Souris

11 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont immunodéprimées puis infectées par instillation pulmonaire de Mycobacterium abscessus, et reçoivent des composés par voie orale ou injectable une à deux fois par jour pendant cinq semaines, pour tester de nouveaux antibiotiques. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une respiration difficile, un écoulement des yeux et du museau et de l'apathie, avec mise à mort anticipée si les points limites sont atteints. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la dynamique de l'infection, ce qui rendrait "nécessaire" le recours à l'animal entier.

Objectifs

Les mycobactéries non tuberculeuses ou mycobactéries atypiques sont des bactéries opportunistes dont le réservoir réside dans l’environnement (sol et eaux). Ce sont des bactéries non pathogènes intrinsèquement pour l’homme, elles sont dites opportunistes car elles vont devenir infectieuses sur un terrain affaibli. Elles vont être responsables d’infections pulmonaires chez des sujets fragilisés, atteints de mucoviscidose, de bronchopneumopathie chronique obstructive ou immunodéprimés. Ces sujets vont alors développer une infection pulmonaire progressive entrainant une insuffisance respiratoire sévère voire la mort si elle n'est pas traitée. Avec une moindre incidence, ces bactéries peuvent être responsables d’infections cutanées, toujours sur des sujets affaiblis. Ces maladies pulmonaires dues aux mycobactéries non tuberculeuses sont en augmentation dans le monde et dans plusieurs pays, dont les États-Unis et le Canada, le taux d'incidence de ces maladies est supérieur à celui de la tuberculose. Les approches thérapeutiques sont limitées et les infections sont difficiles à traiter en raison de la résistance aux antibiotiques conférée par une paroi cellulaire imperméable, des pompes à efflux ou des enzymes de résistance. Parmi les mycobactéries non tuberculeuses, le groupe Mycobacterium abscessus complex est l’un des plus cliniquement pertinents. La prévalence de groupe a augmenté au cours des deux dernières décennies. Afin d’éviter l’émergence de mutants résistants, les traitements sont des cocktails d’antibiotiques sur de longues périodes, plusieurs mois voire plusieurs années. Le développement de nouvelles thérapeutiques s'impose donc de toute urgence. L’objectif de notre projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés dans des modèles d’infection pulmonaire chez la souris induite par des bactéries appartenant au groupe Mycobacterium abscessus complex. Ces composés auront par ailleurs montré leur efficacité in vitro sur ces mêmes bactéries.

Bénéfices attendus

Après avoir montré leur efficacité in vitro sur un panel de Mycobacterium abscessus complex, et démontré de bonnes caractéristiques pharmacocinétiques, les molécules d’intérêt seront testées in vivo dans un ou des modèles d’infection pulmonaire chez la souris. Comme chez l’homme, les mycobactéries non tuberculeuses ne sont pas intrinsèquement pathogènes chez la souris saine. Afin d’obtenir un niveau d’infection permettant d’observer une efficacité, nous devons diminuer voir supprimer leurs défenses immunitaires. Nous utiliserons 2 types de modèles : Un premier, court (maximum 2 semaines) utilisant des souris immunodéprimées, nous permettra de savoir rapidement si le composé testé est efficace pour diminuer significativement la charge bactérienne pulmonaire. Un second, plus long (4 à 5 semaines) utilisant des souris immunocompétentes à l’immunité affaiblie nous permettra de savoir si malgré la présence d’une réaction immunitaire même diminuée le composé reste efficace. Pour chaque modèle, une première procédure, nous permettra d’établir les conditions optimales d’infection. Les nouvelles molécules seront tout d’abord évaluées sur le modèle utilisant des souris immunodéprimées, puis les meilleures d’entre-elles seront évaluées sur le modèle utilisant des souris immunocompétentes.

