Souris
Triple combinaison : radiothérapie, nanoparticules et immunomodulateurs pour lutter contre les cancer ORL
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée par injection de cellules cancéreuses, suivie d'injections de nanoparticules d'or et d'immunomodulateurs, de séances d'imagerie et d'une irradiation localisée. Le porteur indique que la tumeur et le traitement peuvent réduire l'alimentation et affaiblir fortement les souris, tuées ensuite car porteuses de tumeurs. La triple combinaison est présentée comme "prometteuse" pour les patients, mais l'apport reste une évaluation d'efficacité chez l'animal.
Objectifs
Le projet répond au besoin de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques pour augmenter la sensibilité des tumeurs aux rayonnements (radiosensibilité). Augmenter la dose maximale de radiation dans les tissus tumoraux tout en cherchant à réduire les dommages aux tissus normaux a toujours été un grand défi en radiothérapie. Les développements technologiques ces dernières décennies ont permis une amélioration croissante de l’indice thérapeutique (différence entre la dose thérapeutique et la dose toxique). En outre, plusieurs stratégies ont été développées et testées pour surmonter la radiorésistance de la tumeur et pour augmenter l’efficacité de la radiothérapie comme l’utilisation de radiosensibilisants. Les radiosensibilisants sont des produits chimiques ou des agents pharmaceutiques qui peuvent améliorer l’effet destructeur sur les cellules tumorales en accélérant les dommages à l’ADN et en produisant indirectement des radicaux libres. À cet égard, le rôle émergent de la nanomédecine pour le traitement de différents types de cancer peut représenter une approche prometteuse pour équilibrer l’efficacité de la thérapie et les effets secondaires. En particulier, l’utilisation d’une nouvelle classe de nanoparticules améliorant le rayonnement pourrait constituer une approche révolutionnaire pour le traitement local des tumeurs solides traitées par radiothérapie. L’objectif principal de ce projet est de mettre au point des nanoparticules synergiques et non persistantes pour la chimio-radiothérapie en vue de la gestion avancée du cancer. Afin d’améliorer l’application potentielle aux cliniques des nanoparticules, leur efficacité sera évaluée dans des modèles in vivo avancés, avec un intérêt particulier pour le carcinome de la tête et du cou qui est globalement le sixième cancer le plus fréquent par l’incidence dans le monde et il est caractérisé par une résistance aux médicaments importants.
Bénéfices attendus
Les nanoparticules métalliques sont développées de plus en plus comme agents prometteurs en oncologie en tant que vecteurs de médicaments et radiosensibilisants. Avec ce projet, nous allons évaluer l'efficacité anti-tumorale des nanoparticules d’or. Nous eallons évaluer l'efficacité de la triple combinaison radiothérapie, nanoparticules métalliques et immunomodulateurs pour obtenir des effets antitumoraux systémiques. Cette triple combinaison propose un modèle original et nouveau de coopération thérapeutique pour lutter contre le cancer, qui pourrait améliorer la prise en charge des patients de cancers des voies aériennes et digestives supérieures.
Procédures
Les animaux auront une injection de cellules tumorales (durée 1 minute, sous anesthésie générale). Les animaux subiront aussi une injection de nanoparticules et, pour certains, une injection d'immunomodulateur (durée 1 minute). Les animaux auront 3 séances d'imagerie in vivo sous anesthésie générale (durée 10 minutes). Des animaux subiront une irradiations localisée sur la tumeur par animal (durée 10 minutes).
Impact sur les animaux
Le traitement ainsi que la façon dont croît la tumeur peuvent réduire la capacité de la souris à s’alimenter et affaiblir fortement la souris. Les animaux subiront aussi du stress lors des préhensions pour examen, des injections (peu de nuisances car anesthésie locale) et des séances d'imagerie (stress de préhension).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés car ils seront porteurs de tumeurs. De plus, sur certains lots, des analyses post-mortem seront efectuées sur des tissus .
Remplacement
Nous avons utilisé au préalable des tests in vitro pour évaluer l'efficacité des nanoparticules sur les différentes lignées cellulaires utilisées dans ce projet. Les modèles in vivo s’avèrent indispensables pour valider ces résultats avec un système d’administration proche à celle que sera utilisée en clinique (injections intratumorales). Le recours à des modèles animaux est aussi incontournable pour étudier les effets des combinaisons thérapeutiques dans un contexte qui inclut le micro environnement tumoral et qui permet donc l’interaction des cellules tumorales avec le stroma (dont les cellules immunitaires sous dépendance de médiateurs type cytokines ou cellules provenant du reste de l'organisme). Cela est indispensable dans le contexte de la radiothérapie (par exemple: effet «bystander» de l’irradiation i.e. effets que les cellules irradiées pourraient exercer sur des cellules non irradiées à proximité ou à distance par exemple). Il n’existe pas de modèle alternatif permettant une telle étude. Le projet nécessite donc d’être mené sur un organisme vivant disposant d’un système immunitaire complet, et permettant l'étude du microenvironnement tumoral.
Réduction
Nous avons utilisé au préalable des tests in vitro pour évaluer l'efficacité des nanoparticules sur les différentes lignées cellulaires utilisées dans ce projet. ces tests ont permis de sélectionner certaines types de nanoparticules qui ont montré une meilleures efficacité en combinaison avec la radiothérapie. Nous allons donc effectuer les test in vivo uniquement avec le meilleur candidat sélectionné sur la base de ces tests préliminaires, ce qui va nous permettre de réduire le nombre d'animaux nécessaires. En outre, la connaissance des deux modèles tumoraux nous permet d'utiliser uniquement deux doses unique de radiothérapie, car nous connaissons déjà la radiosensibilité de ces modèles. De plus, ces modèles sont bien maitrisés au laboratoire, ce qui a permis d'avoir un tas d'inclusion élevé (très bonne prise de croissance des tumeurs). Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour ce projet nous nous sommes basés sur des analyses statistiques. Le suivi hebdomadaire des animaux permettra de réduire le nombre d'animaux utilisées (augmentation de la puissance statistique).
Raffinement
Un suivi quotidien clinique pour recherche de signes éventuels de souffrance sera effectué, et des mesures d'analgésies seront mises en oeuvre en cas de besoin. Le développement de la tumeur sera suivi par la mesure du volume tumoral grâce à l'imagerie in vivo et par des mesures directes. Des points limites précis et précoces ont été définis et seront strictement appliqués. L'environnement sera enrichi avec des sizzlenests et des tunnels en carton afin de diminuer l'angoisse. Les interventions (injections, imagerie) seront faites sous anesthésie.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques: - La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie. - Génétique proche de celle de l’Homme et bien connue - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - Les modèles de tumeur étudiés sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité. Les souris seront âgées de 8 ou 9 semaines, un âge où la souris est suffisamment mature.
