Souris

142 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur pancréatique leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent chaque jour pendant cinq semaines une injection d'une molécule candidate, la taille de la tumeur étant mesurée deux fois par semaine. Le porteur cite parmi les signes possibles la prostration, l'ulcération de la tumeur, l'automutilation et des vocalises. Il présente le recours à la souris comme "indispensable" et justifie le choix de souris immunodéficientes par un coût réduit et des autorisations moins contraignantes que pour des espèces qu'il dit "plus évoluées".

Objectifs

Le cancer du pancréas est une tumeur maligne très grave. Asymptomatique et métastatique, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement efficace. L’urgence à laquelle la recherche est confrontée nous a amené à développer de nouveaux agents pour combattre ces cancers. Dans ce contexte, des inhibiteurs contre des protéines essentielles dans les tumeurs ont été développé et se sont avérés très efficace sur plusieurs lignées cellulaires dérives des patients. Des résultats prometteurs obtenus, montrent une réduction significative du taux de prolifération cellulaire. L'efficacité de cette famille des molécules est justifiée par son affinité pour une protéine clef dans le processus de carcinogenèse pancréatique. Dans ce contexte, ce projet a l'objectifs d'évaluer si ces molécules ont un effet curatif et sont efficaces pour réduire la tumeur dans ce modèle animal en ciblant ce proteine.

Bénéfices attendus

Notre objectif est de présélectionner la meilleure molécule candidate pour poursuivre nos essais précliniques.

Procédures

Une injection de cellules tumorales (par voie sous-cutanée) sera effectuée. Lorsque le volume de la tumeur est suffisant, les animaux seront traités quotidiennement par une injection d’une solution par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue de 0.5 mL, aiguille de 27G pendant 5 semaines. L’intervention dure 20-30 secondes. 2 fois par semaine, la taille des tumeurs seront mesurés avec un pied à coulisse. L’intervention dure 20-30 secondes.

Impact sur les animaux

Des signes de maladie peuvent être : cyphose dorsale, prostration, diminution du poids de l’animal, volume tumoral >1,5 cm3, ulcération de la tumeur, automutilation, vocalises. Bien que nous n'avons jamais observé de lésions chez les souris dues à cette procédure, les injections répétées quotidiennenment pourraient générer des lésions cutanées. Nous tenons à souligner que ces inhibiteurs n'ont montré aucune toxicité lors d'expériences précédentes aux doses qui seront utilisées dans ce projet, en traitements quotidiens pendant un mois.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever les tissus pour différents analyses.

Remplacement

Concernant le remplacement, le recours aux animaux est indispensable pour ce projet. De nombreuses données antérieures ont été réalisées sur des cellules en culture, y compris celles provenant de patients humains. Cependant, nous avons besoin d'un modèle animal pour prouver que le composé et ses dérivés induisent un effet antitumoral dans un modèle beaucoup plus complexe proche de l'être humain. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.

Réduction

Toutefois, nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 142 individus (4 groupes de 8 souris pour chaque somposé, 8 souris control pour touts les composés, et 6 souris de plus au cas où certaines souris ne les développeraient pas) conformément à la règle de réduction.

Raffinement

Concernant le raffinement, les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage de 530cm 2 ) et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation : en alternance tiges de papier, abris en carton, pelotes de lanières de papier. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. En ce qui concerne le protocole d'injection, la solution sera chauffée avant l'injection. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal: un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) pour différents critères physiologiques et comportementaux (tableau de score fourni en annexe). Tout animal obtenant un score total supérieur ou égal à 7 ou un score de 3 dans une des catégories sera mis à mort.

Choix des espèces

Les souris immunodéficiences sont des modèles très répandus dans la littérature et établis depuis longtemps. Leur utilisation est simple, peu coûteuse, rapide et permet de s’affranchir d’autorisations plus complexes et restrictives concernant des espèces animales plus évoluées Les animaux seront âgées de 4 semaines au moment de leur réception afin d’obtenir des souris adultes et en pleine forme (poids supérieur à 20g) au moment de commencer l’expérimentation. En effet, nous prévoyons une période d’acclimatation de 7 jours minimum après réception avant d’inoculer les cellules en sous-cutanées puis encore 2 à 3 semaines d’attente pour obtenir une tumeur d’un volume satisfaisant. Le traitement commencera alors sur des souris âgées entre 7 et 9 semaines selon la vitesse de développement de la tumeur.

