Souris

1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur colorectale leur est greffée sous la peau, puis elles sont imagées au scanner et irradiées sous anesthésie, pour entraîner un algorithme d'intelligence artificielle censé repérer des signatures d'infiltration immunitaire. Le porteur justifie 50 souris par groupe par le besoin d'un grand jeu de données pour l'apprentissage automatique. Les retombées annoncées pour la médecine personnalisée sont renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat restant le développement de l'algorithme.

Objectifs

L'avènement de l'immunothérapie a conduit à un changement des pratiques dans le traitement de certains cancers, conduisant à des résultats impressionnants en termes de survie et de réponse tumorale. Cependant, seule une fraction des patients répond à l'immunothérapie, soulignant ainsi le besoin urgent de biomarqueurs pronostiques et prédictifs. L'infiltration immunitaire tumorale est un élément essentiel de la réponse immunitaire contre le cancer, conditionnant la réponse à l’immunothérapie. Le développement de stratégies non invasives pour quantifier cette infiltration immunitaire tumorale et prédire le résultat du traitement pourraient représenter une avancée majeure. Ce projet vise à développer et tester, dans des modèles tumoraux murins, une approche basée sur l’analyse d’images radiologiques (par scanner) combinée à des méthodes d’intelligence artificielle pour développer des algorithmes prédictifs.

Bénéfices attendus

À l'ère de la médecine personnalisée, où les stratégies thérapeutiques sont de plus en plus adaptées aux profils spécifiques des patients et des tumeurs, le développement d’algorithmes prédictifs pourrait représenter un outil précieux d'aide à la décision, guidant la prise en charge des patients atteints de cancer. La possibilité de déchiffrer de manière non invasive le microenvironnement tumoral et de suivre la réponse au traitement, par le biais de signatures radio-immunes, pourrait impacter de façon majeure la pratique clinique. De plus, l’opportunité de suivre dynamiquement et "en temps réel" l’infiltration de cellules immunitaires peut nous permettre de proposer de nouveaux traitements sur mesure. Cela pourra améliorer l’efficacité des thérapies et réduire les chances d’échec thérapeutique, en sélectionnant les patients qui ont le plus de possibilités de répondre au traitement sélectionné et en arrêtant précocement des traitements inefficaces.

Procédures

Deux modèles seront développés en parallèle, le premier chez la souris C57BL/6J avec une injection sous-cutanée de cellules de MC38 (murine colon carcinoma cells) dans le flanc droit et le second modèle chez la souris BALB/c avec une injection sous-cutanée de cellules CT26 (murine colon carcinoma cell line) également dans le flanc droit. Après une période de 10 à 20 jours permettant la croissance tumorale, les souris seront imagées sur scanner 1 jour avant l’irradiation, 4 et/ou 6 jours après l’irradiation, chaque acquisition durera 15 min. Les irradiations seront réalisées sur le SARRP et dureront entre 10 et 30 min. Que se soit pour les acquisitions des images ou les irradiations, les souris seront anesthésiées.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables chez les animaux seront occasionnés par l’injection des cellules tumorales et la croissance tumorale qui suivra. Les imageries et les irradiations se feront sous anesthésie et ne sont pas susceptibles de causer de souffrance ou détresse aux animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir collecter les tissus (dont la tumeur) pour analyses ultérieures.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer les effets de la radiothérapie localisée combinée ou non à des immunomodulateurs sur le microenvironnement tumoral et de suivre la réponse au traitement pour dévoiler des signatures radio-immunes. L’étude du recrutement et de la réponse des leucocytes dans la tumeur nécessite la présence d’un système immunitaire efficace dans un modèle dynamique (depuis la production des cellules dans la moelle osseuse, leur libération dans le sang, leur maturation dans les organes lymphoïdes secondaires, jusqu’au recrutement sur le site tumoral) qui ne peut pas être réalisée in vitro. Ceci met en jeu des interactions complexes nécessitant un organisme vivant entier. Les modèles murins sont imparfaits d’un point de vue purement biologique mais permettent d’étudier la réaction immunitaire anti-tumorale in vivo et ont l’avantage d’être d’une taille bien plus faible que chez l’humain, ce qui permet une inclusion en totalité des tumeurs et des tissus environnant pour une analyse histologique exhaustive. Cette inclusion en totalité ouvre une possibilité plus importante de mise en correspondance spatiale d’images histologiques et radiologiques, non réalisable en clinique, et apportera des éléments concrets quant à la réalité biologique d’hypothèses faites depuis plusieurs années en clinique. De plus, des modèles murins permettant la modulation in vivo de sous-populations spécifiques de cellules immunitaires (par exemple la déplétion vs l'enrichissement en CD8) au sein du microenvironnement immunitaire tumoral pourraient renforcer la signification biologique de notre signature radiomique. Nous envisageons pour cela un traitement personnalisé incluant radiothérapie et agents immunomodulateurs (anti-CD8) capables d'agir sur la contexture immunitaire tumorale.