Rôle d’une protéine cible de l’hypoxie dans le développement de l’obésité et dans les effets bénéfiques de l’activité physique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime riche en graisses pendant seize semaines pour devenir obèses, un protocole de course sur tapis de huit semaines et des tests de tolérance au glucose avec prélèvements de sang répétés. Le porteur ne décrit comme nuisance qu'un risque d'irritation aux points d'injection, avant une mise à mort pour prélever les organes. L'étude vise à préciser le rôle d'une protéine adipocytaire dans l'obésité, sans bénéfice thérapeutique annoncé au-delà d'une hypothèse.
Objectifs
Ce projet concerne l'étude d'une protéine cible de l'hypoxie et induite en réponse aux stress. Nous étudieorns son implication dans le développement de la résistance à l'insuline induite par un régime riche en graisses et nous déterminerons si la délétion de cette protéine dans les adipocytes potentialise les effets bénéfiques de l’activité physique. Ce projet ne duplique pas d'études déja publiées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'établir d'une part, le rôle d'une protéine adipocytaire dans le développement de l'obésité et de la résistance à l'insuline, et d'autre part si son invalidation peut avoir des effets bénéfiques sur le traitement de l'obésité.
Procédures
Les souris seront soumises à un régime riche en lipides pendant 16 semaines afin d'induire une prise de poids. Les souris seront soumises à un protocole d'exercice d'endurance (tapis de course adapté à la souris) pendant 8 semaines. Certaines souris obèses seront renourries avec un régime normal afin de réverser les effets de l'obésité. Les souris seront soumises à des prélèvements de sang sur souris vigiles lors des tests de tolérance au glucose (GTT) ou à l'insuline (ITT). Lors de ces tests, une goutte de sang est prélevée pour mesurer la glycémie au cours du temps (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes). Un prélévement de sang sur souris vigile sera effectué à la semaine 6, 14, 20, 22, 24 et 28 (max 100µl) de la procédure 1 et à la semaine 6, 20, 26 et 29 de la procédure 2.
Impact sur les animaux
Lors des injections en intra-péritonéale (lors des GTT, ITT ou tamoxifène) il pourrait y avoir un risque d'irritations et d'infection aux zones d'injection.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récuperer les organes.
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement, nous avons réalisé des études sur des cellules adipocytaires cultivées in vitro et nous avons montré que la protéine d'intérét est impliquée dans le développement de la résistance à l’insuline in vitro. Pour comprendre l’implication de cette protéine chez l’Homme, il est maintenant nécessaire de l’étudier sur l’animal car il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de tenir compte de la physiologie et de toutes les interactions existantes entre cellules et organes dans un organisme.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer trop d’animaux en excès. Chaque procédure utilise un nombre d’animaux minimum mais nécessaire à des études statistiques pertinentes. Le nombre d’animaux a été calculé pour limiter les variations inter-individus et atteindre un niveau statistique validé par une analyse prédictive. Les procédures seront répétées 3 fois. Cependant, si une différence statistiquement significative est observée après 2 répétitions, nous ne ferons pas la troisième répétition.
Raffinement
Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid) et celles-ci seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris maximum/cage (500cm2). Nous réaliserons aussi un suivi quotidien des animaux (par les expérimentateurs ou l'équipe zootechnique), ce qui permettra l'arrêt de l'expérience dès que les souris présenteront un mal-être ou une souffrance.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal facile à utiliser grâce à sa natalité importante, son faible coût d’élevage et notre expertise nous permettant d’avoir des locaux d’hébergements et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de leur patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont réalisées sur des souris et cette espèce nous permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses protéiques et génomique et histologique. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Seules les souris adultes seront utilisées dans ce projet. Pour l’étude du métabolisme, les souris seront mises sous régime alimentaire à 6 semaines. Ceci permet de diminuer la variabilité inter-animaux et donc de réduire les effectifs.
Etude de l’effet anti-ostéoporose de pyridazinones fluorées chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
77 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs ovaires sont retirés par chirurgie pour reproduire l'ostéoporose post-ménopause, puis elles reçoivent des injections tous les deux jours pendant jusqu'à huit semaines et deux prélèvements de sang. Le porteur admet une mortalité chirurgicale acceptée jusqu'à 10 %, et une mise à mort finale pour analyser les tissus osseux. Le test porte sur une famille de molécules développée avec des chimistes, dont l'effet reste à consolider.
Objectifs
L’ostéoporose est une problèmatique de santé publique. Cette pathologie, qui touche près de 40% des femmes et 15% des hommes de plus de 65 ans dans le monde, se traduit par une perte excessive de la masse osseuse et une diminution de la résistance des os, induisant une augmentation considérable du risque de fractures (377 000 nouvelles fractures dues à l’ostéoporose sont recencées chaque année en France). Il en résulte un important impact pour la société en raison des prises en charges hospitalières et thérapeutiques nécessaires à ces patients. Dans le cadre du développement de traitements contre l’ostéoporose nous avons développé, conjointement avec une équipe de chimistes, une famille de molécules agissant à la fois sur les symptômes directs de la maladie associés au remodelage osseux (pertes osseuses) mais également sur les phénomènes inflammatoires associés. L’objectif de ce projet est donc de consolider les données dores et déjà acquises sur l’effet biologique de ces molécules, en étudiant la restauration du phénotype osseux associé à leurs emplois, dans un modèle murin d’ostéoporose induit chez l’animal par le retrait des ovaires (ovariectomie). Cette approche expérimentale permet de récapituler les changements majeurs intervenant dans le cadre de la survenue de la ménopause et impactant l’homéostasie tissulaire osseuse (ostéoporose post-ménopause). Ce travail permettra donc, à terme, de proposer de nouvelles molécules pour lutter contre l’ostéoporose.
Bénéfices attendus
L’ostéoporose se traite actuellement par des moyens non médicamenteux et médicamenteux. La prise en charge non médicamenteuse fait ainsi appel à l’optimisation de la prise de calcium, le plus souvent d’origine alimentaire, une activité physique adaptée et régulière, couplées à la réduction de tous les facteurs favorisant la perte accélérée du capital osseux et les facteurs favorisant les chutes. Les traitements médicamenteux de l’ostéoporose se basent essentiellement sur des médicaments bloquant la résorption osseuse ou des substituts hormonaux, mais toutes ces approches thérapeutiques doivent être adaptées en fonction de différents facteurs de risques. En traitement de première intention, si certaines molécules bloquent la formation et l’activité des cellules qui dégradent naturellement l'os limitant ainsi la perte osseuse, cette approche thérapeutique ne permet pas de récupérer de la densité osseuse car elle bloque également à terme la reformation osseuse. Par ailleurs de nombreux effets secondaires sont associés à ces différents types de traitements : douleurs musculo-squelettiques et troubles digestifs auxquels s’ajoute un risque de destruction des os de la mâchoire avec certaines molecules. L’approche proposée vise à l’obtention d’une efficacité similaire à celle de ces molécules via des modes d’actions différents, laissant présager de ne pas reproduire leurs effets indésirables principaux, favorisant la prise en charge des patientes souffrant d’ostéoporose post-ménopause.