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale d'une heure, onze injections sur animal éveillé et trois tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour étudier les neurones impliqués dans le sevrage aux opiacés. Le porteur indique induire une aversion liée au sevrage tout en cherchant à la minimiser, et met les souris à mort pour prélever leur cerveau. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires ne reproduisent pas l'organisation cérébrale et que les souris génétiquement modifiées utilisées n'existent que chez cette espèce.

Objectifs

Ce projet de recherche vise à identifier le rôle des circuits neuronaux participant au développement de troubles cérébraux, en mettant l'accent sur les troubles émotionnelles négatifs induit par la dépendance et le sevrage aux substances aux opiacés. Ce projet est centré sur les récepteurs aux opiacés. Le système opioïde est un système neuromodulateur complexe composé de trois récepteurs (mu, delta et kappa) activés par des peptides opioïdes endogènes. Le système opioïde régule la douleur, les processus de récompense, la régulation des réponses émotionnelles et des réponses au stress. Les altérations de ce système sont centrales dans le développement de troubles addictifs et de l'humeur. L’objectif de ce projet vise à déterminer le rôle des neurones exprimant les récepteurs aux opiacés dans différentes régions cérébrales dans le processus de sevrage aux opiacés.

Bénéfices attendus

Les implications sont à la fois fondamentales et cliniques, car elles nous permetteront une meilleur connaissance des mécanismes moléculaires responsables des états émotionelles négatifs suite au sevrage aux opiacés. Ce projet aura de nombreux bénéfices, en particulier d’identifier les neurones critiques dans le développement de l’état émotionnelle négatif pendant le sevrage aux opiacés. Ceci permettra de caractériser les mécanismes d’adaptation du cerveau à l’exposition répétée aux opiacés, afin d’identifier de nouvelles cibles neuronales pour des traitements pour la prévention et le traitement du sevrage aux opiacés et de faire face à la forte augmentation de la dépendance et de la consommation d’opiacés dans le monde.

Procédures

Procédure chirurgicale sous anesthésie générale 1 fois pendant 1 heure avec une injection d’anesthésiant local et une injection d’analgésique pendant la chirurgie. Injections multiples sur animal vigile pour administrer les traitements, qui fera un total de 11 injections sur animal vigile par souris. Chaque injection sur animal vigile dure 30 secondes. Nous allons effectuer 3 tests comportementaux par souris (chaque test dure entre 6 et 30 minutes).

Impact sur les animaux

Chirurgie stéréotaxique : Pendant la chirurgie, il y a un risque de surdose d’anesthésiant et d’hypothermie due à l’anesthésie. Il existe aussi un risque d’inflammation ou de réouverture du site d’incision,. Injections multiples : Les souris seront injectées il y a donc la possibilité d’irritation du site d’injection. Tests : les tests comportementaux choisis ne posent aucun risque corporel pour l’animal et il y aura un jour de repos entre chaque test. Les symptômes de sevrage seront minimisés en utilisant le plus faible pour induire une aversion. De plus, les tests ne durent pas plus de 30 minutes

Devenir

les animaux seront mis à mort pour prélèvement du cerveau

Remplacement

"Remplacement" : les effets comportementaux des opiacés ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne récapitulent ni la complexité de l’organisation cérébrale en réseaux neuronaux complexes. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers. De plus nous utiliserons des souris génétiquement modifiées permettant de cibler les circuits neuronaux répondant aux opiacés, ces modèles n’existent que chez la souris.

Réduction

"Réduction" : les animaux utilisés étant consanguins, la variabilité phénotypique est limitée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. De plus ces études se feront de manière longitudinale, afin de tester plusieurs paramètres (dépression et anxiété) chez le même animal afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux effets effets aversifs des opiacés seront constitués de 12 souris chacun.

Raffinement

"Raffinement": nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les réponses comportementales au sevrage à la suite d’une administration d’opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger, une ‘’maison’’ en carton, et des papiers absorbants pour faire un nid. Enfin, les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie (anesthésique profond et un anesthésique local autour du site de chirurgie) et les animaux recevront un traitement antidouleur (traitement par un anti-inflammatoire). La température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté jusqu’au complet réveil de l’animal. Les animaux seront ensuite suivis et la souffrance sera évaluée. Des points limites prédictifs seront établis permettant d’interrompre l’étude limitant ainsi la souffrance, la douleur et le stress pour l’animal.

