Souris

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Isolées en cage individuelle pendant quinze jours, elles reçoivent par gavage un microbiote intestinal humain, puis sont soumises à un modèle d'anorexie par restriction alimentaire ou à un modèle de boulimie, pour tester le lien entre microbiote et troubles du comportement alimentaire. Le porteur indique que la restriction peut provoquer fatigue, prostration et forte perte de poids, une chute de plus de 20 % sur trois jours déclenchant la mise à mort. Il affirme que le recours aux modèles animaux est "indispensable", faute d'un autre modèle étudiant ces aspects "dans leur globalité".

Objectifs

Les Troubles du Comportement Alimentaire (TCA) constituent des pathologies graves de l’adolescence et des jeunes adultes, avec un impact fort en termes de morbidité et de mortalité à long terme. Les TCA regroupent différentes formes : l’anorexie mentale, la boulimie et l’hyperphagie boulimique. La prévalence mondiale de ces maladies atteint 8,4% chez les femmes et 2,2% chez les hommes, ce qui en fait un enjeu de santé publique très important. Les mécanismes moléculaires à l’origine des TCA sont encore mal compris. Ce sont des maladies complexes et impliquant différents facteurs biologiques, psychologiques et socio-culturels. Le microbiote intestinal, qui correspond à l’ensemble des micro-organismes vivant à l’intérieur de l’intestin, pourrait être un de ces facteurs. En effet, ces micro-organismes interagissent et communiquent de façon très étroite avec l’intestin mais également avec le cerveau. Ce microbiote intestinal joue également un rôle dans la digestion, dans la régulation de la prise de poids et dans le comportement alimentaire. Il a été montré que la composition du microbiote intestinal de patients souffrant de TCA était modifiée par rapport à des individus sains. Ces changements pourraient avoir un impact sur la physiologie intestinale, notamment en favorisant l’apparition de troubles fonctionnels digestifs (une comorbidité fréquemment retrouvée chez les patients avec TCA). Notre projet de recherche propose donc d’étudier le rôle du microbiote intestinal dans l’apparition et la persistance de ces maladies et de certaines de leurs comorbidités. Notre projet de recherche reposera sur l’utilisation d’approches expérimentales de type « greffes de microbiote intestinal », de l’Homme vers la Souris, ainsi que sur l’utilisation de plusieurs modèles animaux reproduisant différents aspects des TCA étudiés : un modèle de boulimie et d’hyperphagie chez la souris C57Bl/6 (modèle murin « Binge Eating Disorder » ou BED) et un modèle d’Anorexie chez la Souris C57Bl/6 (modèle murin « Activity-Based Anorexia » ou ABA). L’ensemble des connaissances apportées par ces expériences permettra de mieux comprendre les mécanismes d’apparition et de persistance des troubles du comportement alimentaire. Nous espérons en particulier identifier de nouvelles approches thérapeutiques basées sur la manipulation du microbiote intestinal, qui viendront compléter les approches psychologiques et nutritionnelles actuellement utilisées pour lutter contre ces maladies.

Bénéfices attendus

L’ensemble des approches expérimentales présentées dans ce projet nous permettront de déterminer s’il existe un lien de cause à effet direct entre les altérations du microbiote intestinal et l’apparition de troubles du comportement alimentaire. Les résultats obtenus permettront d’améliorer notre connaissance de la physiopathologie des Troubles du Comportement Alimentaire et ouvriront de nouveaux axes de recherche sur le développement de thérapies innovantes contre ces maladies, basées sur la modulation du microbiote des patients.