Procédures

1/ Administration des composés à tester ou de leur solvant, par voie orale ou sous-cutanée ou intra-veineuse ou intra-péritonéale, une à deux fois par jour pendant un maximum de 5 semaines. 2/ Injection en intra-péritoneale, d’un immuno-suppresseur, 2 fois pendant l’étude. 3/ Injection sous-cutanée d’un anti-inflammatoire, une fois par jour pendant un maximum de 6 semaines. 4/ Instillation en intranasale ou en orotrachéale d’une souche infectieuse 5/ Prélèvement sanguin après anesthésie gazeuse, une fois pendant l’étude

Impact sur les animaux

Les nuisances principales et effets indésirables sont ceux d’une infection pulmonaire : Respiration difficile et/ou bruyante, yeux et museau qui coulent, apathie. Les animaux recevront également les différents traitements par gavage oral ou par injection en sous cutané, en intrapéritonéal ou en intraveineux, traitements susceptibles de créer de l’inconfort voir de la toxicité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédures expérimentales, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement, ni sur une durée de quelques semaines, la dynamique bactérienne dans un organisme, la complexité cellulaire impliquée et la cinétique d’absorption et d’élimination d’une molécule. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour évaluer l’efficacité de potentiels candidats médicaments.

Réduction

Nous utiliserons des modèles bien établis dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Dans la littérature, le nombre d’animaux par groupe est compris entre 6 à 10. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe afin d’obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05. Tous les composés qui seront testés dans ce modèle seront sélectionnés sur la base de leurs efficacité in vitro et leur bonne distribution pharmacocinétique. Un grand nombre de composés synthétisés par notre recherche sont éliminés sur la base de ces résultats et ne sont pas évalués in vivo.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière avec administration d’analgésique dans l’eau de boisson dès l’infection. Si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. Lors de la mise à mort, les animaux seront placés sous anesthésie profonde. Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. Pour éviter tout risque de surinfection, un couvercle filtrant sera placé sur toutes les cages. Les animaux à phénotype dommageable seront hébergés en portoir ventilé. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

L’espèce choisie sera la souris, espèce majoritairement utilisée dans la littérature dans les modèles d’infection pulmonaire et qui permet de recourir à des animaux génétiquement modifiés ou mutants, immunodéprimés. Les animaux seront utilisés à un stade adulte afin d’avoir une maturité pulmonaire.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale d'une heure, des injections de morphine puis de naloxone provoquant un sevrage, et jusqu'à sept tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour mesurer l'activité de neurones par fibre optique. Le porteur indique mettre les souris à mort pour vérifier l'implantation de la fibre. Sur le remplacement, il affirme que ces effets ne s'étudient que sur des "organismes vivants et entiers" et que les souris génétiquement modifiées utilisées n'existent que chez cette espèce.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mesurer l’activité des neurones répondant aux opiacés lors de comportements liées aux réponses émotionnelles chez des animaux naïfs et dépendants aux opiacés ( comme la morphine ou l’héroïne). Le rôle des circuits neuronaux qui répondent aux opiacés dans les réponses émotionnelles positives (activité sociale ou consommation de boisson sucrée) et négatives comme le stress est encore peu étudié. L’objectif de ce projet sera de mesurer l’activité des neurones répondants aux opiacés en utilisant une technique d’imagerie.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier des nouveaux circuits neuronaux lors de réponses émotionnelles positives et négatives. Ce projet aura de nombreux bénéfices, en particulier d’identifier l’implication des neurones critiques dans le développement de l’état émotionnel négatif à l’état pendant le sevrage aux opiacés. Les états négatifs (anxiété et depression) pendant le sevrage aux opiacés sont important car il contribue en grande partie au risque de rechute et donc la fin de l’abstinence. Ceci permettra de caractériser un circuit important dans le développement des troubles affectifs tels que l’anxiété et la dépression, ainsi que les mécanismes d’adaptation du cerveau à l’exposition répétée aux opiacés. Ceci aidera aussi d’identifier de nouvelles cibles neuronales pour des traitements des troubles affectifs et du sevrage aux opiacés, permettant de faire face à la forte augmentation des troubles émotionnelles et de la dépendance et de la consommation d’opiacés. Les implications sont à la fois fondamentales et cliniques.