Procédures
Les animaux recevront une intervention chirurgicale de 30min sous anesthésie générale visant au retrait de leurs ovaires, puis des injections tous les 2 jours pendant 8 semaines au maximum sur animaux vigiles, sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale. Les animaux auront également deux prélèvements sanguins (100µL chacun) à la queue, sous anesthésie générale, le premier en pré-opératoire et le second à 4 semaines post-opératoires.
Impact sur les animaux
Toute approche chirurgicale implique un risque non négligeable de mortalité. Une mortalité en lien avec la réalisation de la chirurgie de 10% est le maximum acceptable au-delà duquel la procédure complète sera abandonnée. Un gonflement, une perte de liquide et une irritation, susceptibles d’engendrer une diminution de l’activité de l’animal, peuvent nuire à la bonne alimentation et donc mener à une perte de poids voire à un comportement de repli. Une légère perte de poids des animaux, classiquement constatée en post-opératoire, est attendue dans les premiers jours.
Devenir
A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés suite à la nécessité de réaliser un prélèvement sanguin puis de prélever les tissus osseux et observer la microarchitecture osseuse par scanner et analyses histologiques et immunohistochimiques afin de pouvoir évaluer l'efficacité des traitements.
Remplacement
A notre connaissance il n’y a pas d’alternative non animale efficace pour étudier la perte osseuse induite par chute des taux hormonaux, mimant l’ostéoporose post-ménopause chez l’Homme. Les modèles d’organes isolés ne peuvent pas, à notre connaissance, fournir une réponse pertinente. Les mécanismes complexes de régulation en cascade des différents tissus, chacun contenant plusieurs types cellulaires, et du système immunitaire notamment via la mise en place d’une mobilisation augmentée des cellules résorbant l’os par exemple n’est pas réalisable en dehors de modèles in vivo impliquant un animal complet. Les données sur ces régulations complexes et multifactorielles sont encore trop minimalistes en l’état actuel des connaissances scientifiques pour envisager une modélisation numérique susceptible de répondre à notre hypothèse.
Réduction
Des analyses à mi-parcours avec dispositif d’arrêt de l’expérience si l'expérmentation ne peut statistiquement pas donner de résultat seront appliquées. Une logique d’arrêt de la procédure est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe des points limites, la procédure sera interrompue. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique, un nombre minimum d’animaux sera utilisé. Nous proposons donc d’effectuer une première série de 5 animaux par groupe, avec une analyse statistique intermédiaire permettant de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir une puissance statistique satisfaisante dans la limite de 10 animaux par groupe au maximum. Des tests statistiques adaptés aux effectifs de cette étude seront ensuite utilisés.
Raffinement
Lors de leur arrivée à l'animalerie, une période de quarantaine d’une semaine sera appliquée afin que les souris s'acclimatent à leur nouveau lieu d'hébergement. Les cages seront enrichies d’abri et roues ainsi que de matériaux (morceau de coton ou de sopalin, tube en carton…) permettant aux animaux d'améliorer leur milieu. A chaque intervention les animaux seront anesthésiés si nécessaire afin de limiter le stress et la douleur. Du fait de l’approche chirurgicale, une douleur post-opératoire sera anticipée avec l’injection préventive et curative d’antidouleurs. Un suivi rapproché (2 fois par jour) sera effectué sur les trois jours suivants la chirurgie et dès les premiers signes d’inconfort détectés. Le suivi des animaux se fera tous les deux jours lors des injections de façon à contrôler l'absence de points limites tout au long de l'étude. Les molécules choisies seront injectées sur animaux vigiles sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale (afin de réduire le stress des animaux) tous les deux jours pendant 28 à 56 jours. Le poids des animaux sera mesuré à chaque temps de traitement. Les animaux seront finalement euthanasiés sous anesthésie générale gazeuse.
Choix des espèces
La réalisation de ces études chez la souris via le modèle est décrite et validée. Les expériences antérieures de l’équipe ont donné des résultats exploitables concernant les traitements dans d’autres champs d’application. La souris étant un animal de petite taille, son hébergement en groupe sociaux de plusieurs individus est facilité au sein de notre établissement utilisateur en regard du matériel à disposition. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines à l’initiation de la procédure.
Evaluation des effets de nouvelles entités pharmacologiques sur l’activité locomotrice spontanée ou pharmaco induite chez le rongeur
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 4800
9 600 rongeurs, 4 800 souris et 4 800 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 7 200 tués à l'issue et 2 400 réutilisés. Ils reçoivent des administrations répétées de composés par plusieurs voies, avec des mises à jeun pouvant atteindre seize heures et un isolement sans eau ni nourriture jusqu'à quatre heures, pour mesurer les effets de nouvelles molécules sur l'activité locomotrice. Les animaux traités sont tués pour éviter toute interférence avec d'autres essais, tandis que les témoins peuvent être réutilisés. Le porteur décrit ces données précliniques comme "indispensables" avant le passage à l'humain.
Objectifs
Des composés ciblant le système nerveux central, par leur action sur certaines régions cérébrales , peuvent avoir un impact sur l’activité locomotrice générale et donc générer des troubles locomoteurs tels que baisse de l’activité exploratoire, activité motrice diminuée ou augmentée. Ce projet a pour objectif d’étudier les effets de nouveaux produits synthétisées ou acquis au sein du laboratoire sur le comportement locomoteur spontané ou pharmacologiquement induit de rongeurs (rats ou souris). Le but de ce projet est d'obtenir des données comportementales chez le rongeur nécessaires pour poursuivre de développement de nouvelles molécules en phase clinique chez l’humain. Il s'agira de - détecter sur l'activité locomotrice l'existence d'effets secondaires chez l’animal avant administration à l’Homme , - de mesurer la capacité de composés à agir sur l’activité locomotrice soit spontanée, soit induite pharmacologiquement (en général une hyperlocomotion induite).
Bénéfices attendus
A court terme, il s’agira de démontrer à l’aide de données précliniques l’efficacité potentielle de nouveaux produits pharmacologiques : les procédures mises en œuvre permettront de mesurer l’efficacité de nouvelles molécules vis-à-vis d’activités locomotrices pharmaco induites, de les comparer et ainsi de choisir la meilleure selon des critères de sélection pour l’application thérapeutique ciblée. Il s’agira aussi de vérifier l’absence d’effets locomoteurs importants de nouvelles entités pharmacologiques sur l’activité spontanée. A long terme, ce projet permettra de d'obtenir des données scientifiques pré-cliniques robustes indispensables pour le développement de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de tests chez l'Homme.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des administrations dont la voie (orale, intrapéritonéale, sous-cutanée) ainsi que la fréquence d’administration (aigüe ou chronique, dans ce cas 2 administrations/jour max) seront adaptées en fonction des objectifs de recherches. Les délais d'administration avant les phase de test d'activité locomotrice seront de 0 à 4h. Pour chaque administration, une courte contention (
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, les animaux recevront des administrations de composés avant les évaluations comportementales. Il est possible que la courte contention alors nécessaire (
Devenir
Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort. Certains animaux, les animaux contrôles, pourront cependant être soumis à une autre procédure expérimentale du projet si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée, ou pourront être réutilisés pour d’autres projets en fonction des objectifs de recherche. La décision sera prise par le responsable projet (une personne compétente désignée par lui) ou le vétérinaire.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de nouvelles entités pharmacologiques sur l’activité motrice dans le cadre du développement de nouveaux médicaments. Il n’existe à ce jour pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet c’est pourquoi l’utilisation de modèles in vivo est indispensable avant toute administration à l’homme, rat et souris étant ici les espèces les plus adaptées.