Réduction

La génération d’un algorithme prédictif et pronostique par deep learning nécessite l’analyse d’un large set de données. En effet, cela est nécessaire pour un bon entraînement des algorithmes de prédiction. De plus, il est nécessaire d’utiliser une cohorte indépendante sur laquelle tester l’efficacité des algorithmes développés. Il n’existe aucune donnée dans la littérature concernant des analyses radiomiques dans des modèles tumoraux murins. Notre estimation de 50 souris par groupe est donc basée sur des observations cliniques et sera adapté sur la base des données obtenues pendant la réalisation du projet. En outre, les modèles murins que nous utiliserons ont déjà été testés et validés dans de nombreuses publications, et la collaboration avec un autre laboratoire nous permettra d'avoir des modèles déjà testés et performants, minimisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation afin de réduire au minimum la souffrance et la douleur des animaux. Les souris seront hébergées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. De plus, l'environnement des animaux sera enrichi en permanence par du coton ou des nids en carton afin de diminuer leur angoisse et favoriser leur bien-être. Une pesée sera effectuée régulièrement. Les points limites seront strictement appliqués. - Le développement de la tumeur ainsi que les signes de toxicité (perte de pois, prostration) seront évalués 3 fois par semaine (euthanasie des souris dès qu’un point limite est atteint).

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et est parmi les plus utilisées pour étudier les réponses immunitaires pendant le développement tumoral. De plus, pour des raisons de taille, de prix et de temps nous avons choisi cette espèce. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront âgées de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures. De plus, des modèles tumoraux ORL et pulmonaire ont été développés et caractérisés en utilisant des souris de cet âge, et nous allons maintenir ces mêmes paramètres pour cette étude avec des tumeurs coliques sous cutanées.

272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant la sclérose latérale amyotrophique, elles reçoivent un traitement par gavage puis un suivi mensuel de la force musculaire, des tests de sociabilité et un test du nid avec isolement d'une nuit, avant un électromyogramme sous anesthésie et la mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur teste si la relocalisation de la protéine FUS dans le noyau des neurones rétablit les capacités motrices. Il présente une extension possible à l'humain comme un axe futur, sans traitement existant à ce jour.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable caractérisée par une paralysie des muscles qui entrainent le décès des patients par insuffisance respiratoire. Nous avons dans notre laboratoire un modèle de souris qui mime cette maladie en reproduisant la mutation d’une protéine mutée chez les patients. Le but du projet est de relocaliser cette protéine dans le noyau des neurones et de voir si cela suffit à rétablir les capacités motrices de nos souris.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle il n’existe aucun traitement efficace de la SLA. Le but de ce projet est de tester une nouvelle approche en remettant une protéine qui s’est déplacée à cause de la maladie dans sa localisation normale puis d’évaluer si cette stratégie permet de rétablir les capacités motrices de ces souris. Si en remettant FUS à sa place, nous arrivons à réduire les troubles moteurs et sociaux observés, nous pourrons envisager que les prochains axes de recherche se tourneront vers la possibilité de trouver un moyen pour relocaliser FUS dans le noyau des patients souffrants de SLA.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure d’administration par gavage d’un traitement durant 5 jours. Nous réaliserons un suivi mensuel des capacités motrices (force musculaire) sur un dispositif dédié afin de voir l’évolution de la maladie. Ce test se passe en 3 session de 3 minutes maximum chacune, entrecoupées de phases de repos de 5 minutes. Les animaux seront toujours remis en groupe et de l’enrichissement sera mis à disposition dans leur cage d’élevage. Nous réaliserons deux tests de sociabilité 2 ou 3 fois au cours de la vie de l’animal (à 4, 10 et peut-être 14 mois selon l’évolution de la maladie). Le premier test dure 5 minutes tandis que pour le second, les souris passeront 4 sessions de 5 minutes chacune (avec des phases de retour en cage de 8 minutes entre les sessions). La passation du premier et du second test sera espacée d’une semaine. Le test du nid sera réalisé 2 ou 3 fois au cours de la vie de l’animal et nécessitera que les souris soient isolées durant une nuit. L’examen du fonctionnement des muscles (EMG) durera environ 20 minutes et sera réalisée en fin de procédure, sur les souris endormies afin d’éviter toute souffrance.