Procédures

Procédure chirurgicale sous anesthésie générale 1 fois pendant 1 heure avec une injection d’anesthésiant local et une injection d’analgésique pendant la chirurgie pour chaque souris. i) Groupe 1 : Nous allons effectuer 7 tests comportementaux par souris de maximum 45 minutes séparées par 7 jours. ii) Groupes 2 et 3 : Les souris recevront 9 injections sur animal vigile par souris d’une durée de 30 secondes iii) Groupes 4 et 5 : Nous allons effectuer un test comportemental sur 5 jours (15-30 minutes). Les souris recevront 8 injections sur animal vigile par souris d’une durée de 30 secondes

Impact sur les animaux

Chirurgie stéréotaxique : Après la chirurgie, Il existe aussi un risque d’inflammation de la plaie, d’infection et de douleur post-opératoire. Injections multiples : Les souris seront injectées par la morphine ou saline (6 fois) en intrapéritonéale et avec la naloxone et saline en sous-cutanée (2 injections), donc il y a la possibilité d’irritation du site d’injection. Tests : les tests comportementaux choisis ne posent aucun risque corporel pour l’animal. Les tests de comportementaux sont potentiellement stressant pour l’animal, donc il y aura 7 jours de repos entre chaque test. Sevrage précipité : les animaux pourront présenter des symptômes d’addiction et de sevrage pouvant entrainer une douleur considérée comme modérée. Le sevrage précipité avec la naloxone peut induire des symptômes somatiques de sevrage, tels que les tremblements de corps ou de pattes, la piloérection, le ptosis, et des sauts.

Devenir

Mise à mort afin de vérifier l'implantation de la fibre optique permettant la mesure d'activité.

Remplacement

"Remplacement" : les effets comportementaux des opiacés ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne récapitulent ni la complexité de l’organisation cérébrale en réseaux neuronaux complexes. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers. De plus nous utiliserons des souris génétiquement modifiées permettant de cibler les circuits neuronaux répondant aux opiacés, ces modèles n’existent que chez la souris.

Réduction

"Réduction" : les animaux utilisés étant consanguins, la variabilité phénotypique est limitée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. De plus ces études se feront de manière longitudinale, afin de tester l’activité des neurones pendant plusieurs comportements (dépression et anxiété) chez le même animal afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux i) troubles affectifs et ii) effets aversifs des opiacés seront constitués de 12 souris chacun.

Raffinement

"Raffinement": nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les réponses comportementales au sevrage à la suite d’une administration d’opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger, une ‘’maison’’ en carton, et des papiers absorbants pour faire un nid. Enfin, les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie (anesthésique profond et un anesthésique local autour du site de chirurgie) et les animaux recevront un traitement antidouleur (traitement par un anti-inflammatoire). La température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté jusqu’au complet réveil de l’animal. Les animaux seront ensuite suivis et la souffrance sera évaluée. Des points limites prédictifs seront établis permettant d’interrompre l’étude limitant ainsi la souffrance, la douleur et le stress pour l’animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle de prédilection pour la recherche biomédicale et sont aujourd'hui utilisés comme modèles standards pour l’étude de la plupart des pathologies, grâce aux connaissances de plus en plus précises de leurs génomes permettant la création de modèles transgéniques de ces maladies. Des souris adultes seront utilisées (agées de 8 semaines au début des expériences).

12 750 animaux non-humains, soit 5 100 souris, 5 100 rats et 2 550 lapins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation de l'œil leur est provoquée par injection oculaire ou systémique, suivie d'examens ophtalmologiques parfois sous anesthésie, avant mise à mort pour analyse des tissus. Le porteur attend des modèles servant à évaluer de futurs traitements et décrit une inflammation, un gonflement au point d'injection et de possibles diarrhées. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'œil "dans sa globalité fonctionnelle".

Objectifs

Les uvéites sont des inflammations, réactions de défense de l'organisme à une agression, de la partie de l'oeil appelée uvée qui est composée de plusieurs structures internes de l’oeil. Elles entrainent une rougeur de l'oeil, altèrent la vision, occasionnant des troubles ou l'apparition de taches, et peuvent conduire à la cécité en l'absence de soins. Dans les pays occidentaux, elles seraient à l’origine de 5 à 20% des cas de cécité. Les causes des uvéites sont variées: d’origine infectieuse, associées à une autre pathologie ou auto-immunes. L’objectif du projet est la mise en place de modèles expérimentaux d'uvéite chez le rongeur et le lapin, afin de contribuer au développement de nouveaux traitements médicaux pour diminuer les symptômes. Compte tenu des particularités physiologiques et anatomiques de l’organe concerné et l’absence pour l’instant de modèle alternatif, nous devrons avoir recours à des animaux pour établir notre modèle. Les informations bibliographiques recueillies, les analyses statistiques ainsi que notre expérience, nous permettrons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements contre les signes et les origines des uvéites est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.