Choix des espèces

La sourisest aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies de son génome (99 % identique à celui de l'homme). De plus, le modèle souris permet la création de lignées génétiquement modifiées (délétion/surexpression globale ou locale d’un gène ou d’un marqueur neuronal, manipulation de neurones ciblés). Pour notre étude, l’utilisation de la souris souris génétiquement modifiée est centrale, car elle nous permet d’étudier spécifiquement les neurones qui répondent aux opiacés, de manipuler leur activité et d’en voir les conséquences sur le comportement. Aucun autre organisme ne permet d’utiliser cette approche très puissante. Les modèles étudiés étant des modèles de pathologie neuropsychiatrique se manifestant principalement à l’âge adulte chez l’humain, les études se feront chez des animaux ayant atteint le stade mature de leur développement, c’est à dire au minimum 2 mois pour les modèles souris.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un antibiotique dans l'eau puis un gavage de bactéries E. coli, avant des traitements à base de phages administrés par gavage trois fois par semaine pendant deux semaines, le côlon étant ensuite prélevé. Le porteur précise que les souris sont génétiquement modifiées et développent spontanément un cancer colorectal, mais affirme arrêter l'expérience avant que la maladie n'affecte leur état. Sur le remplacement, il indique avoir mené des essais in vitro mais juge l'étape in vivo "nécessaire" pour vérifier l'efficacité du traitement.

Objectifs

Les Escherichia coli (E. coli) sont des bactéries colonisant naturellement le tractus digestif. Ces bactéries sont dans la plupart des cas inoffensives. Cependant, elles ont tendance à céder et à acquérir du matériel génétique pouvant dans certains cas les rendre pathogènes pour l’Homme. Ce matériel génétique peut être composé de facteurs de virulences (toxines par exemple) et/ou de nombreux gènes de résistance aux antibiotiques rendant leur éradication extrêmement difficile voir dans certains cas impossible (bactéries dites multi-résistantes). A titre d’exemple, Santé publique France estime pour l’année 2015 à 125 000 le nombre d’infections par des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques en France et à plus de 5 500 le nombre de décès imputables à ces bactéries. Ces chiffres étant en constante augmentation, de nouvelles méthodes d’éradication de ces bactéries sont nécessaires pour continuer à traiter efficacement les patients. Le projet aura comme objectif d’éliminer le portage digestif des E. coli possédant soit des gènes codant pour des toxines soit des gènes de multi-résistance aux antibiotiques. Dans ce projet, nous utiliserons au maximum 220 souris. Les animaux seront hébergés dans des cages standards avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture et le milieu sera enrichit à l’aide de maisons en plastique. Un suivi quotidien des animaux sera effectué de manière à repérer toute détresse animale.

Bénéfices attendus

D’une façon globale, ce projet apportera la preuve de concept in vivo que notre traitement peut être une excellente approche pour éliminer le portage digestif de bactéries E. coli indésirables (producteurs de toxine et/ou multi-résistants aux antibiotiques). La production de notre traitement décolonisateur testé est peu couteuse et extrêmement facile à mettre en place (son administration est elle aussi extrêmement simple). Ainsi, si la preuve de concept de leur pourvoir décolonisant sur nos bactéries modèles s’avère être un succès, il serait alors envisageable d’imaginer de développer chez des patients porteurs de bactéries similaires cette stratégie thérapeutique.

Procédures

Les animaux seront tous gavés, ce qui représente un maximum de 220 souris. Le gavage se fera sur animal vigile par du personnel expérimenté, habitué à cet acte qui hormis la contention n'induit aucune douleur à l'animal et ne dure que quelques secondes. En ce qui concerne la fréquence des gavages, les animaux recevront tous 1 gavage des souches bactériennes d'intérêt. Les traitements décolonisateurs seront administrés quand à eux 3 fois par semaine pendant 2 semaines (110 souris). Si les expériences sont un succès, nous les répèterons en administrant le traitement décolonisateur seulement 1 seule fois (un maximum de 110 souris).