Réduction
Un effectif minimum et suffisant de 12 animaux par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques. En fin de procédure, les animaux (en particulier les contrôles) seront au maximum réutilisés dans d’autres projets comportementaux ou bien pour des analyses histologiques faisant l’objet d’autres projets.
Raffinement
Les animaux (rats, souris) sont hébergés en animalerie centrale et restent 5 jours en acclimatation avant toute expérimentation. Tout au long des études, les animaux sont hébergés en groupe (nombre maximal défini par la règlementation en cours) dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, Sizzle pad pour nidification…). Le change des cages se fait 2 fois par semaine. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), et font l’objet d’un suivi SBEA (Structure Bien-être Animal) par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Les membres de la SBEA (Structure Bien-être Animal) effectuent une observation mensuelle de tous les animaux. En cas d’atteinte d’un des points limites définis plus loin, l’animal est écarté de l'étude pour subir les soins essentiels ou être euthanasié si nécessaire. Le raffinement sera aussi obtenu grâce au recours à des procédures les moins invasives possibles ainsi qu’à la familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (période d’habituation aux pièces et dispositif expérimental, phase de familiarisation aux manipulations, administrations…).
Choix des espèces
Le rat et la souris sont déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et ils ont un système nerveux suffisamment évolué pour envisager raisonnablement une extrapolation à l’homme de certains résultats. De nombreux parallèles existent en effet entre les caractéristiques comportementales étudiées chez le rat ou la souris et les caractéristiques du comportement humain. Ce sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets de substances sur l’activité locomotrice. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets de produits sur l’animal à d’autres stades de développement. De plus, les tests de locomotion décrits dans ce projet sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités motrices et cognitives fonctionnelles.
Hypothyroïdie induite chez la souris : analyse comportementale et imagerie cérébrale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une hypothyroïdie leur est induite par un régime carencé et un antithyroïdien, associée à une chirurgie cérébrale et à un hébergement en obscurité constante ou en cycle jour-nuit atypique, en cage individuelle. Le porteur attend une bradycardie, une température abaissée et un état d'anxiété supérieur à la normale, évalué par des tests comportementaux, avant la mise à mort pour prélèvement de tissus. Les débouchés annoncés pour les patients, une luminothérapie ou des thérapies comportementales, restent conditionnés à la mise en évidence d'un dérèglement de l'horloge interne.
Objectifs
L'hypothyroïdie correspond à un déficit en hormones thyroïdiennes. Toutes causes confondues, l'hypothyroïdie touche près de 10% de la population. Les patients souffrent de fatigue chronique, de bradycardie, d'une sensibilité accrue au froid, et de prise de poids. Ils présentent aussi des troubles liés à l'humeur tels qu'irritabilité, anxiété ou dépression, dont l'étiologie reste mal comprise. Plusieurs observations sur des patients et des modèles animaux suggèrent que l'hypothyroïdie pourrait perturber l'horloge circadienne. Cette horloge biologique coordonne les rythmes physiologiques et comportementaux avec le cycle jour-nuit. Comme le dérèglement de l'horloge cause des troubles de l'humeur tels que ceux observés chez les patients hypothyroïdiens; il est tentant de supposer un lien de causalité entre ces troubles et les rythmes biologiques au cours de l'hypothyroïdie. Nous souhaitons tester cette hypothèse dans un modèle murin d'hypothyroïdie induite.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de mieux comprendre l'étiologie des troubles de l'humeur souvent associés à l'hypothyroïdie, et d'envisager des approches thérapeutiques au-delà du traitement hormonal de substitution. En effet, la prise d'hormone thyroïdienne est efficace pour le traitement de l'hypothyroïdie sur le long terme, mais définir et ajuster la dose optimale de chaque patient s'avère souvent très long et laborieux. La mise en évidence d'un dysfonctionnement de l'horloge circadienne ouvrirait de nouvelles possibilités d'accompagnement des patients dysthyroïdiens pendant cette période d'ajustements hormonaux, par exemple par la mise en place d'une luminothérapie ou de thérapies comportementales pour resynchroniser les rythmes biologiques.
Procédures
Induction d'une hypothyroïdie par régime hypo-iodé et traitement anti-thyroïdien. Maintenue pendant 2 à 3 semaines. Prélèvement unique de 3µl de sang, à la pointe de la queue de souris vigiles. Chirurgie cérébrale ciblée, sous anesthésie générale. Hébergement en cycle jour-nuit atypique (11.5 heures de lumière, 11.5 heures d'obscurité; ou obscurité constante pendant 2 semaines). Hébergement en cage isolée, avec contacts sociaux visuels.
Impact sur les animaux
La présence d'un agent anti-thyroïdien dans l'aliment hypo-iodé le rend moins appétant. Les souris mangent moins mais continuent à prendre du poids, et se stabilisent à environ 90% du poids des souris nourries avec l'aliment contrôle. Les souris hypothyroïdiennes présentent aussi une température corporelle légèrement abaissée par rapport aux souris contrôles (uniquement pendant leur phase d'inactivité), ainsi qu'une bradycardie (ralentissement de la fréquence cardiaque d'environ 25%). Comme cela est le cas chez les patients, nous nous attendons aussi à un état d'anxiété supérieur à la normale, qui sera évalué au travers des tests comportementaux. Le fonctionnement de l'horloge interne sera testé par mesure de l'activité locomotrice volontaire en absence de repères temporels (suppression du cycle jour-nuit). Cette étape requiert un hébergement des souris en cages individuelles équipées d'une roue d'activité, dans l'obscurité constante pendant une vingtaine de jours. Un prélèvement sanguin unique sera réalisé pour évaluation du statut thyroïdien par dosage hormonal. Cela nécessite la collecte d'une goutte de sang suite à une incision à la pointe de la queue (
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement de tissu.
