Souris
Capacité régénérative des cellules satellites après dénervation.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Opérées sous anesthésie pour une section définitive du nerf sciatique d'une patte arrière, 54 souris jeunes adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis mises à mort pour le prélèvement de leurs organes. L'équipe veut savoir si le stress oxydatif qui suit la dénervation altère la capacité de régénération des cellules souches du muscle. Le porteur juge les souris "peu invalidées par cette opération pour une vie en captivité", parce qu'elles sont "quadrupèdes et vivant à ras du sol", et estime l'étude "extrêmement rentable pour la société". Il présente la dénervation comme "définitive", puis prévoit de placer la nourriture à portée en raison de l'"absence temporaire de réactivité de la patte dénervée".
Objectifs
Le système nerveux contrôle de nombreuses fonctions dans l’organisme, l’une d’entre elles est la contraction musculaire. En effet, les motoneurones (i.e. neurones qui fonctionnent spécifiquement pour le mouvement) envoient un signal électrique, via leurs axones, qui se traduit en signal chimique au niveau de la jonction neuromusculaire. Ce signal induit la contraction musculaire. Une fibre musculaire est une cellule de forme cylindrique qui résulte, à l’état embryonnaire de l’organisme, de la fusion de nombreuses cellules pré-musculaires appelées myoblastes. La fibre musculaire est alors une cellule contenant de nombreux noyaux, chaque myoblaste ayant apporté son noyau. La fibre musculaire en elle-même ne se divise pas mais comprend sur sa périphérie quelques cellules souches pré-musculaires, dites cellules satellites, qui se divisent quand les fibres musculaires ont besoin d’être réparées ou de croître pour un gain de force. Quand les cellules satellites sont appelées à se diviser elles s’agrègent avec la fibre qui les portait, on parle dans ce cas d’accrétion. La fibre gagne ainsi de nouveaux noyaux avec pour conséquence un gain en molécules contractiles qui réparent la fibre en cas de blessure ou la rendent plus fortes si c’est pour répondre à des exercices intenses. Il a été décrit dans la littérature que suite à la dénervation, qui prive les muscles des signaux du nerf, les cellules musculaires subissent un fort dommage oxydatif. Nous avons récemment montré que le dommage oxydatif peut modifier, in vitro, les capacités régénératives des myoblastes, précurseur en différenciation des fibres musculaires. Les cellules satellites peuvent être isolées du muscle adulte et mises en culture dans des boîtes. Une fois en culture, leur statut biologique change et elles se mettent à proliférer en tant que myoblastes qui selon certaines conditions de culture peuvent fusionner et s’agréger pour donner des fibres musculaires immatures appelés myotubes. Ceci permet d’étudier plus facilement, que dans l’animale, leur biologie régénérative, sachant qu’avec un animal on obtient de nombreuses cellules permettant de faire de nombreux tests. Actuellement les conséquences du stress oxydatif lié à la dénervation sur les cellules satellites sont peu connues. Nos travaux sont destinés à comprendre si et comment l’activité régénérative des cellules satellites est altérée pendant le processus de dénervation.
Bénéfices attendus
Ce projet a deux volets qui ont un intérêt scientifique général : Tout d’abord nous allons évaluer comment le dommage oxydatif, qui suit une dénervation, va affecter les fibres musculaires et les cellules satellites. Nos résultats dans les cellules en culture nous laissent présager que ce dommage va impacter la capacité régénérative des cellules satellites et contribuer au processus d’atrophie musculaire post-dénervation. Une étude aussi complète de l’effet des dommages oxydatifs dans la problématique de la dénervation n’a jamais été effectuée. Quelques études montrent que le nombre de cellules satellites musculaires ne change pas après dénervation, néanmoins il n’y a aucune étude qui montre que leur capacité à fusionner ou à accomplir l’accrétion est la même. Cette investigation est d’autant plus importante car ses conclusions pourraient être applicables aux accidents de dénervation ou pincements des nerfs qui peuvent survenir chez l’humain. Il est important de connaitre les conséquences du dommage oxydatif induit par la dénervation pour pouvoir chercher des thérapies adaptées pour soulager la conséquente atrophie musculaire (détoxification des molécules oxydantes avec des traitements anti-oxydants, préconisations nutritionnelles). De plus, il est essentiel de vérifier si l’activité de régénération des cellules satellites est conservée après dénervation et comprendre comment la préserver pour limiter l’atrophie musculaire. Au vu des bénéfices attendus en termes scientifiques et médicaux et de l’impact limité sur les souris, nous estimons que cette étude sera extrêmement rentable pour la société.
Procédures
Chirurgie sous anesthésie chimique pour section du nerf. 54 souris seront traitées. La durée d'intervention par souris est d'environ 10 min.
Impact sur les animaux
La technique de dénervation définitive, par section du nerf sciatique présente l’avantage d’être une intervention chirurgicale modérément invasive si on l'a compare par exemple à une chirurgie abdominale. Les conséquences de la dénervation permettent une vie quasi-normale en captivité des animaux traités, la cage d’élevage comprenant de la litière adaptée ainsi qu’un enrichissement sous forme de petite cabane. La technique microchirurgicale de dénervation est effectuée avec le maximum de précautions pour limiter les douleurs post-opératoires des animaux (anesthésie générale et en local du nerf et administration d’antalgique en pré-opératoire et anti-inflammatoire en post-opératoire). La dénervation est effectuée sur l’une des pattes arrière de la souris et ne concerne pas tous les muscles, d’autres afférences nerveuses permettent à la souris de se relever ainsi que ses déplacements sans difficulté sur la litière de la cage. Il est par ailleurs à considérer que les souris étant quadrupèdes et vivant à ras du sol, elles sont par conséquent peu invalidées par cette opération pour une vie en captivité.
Devenir
Mise à mort pour prélèvements d’organes
Remplacement
Le recours à des souris est indispensable parce que la dénervation induit des modifications physiologiques sur l’ensemble du muscle qu’il est impossible de reproduire sur des cellules en culture. De plus, la mise en culture des cellules satellites modifie leur état de quiescence, ce qui peut modifier leur réponse au stress et aux dommages à l’ADN. En effet, la réparation de l’ADN n’est pas la même dans des cellules qui se divisent, des cellules qui ne se diviseront plus ou des cellules quiescentes qui ont toujours une possibilité de se diviser. Nous avons réalisé, en amont de ce projet, des tests préliminaires sur cellules en culture pour certaines mises au point de nos analyses (Immunofluorescence, colorations, traitement aux agents oxydants) permettant de ne recourir aux animaux que lorsque c’est absolument nécessaire.
Réduction
Dans la première phase du projet on prévoit un nombre minimum de 15 souris et un maximum de 18 souris : 5+1 par condition pour 3 temps post-dénervation. La robustesse de la procédure de dénervation et nos résultats préliminaires dans des myoblastes en culture nous ont amené à estimer que 5 souris par condition sera le juste nombre pour avoir des résultats statistiquement valables, une 6eme souris pourrait être utilisée si un problème de reproductibilité se présente. Dans la deuxième phase, on estime un nombre de 12 souris par temps post-dénervation les tests à réaliser demandant 6 souris pour la mesure de l’index de fusion qui correspond à la proportion de cellules comprenant deux noyaux sur l’ensemble de toutes les cellules et 6 souris pour le test d’accrétion qui mesure le nombre de cellules à plus de deux noyaux sur l’ensemble de toutes les cellules présentes. On estime que 5 souris par condition sera le juste nombre pour avoir des résultats statistiquement valables sur la base d’un test statistique dit non paramétrique de Wilcoxon, une 6eme souris pourrait être utilisée si un problème de reproductibilité se présente. Le nombre de souris utilisables dans cette phase sera donc compris entre 30 et 36. Par ailleurs des prélèvements effectués sur ces animaux (cœur, diaphragme, autres muscles, etc ...) seront également mis à profit pour des analyses nécessaires à d’autres projets au sein de notre équipe permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Grâce aux précautions prises pour l’anesthésie générale ainsi que les mesures médicamenteuses anti-douleur et anti-inflammatoires pratiquées en pré et post-opératoire, les souris traitées retrouvent très rapidement un comportement similaire à leurs congénères non traités. Les animaux sont ensuite surveillés quotidiennement pour détecter d’éventuels problèmes (apparence, comportement social, posture, perte de poids) et y remédier par des soins appropriés. Par ailleurs, pour faciliter l’alimentation des souris dénervées qui pourraient présenter une difficulté en raison de l’absence temporaire de réactivité de la patte dénervée, la nourriture sera placée de façon plus accessible dans la cage.
Choix des espèces
La souris est le modèle idéal pour cette analyse car les processus étudiés sont très conservés au cours de l’évolution en particulier chez les mammifères. Nous avons choisi le stade jeune adulte de 8 semaines pour notre étude car la croissance musculaire est terminée et les cellules satellites ne se divisent plus dans les conditions d’élevage pratiquées.