Impact sur les animaux

Nous pourrions observer chez les souris traitées des fausses routes liées à l’administration du traitement. Pour éviter cela, l’expérimentateur en charge de cette partie a suivi des formations pour apprendre à réaliser ce geste et s’est entrainé un grand nombre de fois. Nous pourrions également observer un léger stress causé par la passation du test moteur et des tests de sociabilité. Un temps de repos sera systématiquement appliqué pour les procédures nécessitant plusieurs passages successifs pour le test moteur. Si nous remarquons que les souris sont fatiguées, nous espacerons les différentes sessions. Un délai d’une semaine sera appliqué entre chaque test social. La procédure d’électro myo gramme qui permet d’observer la présence ou non d'atteinte des muscles sera réalisée sous anesthésie, les souris ne ressentiront donc aucune douleur.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à l’issue des procédures 1 et 2 car nous avons besoin de prélever les tissus pour vérifier 1. la relocalisation nucléaire de FUS mais aussi 2. pour étudier les impacts au niveau microscopique (moléculaire, cellulaire et biologique) de notre intervention.

Remplacement

Ce projet a pour but de déterminer s’il est possible de remettre à sa place une protéine dont le changement de localisation entraine la SLA. Pour étudier cela, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale (avec l’apparition possible des troubles de la sociabilité) mais aussi une complexité structurelle du système nerveux, notamment avec les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central chez l’Homme. La souris nous offre la possibilité de travailler avec ces deux niveaux de complexité.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires à la bonne réalisation de ce projet a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Par ailleurs, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici de réaliser les analyses histologiques et moléculaires sur les mêmes animaux que ceux chez qui auront réalisé le suivi longitudinal. Pour limiter le nombre total d’animaux générés et améliorer nos connaissances de la maladie, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous avons décidé de réaliser une première étude pilote pour valider l’approche expérimentale utilisée et potentiellement réduite le nombre de groupes contrôles que nous utiliserons. Si cette étude pilote est validée sur ces deux aspects, nous pourrons réduite de moitié les animaux nécessaires à la réalisation de la seconde partie du projet.

Raffinement

L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales (les souris sont gardées à plusieurs par cage tout au long de leur vie) et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Nous avons établi des points-limites clairs afin de pouvoir soustraire l’animal à la souffrance si nécessaire. Les expérimentateurs en charge sont formés à chaque procédure et nous avons une très bonne connaissance du modèle utilisé. Nous pourrons ainsi facilement déceler un éventuel comportement anormal. Toutes les approches expérimentales que nous souhaitons utiliser dans ce projet sont couramment réalisées dans notre laboratoire, ce qui limite fortement les risques de perte de tissus pour des raisons purement techniques. Par ailleurs, la procédure d’étude du muscle sera réalisée sous anesthésie gazeuse afin de réduire toute souffrance de l’animal et de réduire le stress lié à la manipulation.