Procédures

- Tous les animaux de ce projet (768 souris) seront séparés en cages individuelles après une semaine d’acclimatation à l’animalerie. - Tous les animaux de ce projet (768 souris) seront pesés quotidiennement (animaux vigiles), soit 16 pesées pour chaque animal. Pour cela, les animaux seront extraits de leurs cages et pesés sur une balance adaptée. - L’ensemble des animaux de la procédure 2 (448 souris) et de la procédure 3 (224 souris) seront gavés oralement à 3 reprises (1 fois pour la première greffe de microbiote à J0, 1 fois pour la deuxième greffe de microbiote à J1 et 1 dernière fois à J16). Pour cela, les animaux (vigiles) seront extraits de leurs cages et maintenus en contention pendant quelques secondes. - Tous les animaux de ce projet (768 souris) seront extraits de leurs cages le dernier jour du protocole et maintenus en contention pendant 2 minutes (animaux vigiles) pour effectuer l’analyse de leur composition corporelle. - Tous les animaux de ce projet (768 souris) seront extraits de leurs cages le jour de la mise à mort et maintenus en contention pendant quelques secondes pour la réalisation d’une injection intrapéritonéale d’anesthésiques.

Impact sur les animaux

- L’ensemble des expérimentations prévues nécessitent d’héberger les animaux pendant plusieurs jours en cages individuelles (15 jours). Cet isolement est indispensable pour pouvoir suivre la prise alimentaire et hydrique de chaque souris et évaluer leur activité physique. - La réalisation de greffes de microbiote intestinal par gavage oral chez la Souris nécessite de prendre les animaux en contention, ce qui peut engendrer un stress de quelques secondes. La mesure de composition corporelle (par Echo-MRI) nécessite également une contention d’une durée deux minutes. Ces différentes contentions seront réalisées par des expérimentateurs expérimentés afin de réduire au maximum le stress des animaux. - Le modèle murin d’anorexie « Activity-Based Anorexia » est un modèle très utilisé et bien documenté dans la littérature (Schalla et al., Front Nutr, 2019 ; doi: 10.3389/fnut.2019.00069). Suite à la restriction alimentaire imposée, les animaux peuvent présenter une fatigue, une prostration et une perte de poids importante. Tous ces paramètres sont pris en compte dans l’évaluation du bien-être animal. Le poids corporel sera suivi quotidiennement et fera également l’objet d’un point limite. - Le modèle murin de boulimie/hyperphagie boulimique « Binge Eating Disorder » est également bien documenté. L’accès intermittent à une nourriture riche en sucre et riche en graisse peut induire un stress lié au développement d’un comportement de type addictif. Cet aspect sera également pris en compte dans l’évaluation du bien-être animal.

Devenir

A la fin du protocole, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de pouvoir évaluer différents paramètres physiologiques et marqueurs biologiques et collecter un maximum d’information à partir de ces séries expérimentales.

Remplacement

Ce projet est un projet de recherche en physiologie intégrée visant à étudier les interactions entre les bactéries du microbiote, l’intestin et le cerveau. Ce projet se concentre notamment sur l’analyse de l’impact du microbiote sur la physiologie intestinale (particulièrement les troubles fonctionnels digestifs) et sur le comportement alimentaire. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable pour réaliser cette étude et atteindre les objectifs de ce projet car aucun autre modèle « non animal » actuel ne nous permet d’étudier ces aspects dans leur globalité.

Réduction

Pour nos expérimentations, le nombre d’animaux prévu est dimensionné par rapport au nombre de patients et volontaires sains qui seront inclus dans le protocole clinique (validé par le CPP Ile-de-France V). Nous avons limité ce nombre d’animaux de façon à garder une puissance statistique suffisante dans le traitement des résultats et de pouvoir conclure sur le rôle du microbiote dans l’apparition des troubles fonctionnels digestifs. Les différents paramètres physiologiques et comportementaux mesurés pour chaque lot d’animaux seront comparés. Les analyses de composition du microbiote feront l’objet d’un traitement statistique particulier adapté à ce type de données.