Décryptage et ciblage des interactions cellules endothéliales/cellules immunitaires dans le but de limiter la toxicité digestive radio-induite à l’aide d’un modèle murin
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, modéré et sévère. Une partie est irradiée à l'abdomen, une autre subit une chirurgie pour irradier directement l'intestin grêle, un modèle dont le porteur indique qu'il entraîne 50 % de mortalité, pour étudier les séquelles digestives de la radiothérapie pelvienne. Le porteur décrit la radiothérapie comme un traitement "incontournable" du cancer et souligne l'insuffisance des thérapies contre ses séquelles. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative au modèle animal pour reproduire l'interaction entre les tissus vasculaire, stromal, inflammatoire et épithélial.
Objectifs
L’objectif de cette étude est de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au niveau du côlon et de l’intestin grêle qui sont responsables des séquelles tardives des irradiations de la zone pelvienne occasionnés par la radiothérapie.
Bénéfices attendus
La radiothérapie externe est l’un des traitements incontournables dans la prise en charge des cancers (60% des patients en bénéficient). L’objectif est la recherche d’un compromis entre le contrôle du volume de la tumeur et les dommages aux tissus sains, situés autour de la tumeur. En effet, l’irradiation des tissus sains de la zone pelvienne entraîne de nombreux effets toxiques au niveau de certains organes tels que le côlon, le rectum ou l’intestin grêle dits « organes radiosensibles » du fait d’une forte capacité d’auto-renouvèlement des cellules et aussi d’une forte sensibilité aux rayonnements ionisants. La toxicité radio-induite du tissu intestinal peut entrainer chez certains patients des séquelles à long terme, altérer fortement la qualité de vie du patient voire même dans les cas les plus sévères engager son pronostic vital. L’ensemble et la complexité des séquelles induites suite à une radiothérapie pelvienne ont amené à la définition d’une nouvelle maladie, la « Pelvic Radiation Disease » ou PRD. Le nombre de patients survivants au traitement d’un premier cancer et leur durée de vie augmentent grâce aux progrès de la médecine. L’augmentation de cette survie est associée à une augmentation du risque de complications. Une prise en charge globale du traitement du cancer intégrant le suivi des patients à long terme (> 20ans) est donc indispensable. De plus, réduire les risques de séquelles du traitement du cancer dans leur globalité et améliorer la qualité de vie des patients est un objectif du troisième plan cancer 2014-2019. À ce jour, la complexité physiopathologique de la PRD encore mal décrite, associée au contexte septique intestinal, limite l’efficacité des thérapies disponibles ainsi que la mise en place de nouvelles thérapies efficaces et pérennes. L’arsenal thérapeutique disponible pour le traitement des complications des radiothérapies est insuffisant. Ce projet, utilisant des techniques d’exploration innovantes (études scRNAseq, transcriptomique spatiale), permettra d’améliorer les connaissances sur l’effet des irradiations sur le tissu colique et intestinal et de déterminer des nouvelles voies de traitement ciblant des interactions cellules/cellules.
Procédures
Selon les modalités d’irradiation, les animaux seront anesthésiés pour être irradié localement au niveau de l’abdomen (durée max de 10 min) ou ils subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie afin d’irradier une partie de l’intestin grêle (durée max de 30 min).
Impact sur les animaux
Suite à l’irradiation locale du colon, les souris vont avoir une dépilation au niveau de l’abdomen (zone irradiée). A cette dose, les animaux ne perdent pas de poids. Les animaux sont observés tous les jours. Les animaux présentant une perte de poids trop importante seront euthanasiés. Dans le modèle d’irradiation localisée de l’intestin grêle après chirurgie, la douleur des animaux sera gérée par des injections d’anti-douleurs et un suivi très poussé. Ce modèle entraine un taux de mortalité de 50 % chez les animaux irradiés (pas de mortalité chez les animaux contrôles avec chirurgie seule.)
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.
Remplacement
Le développement des séquelles coliques et intestinales nécessite l’interaction entre différents compartiments tissulaires (vasculaire, stromal, inflammatoire et épithélial), conditions retrouvées chez le modèle animal intégré. A ce jour, il n’existe pas d’alternative au modèle animal pour étudier les processus physiopathologiques des séquelles des radiothérapies pelviennes
Réduction
Les modèles d’expérimentation pour l’étude tardive des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Dans le but d’effectuer des tests statistiques paramétriques sur les analyses histologiques, cellulaires et moléculaires des groupes de 10 à 20 animaux sont nécessaires en fonction du modèle et des mesures réalisées. Des tests statistiques seront réalisés afin de comparer tous les groupes entre eux.
Raffinement
Différentes mesures spécifiques sont prises pour réduire au maximum l’impact sur le bien-être des animaux - Diminution de la dose d’irradiation à la dose nécessaire et suffisante pour obtenir les atteintes souhaitées. - Anesthésie pour les irradiations - Analgésie per et post-opératoire le cas échéant - Suivi du comportement et de leur aspect physique (aspect du poil, mobilité, prostration, pesée)
Choix des espèces
Les modèles d’irradiation chez la souris permettent de reproduire des lésions colorectales et intestinales similaires à celles que l’on peut observer chez des patients ayant des séquelles graves des radiothérapies pelviennes. De nombreux outils pour les études moléculaires sont disponibles chez la souris. Pour reproduire la pathologie humaine, des animaux au stade jeune adulte sont utilisés (8-10 semaines). L’objectif est de modéliser les lésions chez l’animal, histologiquement proche de celles observée chez l’homme mais de faire une relation directe souris/homme. Pour reproduire la pathologie humaine, des animaux au stade jeune adulte (8-10 semaines). L’objectif est de modéliser les lésions chez l’animal, histologiquement proche de celles observée chez l’homme mais de faire une relation directe souris/homme.
Evaluation de thérapies cancéreuses sur des modèles de tumeurs greffées en sous cutané
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 7000
45 000 souris et 5 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère, la plupart tués à l'issue et environ 2 000 réutilisés. Ce projet de prestation prévoit 10 000 animaux par an sur 200 études, avec greffe de tumeurs sous la peau et administration de composés par de multiples voies, dont certaines sous anesthésie et chirurgie. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer nécroses, cachexie et perte de poids, et que les animaux ayant subi peu d'actes sont réutilisés pour entraîner les équipes à de nouveaux gestes. Il affirme que les méthodes alternatives ne prédisent pas l'efficacité in vivo et reconnaît que les reconstructions d'organes en 3D restent "marginales" dans sa pratique.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible de la pathologie cancéreuse humaine afin de pouvoir évaluer de nouveaux médicaments pour traiter le cancer chez l’homme. Pour cela, nous étudierons de nouveaux médicaments dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme. Cela permettra d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Nous nous focaliserons sur des modèles de cancer en sous cutané, dans la graisse mammaire ou en intradermique. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possible afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
Afin d’évaluer l’efficacité antitumorale et la tolérabilité de potentiels traitements anticancéreux, des tumeurs sous cutanées ou intradermiques ou dans la graisse mammaire seront induites par injection de suspension de cellules ou greffe de fragment (sous anesthésie générale avec analgésie,
Impact sur les animaux
- Trois types de greffes pourront être faites : Sous cutanée, intradermique et graisse mammaire sous anesthésie générale, et avec analgésie pour l’intradermique et fragment de tumeur en SC (incision chirurgicale de la peau). - L’évolution tumorale entrainera une distension de la peau qui peut engendrer une douleur légère ou une gêne dans la mobilité. - Il est possible que des nécroses apparaissent. La tumeur n’étant pas innervée, seules les plaies en surface peuvent engendrer une douleur. - La progression tumorale peut parfois entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. - Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de composés dans différents schémas d’administration, par voie topique, intradermique (avec analgésie), sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire (avec analgésie), orale, intrapéritonéale, intratumorale, les traitements pourront induire un stress léger. - Des effets secondaires des composés pourraient être observés, leur observation constituant le paramètre d’intérêt dans le cas des études de tolérance (procédure 3). - Si les animaux sont irradiés le délai d’acclimatation pourra être de 48h . - Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress de 1 à 2 jours. - - Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation.
Devenir
Les animaux seront en général mis à mort afin de prélever de grands quantités de sang ainsi que les organes et tumeurs pour analyse et évaluation de l’efficacité des traitements et / ou de leur toxicité éventuelle. Toutefois, les animaux ayant subi peu d’actes (sévérité modérée ou légère, animaux exclus de la randomisation etc) pourront être réutilisés pour former les équipes à de nouveaux gestes.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales. Des tests sont effectués dans la mesure du possible sur cultures cellulaires et sur prélèvements de tumeurs de patients.