Impact sur les animaux

Les animaux se verront administrer un antibiotique via l'eau de boisson. Cette pratique est très fréquente pour faciliter l'implantation intestinale de souches bactériennes d'intérêts et n'entraine aucune gêne chez les animaux. L'administration des bactéries se fera par gavage. Cet acte n’induit pas de nuisance particulière hormis un stress léger lié à la contention de l’animal. Les souches bactériennes utilisées sont couramment employées au laboratoire et n’induisent aucun stress ou dégradation de l’état général de l’animal. Les effets indésirables résident plus dans le modèle murin lui-même, puisque les souris utilisées sont altérées génétiquement et développent spontanément un cancer colorectal. Cependant l’expérience sera arrêtée bien avant que la pathologie ne se traduise par un impact sur le bien-être des animaux.

Devenir

Les animaux auront reçu des antibiotiques, des bactéries et des phages. C'est pour cela qu'ils seront mis à mort. De plus, nous voulons nous assurer que les phages ont été capable d'éliminer les bactéries associées à la muqueuse intestinale et pour cela, les côlons doivent être récupérés et les animaux mis à mort.

Remplacement

Notre approche expérimentale inclut une première analyse in vitro ayant démontré l’efficacité des traitements décolonisateurs utilisés in vivo. Cependant, la densité du microbiote intestinal est telle dans le tractus digestif, que l’étude de l’efficacité des traitements décolonisateurs in vivo est nécessaire pour nous assurer qu’ils sont réellement efficaces.

Réduction

Nous n’utiliserons que le nombre nécessaire d’animaux pour la bonne interprétation des données. D’expérience, nous savons que les expériences de colonisations intestinales par des E. coli nécessitent 10 animaux/lot (il y a une grande variabilité en termes de colonisation et moins de souris rend l’interprétation impossible). En effet, le laboratoire a publié des données comparant chez des souris prédisposées à développer le cancer colorectal, la colonisation d’une souche de E. coli de laboratoire à celle d’une souche de E. coli associée au cancer colorectal chez l’Homme. Les groupes comportaient entre 14 et 17 animaux. Par ailleurs, le laboratoire réalise de nombreuses infections bactériennes de souris dans le cadre de l’étude du pouvoir inflammatoire des E. coli associés à la maladie de Crohn, une maladie inflammatoire chronique de l’intestin. Bien souvent les chiffres de colonisations présentent des variations et le nombre d’animaux utilisés s’en trouve impacté. Des groupes de 8-12 animaux sont fréquemment constitués. Nous prévoyons une administration répétée ou unique des traitments décolonisateurs. Les epxériences d'administration unique ne seront faites que si l'administration répétée montre un effet bénéfique. Si ce n'est pas le cas, l'expérimentation prenda fin.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans une salle climatisée avec un cycle jour/nuit de durée égale et un taux d'humidité constant. Les animaux auront libre accès à la boisson et à la nourriture. Le milieu sera enrichit à l’aide de maisons en plastique. Un suivi quotidien des animaux sera effectué de manière à repérer toute détresse animale. Le poids des souris sera également suivi avec attention car c’est un très bon marqueur de pathologies intestinales et de la sévérité d’une diarrhée. Nous utiliserons également un système de score de manière à limiter au maximum la souffrance et définir des points limites. Si un animal présente des signes de douleur, un antalgique lui sera administré par gavage pour en contrôler la prise. Les expériences seront réalisées en toute sécurité, notre animalerie permettant notamment la manipulation de pathogènes.

Choix des espèces

Pour les souris de fond génétique sauvage, nous gaverons des animaux âgés de 6-8 semaines. C'est un âge classiquement utilisé dans les expériences de gavage et d'étude de la colonisation intestinale par les bactéries. Pour les souris prédisposées à développer le cancer colorectal, nous gaverons des animaux âges de 6 semaines. C'est l'âge classique pour ce modèle.

3 204 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris transgéniques reproduisant une cécité héréditaire, elles reçoivent une injection sous-rétinienne d'une thérapie génique par CRISPR/Cas9, suivie de prélèvements de larmes et de sang, de fonds d'œil, de tomographies et d'électrorétinogrammes répétés jusqu'à neuf ou dix fois. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer des décollements de rétine et des hémorragies oculaires. Il annonce viser une preuve de concept avant un éventuel passage en clinique.

