l’infection par le virus Zika. En particulier, la transmission du virus de la mère au fœtus, l’apparition de troubles neurocomportementaux secondaires à l’infection et la transmission du virus Zika entre l’hôte et le moustique restent à élucider. Plus spécifiquement, ce projet prévu pour les 5 années à venir, a pour objectif de répondre aux questions scientifiques suivantes : 1. Quels sont les mécanismes responsables des différences de lésions cérébrales induites par l’infection par le virus Zika ? 2. Quels sont les mécanismes de transmission du virus Zika de la mère au fœtus ? 3. Quelles sont les conséquences neurocomportementales de l’infection par le virus Zika ? 4. Quelle est la variation de capacité à s’infecter (« infectabilité ») des souris en fonction de la souche de virus Zika ? 5. Quelle est la variation d’infectabilité des moustiques en fonction de la souche de virus Zika ? 6. Quelle est la variation d’infectabilité des souris en fonction de la souche de moustique ? 7. Quelle est l'influence du fond génétique des souris dans chacune des questions précédentes ? 8. Quels sont les variants génétiques de l’hôte responsables des différences de sensibilité chez la souris ?

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra de comprendre l’influence de la composition génétique de l’hôte dans la sensibilité à l’infection et dans l’infectivité par le virus Zika. La caractérisation poussée de l’infection par le virus Zika dans des lignées de souris sensibles ou résistantes permettra d’identifier de nouveaux gènes responsables de ces différences de sensibilité et d’infectivité. A plus long terme, ce projet permettra de faire progresser des connaissances fondamentales importantes pour comprendre le développement de la maladie et les mécanismes de transmission des maladies vectorielles. Il s'agit d'enjeux majeurs au regard du potentiel de réémergence du virus Zika au niveau mondial et des conséquences neurologiques dramatiques causées par cette infection.

Procédures

Des biopsies de queue seront effectuées sur certaines souris pour connaitre leur statut génétique, une fois au moment du sevrage pour une durée de quelques secondes. Les souris recevront une injection d’anticorps par voie intrapéritonéale une fois pour une durée de quelques secondes. La majeure partie des souris seront infectées avec le virus Zika par une injection (intrapéritonéale, intraveineuse, sous-cutanée ou intradermique) une fois pour une durée de quelques secondes. Certaines souris seront infectées avec le virus Zika par une injection intra-crâniale sous analgésie et anesthésie générale d’une durée de 15 minutes. Des prises de sang seront réalisées, au maximum 3 prélèvements sur 5 jours consécutifs. Chaque prise de sang durera environ 30 secondes. es tests d’évaluation du comportement non invasifs seront effectués sur certaines souris avec une durée de moins de 40 minutes et au maximum 2 fois par semaine (1 test par séance). Des repas sanguins de moustiques seront effectués sur certaines souris pour évaluer la transmission du virus entre la souris et le moustique et vice versa, sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes, au maximum 5 fois sur 7 jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Le projet s'articule autour de 5 procédures de sévérité modérée. Dans la plupart des cas, l'infection aura un impact très modéré sur l'état de santé des souris, avec une perte de poids inférieure à 5% et transitoire (quelques jours). Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante pouvant atteindre 30%, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie partielle. Des souris feront l’objet de tests d’évaluation du comportement non invasifs qui pourront générer un stress limité et transitoire (quelques heures). Des souris seront anesthésiées et soumises aux repas sanguins de moustiques durant la période de virémie qui est quasiment asymptomatique. Elles seront mises à mort avant l'apparition des symptômes induits par l'infection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront infectés par un pathogène dangereux pour l’Homme et/ou feront l’objet de prélèvements de tissus post-mortem.

Remplacement

Les phénomènes biologiques que nous devons étudier se développent au niveau de l'organisme entier (développement de l'infection, réponse immunitaire, conséquences neurocomportementales) voire à l’interface entre deux organismes indépendants (transmission du virus entre la mère et le fœtus ou entre la souris et le moustique) et imposent donc de recourir à des modèles animaux vivants. De plus, notre expérience sur ce virus montre que les résultats obtenus avec des cultures de cellules ne prédisent pas intégralement ce qui se passe dans un organisme entier. Les modèles animaux utilisables sont peu nombreux (primates non-humains, cobayes, hamsters et souris). Ce projet utilisera des souris car cette espèce permet de réaliser des études génétiques puissantes à l'aide de lignées génétiquement modifiées ou de lignées génétiquement très variées.