Raffinement

La mise en place d’un suivi strict de points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur des animaux au cours des expérimentations. L'ensemble des expériences sera mené par des personnels expérimentés, dans des locaux d'hébergement respectant les standards en vigueur. Pour limiter le stress des animaux, plusieurs points seront mis en place : - Après leur arrivée dans l’animalerie, les souris resteront pendant une semaine en période d’acclimatation avant le début des expérimentations. - Le milieu de la cage sera enrichi de coton pour permettre aux animaux de réaliser des nids. - Les animaux seront observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être. Deux points limites seront évalués : - Au cours du modèle ABA (modèle de dénutrition), une attention particulière sera portée à la perte de poids. Un suivi quotidien sera réalisé et permettra d'évaluer le pourcentage de perte de poids des différents animaux. Une perte de poids supérieure à 20% du poids initial sur 3 jours consécutifs entrainera la mise à mort de l'animal. - Une évaluation de la souffrance animale sera réalisée à l’aide de l’échelle « Mouse Grimace Scale » composée de 5 items faciaux. Lorsque la somme des scores de ce critère sera supérieure à 5, les animaux recevront une injection sous-cutanée d’analgésique. Si la douleur persiste plus de deux jours, les animaux seront mis à mort. Lorsque la somme des scores de chaque critère sera supérieure à 7, les animaux seront mis à mort. - Au cours du modèle murin de boulimie/hyperphagie boulimique « Binge Eating Disorder », une attention particulière sera portée au développement d’un comportement de type addictif ou de sevrage chez les animaux lié à l’accès intermittent à la diète riche en sucre et riche en graisse Ces différentes manifestations seront prises en compte lors de nos observations quotidiennes des animaux et lors des tests comportementaux réalisés au cours de notre protocole.

Choix des espèces

La lignée C57Bl/6 a été utilisée par notre laboratoire pour la mise en place des techniques de greffe de microbiote intestinal et de déplétion du microbiote endogène des animaux greffés par antibiotiques (Tirelle et al., BMC Microbiol, 2020, DOI: 10.1186/s12866-020-02018-9). Cette lignée C57Bl/6 a d’autre part été utilisée à de nombreuses reprises par notre laboratoire pour l’étude du modèle ABA (Jésus et al., Clin Nutr, 2014, DOI : 10.1016/j.clnu.2013.11.006 ; Breton et al., Clin Nutr, 2021, DOI : 10.1016/j.clnu.2020.05.002). Il est donc pertinent de développer le modèle BED et d’effectuer l’ensemble des greffes de microbiote intestinal dans cette même lignée. Les souris seront livrées à l’animalerie à l'âge de huit semaines et utilisées pour les expérimentations à l'âge de neuf semaines (après 1 semaine d’acclimatation). Cet âge correspond un stade de jeune adulte chez les souris, ce qui correspond au pic d’incidence retrouvé chez l’Homme pour les troubles du comportement alimentaire (Galmiche et al., Am J Clin Nutr 2019 ; DOI : 10.1093/ajcn/nqy342).

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une injection stéréotaxique de virus dans le cerveau et l'implantation de fibres optiques sous anesthésie, et cent d'entre elles sont exposées cinq minutes par jour pendant dix jours à une souris agressive, avec des blessures possibles. Le porteur indique que l'anhédonie, l'anxiété et l'apathie provoquées "ne peuvent être soulagées" car elles sont l'objet de l'étude. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux vivants ne peut apporter le même niveau d'information.

Objectifs

La dépression touche plus de 350 millions de personnes dans le monde et représente la première cause d'invalidité dans le monde. La dépression est précipitée par des évènements stressants. Cependant, certains individus ne développent pas de profil pathologique après exposition au stress, une qualité définie comme la résilience. Une région du cerveau appelée « locus coeruleus » (LC) et libérant de la noradrénaline (NE) a un rôle majeur dans le circuit de la résilience. Comment ce système contrôle l’activité du système sérotoninergique (impliqué dans la réponse aux antidépresseurs) dans le contexte d’un évènement stressant reste à être étudié. L’objectif de ce projet est d’étudier i) la régulation fonctionnelle du système sérotoninergique par le LC et ii) le rôle de ce circuit dans la résilience au stress chronique. Le modèle de stress utilisé dans ce projet permettra d'identifer des animaux résilients dans un contexte d'aggression sociale et constitue un modèle de résilience à la dépression. Seule l’expérimentation in vivo, permettant d’étudier les conséquences neurobiologiques du stress et mettre en évidence des comportements anxio-dépressif, nous permettra de répondre à cette question.