Remplacement
Il n'existe pas de méthodes alternatives pour étudier l'impact d'une perturbation systémique (l'hypothyroïdie) sur le fonctionnement du cerveau et ses conséquences en terme de comportement. La souris constitue un excellent modèle d'étude des rythmes circadiens chez les Mammifères, pour lequel la physiologie générale, les comportements, et le fonctionnement de l'horloge interne sont suffisamment bien décrits pour servir de référence dans le cadre de ce projet. Notre objectif sur le long terme est d'établir un modèle mathématique suffisamment riche et prédictif pour anticiper le devenir de l'horloge circadienne dans différentes situations physiopathologiques en complément/remplacement des modèles animaux. Les données que nous obtiendrons dans ce projet s'inscrivent dans cette ambition et serviront à préciser et compléter une version initiale du modèle que nous avons proposé.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux impliqués dans les tests comportementaux a été estimée par un calcul de puissance a priori (n=26 souris par groupe). Chaque souris sera évaluée de façon longitudinale dans plusieurs tests, permettant de réduire le nombre total d'animaux. Pour la procédure d'imagerie in vivo, chaque souris sera testée sous régime contrôle et sous régime hypothyroïdien. Chaque souris étant son propre contrôle, le nombre d'animaux impliqués sera réduit. Notre expérience démontre qu'il faut opérer 6 à 8 souris pour obtenir n=4 souris avec un signal suffisamment fort afin de décrire le fonctionnement de suffisamment de neurones horloges dans une condition donnée (un minimum de 10 neurones visibles dans le champ optique par animal.
Raffinement
Dans un souci de raffinement du protocole, nous avons préféré mettre en oeuvre un modèle d'hypothyroïdie induite plutôt que de réaliser une ablation chirurgicale de la glande thyroïde. Cette approche ne nécessite pas d'adaptation particulière des conditions d'élevage. Toutefois, l'apport de matériel de nidification sera renforcé afin de permettre aux souris hypothyroïdiennes (en légère hypothermie) de mieux maitriser la température de leur environnement. Les animaux seront habitués à être manipulés par la personne en charge des tests comportementaux. En vue d'évaluer le statut thyroïdien de façon la moins invasive possible, nous avons développé un protocole de dosage ultra-sensible de l'hormone TSH, à partir d'un volume extrêmement faible de sang total (3 µl, à comparer avec 50 à 100 µl pour les kits commerciaux). La chirurgie préparatoire à la procédure d'imagerie est conduite sous anesthésie générale, avec médication post-opératoire pendant 48 heures. Toutes les souris hébergées en cage isolée conserveront un contact visuel avec d'autres congénères. L'hébergement dans les cages à roue constitue un enrichissement très apprécié, et la mesure de l'activité locomotrice volontaire fournira un index de l'état général des souris : toute souris parcourant une distance inférieure de 50% à celle parcourue par les souris contrôles sera pesée et observée. En cas de perte de poids supérieure à 10% du poids initial, de prostration ou de poil hérissé, les souris auront accès à de la nourriture hydratée et/ou un anti-inflammatoire non-stéroïdien pendant 24 à 72 heures. Nous ne nous attendons pas à un degré de souffrance justifiant la mise à mort des animaux, mais si une souris devait atteindre un poids inférieur de 15% à son poids initial, alors elle sera mise à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle mammifère de choix dont l'horloge circadienne et la physiologie thyroïdienne reposent sur les mêmes principes moléculaires et cellulaires que l'espèce humaine. Cette espèce donne accès à un large éventail d'outils génétiques et moléculaires pour manipuler les systèmes biologiques (ex : nous utiliserons ici des lignées exprimant des allèles modifiés de gènes de l'horloge), ou pour mesurer l'activité neuronale par imagerie in vivo. Jeunes adultes de 6-7 semaines en début d'expérimentation.
Evaluer le potentiel thérapeutique du plasma riche en plaquettes (PRP) dans la douleur neuropathique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une douleur chronique leur est infligée par chirurgie de la patte, entretenue de cinq à douze semaines, avec jusqu'à vingt-cinq tests comportementaux par animal pour la mesurer. Le porteur indique que cette douleur ne peut pas être soulagée puisqu'elle est l'objet même de l'étude, menée pour tester un plasma riche en plaquettes. Les bénéfices annoncés pour les patients, prévention et soulagement de douleurs neuropathiques et post-chirurgicales, restent renvoyés au conditionnel et à un usage clinique futur.
Objectifs
La douleur neuropathique est par définition consécutive à une lésion ou une maladie affectant le système somatosensoriel. Chez la plupart des patients, elle a une origine périphérique, par exemple à la suite d'une lésion des nerfs périphériques. La douleur post-chirurgicale chronique quant à elle est définie comme une douleur qui persiste au-delà de 2 mois après la chirurgie sans autre cause potentielle de douleur telle qu’une infection. Généralement chroniques et invalidantes, ces 2 grands types de douleurs, fréquemment rencontrés dans la population, affectent fortement la qualité de vie des patients et ont un impact socio-économique important par leurs répercussions sur la vie professionnelle. La prise en charge de ces douleurs constitue donc un enjeu important de santé publique. D'un point de vue thérapeutique, ces douleurs sont cependant difficiles à traiter. Certains antidépresseurs et anticonvulsivants sont actuellement les meilleures thérapies disponibles mais leur utilisation clinique est limitée par des effets indésirables. Il en est de même pour les douleurs post-chirurgicales chroniques habituellement traitées avec des opiacés qui entraînent de nombreux effets indésirables et parfois même une addiction. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements et/ou approches thérapeutiques pour soulager ces types de douleurs chroniques. Dans ce contexte, un nouvel outil thérapeutique autologue a été développé ces dernières années : l'injection de plasma riche en plaquettes (PRP) qui est un concentré sanguin plaquettaire autologue contenant une concentration naturelle de facteurs de croissance et de cytokines. Cette technique, largement utilisée en rhumatologie ou en médecine du sport reste encore peu utilisée dans le domaine de la douleur chronique. L'intérêt médical de cette préparation est que les plaquettes concentrées vont favoriser une augmentation des facteurs de croissance libérés au niveau du site de lésion, favorisant ainsi le processus de guérison. Cependant, le mécanisme d'action du PRP reste peu clair. Pour aller au-delà des connaissances actuelles, nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique du PRP dans un modèle murin de douleur neuropathique induite par une compression du nerf sciatique, de généraliser cette évaluation à une autre étiologie de douleur couramment rencontrée : la douleur post-chirurgicale et d'étudier les mécanismes d'action sous-jacents.
Bénéfices attendus
Nous postulons que le PRP pourrait non seulement avoir un potentiel thérapeutique dans le soulagement de la douleur neuropathique installée, mais pourrait également être bénéfique dans la prévention de son initiation et de son maintien. Le PRP pourrait également être efficace pour traiter d’autres étiologies de douleurs comme les douleurs post-chirurgicales qui sont actuellement mal soulagées par les analgésiques acutels (patients non répondeurs ou présentant trop d'effets indésirables). Nous espérons, avec ce projet, proposer un outil thérapeutique pour empêcher le développement des douleurs neuropathiques et post-chirurgicales. A l’issue de ce projet, nous espérons pouvoir proposer ce traitement chez l’Homme en clinique afin de prévénir et de soulager les douleurs neuropathiques et post-chirurgicales. Cette avancée pourrait également permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une douleur chronique allant de 5 semaines pour la douleur post-chirurgicale à 12 semaines maximum pour la douleur neuropathique. Les animaux subiront donc une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 5 min environ sous anesthésie générale. Un groupe d’animaux recevront du plasma riche en plaquettes (PRP) au niveau du site de lésion pendant la chirurgie et un autre groupe d’animaux recevront du PRP par administrations lombaires sous anesthésie gazeuse (5 administrations maximum espacées de 24h, la durée d’une injection intrathécale est de 5 min environ) une fois la douleur chronique installée. Ces animaux subiront également plusieurs tests comportementaux (maximum 25 tests par animal avec un délai de 24h minimum entre chaque test) afin d’évaluer leur douleur (durée des tests allant de 2 min à 20 min avec l’habituation). La durée totale du projet sera de 14 semaine pour la douleur neuropathique et de 7 semaines pour la douleur post-chirurgicale.