Réduction

Le calcul du nombre d'animaux nécessaire dans chaque procédure dépendra de la nature des variables et de la question posée. La conception de chaque expérience reposera sur une analyse statistique préalable pour optimiser la nature et l'effectif de chaque groupe, et éviter les biais expérimentaux. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques appropriés. Aussi souvent que nécessaire, il sera fait appel à des experts en biostatistique. L'évaluation de la charge virale dans une lignée ne requiert pas plus de 5 souris du même sexe d'après notre expérience. L’évaluation du comportement des souris requiert des nombres d’animaux un peu plus grands (10 à 12 souris du même sexe) du fait d’une variabilité intra-groupe plus importante. Ces éléments nous ont permis de calculer les effectifs pour chaque procédure en conciliant réduction du nombre d'animaux et puissance statistique pour conclure. Les analyses incluront des groupes d’animaux des 2 sexes sauf lorsqu'on sait déjà qu'il n'y a pas de différence dans le modèle utilisé. Certaines expériences feront l'objet de réplication mais uniquement lorsque ce sera nécessaire pour conforter la validité des conclusions. Ceci est mentionné et justifié dans chaque procédure.

Raffinement

Les inoculations par voie systémique et les prélèvements de sang entraînent une douleur passagère et légère qui ne justifie pas d'anesthésie ou d'analgésie. L’inoculation par voie intra-crâniale sera réalisée sous anesthésie générale et sous analgésie générale. Les repas sanguins seront effectués sur des souris anesthésiées. Les souris seront exposées aux moustiques sur un flanc, en alternant flanc gauche et flanc droit d'un repas sanguin au suivant. Après chaque repas sanguin, les souris recevront une injection de soluté de réhydratation isotonique pour compenser la perte volémique. Dans la majorité des cas, l'infection par le virus Zika se traduira par un impact très modéré sur l'état de santé des souris. Les animaux infectés seront toutefois surveillés quotidiennement pendant la période symptomatologique critique (précisée dans chaque procédure) avec plusieurs points limites : i) score clinique sur la base de 5 critères, ii) suivi de poids. Un gel nutritif sera placé dans les cages des animaux présentant un affaiblissement ou une parésie/paralysie pouvant laisser craindre qu'ils peinent à atteindre la mangeoire et après les repas sanguins de moustiques.

Choix des espèces

1. Nous disposons de bons modèles d'infection par le virus Zika chez la souris, y compris pour étudier la transmission entre souris et moustique (espèce compatible avec des repas sanguins répétés). 2. La souris est la seule espèce permettant de réaliser des analyses génétiques du niveau requis. 3. Des résultats antérieurs avec le virus Zika montrent la pertinence de cette espèce comme modèle animal d'infection par les flavivirus transmis par des moustiques et pour les analyses génétiques. 4. La dangerosité du virus Zika impose d'héberger les animaux en isolateurs, ce qui est facilement réalisable dans cette espèce et beaucoup plus difficile dans d'autres espèces. Pour la plupart des procédures, nous utiliserons des jeunes adultes (5-6 semaines) ou adultes (6-12 semaines) en nous basant sur la littérature et sur notre propre expérience. Nous utiliserons (détails dans les procédures 1 et 3) des souris jeunes de 1-3 semaines qui permettront d’étudier les effets de l’infection par le virus Zika sur le développement post-natal du cerveau. Nous utiliserons (détails dans la procédure 1) des fœtus entre 15 et 17 jours de développement pour étudier le syndrome congénital causé par le virus Zika.

580 souris et 190 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections de cellules cancéreuses dans le cerveau, le cœur ou une veine, ou de biomatériaux, puis des examens IRM sous anesthésie répétés deux fois par semaine, les tumeurs pouvant provoquer titubation, léthargie et perte de poids. L'objectif n'est pas de soigner mais de développer des séquences d'imagerie IRM plus rapides et quantitatives, destinées à terme à la clinique humaine. Le porteur qualifie l'imagerie du petit animal vivant de "maillon indispensable" et ne prévoit que des essais in vitro préliminaires.