Procédures

Selon la procédure, l'induction de la pathologie peut se faire soit par une injection directement au niveau de l'oeil soit par une injection systémique, intraveineuse pour le lapin, sous cutanée pour le rat, sous-cutanée ou intrapéritoneale pour la souris. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations par une lampe à fente d'phtalmologie). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Les prélèvements de sang se feront par ponction et basé sur des recommandations et durent moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Les signes cliniques attendus sont une inflammation de tissus de l'oeil, conjonctive, iris, humeur aqueuse, rétine, vitré et photophobie. De même un gonflement au niveau du site d'injection de l'inducteur est attendu (patte, dos, et base de la queue). Des diarrhées peuvent se produire, les animaux seront pesés juste avant l’induction le lendemain et chaque semaine qu’à la fin de la procédure.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo sur les tissus impactés (évaluations histologiques, dosages de produits...).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’oeil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur la présence ou l'absence d'effet de la molécule testée sur le paramètre étudié. Des évaluations non invasives des structures internes de l'oeil par des techniques d'imagerie ou de mesure de la fonctionnalité de la rétine sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. L'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum pour les rongeurs, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'oeil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie légère pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l‘établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’oeil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dans les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les rongeurs ont minimum 6 semaines au début de l’étude, les lapins 8-12 semaines, âge minimum pour la maturation de la rétine comme il convient au modèle.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale d'une heure puis des séances comportementales cinq jours par semaine pendant huit semaines, dont le RNT ne précise pas la nature, pour construire un modèle d'addiction reposant sur une stimulation lumineuse des neurones. Le porteur indique que les animaux peuvent présenter des symptômes d'addiction et de sevrage jugés modérément douloureux et sont ensuite tués pour prélever le cerveau. Sur le remplacement, il affirme que les effets des opiacés sur le cerveau ne peuvent être étudiés que sur des "organismes vivants et entiers".

Objectifs

Ce projet de recherche vise à identifier les circuits neuronaux participant à la dépendance aux substances d'abus et plus particulièrement aux opiacés. De plus, il permettra de créer un nouveau modèle d’addiction, ou les drogues d’abus seront remplacées par une stimulation lumineuse par optogénétique, technique qui consiste en le fait d’induire dans une cellule un gène codant pour une protéine photosensible, qui s’activera lorsque celle-ci sera éclairée par une lumière spécifique. Le système opioïde est un système neuromodulateur complexe composé de trois récepteurs (mu, delta et kappa), largement distribués dans le cerveau et peuvent moduler plusieurs fonctions dont la réponse à la douleur, au stress ou encore au contrôle des émotions. Ces derniers sont activés par des peptides opioïdes endogènes. Le système opioïde régule la douleur, les processus de récompense, la régulation des réponses émotionnelles et des réponses au stress. Les altérations de ce système sont centrales dans le développement de troubles addictifs. L’objectif de ce projet est de modéliser les dimensions comportementales de l’addiction communes à toutes les drogues d’abus (impulsivité, résistance à la punition, motivation, rechute), grâce à l’optogénétique et au comportement opérant.

Bénéfices attendus

Ce projet permettera d'améliorer nos connaissances sur mécanismes moléculaires impliqués dans l'addiction aux drogues d'abus, c’est-à-dire sur l’usage excessif de substances qui induisent des modifications des fonctions physiologiques, entraînant une dépendance du consommateur à celles-ci. De plus, il permettera d'établir un nouveau modèle d'addiction sans utilisation de drogues d'abus. ce modèle permettera l'étude de l'ensemble des dimensions comportementales de l’addiction communes à toutes les drogues d’abus (impulsivité, résistance à la punition, motivation, rechute), grâce à l’optogénétique, (technique qui consiste en le fait d’induire dans une cellule un gène codant pour une protéine photosensible, qui s’activera lorsque qu’elle sera éclairée par une lumière spécifique à celle-ci) et au comportement opérant, méthode d’apprentissage qui est basée sur l’associations de récompenses et de punitions à un comportement particulier.