Réduction
Les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le volume tumoral et/ou le poids). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traité et/ou traité avec le véhicule, et un groupe avec tumeur traité avec le composé à tester. Dans la mesure du possible, le maximum de composés seront testés au cours de la même étude afin de ne pas démultiplier les animaux contrôles. Le nombre d’animaux implantés est déterminé sur la base de la prise et de l’évolution tumorale de chaque lignée tumorale grâce aux précédentes études. Il ne sera pas prévu plus de 10% d’animaux résidus non inclus dans un groupe après randomisation. Dans le cas des études d’efficacité, le nombre d’animaux par groupe est choisi sur la base des précédentes études (6 à 15 animaux) afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Les comparaisons statistiques sont effectuées à l’aide du test ANOVA. Dans le cas des études de biodistribution tolérance sur animaux porteurs de tumeurs, dans la mesure du possible , le premier traitement des différents groupes sera décalé d’au minimum 24h, avec lancement initialement du groupe à la plus faible dose. Si 20% ou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite, il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure.. Le nombre minimum permettant de déterminer la MTD et la pharmacocinétique a été identifié : 3 à 5 animaux par groupe seront utilisés. Ce nombre pourra augmenter jusqu’à 10 en cas de variabilité du modèle. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux par groupe. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Les analyses statistiques à réaliser sur les autres paramètres mesurés en cours d’étude seront effectuées au moyen du test ANOVA. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.
Raffinement
Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine et recevront des soins (réhydratation, eau gélifiée et nourriture au fond des cages) adaptés à leur niveau de perte de poids. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus. Les actes douloureux (greffe de tumeur ou de cellules cancéreuses, chirurgies) seront réalisés sous anesthésie profonde avec analgésie forte. Les actes moins stressants (autres administrations et prélèvements de sang et d’urine) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible. Les administrations douloureuses seront réalisées avec analgésie. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation et un traitement est si possible mis en place. Par exemple, en cas de douleur constatée, le vétérinaire prescrira un traitement antalgique. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction de pathologie cancéreuse et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. En cas de toxicité sur l’animal et afin de limiter la souffrance des animaux une procédure sous forme d’un arbre décisionnel validée par la SBEA sera suivi par l’équipe.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines minimum).
Etude des cibles du facteur de transcription NFAT5 impliquées dans le développement métastatique des mélanomes.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées, elles reçoivent une injection de cellules de mélanome dans l'oreille, un suivi par imagerie sous anesthésie une à deux fois par semaine pendant au moins six semaines, et parfois l'ablation chirurgicale de la tumeur, pour étudier la formation des métastases. Le porteur indique que la tumeur de l'oreille occasionne une gêne et que l'apparition de métastases est invalidante. Il affirme que le comportement tumoral ne peut être appréhendé que sur un animal vivant "entier" et que seule la souris immunodéprimée permet l'implantation de cellules humaines.
Objectifs
Le mélanome cutané est une tumeur maligne issue de la transformation des cellules responsables de la couleur de la peau appelées mélanocytes. Ces dix dernières années, le développement de nouvelles thérapies a permis d’augmenter la survie des patients. Cependant, ce cancer est parmi les plus agressifs du fait de sa forte capacité à produire des métastases (cellules disséminées formant des tumeurs secondaires dans d’autres organes) qui sont responsables de la majorité des échecs thérapeutiques et de la mort des patients. Nous avons pu identifier une liste de 21 gènes cibles potentiels pouvant jouer un rôle dans l’émergence des métastases. Nous avons ensuite confirmé et validé 10 cibles grâce à des expériences in vitro et des études sur des prélèvements de patients atteints de mélanomes. Nous souhaitons maintenant confirmer nos résultats en étudiant les effets des modifications d’expression de ces cibles validées sur la formation des métastases in vivo chez la souris. Nous avons choisi le modèle souris pour ce projet car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des métastases du mélanome.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de valider de nouvelle cible thérapeutique. Cela permet donc d’envisager de nouvelles perspectives thérapeutiques pour limiter la progression tumorale chez les patients ayant un mélanome avancé (stade 2 à 4) mais n’ayant pas de métastases détectables au moment de l’exérèse de la tumeur primaire. En effet, chez la plupart de ces patients, les métastases ne sont détectables que plusieurs années après la chirurgie. Outre les retombées médicales envisageables, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de la progression tumorale des mélanomes cutanés.
Procédures
Injection en sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie locale, au niveau de l'oreille: une injection, durée 30 secondes. Séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse, durée maximale 20 min, 1 à deux fois par semaine pendant au moins 6 semaines. Procédure chirurgicale d'ablation de la tumeur au niveau de l'oreille (si la tumeur atteint une taille trop importante avant l'appartion des métastases, qui sont l'objet d'étude du projet) sous anesthésie gazeuse, une seule fois, durée maximale 30 min.
Impact sur les animaux
La tumeur située dans l'oreille de la souris peut occasionner une gêne. L'apparition de métastases est invalidante et peut entrainer des contraintes
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car ils développeront tous potentiellement des tumeurs et des métastases.
Remplacement
Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des métastases du mélanome dans les organes distants. Nous avons cependant valider nos résultats par différentes techniques in vitro avant de passer à l'in vivo. Nous utiliserons des souris immunodéficientes qui permettent l'implantation de cellules humaines.
Réduction
Nous avons pu identifier une liste de 21 cibles potentielles d'un gène pouvant jouer un rôle dans l’émergence de métastases dans le mélanome (tumeur dermatologique très agressive et très courante), grâce à des expériences in vitro et des études sur des prélèvements de patients atteints de mélanomes, nous avons reduit ce nombre à 10 . Enfin, le nombre d'animaux a été réduit au minimum et déterminé grâce à une étude statistique permettant une interprétation précise et significative des résultats obtenu ainsi qu'en regroupant les expériences: un groupe témoins pour au moins 2 groupes d'intérêt. Les techniques d'injection des cellules ont été très standardisées pour assurer la reproductivité des résultats.
Raffinement
Pour respecter les exigences de raffinement, les animaux sont observés tous les jours par les membres responsables du projet, tout comportement anormal sera évalué selon la grille de score de douleur établie et les points limites seront strictement appliqués. De plus, les animaux sont observés et pesés deux à trois fois par semaine par les expérimentateurs confirmés responsables du projet. Si une perte de poids d'environ 10% par rapport au poids initial est observé, un aliment complémentaire riche et appétent sera ajouté dans la cage. Les souris seront anesthésiées (anesthésie locale ou générale, suivant les gestes)lors des différentes procédures.. Si un signe de douleur est observé (prostration, agressivité), un analgésique sera administré et un enrichissement supplémentaire ou différent sera ajouté dans la cage.
Choix des espèces
La souris immunodéficiente sélectionnée est la seule qui permet l'implantation de tumeurs humaines de mélanome avec une efficacité de prise de 70%. Vu la population de patients, les souris seront utilisées à maturité sexuelle, adultes.
Etudes sur des modèles murins de cancer, d’une nouvelle stratégie de vaccination anti-tumorale utilisant des nanoparticules dérivées de virus de plantes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
3 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections d'une nanoparticule dérivée d'un virus de plante puis des cellules tumorales, avec jusqu'à six anesthésies et cinq prélèvements sanguins, pour développer des tumeurs cutanées ou des métastases pulmonaires. Le porteur indique que la croissance des métastases peut provoquer des difficultés respiratoires et la mort par congestion pulmonaire, et que les tumeurs cutanées peuvent nécroser, s'ulcérer et saigner. Il conclut qu'aucun autre système que l'animal ne reproduit la complexité des interactions entre système immunitaire et tumeur, jugeant le recours à un "organisme animal" nécessaire.
Objectifs
Les thérapies antitumorales qui existent aujourd’hui (chimiothérapie, immunothérapies…) permettent certes d’éradiquer certaines tumeurs mais d’autres restent résistantes. C’est pourquoi la recherche de nouvelles thérapies, à utiliser seules ou en combinaison avec celles déjà existantes, se poursuit. Dans l’organisme, il existe des cellules immunitaires qui, tels des chefs d’orchestre, sont capables après reconnaissance d’un fragment de tumeur, d’induire une réaction immunitaire qui détruit les cellules tumorales sans affecter les autres cellules. Afin de déclencher, chez le patient, une réaction immunitaire spécifique et efficace, des composés thérapeutiques innovants qui adressent une fraction de tumeur à ces cellules immunitaires d’intérêt sont développés. Les nanoparticules sont des objets de petite taille (10-100 nm) et de composition variable (protéines, lipides…) qui peuvent pendant ou après leur synthèse être modifiés pour enfermer ou exposer différentes molécules d’intérêt (par exemple une molécule de ciblage et un agent thérapeutique). Elles suscitent donc un grand intérêt pour ce genre d’applications. Ce projet vise à étudier le potentiel antitumoral d’une nouvelle particule thérapeutique dérivée d’un virus de plantes que nous avons produite. Celle-ci est non-toxique et particulièrement innovante car très adaptable, en effet, le fragment tumoral qu’elle renferme peut être facilement changé afin de déclencher une réponse très spécifique de la tumeur à détruire. Dans ce projet, nous souhaitons étudier chez la souris si cette nanoparticule est capable d’empêcher l’émergence de nouvelles tumeurs et/ou de réduire la taille de tumeurs installées. Nous étudierons l’effets des nanoparticules sur des métastases pulmonaires et sur deux tumeurs cutanées de types différents. Ainsi, nous souhaitons étudier si cette nanoparticule peut avoir des applications en thérapie anti-cancéreuse pour de multiples cancers.