Choix des espèces

Les modèles de souris transgéniques sont les plus appropriés à notre étude car ils présentent le niveau de complexité structurelle du cerveau et de la moelle épinière adéquat, une séquence de notre gène d’intérêt (Fus) bien concernée d’un point de vue phylogénétique et des capacités cognitives et motrices qui nous permettent d’évaluer des troubles retrouvés chez les patients. Les études seront réalisées sur des souris adultes car les patients souffrant de SLA liée à FUS présentent très rarement des formes juvéniles.

455 souris vont être utilisées, 450 tuées à l'issue et 5 mâles reproducteurs réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trente femelles gestantes reçoivent des injections sous-cutanées pendant vingt-huit jours, de la gestation jusqu'à trois semaines après la naissance, et les souriceaux sont tués pour prélever leur cerveau. Le porteur teste un peptide censé limiter la mort neuronale dans un modèle murin de trisomie 21. Il inscrit ce traitement dans le cas où les parents décident de poursuivre la grossesse après un diagnostic prénatal.

Objectifs

La trisomie 21 est le syndrome génétique le plus fréquent dans la population générale. En raison des différentes politiques de dépistage et d’interruption médicale de grossesse, cette maladie concerne 1 naissance sur 700 à 1 naissance sur 2000 dans les pays industrialisés. Le projet s’inscrit dans une étude visant à développer une nouvelle approche thérapeutique visant à corriger les désordres neurologiques impliqués dans la trisomie 21. Agir sur le nombre de neurones pourrait permettre de diminuer le risque de déficience intellectuelle dans cette pathologie et de changer son pronostic. Pour cela, le but est de trouver un traitement pour protéger le cerveau lorsque les parents décident de poursuivre la grossesse. Notre étude s’intéresse à une molécule d’origine embryonnaire qui possède des propriétés neuroprotectrices et qui diminue la mort des neurones. Il pourrait donc protéger contre de tels désordres neuro-développementaux. Notre première étude a montré des effets positifs sur le cerveau de souriceaux présentant des caractéristiques de la trisomie 21, traités pendant la gestation. Dans cette étude, le traitement sera administré par injection sous-cutanée à la mère durant la gestation et durant 21 jours après la naissance. Des analyses seront réalisées sur les cerveaux de la descendance ayant reçu ou non le traitement afin de déterminer de quelle façon il est protecteur, d’évaluer son innocuité et sa persistance à l’âge adulte. 5 mâles reproducteurs et 30 femelles seront nécessaires pour le traitement et quatre groupes de souriceaux seront constitués : des témoins traités et non traités et des trisomiques traités et non traités, pour un total de 420 souriceaux.

Bénéfices attendus

Cette pathologie, associée à une déficience intellectuelle, à des troubles du comportement et du langage, impacte l’autonomie des personnes porteuses de ce syndrome. Ce projet permettrait de continuer à explorer les mécanismes conduisant à des anomalies cérébrales dans la trisomie 21 ainsi que de pouvoir définir les mécanismes impliqués dans les effets du traitement administré. Ce traitement pourrait être considéré comme une approche thérapeutique dans le but de diminuer la déficience intellectuelle lorsque les parents décident de poursuivre la grossesse suite à un diagnostic prénatal de trisomie 21.

Procédures

5 mâles seront utlisés pour la reproduction. 30 femelles recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ou du traitement. Ce geste sera réalisé sur l’animal vigile, à partir du 14ème jour de gestation, jusqu’à 21 jours après la naissance des souriceaux soit durant 28 jours. Les souris issues des femelles gestantes seront utilisées pour étudier les mécanismes impliqués dans l’effet du traitement sur le cerveau.

Impact sur les animaux

Les injections aux femelles gestantes de la molécule seront effectuées sur l'animal vigile et effectuée selon les bonnes pratiques vétérinaires et n'induisent pas de douleur ou d’inconfort à l'animal autre que la piqûre de l'aiguille ainsi que du stress engendré par la manipulation.

Devenir

Tous les souriceaux utilisés seront mis à mort afin de prélever les cerveaux pour effectuer des analyses sur le nombre de neurones, la mort neuronale ainsi que pour déterminer les mécanismes d’action du traitement. Toutes les femelles pour les analyses du foie et des reins afin de confirmer la sécurité du traitement. Les mâles reproducteurs seront réutilisés dans un autre projet.