Procédures

Procédure chirurgicale : 1 fois sous anesthésie générale pendant 1 heure Tests comportementaux : 5 sessions comportementales par semaine seront réalisées pendant 8 semaines (2 jours de repos par semaine), les sessions seront limitées à 60 minutes, sauf pour une session qui sera limité à 4 heures.

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale peut induire des effets indésirables sur les animaux, tels que des ouvertures de la plaie et des infections. Un suivi rigoureux et quotidien sera mis en place pour chaque animal. Les animaux peuvent également présenter des états de stress en lien avec les expérimentations. Une habituation sera réalisée plusieurs jours avant le début des expérimentations afin de réduire au maximum le stress engendré. De plus, les animaux pourront présenter des symptômes d’addiction et de sevrage pouvant entrainer une douleur considérée comme modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des cerveaux.

Remplacement

"Remplacer" : les effets moléculaires des opiacés, sur le cerveau et d’autres tissus de l’organisme, ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne récapitulent ni la complexité de l’organisation cérébrale en réseaux complexes de structures interconnectées, ni les communications inter-tissulaires. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers.

Réduction

"Réduire" : les animaux utilisés étant consanguins, la variabilité phénotypique est limitée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux effets de récompense seront constitués de 15 souris chacun (par sexe). En effet, chaque expérience sera menée en parallèle chez des souris mâles et femelles. Alors que l’addiction aux opiacés est plus fréquente chez l’homme que chez la femme, on sait très peu de choses sur les mécanismes neurobiologiques qui pourraient différer selon le sexe et contribuer à expliquer cette différence de vulnérabilité. Sur le plan éthique, il apparait essentiel d’aborder systématiquement cet aspect sur le plan de la recherche fondamentale, aussi bien pour maximiser la relevance des données obtenues pour la compréhension de l’addiction aux opiacés chez l’homme, que pour l’utilisation de tous les animaux obtenus lors de la reproduction de la lignée de souris que nous utiliserons.

Raffinement

"Raffiner" : nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les propriétés aversives des opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger et des papiers absorbants pour faire un nid. Enfin, lors de la réalisation de procédures chirurgicales, les animaux seront sous anesthésie générale et recevront un traitement antidouleur (anesthésique local autour du site de chirurgie et traitement par un anti- inflammatoire non stéroïdien). De plus, des points limites seront déterminés avant et après les procédures chirurgicales afin d’apporter un suivi individuel à chaque animal permettant de limiter ou arrêter la souffrance de l’animal. Avant de commencer les expérimentations les animaux seront pris en mains afin d’être habitués aux manipulateurs. Les souris seront également habituées aux expérimentations en étant enveloppées dans du papier afin d’être branchées à la fibre optique. Enfin, elles seront branchées à la fibre laser et seront libre d’explorer leur cage, afin d’être habituées à la sensation.

Choix des espèces

La souris est aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies de son génome (99 % identique à celui de l'humain). De plus, le modèle souris permet la création de lignées génétiquement modifiées (délétion/surexpression globale ou locale d’un gène ou d’un marqueur neuronal, manipulation de neurones ciblés). Pour notre étude, les souris MOR-Cre permetteront de cibler et manipuler spécifiquemenent les neurones aux opiacés. Nous utiliserons des souris agées de 8 semaines au début de l'expérience.

5 346 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent des injections quotidiennes entre le 7e et le 17e jour de gestation, des mesures répétées de tension pouvant irriter la queue jusqu'à des plaies, et se voient retirer leurs petits à trois jours, le suivi allant jusqu'à quinze mois après. Le porteur étudie la prééclampsie et ses conséquences cérébrales tardives, dont la valeur thérapeutique reste annoncée au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'interaction entre placenta et système neurovasculaire dans la durée.