Bénéfices attendus
La nouvelle nanoparticule utilisée dans cette étude pour de la vaccination anti-tumorale constitue une innovation intéressante qui pourrait enrichir les stratégies existantes pour lutter contre le cancer. En effet, si aujourd’hui les nouvelles immunothérapies ont certes permis d’améliorer la rémission de certains patients, d’autres demeurent résistants à ces composés. Pour ceux-ci, utiliser des nanoparticules innovantes seules ou en combinaison avec d’autres composés thérapeutiques déjà existants pourrait constituer une alternative thérapeutique. Par ailleurs, la nanoparticule utilisée dans cette étude peut-être facilement modifiée pour s’adapter au mieux à différentes pathologie tumorales, ce qui est un atout certain. A terme, des particules intégrant un (ou plusieurs) autre(s) fragment(s) tumoral(aux) d’intérêt pourraient être développées. Après des études précliniques et cliniques, elles pourraient, chez l’Homme, compléter les traitements existants pour lutter contre le cancer.
Procédures
Au cours de l’expérimentation, les animaux seront soumis à plusieurs gestes techniques. En effet, ils recevront une ou trois injections de nanoparticules espacées de 5 jours par voie intradermique dans l’oreille ou par voie sous-cutanée dans le flanc. 3 à 8 jours après ou avant ces injections, selon la procédure, les animaux recevront par ailleurs une injection de cellules tumorales soit par voie intraveineuses (modèle métastases) soit par voie sous-cutanée dans le flanc (modèle tumeur solide). Par ailleurs, au cours de la procédure jusqu’à 5 prélèvements sanguins seront effectués. Ils seront d’un volume adapté à leur fréquence pour laisser le temps à l’organisme de l’animal de régénérer tout son volume sanguin avant le prélèvement suivant. Ces trois types d’intervention seront tous réalisés sous anesthésie générale gazeuse (complétée avec un anesthésiant local pour les injections intraveineuses). Les animaux subiront au total au plus 6 anesthésies générales espacées d’au moins 3 jours. Chaque anesthésie durera environ 10-15 minutes.
Impact sur les animaux
Les impacts cliniques prévus sur les animaux inclus dans cette étude sont décrits ci-dessous. Les injections de nanoparticules peuvent localement au niveau du site d’injection (oreille ou flanc) provoquer un une réaction inflammatoire locale courte et de faible amplitude qui pourrait causer une souffrance limitée (démangeaisons, rougeur cutanée, croûte) pour l’animal pendant au plus 2 jours. Dans de très rares cas, une infection pourrait survenir au niveau du site d’injection. La non-toxicité des nanoparticules a été vérifiée en amont ainsi, en elles mêmes, les nanoparticules injectées ne seront pas sources d’effets indésirables elles pourraient en revanche avoir un effet bénéfique sur la croissance tumorale et donc réduire les nuisances associées. Les injections de cellules tumorales (flanc ou voie intraveineuse peuvent être sources d’inconfort/gêne locale. Dans le modèle des métastases, la croissance des foyers métastatiques sur les poumons des souris peut provoquer des difficultés respiratoires et conduire à terme à la mort de l’animal par congestion pulmonaire. Dans les modèles cutanés de tumeurs solides la croissance tumorale peut être source de douleur. Si la tumeur atteint une taille trop élevée, elle peut nécroser en son centre, ulcérer et/ou saigner. En outre, en plus des répercussions liées à la localisation des cellules tumorales, des nuisances systémiques peuvent apparaître : le comportement et les capacités locomotrices des animaux peuvent être affectés. Les prélèvements sanguins répétés (au plus 5) seront suffisamment espacés et d’un volume adapté pour laisser au temps à l’organisme de l’animal de regénérer son volume sanguin entre deux prélèvements. Ainsi les animaux ne devraient que très légèrement être affaiblis par la réduction transitoire de leur volume sanguin. Après le prélèvement, au niveau du point de prélèvement du sang, une croûte pourrait se former et démanger l’animal, cette dernière devrait se résorber rapidement. Enfin toutes les manipulations répétées des animaux préalables aux injections et aux prélèvements sanguins peuvent être sources de stress. Pour limiter le stress et la douleur occasionnés par les injections et les prélèvements sanguins, les animaux seront placés sous anesthésie générale gazeuse parfois complétée avec une anesthésie locale au niveau du site d’injection. Les animaux seront toujours manipulés par du personnel compétent, habitué et sensibilisé au bien-être animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en vue de récupérer différents organes. Leur analyse permettra de conclure quant aux effets de la vaccination avec des nanoparticules sur la croissance des tumeurs.
Remplacement
Lors d’études préliminaires in vitro nous avons confirmé la non-toxicité des nanoparticules et avons obtenu des résultats très encourageants qui démontrent que les nanoparticules étudiées ici sont capable d’adresser spécifiquement une molécule bioactive aux cellules ciblées capables ensuite in vitro d’être fonctionnelles. Nous avons également, chez des animaux non porteurs de tumeurs, montré in vivo que les nanoparticules sont capables d’activer le système immunitaire. Ici nous souhaitons étudier son potentiel effet anti-tumoral à empêcher la croissance tumorale voire à conduire à son éradication complète. Si la nanoparticule a un effet celui-ci sera la conséquence d’une activation de différentes mécanismes complexes du système immunitaire conduisant à la mise en place d’une réponse immunitaire spécifique de la tumeur et à la suppression spécifique des cellules tumorales. ll n’existe actuellement pas d’autre système que le modèle animal pour reproduire fidèlement la complexité des interactions entre cellules immunitaires et cellules tumorales. Ainsi le recours à un organisme animal est nécessaire.
Réduction
Nos premières études in vivo (décrites dans une autre demande APAFIS déjà autorisée) indiquent que l’injection dans les oreilles des particules induit chez la souris la mise en place d’une réponse immunitaire efficace. Nous n’avons pas encore étudié l’injection dans le flanc (études également autorisées dans une précédente demande) si celle-ci s’avère inefficace, nous nous limiterons, à l’étude de l’effet antitumoral des particules par la seule voie intradermique (oreille), réduisant alors le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total de souris utilisées dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Il est prévu de réaliser chaque expérimentation 4 fois afin de s’assurer que les effets observés soient constants et reproductibles d’une expérimentation à l’autre. Pour chaque condition testée, 3 animaux seront inclus par expérimentations pour atteindre au plus 12 souris par groupe. Si dès la troisième répétition d’expérience (effectif de 9 animaux) des effets sont mis en évidence par les tests statistiques alors nous ne réaliserons pas la quatrième répétition, ce qui réduira le nombre d’animaux utilisés. Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adéquats qui permettront de mettre en évidence des éventuels bénéfices du traitement avec la nanoparticule sur la mise en place des tumeurs chez les souris.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes dans des cages enrichies avec l’ajout de nids et de bâtons à ronger. Les animaux seront surveillés et manipulés par des personnes compétentes et formées au bien-être animal. Quotidiennement, leur état général sera surveillé visuellement afin de déterminer l’éventuelle présence de signes de stress ou de souffrance (attitude prostrée, dos voûté, démarche anormale, …). Après l’injection des cellules tumorales, 3 fois par semaine, les animaux seront pesés et la taille des tumeurs cutanées sera mesurée. Par ailleurs, le nombre de cellules tumorales injectées a été choisi en accord avec les données de la littérature comme permettant l’induction de tumeurs dont la temporalité de croissance est bien connue ce qui nous a permis de définir des points limites ou une fin de protocole en amont d’une souffrance animale trop élevée. En cas d’atteinte d’un des points limites l’arrêt anticipé de l’expérimentation sera alors décidé. Les injections (intradermiques, intraveineuses, sous-cutanées) et les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress des animaux. Par ailleurs, dans le cas des injections par voie intraveineuse l’anesthésie générale sera complétée d’une anesthésie locale au niveau du site d’injection.
Choix des espèces
Les souris (Mus musculus) sont des mammifères dont le système immunitaire est très proche du système immunitaire humain tant du point de vue des caractéristiques des cellules immunitaires que des mécanismes globaux. En particulier, la type de cellules que nous souhaitons cibler avec notre nanoparticule dans cette étude est décrite avec des caractéristiques proches chez l’homme et chez la souris. Ainsi, pour nos études précliniques, la souris est un modèle de choix. Il existe des procédures bien décrites dans la littérature qui permettent de mettre en place chez la souris des modèles de métastases ou de tumeurs solides afin d’étudier une nouvelle particule thérapeutique et de suivre ses éventuels effets bénéfiques sur les tumeurs. Nous utiliserons des souris femelles adultes jeunes (2 à 3 mois) qui possèdent un système immunitaire mature et fonctionnel.