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche est de mettre au point une thérapie génique permettant de limiter la progression de la rétinite pigmentaire autosomique dominante, une maladie génétique responsable d’une dégénérescence des photorécepteurs, cellules permettant la vision, et aboutissant à une cécité, dans deux modèles de souris atteintes de rétinite pigmentaire autosomale dominante. Cette thérapie génique reposera sur une stratégie de « Suppression », éliminer le gène responsable de maladie chez le patient en utilisant les ciseaux génétiques CRISPR/Cas9, associée à une stratégie de « Remplacement » qui consistera à apporter au patient une version saine du gène précédemment supprimé (gène médicament). La finalité étant le développement d’une thérapie curative accessible au plus grand nombre de patients atteints par cette cécité héréditaire.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mettre en avant la preuve de concept d’efficacité d’une thérapie génique indépendante des mutations et utilisant l’outil d’édition du génome CRISPR/Cas9 sur nos modèles murins de rétinite pigmentaire autosomale dominante. Le bénéfice attendu est à terme d’amener en clinique cette thérapie génique mutation indépendante pour la rétinite pigmentaire autosomique dominante, pour lesquelles le développement de traitement spécifique à chaque mutation identifiée n’est aujourd’hui pas possible.

Procédures

- Injection sous-rétinienne : les animaux recevront une injection intraoculaire (une seule par œil) de la thérapeutique à évaluer. L’injection est rapide (5 à 10 minutes) et sera réalisée sous analgésie et anesthésie générale. Les souris ne passeront qu’une seule fois par cette étape expérimentale. - Prélèvement de larmes : le prélèvement est effectué sur souris vigiles (non anesthésiées). Le prélèvement de larmes est rapide (30 secondes) et considéré non douloureux chez l’animal. Les larmes des souris seront prélevées avant l’injection intraoculaire de l’élément thérapeutique testé (si l’âge des souris à l’injection le permet) puis une fois par semaine pendant 4 semaines, soit au maximum 5 fois. - Prélèvement de sang : le prélèvement est effectué sur souris anesthésiées. Le prélèvement de larmes est rapide (30 secondes) et considéré non douloureux chez l’animal. Le sang sera prélevé avant l’injection intraoculaire de l’élément thérapeutique testé (si l’âge des souris à l’injection le permet) puis une fois par semaine pendant 4 semaines, soit au maximum 5 fois. - Fond d’œil : suite à l’injection de la thérapeutique, le fond d’œil des animaux sera visualisé pour contrôler la qualité de l’injection réalisée. La procédure est rapide (5 minutes) et sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé 1 à 3 fois selon les conditions expérimentales. - Tomographie à cohérence optique : ce test permet de visualiser la structure anatomique de la rétine (différentes couches de cellules). L’acquisition d’images dure environ 5-10 minutes par animal et sera réalisée sous anesthésie gazeuse Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé au maximum 10 fois par animal. - Electrorétinogramme : ce test permet d’évaluer la fonction de la rétine (capacité des cellules de la rétine à répondre à un stimulus lumineux). L’analyse dure environ 30 minutes par animal et sera réalisée sous anesthésie générale. Pour les animaux soumis à cet examen, il sera réalisé au maximum 9 fois par animal. - Euthanasie par des méthodes réglementaires en vue de prélèvements : en fin de procédure expérimentale, toutes les souris seront euthanasiées pour collecter des échantillons pour des analyses microscopiques des tissus et des analyses biochimiques ultérieures.

Impact sur les animaux

Les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Les injections intrapéritonéales et sous-cutanées peuvent induire une douleur ponctuelle réversible. La majorité des gestes expérimentaux auxquels seront soumises les souris seront réalisés sous anesthésie (injection intraoculaire, prélèvement de sang, fond d’œil, tomographie à cohérence optique, électrorétinogramme) induisant une répétition des anesthésies. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme). A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les yeux pour des analyses histologiques post-mortem.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de collecter des échantillons pour des analyses histologiques et biochimiques post-mortem.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé que dans un modèle in vivo car les propriétés pharmacologiques du traitement ne peuvent être évaluées que dans des conditions physiologiques, pour notamment étudier l’interaction entre les vecteurs d’injection de la thérapie génique et le système immunitaire de l’hôte. De même que le fonctionnement de la rétine et la vision ne peuvent être évalués qu'in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés (3204 souris) sera toujours limité au minimum nécessaire pour fournir des données biologiquement et statistiquement significatives. Les tests statistiques réalisés seront adaptés aux échantillons de petite taille afin de limiter le nombre d’animaux par groupe (12 souris/groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe (17 pour J2-3) est basé sur des études antérieures du laboratoire utilisant des techniques similaires. Plusieurs tissus seront prélevés sur toutes les souris utilisées dans ce projet afin de collecter un maximum d’échantillons et d’éviter de relancer des expérimentations additionnelles.