Bénéfices attendus

Environ 30% des patients dépressifs ne répondent pas aux traitements antidépresseurs conventionnelles. Ce projet a un intérêt majeur puisqu'il permettra d'améliorer la compréhension de la neurobiologie de dépression et de la résilience afin de concevoir de nouvelles approches thérapeutiques plus efficaces pour ces patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 procédures chirurgicales: une première procédure d'injection stereotaxique de virus AAV sera réalisée chez 320 souris et une deuxième procédure d'implantation de fibres optique sera réalisées chez 280 souris, 3 semaines suite à l'injection de virus AAV. Chaque procédure aura lieu sous anesthésie pour une durée de 1 ou 2 heures chacune. Parmi les animaux, 100 souris seront également soumises à un protocole de stress chronique de défaite sociale pendant 10 jours.

Impact sur les animaux

La nature de cette expérience aboutira à une gêne (anhédonie, anxiété et apathie) qui ne peut être soulagée étant donné que l’objectif de ce projet qui est d’étudier les effets du stress et de la dépression sur le cerveau. Lors de la procédure de stress chronique de défaite sociale, les animaux (100 DBHcre) sont mis en contact avec une souris CD1 aggressives 5 minutes par jour pendant 10 jours. Des blessures ou lésions induites par les agressions physique lors de cette procédure peuvent être observées. Les souris CD1 agressives seront isolées à leur arrivé à l’animalerie pour éviter les combats entre elles.

Devenir

A l'issue des 3 procédures, les animaux seront mis à mort et les cerveaux utilisés pour des analyses immunohistologique.

Remplacement

L’objectif de ce projet de recherche étant d’étudier l’émergence de troubles psychiatriques en réponse au stress, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Notre projet nécessite l’emploi de plusieurs techniques expérimentales. Compte tenu de la littérature et de notre expérience, nous utiliserons les tests statistiques pour analyser nos données. Ces tests nécessitent d’avoir un nombre minimum d’animaux pour atteindre les seuils statistiques de significativité en fonction des expériences réalisées. Plusieurs paramètres peuvent induire de la variabilité ou la perte d'animaux au cours des différentes procédures expèrimentales : - Pour la procédure 1, validation de la stratègie virale et cartographie anatomique, l'injection de virus peut être déficiente, nous estimons donc que des lots de n=5 par groupe sont necessaires. - Pour la procédure 2, qui implique 2 procédures d'injection et d'implantation stéreotaxiques, le risque de perte augmente. Cette procédure implique également des enregistrement en imagerie calcique qui présente de grande variabilité entre individus en fonction de l'expression virale et du site d'implantation. Un nombre de n=20 animaux par groupe est nécessaire. - Pour la procédure 3, s'ajoute à la variabilité induite par les procédures chirurgicales et d'enregistrement, la variabilité comportementale. Par ailleurs, sachant que 30% des souris stressées sont résilientes à la défiate sociale, 80 souris stréssées sont nécessaires pour obtenir 24 souris résilientes.

Raffinement

La nature de certaines de nos expériences, en particulier celles dont le but est de déterminer les effets du stress et de la dépression sur le cerveau, aboutira à une gêne (anhédonie, anxiété et apathie) qui ne peut être soulagée. Par contre, si un animal est en souffrance, alors, il sera euthanasié. Pour limiter l’angoisse des animaux, ceux-ci seront habitues à l’expérimentateur, au dispositif et à la pièce d’expérimentation pour éviter un stress supplémentaire. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et des protocoles analgésiques seront mis en place pour limiter la douleur des animaux. Des points limites ont été établis pour chaque procédure.