Rôle dans la douleur d’un gène identifié in vitro par criblage génétique sur des neurones sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans la patte des injections d'agents pro-inflammatoires comme l'adjuvant complet de Freund ou la formaline, puis leur douleur est mesurée par l'observation des léchages, morsures et secouements pendant quatre-vingt-dix minutes, et par le test des filaments de von Frey. Le porteur décrit ces modèles de douleur comme des standards de la littérature et indique vouloir confirmer in vivo le rôle d'un gène repéré sur des neurones en culture. Les retombées annoncées, des traitements contre les douleurs mécaniques de l'arthrose ou de la polyarthrite, restent une perspective.
Objectifs
Notre projet a pour but d’identifier des acteurs moléculaires impliqués dans la sensibilité mécanique douloureuse afin de définir de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les désordres liés à la perception exagérée des douleurs d’origine mécanique. Nous avons identifié des gènes candidats impliqués dans la transduction mécanique, i.e. la conversion des stimulations mécaniques en signaux biologiques, dans les neurones sensoriels dont font partie les neurones nociceptifs impliqués dans la douleur. Nous avons ensuite testé ces candidats in vitro et identifié un gène dont l'inhibition diminue significativement les réponses des neurones nociceptifs aux stimulations mécaniques. Nous voulons confirmer ces résultats in vivo en testant l’impact de ce gène sur la perception de la douleur par la réalisation de tests comportementaux. Ces tests seront réalisés en conditions inflammatoires (induites par injection d’adjuvent complet de Freund (CFA) ou de Formaline), qui sont des modèles de douleur établis dans la littérature scientifique, sur des souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Cette étude pourrait être à l’origine du développement de traitement ciblant des types de douleurs mécaniques qui interviennent dans de multiples maladies et syndromes chroniques ou inflammatoires, telles que la polyarthrite rhumatoïde ou l’arthrose qui touche 10 millions de français.
Procédures
Les animaux recevront des injections d'agents proinflamatoires dans la patte ou dans la zone tibio-tarsale. Les animaux ayant reçu une injection dans la patte seront ensuite placés en box d’observation afin de mesurer la durée de comportements douloureux spontanés (léchage, morsure, secouements de la patte) sur une durée maximum de 90 minutes. Les animaux ayant reçu une injection dans la zone tibio-tarsale seront testés avec des fialments de von Frey aux jours 7, 10 et 21 post-injection afin de determiner leur sensibilité mécanique. Le test dure environ 15 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les modèles inflammatoires utilisés dans ce projet constituent les standards de ce type d'étude et sont très bien établis dans la littérature. Ils produisent des phénotypes de douleur légère ou modérée chez l'animal, ce qui est l'objectif du projet de tester l'implication du gène cible dans la douleur. Les procédures de test comportemental (box d'observation ou test de sensibilité mécanique) peuvent induire un stress limité chez l'animal, qui sera minimisé par les temps d'acclimatation.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés car ne pouvant plus servir dans de nouvelles procédures. Un certain nombre d'animaux seront utilisés pour le prélèvement des ganglions rachidiens (DRG) pour l'enregistrement électrophysiologique in vitro.
Remplacement
La sensibilité / douleur mécanique et thermique ne peuvent s'évaluer in fine que sur des animaux vivants. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit donc dans la continuité de nos expériences et des résultats que nous avons obtenus in vitro.
Réduction
Réduction du nombre d’animaux sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats. Le nombre d’animaux utilisés pour cette étude est paramétré afin de pouvoir effectuer des tests statistiques afin d’observer des différences significatives sur les paramètres étudiés. Lors de la réalisation des protocoles, le maximum d’informations sera récolté afin de restreindre le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Raffinement : le nombre de souris par cage respectera les directives européennes du 1er février 2013, sachant que le projet utilise de jeunes adultes entre 20 et 25g, nécessitant 70 cm2 par individus dans les cages, soit 5 animaux par cage de 374 cm2. Une définition précise des points limites et une surveillance adaptée des animaux permettra d’éviter la souffrance des animaux. Ils permettront de définir la nécessité d’un traitement symptomatique (analgésique, modification du protocole expérimental). Les expériences de comportement ont été choisies afin de limiter au maximum la contention de l’animal (animal libre de ses mouvements), et l’environnement des animaux sera enrichi avec des dômes en cartonainsi que des nids de papier kraft (sizzle pad).
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle souris, du fait de l'existence de souris transgéniques dont le gène d'intérêt a été éteint (souris KO), et pour lequel les tests comportementaux évaluant la perception à la douleur d’origine mécanique et thermique sont établis et documentés dans la littérature scientifique. Nous pourrons ainsi déterminer l’effet spécifique de ces gènes dans la sensibilité mécanique et thermique dans des modèles de douleur. Les souris qui seront utilisées dans ce projet seront âgées de 6 à 8 semaines ce qui correspond à un stade jeune adulte. Les souris ont ainsi fini leur croissance et présentent une sensibilité mécanique et thermique assez stable entre 6 et 8 semaines.
Evaluation de l’effet d’une supplémentation alimentaire en poudre de tomate sur le métabolisme, l’inflammation et la résistance à l’insuline dans le modèle d’obésité induite par l’alimentation chez la souris mâle et femelle.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime riche en graisse, elles reçoivent huit poudres de tomate différentes pendant douze semaines, avec prélèvements sanguins sur animal éveillé, tests de tolérance au glucose et à l'insuline, perçage des oreilles et isolements répétés. Le porteur décrit un objectif appliqué, améliorer les effets santé de la tomate en combinant choix de variétés, pratiques de culture et technologie alimentaire. Il affirme que l'étude d'une supplémentation alimentaire ne peut s'envisager que sur un modèle vivant.
Objectifs
La tomate est une des productions agricoles les plus importantes en termes de volume de production et de portée économique. Sa consommation, notamment sous forme de poudre de tomate, est associée à des effets bénéfiques pour la santé métabolique, mais son profil nutritionnel et sa teneur en micronutriments dépend du génotype et des conditions de production. L’objectif du projet est de mieux comprendre l’impact du génotype de tomate et du déficit d’irrigation sur la qualité nutritionnelle des poudres de fruit et les conséquences que cela va engendrer en terme de santé métabolique chez la souris. Pour ce faire, 4 génotypes de tomate ayant subit 2 niveaux d'irrigation et présentant des profils contrastés en phytomicronutriments seront lyophilisés (8 poudres différentes en tout) puis administrés à 180 souris C57Bl/6J (8 groupes de 9 souris mâles et 9 souris femelles supplémentés et 2 groupes de 18 souris contrôles) durant 12 semaines, dans le cadre d'un régime riche en graisse. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9eme semaine et un test de tolérance au glucose ainsi qu'un test de perméabilité intestinale à la 10eme semaine. Les fèces seront également récoltés et le microbiote des animaux sera analysé.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux évaluer l’impact du génotype et des conditions de culture de poudre de tomate sur les effets sur la santé métabolique. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer les effets santé de la tomate avec une combinaison innovante du choix de génotypes, de pratiques culturales et de technologie alimentaire.
Procédures
Des prélèvements de sang sur un animal vigile seront réalisés. Pour ce faire, les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués. Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en isolement des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur glycémie. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé. Lors de la procédure, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.
Impact sur les animaux
Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères. Douleurs possibles lors des interventions de prélèvements sanguins, de perçage des oreilles pour l'identification des animaux lors des injections d'insuline. Ces nuisances ou effets indésirables toutes temporaires et réversibles sont associés à des mesures de raffinement (enrichissement de la cage, manipulation régulière des animaux, soins apportés si nécessité).
Devenir
Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de tomate.
Remplacement
L’étude d’une supplémentation en poudre de tomate sur la santé métabolique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Les souris C57Bl/6J sont un modèle largement utilisé et reconnu pour les études sur le métabolisme.
Réduction
Le nombre d'animaux (18 par groupe, soit 9 par sexe) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes de manière sexe-dépendante, notamment en ce qui concerne la prise de poids. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé sur la base d’une étude similaire sexe-dépendante et déterminée avec la variation du poids (variable quantitative) comme résultat principal de l’étude.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt.
Choix des espèces
Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.