Raffinement

- Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement, nourriture et boisson à volonté). - Une anesthésie courte gazeuse, permettant un réveil rapide de l’animal, sera privilégiée quand les procédures le permettent. - Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections sous-rétiniennes, intrapéritonéales et sous-cutanées. - Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (tunnel en carton et coton), ainsi que nourriture et eau à volonté. - Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. - Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale. - Les animaux provenant de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum.

Choix des espèces

Les deux modèles de souris transgéniques utilisés dans ce projet reproduisent la pathologie étudiée : la rétinite pigmentaire autosomale dominante. Comme chez l’Homme, une mutation présente dans le gène codant pour la rhodopsine, induit une dégénérescence progressive des photorécepteurs. De plus, chez ces deux modèles de souris la vitesse de dégénérescence des photorécepteurs diffère, notamment due aux différentes mutations, ce qui est également observé chez les patients. Le but de cette étude étant de tester l’effet de nouveaux composés thérapeutiques pour ralentir la dégénérescence rétinienne, l’intervention interviendra avant que la dégénérescence des photorécepteurs n’atteigne un stade avancé, soit chez des souris âgées de 2-3 jours, 7 jours, 14 jours afin de déterminer le temps d’injection ayant le meilleur avantage thérapeutique. Les souris âgées de 42 à 49 jours seront utilisées car celles-ci possèdent un système immunitaire pleinement mature, nécessaire à la comparaison avec les stades antérieurs.

2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette prestation menée pour des laboratoires partenaires utilise des souris porteuses d'une mutation reproduisant une maladie liée aux immunoglobulines G4, avec injections de composés et prélèvements de sang et d'urine sur des animaux dès l'âge de deux semaines maintenus avec leur mère. Le porteur indique n'administrer aucun analgésique, au motif qu'il fausserait la réponse immunitaire observée. Il affirme que le modèle doit être évalué à l'échelle de l'"organisme entier" et qu'aucune méthode alternative ne le permet.

Objectifs

Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaître l’impact de leurs composés thérapeutiques sur les maladies associées aux immunoglobulines G4 (IgG4-RD). Ces maladies sont des troubles fibro-inflammatoires chroniques graves à médiation immune qui se traduisent souvent par des niveaux élevés de protéines dans le sang (IgG4), dans les urines et par le développement de masses semblables à des tumeurs touchant plusieurs organes chez l’homme. Ses différentes manifestations cliniques rendent son diagnostic difficile. Les traitements conventionnels visent à atténuer l'inflammation par l'utilisation anti-inflammatoires mais le taux de rechute (40%) et les conséquences de leur prise sur le long terme sont importants. Le présent projet propose d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques ciblant les IgG4-RD afin d’augmenter les chances de rémission. Pour cela, nous disposons d’un modèle murin très bien caractérisé nommé LATY136F qui développe spontanément un syndrome lymphoprolifératif ayant des caractéristiques immunopathologiques semblables aux IgG4-RD chez l’homme. Ce modèle nous permet d’envisager l’étude de composés à visée thérapeutique afin d’évaluer leur efficacité sur la mise en place et l’évolution des IgG4-RD. Pour cela, nous évaluerons les différentes populations cellulaires du système immunitaire de ces souris après injection de composés thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer en phase pré-clinique l’efficacité des composés thérapeutiques ciblant les maladies chroniques graves associées aux IgG4. La prévalence exacte de ces maladies n’est pas connue en partie à cause de son diagnostic difficile à établir et à les dissocier des maladies chroniques connues. Actuellement, les traitements reposent sur l’utilisation d’agents anti-inflammatoires et 40% des patients sont en rechutes. Ainsi, la découverte de nouveaux agents thérapeutiques est nécessaire afin d’augmenter les chances de rémission des patients. Ce projet permettra d’évaluer à la fois l’effet des composés thérapeutiques sur l’initiation et le développement des IgG4-RD.