Choix des espèces

La souris est le modèle standard pour l'étude de la fonction des circuits cérébraux dans le cerveau des mammifères : i) l’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine ; ii) L'anatomie, la morphologie cellulaire, la biochimie et l'électrophysiologie du cerveau de la souris sont bien caractérisées ; iii) Il existe une vaste littérature sur le comportement de la souris, l'apprentissage et la mémoire. Par ailleurs, il est possible d'utiliser une batterie de souris Génétiquement modifiées. La souris est donc le modèle le plus adapté étant donné également sa petite taille et sa reproduction rapide. Les études seront réalisées à l’âge adulte (8-12 semaines) car nous cherchons à étudier les mécanismes neurobiologiques mis en place chez l'adultes pour conserver un état neuropsychobiologique normal en réponse à un évènement stressant. La prévalence de la dépression chez l'adulte a augmenté de 2,5 points en deux ans, ce qui représente 13,5% de le population française de plus de 15 ans.

180 souris, mâles et femelles, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une ligature du nerf sciatique leur inflige une douleur neuropathique chronique, suivie de dix-sept évaluations de la douleur et de six tests comportementaux sur sept à neuf semaines, pour comparer selon le sexe les troubles anxio-dépressifs liés à la douleur. Le porteur indique que le développement de ces troubles est attendu et "ne peut être évité car c'est l'objet de l'étude". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut remplacer l'observation comportementale de l'animal vigile.

Objectifs

La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux somatosensoriel. Généralement chronique, avec une prévalence de 5 à 7% dans la population, elle s’accompagne d’un fort risque de développement de troubles de l’humeur. En effet, environ 50% des patients présentent cette co-morbidité. Ceci constitue un enjeu important de santé publique. Malgré les données cliniques, les mécanismes sous-jacents de cette co-morbidité restent encore inconnus et nécessitent des études précliniques. Chez la souris mâle des données de la littérature suggèrent que plusieurs structures cérébrales clés seraient impliquées dans les conséquences affectives à long terme d’une douleur neuropathique. Les données d’imagerie neuroanatomique et fonctionnelle chez l’homme, ainsi que des résultats obtenus par des approches lésionnelle et d’imagerie, chez la souris montrent que non seulement la dépression majeure mais aussi les situations douloureuses s’accompagnent de changements dans des régions céréblales. De plus, de nombreuses données de la littérature ont démontré d’importantes différences dans la sensibilité à la douleur entre les hommes et les femmes ; données également observées chez les rongeurs. La prévalence des troubles anxieux et dépressifs, dans la population générale ainsi que chez les patients douloureux chronique, présente également des différences intersexuelles. De telles différences suggèrent très probablement des mécanismes spécifiques à chaque sexe. Ainsi, bien que les régions cérébrales impliquées dans les troubles de l’humeur provoqués par la douleur chronique soient sans doute les mêmes, les altérations des réseaux que ces structures forment sont sans doute différentes chez des individus mâles et femelles. Le but de ce projet est donc de comparer les changements comportementaux éventuels entre mâles et femelles dans un modèle de constriction du nerf sciatique par ligatures chez la souris.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de comparer chez la souris mâle et femelle les comportements de troubles anxio-dépressifs liés à la douleur chronique. Cette comparaison sera aussi menée vis-à-vis des effets des traitements contre la douleur et contre l’état anxio-dépréssif selon le sexe. A l’issue de ce projet, nous serons en mesure de définir le développement des comportements de type anxieux et dépressif chez les deux sexes dans un modèle de ligature du nerf sciatique. Cette avancée pourrait permettre d’affiner les interventions thérapeutiques selon le sexe.