Comprendre et cibler l’épitranscriptome de l’îlot pancréatique pour restaurer la sécrétion d’insuline dans le diabète de type 2.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Elles subissent des injections intrapéritonéales de glucose et d'insuline, des gavages, un séjour en cage métabolique et des injections répétées de deux inhibiteurs, le brequinar et le bisantrène, pour étudier une enzyme liée à la sécrétion d'insuline dans le diabète de type 2. Le porteur indique que ces molécules sont cytotoxiques in vitro et qu'elles ont provoqué chez l'humain des effets toxiques sur le sang et le foie, les souris étant surveillées et euthanasiées si elles perdent 20 % de leur poids. Il conclut que les lignées cellulaires ne permettent pas d'étudier la communication entre organes, ce qui justifierait le modèle in vivo.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer, in vivo, le rôle de la déméthylase FTO dans la fonction et l’identité des cellules bêta au sein des îlots pancréatiques mais égalment dans d'autres organes métaboliques. Pour cela nous injecterons dans différents modèles de souris des inhibiteurs pharmacologiques de cette enzyme, le bisantrene et le brequinar puis nous étudierons leurs différents effets au niveau transcriptionnel et métabolique. Des modèles génétiques d'invalidation du gène codant l'enzyme seront également utilisés pour les différents tissus (cellules bêta et alpha pancréatiques, foie, tissus adipeux)
Bénéfices attendus
Des données préliminaires réalisées au sein du laboratoire sur des lignées cellulaires bêta pancréatiques montrent que l’inhibition de la déméthylase FTO (par siRNA ou inhibiteurs pharmacologiques) améliore l’expression des gènes de l’identité et de la fonction de la cellule bêta pancréatique, associé à une augmentation de la sécrétion d’insuline. Ainsi les résultats obtenus au cours du projet pourraient nous permettre d’identifier in vivo de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de conserver la masse des cellules bêta pancréatiques et/ou d'améliorer la sécrétion d’insuline au cours du diabète de type 2.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - une prise de poids régulière 2 fois par semaines au maximum. - suivi en cage métabolique (durée 1 semaine) - des injections intrapéritonéales de glucose, pyruvate ou insuline (6 fois pour chaque individu, en cours et fin de protocoles, chaque expérimentations étant espacées d'une semaine minimum, durée 4 heures) - des gavages de glucose (3 fois pour chaque individu, en cours et fin de protocoles, durée 4 heures) - des injections intrapéritonéales de molécule pharmacologiques (1 fois par jour pour chaque individu, pendant 5 à 20 jours, durée 1 heures), avec changement de site d'injection entre chaque injection
Impact sur les animaux
Les différents protocole pourront engendrer un stress chez les animaux suite aux diverses manipulations ainsi que des douleurs légères. Seuls l'effet du brequinar et du bisantrene, encore peu connu chez la souris, est susceptible d'induire des douleurs modérée chez les animaux et/ou des variations de comportements. Toutefois des études in vitro montrent que ces inhibiteurs peuvent être cytotoxiques. Chez l’Homme des essais cliniques pour le traitement de la leucémie ont également montré des effets hématotoxiques et hépatoxiques temporaires. Pour pallier à toutes ces nuisances, les animaux seront manipulés dans des pièces dédiées et calmes, avec une surveillance quotidienne pour détecter le moindre signe de souffrance (blessure, posture ou comportements anormaux, perte de poids importante, etc).
Devenir
Les animaux utilisés étant génétiquement modifiés, aucun des animaux utilisés en fin de protocoles sera maintenu en vie. Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude.
Remplacement
Des expérimentations in vitro, réalisées sur des lignées cellulaires de cellules bêta pancréatiques murines, montrent des résultats très encourageants quand au rôle de la déméthylase FTO et de ses inhibiteurs dans la régulation de l'homéostasie du glucose. Toutefois les modèles de lignées cellulaires sont limités et ne permettent pas d'étudier la communication inter-organe qui peut avoir lieu au cours de la régulation de l'homéostasie du glucose et du diabète de type 2. Ainsi l'utilisation de modèles in vivo, par l'utilisation de souris génétiquement modifiées, et/ou soumises à un régime riche en graisse, permet de reproduire les conditions physiologiques et physiopathologiques afin de mieux comprendre le rôle de la déméthylase FTO dans le développement du diabète de type 2 ou d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Pour définir statistiquement le nombre d'animaux nécessaires, nous avons utilisé une méthode statistique pour réduire au minimum le nombre d'animaux, permettant ainsi de déterminer le nombre exact d'animaux par expérimentation en fonction des paramètres recherchés.
Raffinement
Un suivi quotidien et une observation des animaux sont réalisés par les membres de l'équipe de l'animalerie dans laquelle les animaux sont hébergés. Les membres de l'équipe travaillant sur ce projet suivent également les animaux afin de garantir leur bien-être et minimiser au maximum leurs éventuelles souffrances. L'état général des animaux est évalué tous les jours par des observations quotidennes et pesées hebdomadaires. L’état général des animaux sera évalué par les utilisateurs ainsi le personnel animalier. Les points limites déterminés pour nos protocoles sont : le dos vouté, le poil hérissé, une perte de poids de 20% et la prostration ou l’absence de réaction des animaux. Dans ce cas l’animal sera enregistré au SBEA. Un traitement visant à soulager l’animal pourra être mis en place, le cas échant sans amélioration, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris reste le meilleur modèle permettant d’étudier l’importance d’un gène dans le développement de maladies et d’identifier de nouveaux traitements potentiels. Pour ce projet, nous utiliserons des modèles de souris génétiquement déficientes pour le récepteur de la leptine (souris Db/Db), qui reproduisent la physiopathologie du diabète de type 2 ainsi que les souris contrôles correspondantes. Des souris C57Bl6J soumises à un régime standard ou riche en graisse seront également utilisées dans ce même but. Des souris invalidées dans les cellules alpha ou bêta pancréatiques et dans d'autres tissus pour le gène codant la déméthylase FTO pourront également être utilisées au cours du projet afin de mieux comprendre le rôle de Fto dans les différents organes métaboliques (MipCre Fto-Flox, RipCre Fto-Flox ; GcgCre Fto-Flox ; AdipoQCre Fto-Flox ; AlbCre Fto-Flox). Ces modèles de souris seront associés aux souris contrôles respectives. Les souris C57Bl6/J ou invalidées pour FTO seront utilisées à partir de 5 semaines de développement afin de mettre en place un régime alimentaire riche en graisse de 12 à 24 semaines et induire un phénotype diabétique. Des souris Db/Db de 8 et 16 semaines seront également utilisés pour les injections d'inhibiteurs de FTO (bisantrene ou brequinar). Les souris de 8 semaines permettront d'étudier les effets de l'inhibition de FTO dans des cellules bêta fonctionnelles. Les souris de 16 semaines permettront également d'étudier les effets de l'inhibition de FTO mais dans des cellules bêta ayant une fonction altérée.
Etude du rôle des Neutrophil Extracellular Traps dans la fibrose pulmonaire
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une fibrose pulmonaire leur est provoquée par instillation intranasale de bléomycine sous anesthésie, puis elles reçoivent des injections intrapéritonéales d'inhibiteurs, avant prélèvement des poumons pour analyse. Le porteur indique que la maladie peut entraîner des difficultés respiratoires, des troubles du déplacement et des signes de douleur comme des vocalisations et un dos voûté, les souris étant surveillées et euthanasiées si leur état se dégrade. Sur le remplacement, il affirme avoir développé des cultures in vitro mais conclut qu'elles ne reproduisent pas la complexité de l'organe, ce qui justifierait le recours à la souris.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact des voies de signalisation responsables du recrutement des neutrophiles et de la formation des Neutrophil Extracellular Traps (NETs) dans la fibrose pulmonaire. En effet, nos résultats obtenus in vitro montrent que les neutrophiles et NETs entrainent un environnement fibrotique. Ainsi, nous voulons maintenant confirmer nos résultats chez la souris en utilisant un modèle de fibrose pulmonaire induite par instillation intranasale de Bléomycine. En effet nous nous attendons à une diminution de la fibrose pulmonaire induite par Bléomycine après inhibition du recrutement des neutrophiles et NETs et de leurs sous-effecteurs (que nous avons identifié in vitro).
Bénéfices attendus
Notre étude nécessite l’utilisation d’animaux mais pourrait déboucher sur la mise au point de nouveaux médicaments permettant d’améliorer les traitements pour les patients atteints de fibrose pulmonaire. En effet, il n’y a aucun traitement vraiment efficace de nos jours pour diminuer la fibrose pulmonaire. Nous avons déjà identifié la présence de NETs dans les poumons de souris atteinte de fibrose pulmonaire (induite par bléomycine) ainsi que dans les poumons de patients atteints de fibrose pulmonaire. Cette étude permettra de mettre en évidence les neutrophiles et les NETs comme cibles thérapeutiques permettant de contrecarrer la fibrose pulmonaire.
Procédures
Nous administrerons par instillation nasale de la bléomycine chez les souris C57BL/6 femelles placées sur un tapis chauffant sous anesthésie générale (induction à 5% isoflurane pendant une à deux minutes, et une fois les souris endormies, elles seront instillées nasalement avec de la bléomycine, tout en étant endormi). Les souris seront ensuite replacées dans leurs cages. L’administration des inhibiteurs/anticorps et de leur véhicule commencera 30 minutes avant l’administration de bleomycine, par injection intrapéritonéale et jusqu’à la fin de l’expérience. Chaque injection intrapéritonéale durera environ 30 secondes (le temps de contentioner la souris, de la position, de l'injecter et de la reposer dans sa cage).