Procédures

La procédure expérimentale consiste en l’injection intra-péritonéale (i.p) ou sous-cutanée (s.c) de composés thérapeutiques visant à diminuer ou empêcher le développement spontané du syndrome lymphoprolifératif chez les souris LatY136F, modèle qui reflète les maladies associées aux IgG4 chez l’homme. Chaque individu sera manipulé pour : - les collectes de sang et d’urine à J0 et en fin d'expérimentation (=10 semaines) pour déterminer l'évolution des protéines dans le sang et les urines et d'en conclure sur l’efficacité du traitement. Cette intervention est rapide et dure environ 2 minutes par souris pour la récolte du sang et de l'urine. - les pesées hebdomadaire (30 secondes par souris) - les injections des composés thérapeutiques par voie i.p ou s.c en fonction du type de molécule et de la demande des partenaires. La durée d’injection par voie i.p est de 30 secondes par souris. La durée d’injection par voie s.c est de 3 min et 30 secondes temps comprenant la phase d’endormissement de 3 min à l’isoflurane et 30 secondes pour l’injection. -les anesthésies générales gazeuses à l’isoflurane dans le cas d’injection des composés thérapeutiques en s.c d'une durée de 3 minutes. L’expérimentation se terminera lorsque les souris auront 12 semaines. Le jour de l’arrêt expérimental, les souris seront mises à mort pour le prélèvement des organes lymphoïdes et non lymphoïdes en vue de l’immunophénotypage et des études histologiques.

Impact sur les animaux

Les tests d’efficacité de composés thérapeutiques sur les maladies liées aux-IgG4 n’entraineront pas d’effet indésirable chez les animaux dans la mesure où les doses injectées sont préalablement testées pour leur toxicité chez nos laboratoires partenaires. Toutefois, lors de l’expérimentation les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques pouvant engendrer du stress notamment lors des contentions, des collectes de sang et d’urine, des pesées hebdomadaires et des injections de composés thérapeutiques pendant 10 semaines. Les injections n’entraineront pas de douleur. Tous les actes techniques seront réalisés par du personnel expérimenté et expert afin de limiter les contraintes subies par l’animal. Toutes les souris seront mises à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte des organes dans le but d’analyser la réponse immunitaire suite aux traitements

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’experience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire ou pour l’histologie.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Ainsi, le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par groupe expérimental, les deux sexes confondus, afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience. Le nombre de groupe sera amené à varier selon les besoins du partenaire, notamment si plusieurs molécules, doses ou durées de traitement sont à tester. Dans la mesure du possible, les expériences sont multiplexées afin d’utiliser un seul groupe contrôle pour plusieurs groupes tests.

Raffinement

Les animaux en expérimentation sont hébergés en zone d’expérimentation en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier, que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Ce protocole demande également l’utilisation d’animaux jeunes de 2 semaines nés au sein de notre animalerie. Les animaux seront maintenus avec leur mère pour la première injection et sevrés ensuite vers 21 jours. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début des injections. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique. Toutefois, nous veillerons au bien être animal par une surveillance quotidienne des animaux par du personnel qualifié. Tout fait notable sera consigné sur une grille de score évaluant la souffrance et le stress des animaux. Les points limites sont clairement déterminés et les animaux identifiés par une alerte feront l’objet d’une surveillance accrue et des actions seront mises en place pour palier à divers problèmes tels qu’une observation bijournalière par le personnel expérimentateur ; l’ajout de gel Diet / pâtée SAFE Energy, l’ajout de coton…

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Nous utiliserons des animaux à des âges différents dans la mesure où le développement de la pathologie observé est progressif. Afin de vérifier l’effet des composés thérapeutiques, nous traiterons des souris âgées de 2 semaines avant l’apparition des premiers symptômes pour vérifier si le traitement empêche ou retarde la maladie ; puis sur des souris âgées de plus de 3 semaines lorsque la pathologie est mise en place pour vérifier l’effet du traitement sur les symptômes.

1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une maladie inflammatoire humaine, elles reçoivent des composés jusqu'à deux fois par jour pendant douze semaines, avec cinq à neuf prélèvements sanguins au sinus rétro-orbital et des prélèvements urinaires. Le porteur indique que le phénotype dommageable, avec gonflement des ganglions et lésions tissulaires, s'installe vers vingt semaines, et que les composés testés peuvent induire un inconfort. Il affirme que le recours à un modèle animal est "indispensable" pour juger de l'efficacité d'un composé après une phase in vitro.