Impact sur les animaux
Il y a présence de douleur qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Mais l'objectif de l'étude est d'évaluer l'effet analgésique préventif et curatif du PRP, celui-ci devrait donc avoir un effet bénéfique sur la douleur. Suite à la chirurgie neuropathique ou incision de la patte, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les chirurgies neuropathiques ou incisionnelles vont induire une réponse inflammatoire classique et attendue qui permet la mise en place de ces modèles. Certains animaux vont subir des injections intrathécales lombaires. Les animaux subiront toute une batterie de tests comportementaux nociceptifs sur lesquels ils gardent le contrôle (retrait de la patte).
Devenir
A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour prélèvements.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse de l’effet thérapeutique du PRP dans un modèle de douleur neuropathique ainsi que dans un modèle de douleur post-opératoire nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 14 souris mâles et 14 souris femelles, le risque de variabilité lié à l’activité intrinsèque du PRP étant inconnu et non négligeable. Un calcul statistique a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides au plan statistique. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d'analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la Société du Bien-Etre Animale (SBEA) de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font de la souris un modèle pertinent. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (arrivée des animaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).
Transfert de microbiote de cochon stressé chez la souris : étude des effets sur la physiologie de l’hôte et d’une supplémentation en probiotiques.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Rendues stériles puis colonisées par le microbiote de cochons stressés ou non, elles subissent des administrations orales répétées, des prélèvements de fèces et un prélèvement de sang terminal, pour repérer des bactéries probiotiques. Le porteur relie l'objectif au bien-être des animaux non-humains en élevage porcin, tout en précisant que des animaux moins stressés sont aussi plus performants économiquement. Les retombées annoncées pour la santé humaine sont renvoyées à un horizon lointain.
Objectifs
L'intestin héberge une communauté microbienne résidente (microbiote intestinal), abondante et complexe, qui assure des fonctions essentielles pour la santé de l'hôte. Il participe notamment à la dégradation des aliments, à la synthèse de vitamines et à la protection contre des microorganismes pathogènes. Chez l'espèce porcine, le microbiote intestinal joue un rôle dans la détermination des paramètres d'intérêt économique pour le secteur, tels que le poids corporel et le comportement. Notre projet de recherche concerne l’étude des mécanismes d’action par lesquels le microbiote ou ses composants agissent sur le bien-être de l’hôte. Nous analyserons l’impact de microbiotes de cochons stressés ou non stressés transférés à des souris dépourvues de microbiote, sur des paramètres liés au stress, ainsi que le bénéfice d’une supplémentation en bactéries sur ces mêmes paramètres. Notre objectif est de pouvoir identifier des leviers d’action pour améliorer le bien-être animal dans les élevages porcins. Par ricochet, des animaux moins stressés sont globalement en meilleure santé et plus performants économiquement. Au final, ces éléments sont susceptibles d’avoir également des répercussions en santé humaine. Ici, la stratégie consiste à utiliser des souris porteuses de microbiotes de cochon stressés ou non stressés puis à étudier différents paramètres de l’hôte pour identifier des « cibles » du microbiote intestinal. Dans notre projet, nous étudierons plus particulièrement des mélanges de microbiotes de porcs placés en condition classique d’élevage, considérée ici comme stressante, ou bien en condition non-stressante ; ceci afin d’améliorer le bien-être animal dans les élevages. Nous implanterons les microbiotes issus de ces animaux dans des souris axéniques afin de constater l’impact de ces microbiotes sur différents paramètres physiologiques liés au stress. La souris servira donc de modèle pour établir un lien de causalité entre le microbiote et le stress chez le porc. Finalement, certaines bactéries, déjà identifiées comme marqueurs de bien-être chez le cochon et identifiées comme probiotiques potentielles, seront analysées dans notre étude. Pour cela, elles seront administrées au moment de la colonisation avec le microbiote stressé. Nous travaillerons sur des souris élevées dans des enceintes stériles (isolateurs). L'élevage en isolateur permet d'obtenir des animaux dépourvus de bactéries ou colonisés par une ou plusieurs bactéries.
Bénéfices attendus
Le bénéfice essentiel de ce projet est la génération de nouvelles connaissances concernant le lien entre le microbiote et la santé de l’hôte. Il permettra aussi l’identification de bactéries probiotiques ayant un effet bénéfique sur la santé. Notre objectif est de pouvoir améliorer le bien-être animal dans les élevages porcins. Par ricochet, des animaux moins stressés sont globalement en meilleure santé et plus performants économiquement. Au final, de manière plus lointaine, ces éléments sont susceptibles d’avoir également des bénéfices en santé humaine.
Procédures
Administrations par voie orale (moins de 5 minutes par administration, sur animal vigile) : 6 fois sur 3 jours pour tous les animaux. Prélèvements de fèces 2 fois par semaine (environ 5 minutes par prélèvement, sur animal vigile), entre 6 et 10 fois en tout. Prise de poids 3 fois par semaine (environ 3 minutes par animal, sur animal vigile), entre 9 et 15 fois en tout. Prélèvement de sang en fin d’essai (moins de 2 minutes), sur animal vigile: 1 seule fois pour tous les animaux.
Impact sur les animaux
Il y aura besoin de contention pour effectuer les gavages qui peuvent générer un bref inconfort et un peu de stress transitoire pour les animaux. Par ailleurs, en fin d´essai, nous réaliserons un prélèvement de sang. Enfin, nous aurons également besoin d’isoler les animaux dans des pots en plastique transparents afin de collecter des fèces individuellement. Cet isolement dure quelques minutes.
Devenir
La survie des animaux est incompatible avec les différents prélèvements effectués en fin d’essai.
Remplacement
Pour l’étude des effets d’un microbiote sur un organisme, les cultures cellulaires ne permettent pas de reconstituer les communications complexes entre les différents organes de l’hôte. Le recours à des animaux axéniques (dépourvus de microbiote) est nécessaire.
Réduction
Les données de la littérature sur le sujet ont permis de définir des tailles de lots de 10 souris pour chaque condition afin d’obtenir des résultats significatifs à l’aide de tests statistiques appropriés.