Objectifs

L’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) apparait comme une technique d'imagerie pouvant remplacer le scanner du fait de son innocuité. Cette technique est devenue un outil de plus en plus utilisé pour le diagnostic médical, grâce à sa bonne résolution spatiale, son caractère non-traumatique et sa grande variété de contrastes. Ces progrès n'ont pu être réalisés sans d'importants développements méthodologiques. Afin de poursuivre ces avancées techniques, notre projet consiste à développer des stratégies pour analyser les systèmes biologiques dans une réelle approche intégrative en cherchant autant que possible à limiter la perturbation et l’influence de l’exploration sur le comportement du système analysé. Plus précisément il s'agit d'une part d'optimiser ou de développer de nouvelles méthodes en imagerie permettant d'obtenir des informations sur la structure et/ou la fonction d'une partie d'un organe ou sur la totalité de l'organisme dans le temps et dans l'espace et de mettre en évidence des dysfonctionnements. Ces méthodes ont pour objectifs d’être, à terme, utilisées en routine clinique chez l’homme. D'autre part, dans le cadre de développement de thérapies (cellulaires) ciblées, il est important de perfectionner ou d'inventer des méthodes innovantes de ciblage et de marquage cellulaire afin de les détecter et suivre leur devenir par IRM. Ces méthodes nécessitent l'injection d'un agent ciblant stable et biocompatible agissant comme des agents de contraste intelligents. Ce projet est donc basé sur le développement de séquences IRM sur le petit animal pour obtenir des informations précises et fiables, en 3D et en des temps d’acquisition rapides. C’est pour cela que des techniques originales d’acquisition des données seront développées, et combinées à des techniques de traitement du signal. Les principaux problèmes auxquels ces nouvelles méthodes devront répondre sont le manque de contraste du tissu d’intérêt, les mouvements respiratoires et cardiaques qui rendent les images floues, le signal hyperintense de la graisse, la sensibilité aux hétérogénéités de champ magnétique et la quantification précise, fiable et reproductible de paramètres physiques.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de, non seulement apporter plus de connaissances sur l’anatomie du cerveau, mais aussi de développer des méthodes IRM plus rapides, plus informatives, pour obtenir des diagnostics plus précoces et précis pour l’oncologie. Finalement, en ingénierie des biomatériaux, ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de la régénération tissulaire et vasculaire dans des organes profonds, avant leur transfert à l’homme.

Procédures

Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Un premier groupe de 70 souris et 30 rats sera soumis à une injection de cellules cancéreuses ou de biomatériaux dans le cerveau (en une seule fois, chirurgie ne dépassant pas 15min par animal) puis subiront des examens IRM (ne dépassant pas 1h par animal) répétés deux fois par semaine. Un deuxième groupe de 30 souris animaux sera soumis à une injection de cellules cancéreuses via une injection via le coeur (en une seule fois, intervention de quelques minutes) puis subiront des examens IRM (ne dépassant pas 1h par animal) répétés deux fois par semaine. Un troisième groupe de 30 souris sera soumis à une injection intraveineuse de cellules cancéreuses via la veine cave (intervention de quelques minutes) puis subiront des examens IRM (ne dépassant pas 1h par animal) répétés deux fois par semaine. Un quatrième groupe de 580 souris et 190 rats sera soumis à une injection intraveineuse de cellules cancéreuses ou d’agents de contraste IRM via la veine caudale (intervention de quelques minutes) puis subiront des examens IRM (ne dépassant pas 1h par animal) répétés deux fois par semaine. Un cinquième groupe de 60 souris et 40 rats sera soumis à une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses ou de biomatériaux (intervention de quelques minutes) puis subiront des examens IRM (ne dépassant pas 1h par animal) répétés deux fois par semaine.