Objectifs

Ce projet porte sur la prééclampsie, la principale pathologie de la grossesse, et plus particulièrement sur l’implication d’une famille de facteurs dénommés les prokinéticines au cours de cette pathologie. Nous nous intéressons également aux conséquences à long terme de cette pathologie qui ont pu être observées en clinique chez les femmes ayant fait une prééclampsie. Au cours de la grossesse normale, les niveaux des prokinéticines circulants augmentent graduellement avec un pic au premier trimestre puis chutent significativement aux deuxième et troisième trimestres. En revanche, chez les patientes prééclamptiques, leurs taux circulants sont significativement plus élevés et le restent au deuxième et au troisième trimestres, associés à de l’hypertension. Ceci est dû à une anomalie au moment de la formation des vaisseaux sanguins du placenta, qui permettent les échanges entre la mère et le fœtus. De ce fait le placenta ne reçoit pas suffisamment de nutriments et d’oxygène et développe un retard de croissance. Chez la mère, le manque d’oxygénation du placenta a diverses conséquences : une hypertension artérielle gravidique, des lésions au niveau des vaisseaux des reins, du foie et du cerveau, ainsi que des troubles de la coagulation sanguine. Le placenta, qui est pour sa part en hypoxie, et va alors se mettre à sécréter et libérer de nombreux facteurs pro-inflammatoires, dont les prokinéticines, dans la circulation sanguine maternelle Il est connu que les femmes ayant fait une prééclampsie sont plus tard, davantage sujettes aux pathologies cardiovasculaires. Récemment, plusieurs études cliniques ont également reporté qu’elles sont aussi susceptibles de développer des troubles de l’attention et de la mémoire, associés à des modifications du tissu cérébral, observées par imagerie médicale, 10 à 20 ans plus tard. L’objectif du projet est donc d'investiguer les mécanismes impliquant les prokinéticines à long terme dans l’apparition des modifications anatomiques cérébrales qui provoqueraient des troubles cognitifs et d’éventuelles pathologies neurodégénératives. Actuellement, ces facteurs sont en cours de certification comme biomarqueurs de la pathologie de la prééclampsie. Donc le but ultime de notre projet est de déterminer s’ils pourraient constituer des cibles thérapeutiques pour traiter la pathologie et ses conséquences à long terme.

Bénéfices attendus

•Les analyses, réalisées précédemment sur des sérums de patientes prééclamptiques, ainsi qu’en provenance d’animaux modèle de la pathologie, suggèrent une implication de la famille des prokinéticines dans le développement de la pathologie grave de la grossesse, qu’est la prééclampsie. •Cette étude in vivo nous permettra de mieux comprendre le rôle des facteurs pro-inflammatoires, que sont les prokinéticines, dans la prééclampsie et sur leurs conséquences à long terme. Enfin ces études nous permettrons de démontrer la valeur thérapeutique des antagonistes des prokinéticines dans le cadre d’un traitement de la pathologie.

Procédures

•les souris gestantes seront traitées par injection (durée : 1 minute), une fois par jour et tous les jours, entre le 7ème et le 17ème jour de la gestation. •Mesure du poids (durée: 5 min) et de la tension artérielle (durée : 20 min) des souris gestantes, tous les 2 jours, pendant 17 jours. • L’IRM des cerveaux sera réalisée 1 fois après la gestation (durée : maximum 2h). •Au moment de l’euthanasie les souris seront analgésiées 30 minutes avant de procéder à l’anesthésie.

Impact sur les animaux

• L’étude implique des injections intrapéritonéales répétées ce qui risquent de provoquer un peu de stress, un léchage de la région d’injection et/ou l’adoption d’une position recourbée suite à l’injection et durant quelques minutes, comme toutes injections chez les souris. •Les souris donnant naissance et allaitant jusqu’au sevrage pourront avoir une perte de poids. •L’enlèvement des souriceaux à J+3 peut représenter un stress pour la mère. •Les mesures de la pression artérielle répétée peuvent provoquer une irritation de la queue avec parfois l’apparition de plaies. •Cette étude porte sur des temps longs (jusqu’à 15 mois après la prééclampsie), des troubles cognitifs, i.e. stéréotypie, pourraient apparaitre.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour effectuer soit des dosages sanguins et tissulaires, soit d’une recherche in situ de marqueurs de l’inflammation et du développement de démence cérébrovasculaire.

Remplacement

•Le projet porte sur l’étude des conséquences cérébrales au cours du vieillissement suite à une pathologie de la grossesse, il nous est donc impossible à ce jour de remplacer par un modèle cellulaire la complexité d’interaction entre organes et cellulaires sur la durée qui existe lors de ce processus in vivo. •Ces mécanismes résultent d’interaction entre le placenta et le système neurovasculaire. A ce jour, il n’existe pas de modèle qui puisse reproduire ce contexte in vitro, sur une seule population cellulaire ou des explants en culture. En effet, l’organisme entier offre la possibilité d’étudier les lésions et les réponses inflammatoires, par dosage des cytokines circulantes, et, in situ, au niveau du site inflammatoire, i.e. : le cerveau dans notre projet. •Ce projet nécessite donc l’approche sur des animaux modèles de la pathologie permettant l’étude des mécanismes physiologiques complexes mis en oeuvre.