Remplacement

Pour atteindre les objectifs du projet basé sur un traitement, un organisme entier et vivant est nécessaire, n’ayant pas la possibilité de créer artificiellement la complexité d’un organisme avec tous les différents types de cellules présentes dans le cerveau.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé après avoir établi l’ensemble des procédures expérimentales à l’aide d’un test de puissance statistique en se basant sur la variabilité entre animaux et la distribution des valeurs.

Raffinement

Afin de garantir le bien-être des animaux, le milieu sera enrichi par l’ajout d’un nid végétal et d’un rouleau en carton. Pour les femelles gestantes et avec leurs petits, de l’enrichissement supplémentaire sera apporté sous forme d’une cabane en carton. Les approches expérimentales seront accompagnées d’une surveillance journalière afin de vérifier tout comportement anormal traduisant une souffrance, comme des signes de prostration, d’agressivité, d’apparence physique. Le poids des femelles gestantes sera relevé tous les jours lors de l’injection du traitement. Une absence de prise de poids sera particulièrement surveillée afin de déterminer s’il s’agit d’une dégradation de l’état de santé de l’animal et/ou d’une interruption de la gestation afin de retirer l’animal de l’étude. Du gel enrichi pourra être proposé dans la cage. Concernant plus spécifiquement les souriceaux, ils seront observés lors des pesées ayant lieu trois fois par semaine selon des critères spécifiques liés à leur âge (coloration, mouvement, respiration, comportement, etc). Lors de la manipulation des souris, les mains de l’expérimentateur seront systématiquement frottées avec de la litière de la cage afin de favoriser des odeurs familières moins stressantes pour les petits et la mère. Un changement de gants aura lieu entre 2 cages de femelles gestantes.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris dans ce projet nous permet de pouvoir réaliser des analyses sur un modèle établi comme modèle de la trisomie 21. Les injections du traitement seront réalisées sur des femelles adultes à partir du 14ème jour de gestation jusqu’à 21 jours après la naissance des souriceaux (soit durant 28 jours) afin de réaliser le traitement durant la gestation et après la naissance. Les analyses réalisées sur le cerveau des souris 30 jours après leur naissance permettront d’étudier l’effet du traitement sur les désordres neurodéveloppementaux et d’évaluer la persistance de son efficacité au stade jeune adulte. Ceci permettrait également à l’étude d’évaluer le potentiel thérapeutique transposable à l’Homme dans le cas d’une administration chez la femme pendant la grossesse pour corriger très précocement la déficience intellectuelle associée à la trisomie 21.

1 336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit l'objectif en une phrase et ne détaille comme acte qu'un tatouage et une biopsie à quatre jours, alors que la mutation de deux gènes peut empêcher la myélinisation. Il indique que les souriceaux pourraient présenter dès la naissance des rétractions articulaires les rendant immobiles, avant une mise à mort pour prélever les nerfs sciatiques. L'écart est net entre un effectif de plus de mille animaux et une justification scientifique réduite à quelques lignes.

Objectifs

Cette étude vise à confirmer l’importance de deux protéines dans la formation du système nerveux et leur impact en développement humain.

Bénéfices attendus

Dans le cas de de maladies neurogénératives telles que Charcot-Marie-Tooth, les neuropathies périphériques ou l'arthrogrypose , les causes précises restent parfois obscures et, malheureusement, aucun traitement curatif n'existe. Nous identifierons ainsi un nouvel acteur qui pourra être utilisé en diagnostic et qui pourrait être une cible thérapeutique

Procédures

Les animaux sont tatoués et prelevés par biopsie à 4j, sous anesthésie afin de les identifier. Cette procédure unique dure moins de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Comme la mutation des 2 gènes risque d’impacter le développement de la myéline périphérique, les souriceaux pourraient présenter des rétractions articulaires qui les rendraient immobiles dès la naissance

Devenir

Tous les animaux seront euthanasies pour prélèvement des nerfs sciatiques post-mortem pour analyse de celui-ci par différentes méthodologies complémentaires