Impact sur les animaux

Le création des modèles tumoraux et d’implantation de biomatériaux peuvent induire des douleurs dues aux chirurgies correspondantes, notamment au niveau de la tête et de l’abdomen. Les modèles tumoraux pourraient induire des effets indésirables sur le comportement de l’animal (titubation, léthargie), sur son apparence (yeux mi-clos, dos vouté), une perte de poids, des signes neurologiques tels que la tête penchée, et des signes de modification de la fonction respiratoire. L’implantation des biomatériaux devrait générer une inflammation locale et temporaire.

Devenir

Les suivis IRM sont nécessaires à l'évaluation de l’efficacité des nouvelles méthodes IRM dans la détection, le diagnostic et le pronostic. Afin de confirmer la détection de tumeurs ou de biomatériaux par IRM, les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure pour extraire des organes et tissus d’intérêt et ainsi réaliser des études histologiques.

Remplacement

Nous souhaitons développer des séquences IRM permettant un diagnostic plus précoces et fiables grâce à l’obtention d’images avec des résolutions spatiales et temporelles plus élevées, et des informations plus quantitatives. L’imagerie du petit animal vivant est donc un maillon indispensable dans ce processus. En revanche, nous réaliserons des expérimentations in vitro préliminaires avant tout passage à l’animal, concernant l’efficacité du marquage cellulaire et la détection des biomatériaux. Pour cela, les cellules marquées ou les biomatériaux seront piégés dans du gel d’agarose puis imagés. Cela permettra de réaliser une 1e optimisation des nouvelles méthodes IRM.

Réduction

Des contrôles sains seront nécessaires pour vérifier la validité des diagnostics IRM des animaux pathologiques. Cependant, du fait de la non-invasivité de l’IRM, les mêmes animaux seront imagés plusieurs fois avec un minimum de trois jours entre chaque examen. De plus, les structures contralatérales (ou éloignées du site d’implantation) de chaque tissu d’intérêt serviront de contrôle interne. Cette démarche permet de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront gardés dans des cages séparées, avec de l’enrichissement et de la nourriture et de l’eau à volonté. L'utilisation d'anesthésies gazeuses générales lors des procédures, d'une couverture analgésique pendant les chirurgies, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et le contrôle de la respiration permettent d'assurer un réveil rapide des animaux et sans douleur. L’expérience d’IRM en elle-même ne génère aucun signe de souffrance visible. L’agent de contraste utilisé est quotidiennement employé lors des examens sur les patients. Cet agent de contraste n’entraîne pas d’effets secondaires. De plus, les animaux seront injectés à une dose 5 fois inférieure à la dose clinique. Une grille de scorage a été instaurée pour surveiller la santé et le bien-être des animaux, comprenant des signes au niveau du comportement, de la mobilité, de la perte de poids, et de l’apparition de symptômes cliniques. Les souris pathologiques seront étudiées jusqu’à ce que leurs poids aient diminué de 15% ou que les autres points limites soient atteints. Si des signes de mal-être apparaissent, les animaux seront pris en charge par un analgésique et pourront être séparés et placés dans des cages individuelles. Des points limites ont aussi été instaurés, induisant une euthanasie immédiate. L’état de santé des animaux sera suivie quotidiennement.

Choix des espèces

Les souris C57Bl/6N sont des souris sans modification génétique, représentant des animaux d’étude de l’anatomie du cerveau sain, et de l’efficacité de régénération tissulaire suite à l’implantation d’un biomatériau. De même, des rats Wistar seront utilisés du fait de leur taille importante comparée à la souris permettant de faciliter l’implantation de biomatériaux. Les souris BalbC et Swiss Nude permettront d'obtenir des modèles de tumeurs d'origine murine ou humaines. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte.

4 875 souris et 1 950 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une vasectomie chirurgicale sous anesthésie, avec un risque de douleur post-opératoire, de saignement et de mauvaise cicatrisation, afin de produire par accouplement des femelles pseudogestantes pour des transferts d'embryons. Après six mois à un an d'accouplements, ils sont tués par inhalation de CO2 ou dislocation cervicale. Le porteur indique qu'aucune alternative de type injection d'hormones n'existe chez les rongeurs et présente l'accouplement avec un mâle vasectomisé comme la méthode "de référence" pour ce "besoin".