Raffinement
Tout au long des procédures expérimentales, les animaux sont observés quotidiennement. Par ailleurs, ils sont hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas exposer ces animaux sociaux à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux sont séparés ne représentent qu’un temps très court (5 minutes environ, pour chaque gavage et/ou récupération de fécès) et ne sont pas considérées comme dommageables. Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la création de nids, bâtons à ronger. Le matériel que nous utilisons est adapté à nos animaux. Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin à bords arrondis et de taille adaptée pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Des points limites sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux. Enfin, toutes les personnes manipulant les animaux sont formées et compétentes pour ce type d’expérimentation.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence et un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies. Le besoin de travailler en environnement complètement stérile, compatible avec la taille des animaux, constitue de plus un facteur imposant cette espèce animale. Des élevages de souris axéniques sont existants et accessibles, et les outils de biochimie et biologie moléculaire sont particulièrement bien développés pour l’espèce (contrairement au porc par exemple). De plus, même si des porcs sans microbiote sont disponibles, ils sont obtenus par césarienne et non élevés avec la mère, ce qui génère un stress susceptible de biaiser les résultats d’un projet comme le nôtre qui s’intéresse justement au stress et bien-être des animaux. Les animaux sont utilisés à un âge de 4 à 10 semaines, qui correspond à un âge auquel le système digestif est mature alors que les animaux sont toujours en croissance. Cet âge constitue donc un temps logique par rapport à la physiologie de l’animal.
Impact de la réponse UPR (Unfolded Protein Response) sur la réponse immunitaire lors de l’infection aigüe et chronique par Toxoplasma gondii.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
874 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 330 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées une fois par le parasite Toxoplasma gondii, puis tuées à un moment donné pour prélever le foie, la rate et le cerveau. Le porteur indique que 15 à 20 % des souris peuvent développer une forme aiguë avec tremblements, poil hérissé et abdomen distendu, et prévoit une euthanasie dès les premiers signes. Il décrit la souris comme un "modèle incontournable", hôte naturel du parasite, qu'il n'a pas été possible de remplacer par des tests in vitro.
Objectifs
Toxoplasma gondii est un modèle pertinent pour l’étude des mécanismes impliqués dans la virulence des parasites apicomplexes, qui incluent Plasmodium, agent de la Malaria. Nos recherches sur les mécanismes assurant la dissémination et la survie du parasite au sein de son hôte pourront servir à long terme à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les parasites de ce phylum. De plus, la toxoplasmose chronique est responsable d’encéphalites aigües lors de la réactivation des formes kystiques latentes présentes dans le cerveau des individus infectés souffrant d'immunodépression. Ainsi, l’étude des mécanismes régulant les interactions entre le parasite et le système immunitaire de l’hôte permettra de lutter contre l’établissement de la toxoplasmose cérébrale latente pour laquelle il n’existe actuellement aucun traitement. Préalablement aux expériences sur l'animal, des expériences menées in vitro ont permis de démontrer que l’infection par T. gondii stimule l’induction de la réponse UPR dans des cellules dendritiques. Par la suite, dans les souris, nous avons pu démontrer l’activation de la voie IRE1 de l’UPR dans les cellules dendritiques conventionnelles de type 1 (cDC1) lors de l’infection et que cette activation est essentielle pour monter une immunité protectrice contrôlant la dissémination parasitaire. Cependant, il reste à identifier par quels mécanismes la voie IRE1 stimule les fonctions des cDC1. En particulier, nous nous intéressons à la régulation par la voie IRE1 de l’activité de présentation antigénique sur les molécules CMH-I des cDC1, un processus nécessaire à l'activation des lymphocytes T spécifiques, amenant une protection à long terme contre une ré-infection, ainsi que le contrôle de la toxoplasmose chronique cérébrale. D'autre part, l'évaluation de la pathogénicité de certaines souches parasitaires mutantes peut aider à développer de nouvelles stratégies de vaccination contre cette infection, pour laquelle aucun vaccin n'est disponible chez l'Homme. En cela, nos recherches nécessitent des modèles in vivo pertinents qu’il n’a pas été possible jusqu’ici de remplacer par des tests in vitro.
Bénéfices attendus
Des études ont montré que l'induction de la voie IRE1 dans les cellules dendritiques est essentielle à la mise en place d'une réponse immunitaire protectrice contre certaines infections bactériennes et parasitaires par l'induction d'une réponse efficcace des Lymphocytes T (LT). Découvrir les mécanismes moléculaires sous-jacents permettra de proposer des thérapies ciblées visant à booster l'activation des LT spécifiques et bloquer l'installation de la toxplasmose latente cérébrale, pour laquelle il n'existe aucun traitements. Nos découvertes pourront également s'appliquer à d'autres agents infectieux comme Mycobactérium (agent de la tuberculose) et des virus respiratoires, qui ont été démontrés comme activant la voie IRE1 dans les cellules dendritiques lors d'une infection. D'autre part, l'évaluation de la pathogénicité de certaines souches parasitaires mutantes peut aider à développer de nouvelles stratégies de vaccination contre la toxoplasmose.
Procédures
L’infection des souris est réalisée une seule fois en début d’expérience par injection intrapéritonéale d’une faible dose de parasites. Les prélèvements sont effectués post-mortem à un temps donné de l’infection, représentant la fin du protocole expérimental. Le foie, la rate, le cerveau sont prélevés ainsi que 100µL de sang par ponction cardiaque. Les souris ne reçoivent aucun traitement ou manipulation avant euthanasie.
Impact sur les animaux
Les souris sont infectées une seule fois par voie intra-péritonéale en début de protocole expérimental et ne sont soumises à aucun prélèvement. Le prélèvement des organes/sang ne se fait qu'après la mise à mort en fin de protocol expérimental. Les souris infectées par la souche parasitaire PRU sont euthanasiées 6 jours post-infection dans la majorité des procédures expérimentales, avant le développement de symptômes cliniques pouvant entrainer une souffrance de l'animal. Pour le modèle de la toxoplasmose chronique, les souris seront sacrifiées 3 semaines post-infection, mais à ce stade, elles ne développent aucun signe clinique, cette forme de toxoplasmose étant bégnine (certains symptômes neurologiques de changements comportementaux peuvent se développer à partir de 3 mois d’infection). Cependant, certaines souris peuvent développer (dans 15 à 20% des cas) une toxoplasmose aïgue (Jours 9-14 post-infection) corrélée à des changements de comportement : tremblement, diminution de l’exploration, et/ou d'aspect physique externe : poil hérissé, abdomen distendu. Les souris sont surveillées quotidiennement après l'infection et l'apparition de signes précoces de souffrance (point limite fixé est quantifié par une grille de score) entrainera leur euthanasie immédiate.
Devenir
Afin d'évaluer la réponse immunitaire des souris infectées ainsi que la dissémination parasitaire, nos procédures impliquent le prélèvement d'organes vitaux comme la rate, le foie et le cerveau. Les animaux doivent donc être euthanasiés avant prélèvement et analyse de ces paramètres. De manière similaire, la génération de cellules dendritiques primaires à partir de la moëlle osseuse requiert le prélèvement des tibias et fémurs de la souris et ne peut donc se faire qu'après euthanasie de l'animal.