Impact sur les animaux
Les signes cliniques attendus des animaux développant une fibrose pulmonaire sont des problèmes de respiration, de déplacements et des signes de douleurs (vocalisation, agressivité). Les effets indésirables définis comme toutes atteintes à une ou plusieurs des 5 libertés fondamentales définissant le bien-être des animaux placés sous la responsabilité de l’être humain, sont les suivantes : - Une altération du déplacement. En effet, les animaux auront des problèmes de respiration causé par la fibrose pulmonaire, ce qui peux entrainer des problèmes de déplacements. - Des signes de douleurs. En effet, la fibrose pulmonaire peut être à l’origine de douleurs (causé par les problèmes de respiration), caractérisées par un comportement agressif de l’animal, des vocalisations, un manque de toilettage ou encore un dos vouté. - Des rougeurs peuvent apparaitre au niveau du site des IP.
Devenir
Les animaux seront mis à mort puis les poumons seront prélevées pour analyse ex vivo. Les critères d’analyses des échantillons utilisés seront l’évaluation 1) de fibrose pulmonaire, par marquage de la matrice extracellulaire en utilisant des techniques d’immunofluorescence ; 2) de la présence de neutrophiles/NETs/macrophages dans les poumons.
Remplacement
Remplacer : Nos recherches ont décrit les cultures in vitro comme une méthode de remplacement pour l’étude de l’activation des macrophages et fibroblastes, qui sont les cellules à l’origine du dépôt accru de matrice extracellulaire responsable de la fibrose. Nous avons déjà développé des modèles in vitro permettant de vérifier le rôle des NETs sur l’activation des macrophages et des fibroblastes et ainsi la mise en place d’un environnement fibrotique. Ces cultures ne récapitulent pas la complexité de l’organe (notamment les relations entre les cellules épithéliales pulmonaire et les cellules immunitaires, dont les neutrophiles), nous avons donc recours aux animaux.
Réduction
Réduire : Le nombre d’animaux est choisi pour détecter toute différence significative sur la fibrose pulmonaire (en quantifiant le collagène par immunofluorescence des poumons) avec un nombre de souris minimum. Les tests statistiques nous permettent d'estimer le nombre de sujet dans chaque groupe à 22. Les résultats obtenus au laboratoire in vitro permettent de réduire le nombre d’animaux. De plus, les résultats déjà publiés avec ce modèle et l’utilisation de ce modèle lors de mon post-doctorat nous permettent de connaitre la cinétique de développement de la maladie. Toutes ces données nous ont permis de générer une analyse statistique prévisionnelle permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Raffinement : Les signes cliniques attendus des animaux développant une fibrose pulmonaire sont des problèmes de respiration, de déplacements et des signes de douleurs. L’administration de bléomycine se fera sur un tapis chauffant, sans incision sous anesthésie générale (induction à 5% isoflurane pendant une minute, et maintien au masque à 2.5% isoflurane d’environ 1 minute, temps nécessaire à l’instillation intranasale de bléomycine). Afin d’évaluer le bien-être animal au mieux et de manière objective, nous avons établi des fiches d’évaluation du bien-être animal adaptées à cette procédure (cf. annexe 1). Cette fiche d’évaluation comprend des points limites qui sont précoces et adaptés. Notamment le poids des animaux et les sites d’injections seront surveillés et un suivi journalier est effectué (notamment lors des injections quotidiennes). De plus, les résultats obtenus avec ce même modèle nous permettent de connaitre la cinétique de développement de la maladie et justifient les procédures proposées.
Choix des espèces
Nous souhaitons étudier le rôle des NETs dans le développement de la fibrose pulmonaire. Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. En outre, le modèle de fibrose pulmonaire induit par instillation intranasale de bléomycine est couramment utilisé par la communauté scientifique. De plus, j’ai déjà utilisé ce modèle lors de mon post-docotrat pour étudier la cinétique de développement de la fibrose pulmonaire, et ce modèle m’a déjà permis d’identifier la présence de NETs dans les poumons des souris atteintes de fibrose pulmonaire induite par bléomycine. Les administrations de bléomycine seront réalisées sur des souris âgées d’au moins 8 semaines ce qui représentent l’âge adulte chez la souris. En effet, nous nous intéressons au développement de fibrose pulmonaire chez l’adulte et non chez l’enfant. Les prélèvements des poumons sur les souris se feront au maximum 28 jours après injection de bléomycine.
Etude des effets préventifs d’une série de composés en développement sur le syndrôme métabolique chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisses
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par une alimentation à 60 % de lipides, elles reçoivent chaque jour pendant douze semaines un composé par voie orale, avec prélèvements sanguins après jeûne et hébergement individuel, pour le compte d'un laboratoire client préparant un médicament contre l'obésité. Le porteur indique que la perte de poids peut devenir une nuisance si elle est trop rapide, et prévoit une mise à mort pour prélever les organes. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier ces régulations métaboliques.
Objectifs
L'obésité dans le monde a plus que triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 1 milliard de personnes obèses aujourd'hui, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Dans ce contexte, notre client souhaite évaluer l'effet des nouveaux composés sur les symptômes liés à l'obésité chez les souris obèses (induites par une alimentation enrichie en graisses). Notre entreprise mènera, pour le compte de notre client, une étude in vivo visant à évaluer les effets des composés clients sur la prise alimentaire, le poids corporel et le métabolisme du glucose chez la souris obèse. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré que ces composés induisent une perte de poids corporel associée à une diminution de prise alimentaire. L’objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l’impact à plus long terme de ces composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris soumises à une alimentation enrichie en graisses (HFD; 60% de l'énergie fournie par les lipides). A termes, ces données seront incluses dans un dossier de demande d'autorisation d'essais cliniques dans le but d'obtenir une autorisation sur le marché d'une nouvelle classe de médicaments visant à traiter les troubles métaboliques.
Bénéfices attendus
Cette étude a pour objectif de constituer un dossier de demande de premier essais cliniques chez l'humain dans le but d'obtenir une autorisation de mise sur le marché d'un composé thérapeutique luttant contre l'obésité et les troubles métaboliques associés.
Procédures
Les animaux seront pesés régulièrement et leur prise alimentaire mesurée. Ces mesures durent environ 2-3 minutes. Des prélèvements sanguins sont prévus après 4 heures de mise à jeun. Les prélèvements en eux même durent environ 3 minutes. Des mesures de composition corporelle non-invasives seront réalisées. Ces mesures sont rapides (
Impact sur les animaux
La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire implique l'hébergement individuel des animaux. Etant donné leur phénotype attendu, les souris seront obèses. Toutefois, la perte de poids induite par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance si celle-ci s'avère trop rapide. D'autre part, des prélèvements sanguins avec mise à jeun préalable de 4h, les administrations quotidiennes per os pendant 12 semaines, les mesures de composition corporelles et le test de tolérance au glucose (avec une mise à jeun de 8h préalable) peuvent être source de nuisance pour les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issu de l'étude afin de collecter des organes d'intérêt. Des analyses biochimiques seront réalisées a posteriori sur ces derniers.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et la régulation glycémique dans les cas de troubles métaboliques. En effet, les paramètres physiologiques impactés impliquent une communication hormonale et nerveuse entre différents organes qui produit des effets au niveau de l'ensemble des cellules de l'organisme et il n'existe pas à l'heure actuelle de modèle non animal capable de reproduire ou de prédire l'impact d'un composé sur ces phénomènes de régulation.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et %), prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire (Gain de poids en g/Prise alimentaire cumulée en g), composition corporelle (mesures de la masse de tissu gras, de la masse de tissu maigre et de la masse de fuides non liés), test de tolérance au glucose (glycémie, insulinémie et aires sous la courbe), glycémie à jeun, insulinémie, HOMA-IR et HOMA-b (résistance à l'insuline et fonction des cellules b du pancréas) et les poids des différents organes. Dans le cadre des groupes expérimentaux obèses, le nombre d'animaux a été fixé à 12/groupe en prenan également en compte l'hétérogénéité du modèle, certains animaux présentant naturellement une résistance à l'induction de l'obésité. Concernant le groupe témoin du modèle d'obésité (Groupe 1, nourri avec la nourriture sandard et traité au véhicule), nous avons réduit le nombre à 10 animaux.
Raffinement
Le modèle animal utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles mais conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos et de matériels de nidification. Concernant les prélèvements sanguins, un anesthésique local sera appliquée sur la queue des souris 30 minutes avant. Avant les mesures de composition corporelle, les animaux seront préalablement habitués au système. Pour les mesures de glycémie, la mise à jeun préalable sera limitée à 4h afin de limiter l'inconfort. Concernant les traitements, ceux ci seront réalisés par des expérimentateurs rodés à geste expérimental en utilisant des canules souples pourvues d'embouts en silicone. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques.