Objectifs

Ce projet de vasectomies de rongeurs de laboratoires a pour objectif de fournir des mâles stériles dont la libido n'aura pas été altérée. Ils sont destinés à la production de femelles pseudogestantes pour des chirurgies de transferts embryonnaires. La pseudogestation est obtenue après accouplement d'une nuit avec un mâle vasectomisé dont la fréquence de mise en accouplement n'exédera pas 1 jour sur 3. Les femelles accouplées sont préalablement triées en fonction de leur cycle et seules les femelles en oestrus sont sélectionnées. Le lendemain matin de l'accouplement, la présence d'un bouchon vaginal témoignera des coïts et sera le premier signe de pseudogestation potentielle. Cette dernière sera confirmée au cours de la chirurgie de transfert d'embryons par la présence de corps jaunes sur les ovaires et d'un ampoulla au niveau de l'infundibulum pour les stades de gestation 0.5 dpc (days post-coïtum).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de pouvoir disposer d'animaux en bonne santé et aptes à générer efficacement des femelles en état de pseudogestation après leur mise en accouplement.

Procédures

Chaque animal subira sous anesthésie, une chirurge du système reproducteur (vasectomie) pour une durée inférieure à 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie et celle en post-opératoire, le risque de saignement continu et une mauvaise cicatrisation.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de leur période d'utilisation (6 mois à 1an) pour les accouplements, soit par inhalation de CO2, soit par dislocation cervicale (sous anesthésie en fonction du poids de l’animal) selon les protocoles de la directive 2010/63/UE. Il n'y a pas de possibilité pour les animaux de continuer le projet ou d’être réutilisés.

Remplacement

Contrairement à d'autres espèces, il n'est pas décrit de solution alternative efficace (type injection d'hormones) pour les rongeurs afin d'obtenir des femelles pseudogestantes. L'accouplement naturel avec un mâle vasectomisé reste la méthode de référence utilisée pour ce besoin.

Réduction

L'aspect réduction du nombre d'animaux est traité via une politique de réduction au strict minimum nécessaire de femelles pseudogestantes pour atteintre des objectifs demandés par les utilisateurs finaux de la communauté scientifique. Aucune approche statistique n'a été réalisée. Les fonds génétiques des mâles utilisés pour cette chirugie, seront de préférences ceux qui présentent les meilleures libidos au sein de ces espèces. Ceci permettra de réduire le nombre de mâles necessairepour obtenir un taux de bouchons vaginaux le plus élevé possible. Le ratio est qu'1 mâle vasectomisé peut donner de 50 à 100 femelles pseudogestantes durant son cycle d'accouplement.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique à la chirurgie et à l'activité d'élevage. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux. Ils seront hébergés accompagnés d'une femelle non destinée à être opérée pour éviter l'isolement du mâle. Puis, la femelle destinée au transfert d'embryons est ajoutée à ce binome permanent pour créer pontuellement un trio.

Choix des espèces

L’espèce choisie doit être identique à celle des femelles pseudogestantes utilisées pour lesquelles le recours à la technique de transfert embryonnaires est nécessaire. Pour les souris comme pour les rats, il sera utilisé des fonds génétiques non consanguins, reconnus pour leur libido et leur longévité d'utilisation. L’âge des animaux est déterminé par celui de leur puberté pour mener à bien la production de femelles pseudogestantes avec des rendements optimums afin de réduire au maximun le nombre de femelles à accoupler et le nombre de mâles à utiliser : -Rats : mâles âgés de 5 à 8 semaines lors de la chirurgie -Souris : mâles âgés de 5 à 8 semaines lors de la chirurgie

3 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis des chimiothérapies, immunothérapies et molécules par voie orale ou intrapéritonéale, la tumeur au flanc pouvant gêner leurs déplacements et déclencher la mise à mort au-delà d'un volume limite. L'objectif est de tester des molécules censées lever la résistance à la chimio-immunothérapie dans des cancers du côlon, du poumon et du pancréas, les bénéfices pour les patients restant hypothétiques. Le porteur affirme que l'efficacité des combinaisons en oncologie doit être évaluée sur des "organismes vivants" et conclut au recours à la souris.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer l’efficacité antitumorale d’une association immunothérapie (anti-PD-1) et chimiothérapies utilisées en clinique en association avec des inhibiteurs de certaines voies de résistance aux traitements, dans trois modèles de cancers chez la souris, un pour le côlon, un pour le poumon et un pour le pancréas.