Remplacement

L'arthrogrypose est une maladie musculaire et articulaire avec une atteinte de l’intégrité des axones, suite à leur non myélinisation. Ce phénotype a été visualisé chez l'Homme. Les multiples tissus impactés et l' interaction entre différents types de cellules impliquées dans la mise en place du système nerveux périphérique est donc nécessaire pour faire cette étude et nécessite donc un organisme entier mammifère. Aucun système cellulaire ex vivo ne peut rendre compte de la physiologie du développement qui fait intervenir des interactions cellulaires (contact entre nerfs et muscles), molécules informatives véhiculéee par le sang (hormones, cytokines) ou des effets environnementaux. Cette complexité est donc difficile voir impossible à reproduire in vitro et nécessite donc l’utilisation d’animaux notamment dans notre cas et le remplacement complet n’est pas possible. De plus, l'inactivation d'un gène dans une lignée de cellules spécifiques indispensable pour nos études n'est possible que chez le rongeur.

Réduction

D ans un 1e temps, nos lignées sont le plus souvent hétérozygotes pour le gène étudié. Ensuite, ces derniers seront croisés entre eux pour générer les homozygotes et les contrôles au sein de la même portée afin de limiter les animaux ne protant pas mutations. Le nombre d'animaux utilisés à des fins de recherche a été calculé en tenant compte de la limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables, Les expériences seront regroupées pour limiter le nombre des animaux des groupes contrôles.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux dans une animalerie agrée, dans des conditions de températures et hygrométrie controlées. Elles ont acces ad libitum à la nourriture et l'eau. Les cages présentent un enrichissement du milieu et sont quotidiennement surveillées (week end inclus). Des protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis en cas de souci et tous les prévelements sont post-mortem. Des points limites précoces ont été clairement définis afin d'éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Nous utilisons l'animal le plus utilisé par les chercheurs, la souris. Ces animaux constituent un excellent modèle pour l’étude du développement, des processus morphologiques et des pathologies, observées chez les Mammifères. Leur génome est très bien connu, ce qui permet de les "modifier génétiquement". Cet avantage nous permet d’utiliser des souris mutées et des souris sauvages du même fond génétique dans nos études expérimentales. De plus,l'inactivation du gène d'intérêt dans une lignée de cellules spécifiques indispensable pour nos études, n'est possible que chez le rongeur. Les stades de développement choisis sont ceux qui sont aussi pertinents chez l'Homme afin de pouvoir transposer les résultats

2 688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à sept actes en un peu plus d'un mois, dont des injections, deux anesthésies rapprochées, une hyperthermie localisée et un prélèvement de sang intracardiaque terminal, pour tester des nanoassemblages contre l'hépatite auto-immune. Le porteur obtient ce total en triplant un effectif de 896 animaux, soit trois répétitions indépendantes. Le bénéfice annoncé, un traitement ciblé épargnant l'immunité globale, reste une perspective, ces produits n'ayant jamais été administrés à des animaux.

Objectifs

Les maladies auto-immunes comme le diabète de type I, la polyarthrite rhumatoïde ou la sclérose en plaque résultent d’un dérèglement du système immunitaire. Parmi ces maladies, l’hépatite auto-immune (HAI) est une maladie rare avec une prévalence en Europe de 16 à 18 cas pour 100 000 habitants. Ce dérèglement hépatique provoqué par une attaque du foie par des lymphocytes T peut entraîner des défaillances hépatiques et/ou des cirrhoses. Le traitement actuel, non-spécifique (à base d’immunosuppresseurs combinant des corticostéroïdes et de l’azathioprine) présente de nombreux effets secondaires et entraîne une rémission complète en 18 mois pour seulement 75% des patients. De plus, 50 à 90% des patients rechutent dans l’année après arrêt du traitement. Des nouveaux traitements sont donc nécessaires. Nous souhaitons tester une nouvelle approche de thérapie sous la forme de nanoassemblages (NA) complexes combinant plusieurs stratégies. Une première étape de caractérisation, de validation, et de test de toxicité dans des cellules en culture a été réalisée pour plusieurs formulations, à l’issue de laquelle, 4 différentes formulations ont été sélectionnées pour faire l’objet d’une poursuite d’étude dans un modèle animal. Nous disposons de 2 modèles murins complémentaires d’une atteinte autoimmune hépatique. Les objectifs du projet sont de tester l’innocuité des 4 formulations sélectionnées sur des souris sauvages, puis de tester l’effet thérapeutique de ces NA sur les modèles murins d’hépatite. Ces travaux permettront in fine de combler l’absence actuelle d’approche thérapeutique ciblée pour le traitement de l’hépatite autoimmune.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’établir l’efficacité d’une nouvelle approche pour le traitement de l’hépatite autoimmune. Le traitement actuel de cette maladie n’a pas évolué depuis plus de 30 ans et consiste en une immunosuppression non spécifique prise au long cours, qui présente des effets indésirables certains. L’approche testée dans ce projet permet d’envisager un traitement ciblé, permettant de ne pas altérer l’immunité globale du patient.