Objectifs

Chez l’homme, la maladie à IgG4 est une maladie fibro-inflammatoire systémique à médiation immunitaire. Elle se présente sous forme de dysfonctionnement d’organe ou de lésions avec infiltration lympho-plasmacytique dans un ou plusieurs organes (principalement entre autres dans les reins et les poumons) avec des symptômes relatifs à l’organe atteint. Elle peut entraîner une défaillance d’un ou plusieurs organes voire la mort si elle n’est pas traitée. Un taux élévé d’immunoglobulines caractérise également cette pathologie. L’objectif du projet est la découverte de médicament présentant des avantages thérapeutiques par rapport à l’offre médicamenteuse actuelle, capables de contrer l’augmentation des immunoglobulines permettant ainsi de diminuer la gravité des signes cliniques. Par extension, certaines maladies auto-immunes (i.e. Lupus érythémateux disséminé) pourraient également bénéficier de ces thérapies. Pour ce faire, le projet utilisera des souris homozygotes pour la mutation LATY136Fqui récapitule bon nombre des caractéristiques de la pathologie humaine.

Bénéfices attendus

Il n’y a actuellement pas de traitement spécifique de la maladie associée aux IgG4 mais les corticoïdes voire des immunosuppresseurs, permettent la régression des infiltrats inflammatoires et donc des symptômes de la maladie. L’objectif du projet est la découverte d’autres options thérapeutiques capables de contrer l’augmentation des immunoglobulines permettant ainsi de diminuer la gravité des signes cliniques. Par extension certaines maladies auto-immunes (i.e. SLE) pourraient également bénéficier de ces thérapies.

Procédures

1/ Administration des composés à tester ou de leur solvant, par voie orale ou sous-cutanée ou intra-veineuse ou intra-péritonéale, une à deux fois par jour pendant un maximum de 12 semaines sous un volume de 5 à 10mL/kg en fonction de la voie d’administration 2/ en fonction de la durée de l’étude, 5 à 9 prélèvements sanguins à la veine sub-mandibulaire ou au sinus rétro-orbital (sous anesthésie à l’isoflurane et après application locale d’analgésique) 3/ lors des études longues, au maximum 9 prélèvements urinaires (dont un au moment du sacrifice) seront obtenus par mixtion spontanée (espacés d’une semaine) 3/ Au maximum 8 prélèvements urinaires pour les études longues

Impact sur les animaux

Les signes physiologiques des homozygotes apparaissent à partir de 4 semaines d’âge (adénomégalie, lésions tissulaires) et s’amplifient au cours du temps jusqu'à atteindre un phenotype dommageable aux alentour de 20 semaines. Les composés administrés peuvent induire un inconfort. La dose pourra alors être diminuée pour l'ensemble du groupe traité. L'arrêt temporaire ou définitif du traitement pour ce groupe peut être envisagé tout en continuant l'étude pour les autres groupes. Si ces mesures ne fonctionnent pas, une mise à mort anticipée sera envisagée (avis vétérinaire). Des prélèvements sanguins seront effectués : 5 à 9 en fonction de la durée de l’étude. Au maximum, 8 prélèvements urinaires par mixion spontanée seront effectués lors des études longues (espacés d’une semaine).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

Après une phase de test d’évaluation d’efficacité in vitro permettant la sélection des meilleurs candidats, l’utilisation de modèles animaux mimant les pathologies humaines est indispensable pour juger de l’efficacité d’un nouveau composé

Réduction

Le modèle utilisé étant bien décrit dans la littérature, la mise au point sera ainsi limitée. Nous travaillerons sur des groupes homogènes au moment de leur inclusion dans l’étude, afin de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé et générer des résultats reproductibles. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe afin d’obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (par exemple, maisons en carton, carrés de coton et feuilles de cellulose). Il sera toutefois adapté en cas de signes d’atteintes pulmonaires (élimination des sources de poussières), ou rénale (avec une litiére absorbante). La bonne connaissance de ce modèle décrit dans la littérature permettra de raffiner et d’anticiper le développement de la maladie chez l’animal et donc d’anticiper la mise à mort éthique selon des critères d’interruption prédéfinis. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse pouvant être infligées aux animaux, une surveillance journalière ainsi que des points limites précoces et spécifiques à ce modèle ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal. Lors de la mise à mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée est la souris, notamment une souche portant la mutation LATY136F, caractérisée et décrite dans la littérature par plusieurs équipes. Nous nous appuierons sur de la bibliographie solide et sur un modèle déjà bien documenté afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour la mise au point. Nous utiliserons des animaux entre 4 et 16 semaines d’âge suivant l’objectif de l’étude : effet des molécules sur les taux d’IgG1 et IgE ou caractérisation de l’impact de la diminution du taux d’immunoglobulines sur les atteintes tissulaires et fonctionnelles à long terme.