Réduction

Cette étude se déroule sur une cinétique de 15 mois pour chacun des antagonistes testés, avec 6 points de cinétique. Pour obtenir des résultats statistiquement robustes, chaque groupe de souris comportera 10 souris femelles pour chaque étude. Afin de valoriser totalement les animaux engagés dans cette étude, une étude sera mise en place d’expérimentations in vitro, avec les souriceaux qui vont naitre au cours du projet.

Raffinement

Les animaux femelles sont hébergés en groupe et sans mâles dans un environnement enrichi : tube de cartons, petites maisons en plastique, matériel de nidification, ... L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettent de garantir leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé (état général) tout au long de l’expérience et quotidiennement, ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. •Les modifications de comportement et le degré de mal être des animaux seront surveillés quotidiennement, les points limites seront estimés à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être animal spécifique au projet. Plus l’état de la souris se détériore, plus le score établi dans cette grille augmente. La grille attribue un score suivant l’aspect général, le comportement et la locomotion ainsi que la perte de poids. Des points limites spécifiques à ce projet seront également pris en compte Un arbre décisionnel est mis en place permettant d’intervenir en cas de douleur voir d’euthanasier l’animal, mettant un arrêt à son expérimentation. Dans ce cas les tissus seront prélevés pour être analysés. •Avant les procédures d’IRM et de collecte du sang, les animaux seront analgésiés et anesthésiés.

Choix des espèces

•L’objectif du projet est d’étudier les conséquences de la prééclampsie, c’est à dire de la réaction inflammatoire du placenta au moment de la grossesse, sur le vieillissement du cerveau des années plus tard. Donc le choix de travailler sur un modèle animal est nécessaire pour avoir cette interaction inter-organe et dans le temps. •L’usage de la souris pour ce projet est approprié car comme chez l’humain, la placentation chez la souris est hémochoriale (le sang maternel est au contact direct avec les cellules foetales placentaires). •Par ailleurs, plusieurs études ont montré qu’il existe une grande similitude dans l’expression et la régulation des gènes clés de la placentation chez les deux espèces et que plusieurs facteurs impliqués sont exprimés et régulés de la même façon. •Les travaux de l’équipe, depuis dix ans, ont montré qu’il existe une grande similitude dans l’expression et la régulation des prokinéticines, facteurs inflammatoires étudiés dans ce projet, chez les deux espèces également. •Le projet s’attache à étudier les troubles cognitifs des années après un épisode de prééclampsie, les souris femelles seront étudiées au moment de la prééclampsie (pendant et jusqu’à la fin de la gestation) puis au cours de leur vieillissement, jusqu’à 15 mois post-gestation, ce qui correspond à un âge d’environ 70 ans chez la femme.

1 890 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'ablation chirurgicale de 40 % d'un tissu adipeux sous-cutané, suivie d'injections d'une molécule orientant la cicatrisation ou la régénération, avant prélèvement d'organes. Le porteur décrit un suivi du bien-être adapté à l'inflammation provoquée par la chirurgie. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de la régénération d'un organe ne peut se faire que sur des animaux vivants, les hypothèses étant d'abord testées in vitro et in silico.

Objectifs

La réparation tissulaire d’une lésion peut conduire à l’activation de deux processus : la régénération qui correspond à la restauration de la structure du tissu et de sa fonction, ou la cicatrisation qui est caractérisée par un dépôt excessif de matrice extracellulaire(MEC) affectant l’architecture globale du tissu et sa fonction. La faculté de régénérer certains membres ou organes est retrouvée chez les vertébrés non mammifères ou chez des organismes inférieurs tels que la salamandre, le poisson zèbre ou encore le planaire. En revanche, chez les mammifères, les capacités régénératrices sont restreintes à une courte période périnatale. Cette perte de capacités régénératrices post-natales chez les mammifères adultes suggère la mise en place de mécanismes inhibant la régénération au profit des processus cicatriciels. Notre projet consiste désormais à explorer comment les propriétés mécaniques de la matrice extracellulaire contrôlent les processus de régénération chez les mammifères. Ce projet sera développé sur un modèle de lésion du tissu adipeux (lipectomie) chez la souris, puisque notre équipe a déja démontré la capacité de ce tissu à régénérer, sous certaines conditions bien maîtrisées.