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J nourries avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge de jeune adulte adulte au début des traitements (7 semaines d'âge). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.
Etude du rôle de deux gènes dans le développement du mélanome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales et développent une tumeur au flanc, pour étudier le rôle de deux gènes dans le mélanome. Le porteur indique une mise à mort au plus tard 28 jours après l'injection, ou avant si un point limite est atteint. Il n'utilise que des mâles, ses lignées de mélanome ne se développant pas chez les femelles, et présente la souris comme le modèle le plus proche de la maladie humaine.
Objectifs
Le mélanome malin cutané est la forme la plus agressive des cancers de la peau. Aujourd'hui, le seul traitement efficace reste la chirurgie pratiquée à un stade précoce car une fois disséminées, les cellules de mélanome deviennent résistantes aux chimiothérapies conventionnelles. Les espoirs apportés par l'essor des thérapies ciblées et de l’immunothérapies ont été fortement nuancés par des cas de non-réponse ou rechutes rapides. Il est donc aujourd'hui crucial de comprendre les mécanismes de résistance mis en place par ces cellules cancéreuses. La capacité des cellules tumorales à s’adapter aux traitements anti-cancéreux, est régulée par un ensemble de gènes. Nous avons identifié deux gènes fréquemment altérés dans le mélanome et impliqués dans la capacité d’adaptation de ces cellules. Ce projet a pour but de décrypter l'impact de ces 2 gènes sur le développement des cellules de mélanome chez la souris.
Bénéfices attendus
Malgré l’essor récent des thérapies ciblées et de l’immunothérapie dans le traitement du mélanome, la plupart des patients rechutent avec un mélanome résistant. Identifier de nouveaux acteurs impliqués dans la résistance permettra de mieux comprendre la capacité d’adaptation des cellules de mélanome et de développer de nouvelles approches de combinaison thérapeutique
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection unique en sous-cutanée de cellules tumorales. Ils seront aussi soumis à de la contention.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont l'apparition de tumeur localisée sur le flanc arrière droit. La contention va également leur générer du stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car les souris ne rentreront pas dans un nouveau protocole. Les animaux ayant reçu une injection de lignées tumorales en procédure 2 seront mises à mort au maximum 28 jours après injection, si aucun point limite n'est atteint avant cette date.
Remplacement
Nous avons étudié les effets de la dérégulation de 2 gènes in vitro dans des lignées cellulaires de mélanome. Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier le développement tumoral dans un environnement complexe. En parallèle des analyses complémentaires seront réalisées in vitro dans des lignées de mélanome, et sur des prélèvements tumoraux de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Réduction
Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet (n=272) a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Pour chacune des procédures expérimentales présentées, le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats adaptée selon le cas. De plus, un animal permettra d’obtenir des résultats dans plusieurs expériences (pousse tumorale, analyse histologique de la tumeur). Aussi, en accord avec une autre équipe utilisant la souris génétiquement modifiée étudiée, nous récupèrerons des mâles qui seront déduits du nombre total déclarés dans cette DAP. En échange, nous donnerons des femelles qui permettront également de réduire le nombre de souris de la DAP de l'autre équipe.
Raffinement
Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine. L'environnement sera enrichi avec du coton cardé et des maisonettes. Aussi, le phénotype dommageable des souris ne s'exprime pas dans les conditions ventilées de l'animalerie dans laquelle elles sont hébergées
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études du mélanome car c'est un modèle proche de la pathologie humaine reproduisant les caractéristiques histologiques. Nous disposons également d'outils, d'expériences et de compétences solides pour réaliser cette étude dans les meilleures conditions chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, âge standard pour l'étude du système immunitaire. Nous utiliserons également que des souris mâles, car nous avons remarqué dans des précédentes études que nos lignées de mélanome ne poussaient pas toutes chez des souris femelles. A l'inverse, aucun problème n'était observé chez les mâles.
Etude du remodelage arteriel induit par l’angiotensine
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie, puis une seconde pour une mini-pompe délivrant de l'angiotensine, afin d'étudier le remodelage des artères sous hypertension et le rôle de gènes de la famille PI3K. Le porteur indique des douleurs modérées post-opératoires, minorées par des antalgiques, et une mise à mort pour prélèvement d'organes. Il présente la souris comme la "seule" espèce disposant des modèles génétiquement modifiés utiles et le recours à l'animal comme un "complément indispensable" des études in vitro.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont particulièrement incidentes chez les patients présentant des pathologies sous-jacentes telles que l'hypertension. Un des processus responsable de la grande majorité des accidents vasculaires est l'athérosclérose. L’athérosclérose va se développer dans différentes zones artérielles, obstruer le vaisseau et dans les étapes ultimes de la maladie provoquer des infarctus du myocarde ou des accidents vasculaires cérébraux. Afin de limiter ce risque, la technique d’angioplastie (pose de "stents") a alors été développée afin de rétablir la lumière du vaisseau. Elle consiste en la pose d’un stent actif, délivrant des substances médicamenteuses, dans le vaisseau endommagé. Cet acte chirurgical est associé à un traiement médicamenteux pour prevenir les rechutes en particulier chez les patients hypertendus. Cependant, des phénomènes de résistance à ces molécules ont été observés. Dans ce contexte, notre équipe se propose donc d'étudier le role des genes de la famille des PI3K dans le remodelage arteriel dans un contexte d'hypertension pour ameliorer ces traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence les cibles médicamenteuses pertinentes et efficaces pour lutter contre les complications cardiovasculaires régulièrement retrouvées chez les patients hypertendus.
Procédures
Les animaux seront soumis à une ou deux interventions chirugicales selon les cas. La première intervention chirurgicale pour implanter la puce de télémetrie dure environ 30min. 1 semaine apres la pose de la puce de la télémetrie, les animaux subiront une deuxième chirurgie de 15 min consistant à la pose en sous cutanné d'une mini-pompe.
Impact sur les animaux
Les deux procédures chirurgicales induisent la pose de 3 sites de sutures sur le thorax et 1 à l'arriere de la tête. Ces actes chirugicaux peuvent entrainer des douleurs modérées post-opératoires qui seront minorées par des antalgiques et les risques d'irritations et de demangeaisons seront minorés par utilisation d'antiseptique.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organe.
Remplacement
L'utilisation de ce modèle animal est un complément indispensable des études in vitro sur des lignées de cellules musculaires lisses que nous avons déjà réalisées au laboratoire. En effet, ces approches de culture cellulaire ne permettent pas d’étudier le remodelage artériel et de mesurer le bénéfice de nos cibles thérapeutiques dans un contexte physiopathologique intégrés prenant en compte l'ensemble des réponses cellulaires mise en jeu au sein d'une artère.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est réduit à son maximum en respectant les contraintes de publication, sans compromettre les objectifs du projet et pour permettre de bonne analyses statistiques. Le nombre de souris utilisé est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs et est donc précisé dans chaque procédure en fonction de la variabilité obtenue des protocoles expérimentaux mis en jeu. La télémetrie permet de diminuer le nombre d’animaux enrolés dans ce protocole en augmentant significativement le niveau de fiabilité et de reproductibilité des mesures de tension arterielle.
Raffinement
Quelle que soit la procédure utilisée, une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement. L’état général de l’animal est évalué : prise de nourriture, toilette et mouvements habituels sont considérés comme des signes de bonne santé. La douleur est évaluée par les signes de prostration, de perte d’appétit ou de poids et de mouvements pénibles. L’environnement des animaux est enrichi (bandes de papier Sizzle-Nest pour la nidification, cube de bois pour usure des dents mais pas de tunnel ou d'igloo pour éviter à l'animal de se bloquer avec la pompe alzet), pour éviter l’angoisse et eventuellement faciliter l'acces à la nourriture et à l'eau en placant des croquettes humidifiées et de l'hydogel dans la cage. Si les points limites déterminés par le responsable de l'étude sont atteints, nous déterminerons avec la SBEA et le vétérinaire les soins ou l'action à appliquer pour réduire la souffrance animale.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris, seule espèce animale pour laquelle il existe des modèles animaux génétiquement modifiés pour nos cibles pharmacologiques. Les complications cardiovasculaires en condition d'hypertension font intervenir des mécanismes intégrés qui ne sont pas modélisables par des approches in vitro. L’expérimentation animale est donc une approche complémentaire aux études in vitro, permettant d’utiliser des modèles animaux susceptibles au développement des pathologies vasculaires. Enfin, plusieurs des cibles pharmacologiques potentielles seront validées en utilisant des modèles animaux génétiquement modifiés. Les souris seront utilisées à l'âge de 8 à 20 semaines, au stade jeune adulte car il est nécessaire que leurs systemes cardiovasculaire, immunitaire et métabolique soit entièrement developpé et mature.