Procédures

L'ensemble des animaux subiront une chirurgie (durée 10 min maximum) sous anesthésie. A la suite de quoi les animaux auront une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Pour les animaux de l’expérience 1, nous évaluerons à 17 reprises de la douleur neuropathique (durée du test est de 30min avec 5min d’habituation avant) et 6 tests sur comportement (durée de 5 à 25 min chacun selon le test) une période de 9 semaines de alors que ceux des expériences 2 et 3 seront soumis à 13 évaluations de la douleur neuropathique (durée du test est de 30min avec 5min d’habituation avant) et 6 tests de comportement (durée de 5 à 25 min chacun selon le test) sur une période de 7 semaines.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. De plus comme dans toute chirurgie, il peut apparaitre des signes de douleur, d’inflammation, d’infection ou une perte de poids. Le développement de troubles anxio-dépressifs est attendu et ne peut être évité car c'est l'objet de l'étude.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse du développement des troubles anxio-dépressifs dans un modèle de douleur neuropathique nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 souris mâles et 10 souris femelles. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Pour cette raison une même cohorte d’animaux sera étudiée et caractérisée au niveau comportemental. Des analyses statistiques finales seront réalisées.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé et le poids corporel des animaux sera mesuré au minimum lors de chaque expérimentation (test de comportement ou traitement). Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines).

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Nourries d'un régime gras, elles subissent gavages, injections intrapéritonéales, mises à jeun et prélèvements sanguins répétés, pour étudier le rôle des cellules NK dans les complications hépatiques de l'obésité. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer gêne, rougeur, infection ou nécrose au point d'injection, et que peuvent survenir obésité, hyperglycémie ou diabète. Il conclut qu'"aucune autre espèce ne peut être utilisée" et que les études in vitro ne reproduisent pas les interactions entre organes.

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires et s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Malgré l'importance clinique de ces pathologies, aucun traitement pharmacologique efficace n’est actuellement disponible. La mise en place d’une inflammation chronique joue un rôle crucial dans le développement de ces maladies. Les cellules immunitaires sont impliquées dans les processus inflammatoires et ces cellules sont retrouvées, entre autres, dans des organes comme le tissu adipeux et l’intestin qui participent au développement des complications hépatiques. En particulier, dans ces maladies du foie, les fonctions de l’intestin sont dégradées et ceci contribue à l’activation des cellules immunitaires hépatiques. Notre objectif est de comprendre comment une famille de cellules immunitaires participent au développement des maladies du foie associées à l’obésité. Afin de répondre à notre problématique, nous utiliserons des animaux qui n’expriment pas une molécule indispensable pour le développement de ces cellules. Nous espérons ainsi démontrer le rôle exact de ces cellules immunitaires dans ces maladies afin de proposer de nouvelles thérapies les ciblant. Ces études seront réalisées dans le souci d'utiliser un nombre raisonnable d'animaux sans compromettre les objectifs du projet et tenant compte des exigences de remplacement, réduction et raffinement. Le nombre total d'animaux utilisé dans ce projet sera de 540. Ce projet utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Leur bien-être sera scrupuleusement pris en compte en termes de conditions d’élevage, d’hébergement et de soins (environnement enrichi, suivis réguliers par les expérimentateurs) afin de réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’une part de valider in vivo le rôle exact des cellules tueuses naturelles (NK) dans le contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et d’autre part de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie. Nous espérons pouvoir proposer de cibler les fonctions des cellules NK comme nouvelle stratégie thérapeutique pour ces maladies qui actuellement ne disposent pas de traitements pharmacologiques.

Procédures

En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront soumis à un prélèvement sanguin en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine pendant 6 semaines.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la perte de poids chez l’animal, la contention, les mises à jeun de 4h et 6h, les injections intrapéritonéales et les gavages par voie orale, les prélèvements sanguins à la base de la queue, la survenue d'une obésité, d'une hyperglycémie ou d'un diabète. Les injections pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...). Des animaux agressifs pourront été également être isolés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin d'analyser la réponse immunitaire au sein des organes d'intérêt.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires (effets des lipides et des dérivés bactériens comme le lipopolysaccharide sur la physiologie des cellules). Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris sauvages contrôles et 50% de souris pour lesquelles Eomes est invalidé dans les cellules NK ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expériences.

Raffinement

La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés à chaque nos procédures et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure, permettra de limiter la sévérité de celles-ci. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). La surveillance quotidienne des animaux par les zootechniciens et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa fécondité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée Nous utiliserons des souris à partir de la 7ème semaine d'âge c'est à dire à l'âge adulte avec un poids stabilisé.