Bénéfices attendus

Les cancers du côlon et du poumon font partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Actuellement, leur traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies, d’immunothérapies ou une combinaison des deux. Bien qu’ayant montré des effets bénéfiques chez certains patients, ces traitements restent inefficaces pour un grand nombre d’entre eux. Il serait donc intéressant de trouver des molécules capables de lever la résistance à la chimio-immunothérapie. La découverte de tels agents permettrait de rendre la chimio-immunothérapie efficace pour un plus grand nombre de patients. Nous proposons ici de tester des inhibiteurs de deux voies majeures connues pour réguler la réponse immunitaire et l’évolution du cancer. Le but du projet est d’évaluer l’efficacité antitumorale d’une association immunothérapie et chimiothérapies utilisées en clinique en association avec des inhibiteurs de certaines voies de résistance dans trois modèles de cancers chez la souris, un pour le côlon, un pour le poumon et un pour le pancréas. Dans ce projet, nous évaluerons : - l’efficacité des traitements sur la croissance tumorale chez des souris standards. Ceci permettra d’évaluer l’efficacité d’une combinaison chimio-immunothérapie + composés testés par rapport à une chimio-immunothérapie seule. Etant donné que certaines cellules du système immunitaire peuvent contribuer à l’élimination des cancers, nous étudierons leur état d’activation chez les souris traitées par la chimio-immunothérapie seule ou en association avec les composés testés, par rapport aux souris non traitées (immunomonitoring, Nanostring). - la nécessité du système immunitaire, en réalisant les mêmes expériences chez des souris génétiquement modifiées, comme par exemple la souris de type Balb/nude (dépourvue de lymphocytes T et ayant un système immunitaire affaibli). L’importance de certains régulateurs de l’inflammation ou de l’autophagie sera également évaluée. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux tumeurs et de rechercher des moyens de potentialiser l’immunothérapie, la chimiothérapie et/ou la chimio-immunothérapie, jusqu’alors peu efficaces dans le traitement du cancer.

Procédures

- Injection de cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée 5 minutes - Nombre de souris : 3500 souris. - Traitements par chimiothérapie: - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée 1 minute - Nombre de souris : 1960 souris. - Traitements par immunothérapie: - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée 1 minute Nombre de souris : 1540 souris . - Traitements par trametinib par voie orale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une administration par jour pendant 10 jours par animal - Durée 1 minute Nombre de souris : 630 souris. - Traitements par anakinra par voie intrapéritonéale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée 1 minute Nombre de souris : 630 souris.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Lorsque le volume tumoral est trop important, ou que la tumeur parait gêner le déplacement de la souris celle-ci sera mise à mort. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite. Donc surveillance régulière du poids, posture douloureuse, léthargie, absence de toilettage. Si un point limite est atteint, la souris sera mise à mort. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux sont possibles : les chimiothérapies, immunothérapies et thérapies spécifiques utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. Surveillance régulière de l’état général et des points limites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Les souris utilisées pour les expériences de croissances tumorales seront mises à mort lorsque la taille des tumeurs sera trop importante. Les souris utilisées pour les expériences d’analyse du système immunitaire seront mises à mort afin de prélever la tumeur.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. Si l’un des modèles ne donne pas les résultats escomptés ou s’il s’avère que les points limites sont atteints prématurément, celui-ci sera abandonné. Si aucun effet bénéfique de certains composés seuls ou en association avec la chimio-immunothérapie sur la réponse anti-tumorale (croissance et infiltrats immunitaires) n’est observé au début du projet, alors ces composés ne seront pas testés sur les souris immunodéficientes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe. L’utilisation d’un arbre décisionnel selon les points limites adaptés (poids, posture, expression de la douleur, absence de toilettage, léthargie, immobilité, tumeurs, …) et leur comptabilisation dans une grille de scores permettra de stopper la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.