Procédures

Au maximum, les animaux subiront 7 actes, sur une période de 34 à 37 jours. Des animaux recevront une injection (durée 1 minute, animal anesthésié), suivie 10 jours après d’une injection (durée 30 secondes, animal vigile), puis deux injections seront réalisées à une semaine d’intervalle (durée 1 minute chacune, animal anesthésié). Des souris subiront deux anesthésies à des temps rapprochés, la première pour une injection (durée 1 minute) et la seconde, 6 heures après, pour une phase d’hyperthermie modérée localisée (durée 30 minutes), Enfin, un prélèvement sanguin intra-cardiaque (durée 1 à 2 minutes, animal anesthésié) est prévu avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection intrapéritonéale et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Des animaux subiront deux anesthésies gazeuses rapprochées (6 heures d’intervalle), ce qui pourrait engendrer un stress. De plus la seconde anesthésie, d’une durée de 30 minutes pourrait entrainer une dépression cardiovasculaire transitoire, ainsi qu’une diminution de la température corporelle de l’animal. Les modèles d’hépatite utilisés provoquent tous deux une hépatite modérée qui n’entraine pas d’effets indésirables notoires. Pour ce qui est des traitements testés, on ne peut pas savoir à l’avance puisqu’ils n’ont jamais été utilisés chez l’animal. Toutefois en se basant sur la bibliographie utilisant des produits comparables, aucun effet indésirable n’a été rapporté. Les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive après les traitements.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont euthanasiés pour récupérer le foie, les organes, le sang, la rate, les ganglions et mener des analyses d’histologie, de microscopie, de biologie cellulaire et d’immunologie.

Remplacement

Les étapes de mise au point ont été autant que possible réalisées sur des cellules en culture, y compris les premiers tests de toxicité cellulaire. Le passage aux études in vivo est réduit aux tests nécessaires qui requièrent un système physiologique complexe, qu’il n’est pas encore possible de modéliser en vitro. Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique adapté.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 2688 animaux seront étudiés : Nous estimons un nombre total de 112 lots de 8 animaux = 896 ; 3 répétitions indépendantes : 2688 animaux. De façon à réduire au plus le nombre d’animaux nécessaires, le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. S’il s’avère qu’un traitement présente une toxicité, l’étude de ce traitement ne sera pas poursuivie dans les procédures suivantes. Dans un but de réduction, nous pourrons réduire le nombre de groupes contrôles s’il s’avère que les concentrations sont les mêmes pour plusieurs produits et en absence d’autres effets potentiels de paramètres extérieurs qui pourraient interférer. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toutes manipulations, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les manipulations invasives seront précédées d’une courte anesthésie générale gazeuse et d’une analgésie locale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. A notre connaissance, il n’existe pas de modèle pertinent autres pour notre étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont des souris adultes de 8 à 10 semaines, car la croissance hépatique est achevée et le système immunitaire mature. A des âges plus avancés le système immunitaire ainsi que la capacité de prolifération du tissu hépatique peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité dans l’induction de la pathologie et dans la réponse au traitement.