Bénéfices attendus

La compréhension du mécanisme de régénération, en particulier la maîtrise de la production de MEC, pourrait permettre d’améliorer la réparation tissulaire chez le mammifère adulte, y compris l'homme, afin de rétablir les fonctions tissulaires après lésion.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une seule intervention chirurgicale permettant d'initier le modèle lésionnel. Il s'agit d'une lipectomie : résection partielle (40%) d'un seul tisu adipeux sous-cutané, réalisée en 10 minutes. Puis tous les animaux seront injectés (maximum 1 minute) avec une molécule pharmalogique afin d'orienter l'issue du modèle vers la régénération ou la cicatrisation et d'en étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires. Celles ci n’excèderont pas 200 μL par voie sous-cutanée ou par voir intra-péritonéale, et leur fréquence (1seule par jour) pourra varier selon les molécules, de J0 à J4, ou bien tous les 3 jours pendant la durée du protocole.

Impact sur les animaux

L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux sur l’état global de santé des animaux, et sera adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures, tels que l'inflammation générée par la chirurgie. Les protocoles sont réfléchis afin d’être le moins douloureux possible pour l’animal (mode et volume d’injection, durée du traitement…) et les études antérieures nous ont permis de mieux appréhender les points limites pour le bien-être des animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour prélevements d'organes.

Remplacement

Même si l’étude de la régénération d’un organe ne peut se faire qu’’en utilisant des animaux vivants, de nombreuses hypothèses sont au préalable testées in vitro et in silico. Le recours à l’animal est donc restreint uniquement aux expériences indispensables.

Réduction

Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience et d’établir un protocole d’étude adapté à l’obtention de résultats fiables permettant d’atteindre l’objectif, et en évitant la répétition des groupes contrôles indispensable à la validation des résultats. D'après notre expertise le nombre minimum d'animaux pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement interprétables est de 5 animaux par groupe, et doit être répété 3 fois pour obtenir une significativité des résultats. Ce sont également les résultats des simulations dans notre modèle in silico qui nous permet de ne réaliser que les expérimentations les plus pertinentes.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un travail de raffinement continu dans le but d’aboutir à des procédures de travail définies, et avec une procédure de suivi du bien-être animal adaptée aux expériences. En effet, les animaux ne seront jamais seuls en cage afin de respecter le caractère grégaire de la souris. Nous proposons aussi d’enrichir l’environnement des souris, favorisant le bien-être de l’animal. L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux, adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures, sur l’état global de santé des animaux. Les protocoles sont réfléchis afin d’être le moins douloureux possible pour l’animal (anesthésie gazeuse, mode et volume d’injection, durée du traitement…) et les études antérieures nous ont permis de mieux appréhender les points limites pour le bien-être des animaux. La surveillance des souris sera réalisée tous les jours. Ceci permettra de proposer des soins adaptés, de sortir de l’étude, ou bien d’euthanasier les animaux en cas de comportements anormaux ou de souffrance (points limite : perte de poids, prostration, poil hirsute).

Choix des espèces

Afin d’étudier les processus de régénération, il est indispensable d’étudier les mécanismes mis en place au cours du temps, après lésion tissulaire. Notre laboratoire a montré que le fond génétique, ou bien les récepteurs aux opioïdes jouaient un rôle majeur dans la balance régénération/cicatrisation. Afin d’en étudier les effets de ces paramètres, nous disposons au laboratoire ou par l’intermédiaire de collaborations plusieurs lignées transgéniques de souris tout à fait pertinentes pour mener à bien notre étude. C’est pourquoi l’ensemble de ce projet nécessite l’utilisation de l’espèce mus musculus. Les animaux seront utilisés à l’âge de jeune adulte (de 6 à 8 semaines) afin d’utiliser des animaux à maturité sexuelle. Les procédures décrites dans ce protocole ont déjà été validées sur des animaux de cet âge et les résultats ont été publiés.