Remplacement
A ce jour, aucun système in vitro ne permet d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à la toxoplasmose aigüe ou cérébrale chronique, caractérisée par l’installation de kystes latents dans le cerveau qui sont résistants aux traitements antibiotiques existants. De plus, l'évaluation de la pathogénicité de certaines souches parasitaires mutantes peut aider à développer de nouvelles stratégies de vaccination contre cette infection. En cela, nos recherches nécessitent des modèles in vivo pertinents qu’il n’a pas été possible jusqu’ici de remplacer par des tests in vitro. De nombreux aspects de la pathogénicité étant comparables entre l’Homme et la souris, il est admis que la souris constitue un modèle incontournable pour le suivi de la réplication du parasite in vivo et l’étude des interactions avec le système immunitaire de l’hôte. Par ailleurs, les différentes stratégies innovantes de lutte contre le parasite peuvent être évaluées et validées chez la souris qui est un modèle naturel d’infection et développe une toxoplasmose aigüe et chronique, similaires à ce qui est observé chez l’Homme. Par ailleurs, nous analysons la modulation de la réponse UPR (Unfolded Protein Response) au stress infectieux dans les cellules dendritiques, une réponse qui permet la mise en place d'une réponse immunitaire efficace contre le parasite. Nos résultats préliminaires montrent un impact de la réponse UPR sur la prolifération d'un sous-type de DC spléniques. Pour ces raisons, notre projet nécessite de réaliser nos études dans des cellules primaires et non des lignées cellulaires immortalisées, qui ont un cyle de division modifié. Cependant, nous utilisons une lignée de cellules dendritiques cDC1 immortalisée (MuTuDC) afin de valider certaines de nos hypothèses mécanistiques avant de les tester sur des cellules primaires issues de souris ou dans la souris, et d'étudier leur impact sur la dissémination parasitaire et la mise en place d'une immunité mémoire.
Réduction
Afin de minimiser le nombre de souris utilisées, l’analyse de nombreux paramètres se fait simultanément sur une même souris après prélèvement des différents organes (rate, foie, cerveau, sang). Les expériences sont répétées 3 fois et chaque expérience (3-7 souris par groupe expérimental) est analysée de manière indépendante. Ces conditions nous permettent de vérifier la reproductibilité des observations et de générer des résultats statistiquement validés. Notre connaissance préalable des protocoles expérimentaux utilisés ainsi qu'une étude statistique adaptée nous permet d’assurer la fiabilité du résultat tout en limitant à son minimum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur pendant l’expérience : les animaux manipulés sont isolés dans une pièce séparée afin d’éviter tout stress aux animaux non manipulés ; les souris ne sont pas soumises à des traitements ou prélèvements répétitifs mais à un prélèvement unique après euthanasie. De plus, après infection, les animaux sont surveillés quotidiennement afin de détecter les signes éventuels de souffrance le plus tôt possible. L'obtention du point limite fixé, caractérisé par un changement de comportement : diminution de l’exploration, ou d'aspect physique externe : poil hérissé, abdomen distendu, entrainera l’euthanasie immédiate de l’animal . Les animaux sont maintenus dans les conditions standart de température, cycle lumière/obscurité, d'alimentation et la cage possède un enrichissement (maison en dur).
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent d’étude car il est un hôte naturel de T. gondii qui inclut 1) La possibilité d’induction d’une toxoplasmose aigüe et chronique chez la souris par des souches de T. gondii infectant l’Homme et la pertinence de ce modèle expérimental en ce qui concerne l’évolution de la maladie, 2) Les nombreuses connaissances et outils disponibles pour cette espèce. En particulier, de nombreux anticorps contre des cytokines, chimiokines, voies de signalisation pro-inflammatoires assurent la réalisation d’expériences clés pour l’étude de la réponse immunitaire. Aussi, l’existence de LT CD8+ reconnaissant spécifiquement des antigènes de T. gondii sur les cDC murines permettent l’étude de l’activité de présentation antigénique. Ces paramètres font de ce modèle expérimental un système de choix qui permet d’éviter le recours aux espèces plus sensibles.
Comprendre la plasticité cellulaire dans la récidive du glioblastome après traitement
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
592 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules de glioblastome sont injectées dans le cerveau, la tumeur est retirée par craniotomie, puis les animaux reçoivent radiothérapie et chimiothérapie selon le protocole utilisé chez les patients, avant mise à mort pour analyses. Le porteur indique que la craniotomie provoque une douleur et que la tumeur peut entraîner une perte de coordination et de poids. Il affirme qu'il est impossible de recréer le microenvironnement tumoral hors de l'animal, tout en reconnaissant avoir observé in vitro une partie du phénomène étudié.
Objectifs
Les glioblastomes (GBM) sont les tumeurs cérébrales les plus fréquentes et les plus agressives chez l’adulte. Malgré un traitement lourd associant chirurgie (résection pour réduire au maximum la tumeur), chimiothérapie et radiothérapie (protocole de Stupp), la survie moyenne des patients n’excède pas 15 mois en raison de l’apparition, quasi-systématique, de récidives. Le principal facteur supposé pouvant expliquer l’apparition de ces récidives est la repousse de cellules très invasives, se propageant à partir de la masse tumorale. L’environnement protecteur empêche l’élimination de ces cellules par le protocole de Stupp. L'unité gliovasculaire (UGV) faite de cellules tumorales, de cellules immunitaires et de cellules cérébrales localisées à proximité des vaisseaux sanguins- est une niche protectrice favorisant la survie, la résistance au traitement et la dissémination des cellules de GBM. Elle a la pleine compétence pour jouer un rôle clé dans la récidive mais son rôle dans ce processus est encore mal connu. Mieux comprendre le comportement des cellules tumorales ainsi que le rôle du microenvironnement au sein de l'unité gliovasculaire et identifier des biomarqueurs spécifiques de la récurrence pourraient transformer considérablement notre vision actuelle de la thérapie des GBM et ainsi améliorer la prise en charge des GBM chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est la tumeur cérébrale agressive la plus fréquente chez l’adulte et l’un des cancers les plus mortels. Malgré des traitements très lourds (chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie), la rechute est pratiquement inévitable (90%). Des données de la littérature ainsi que les résultats préliminaires obtenus au laboratoire, suggèrent que l’unité gliovasculaire (cellules tumorales, endothéliales, péricytaires, astrocytaires et immunitaires) pourrait jouer un rôle déterminant dans la survie des cellules tumorales après traitement. Cette étude nous permettra de définir précisément le rôle de l’unité gliovasculaire dans la résistance au traitement et sera déterminante pour l’identification de cibles thérapeutiques. Ce projet s’insère dans une grande étude réalisée en collaborations avec plusieurs équipes de recherche sur le glioblastome (cliniciens et chercheurs). Les résultats obtenus dans notre modèle préclinique murin seront ensuite validés à partir de biopsie de patients traités ou non au protocole de Stupp. L'application directe et immédiate de ces connaissances pourrait ainsi favoriser le développement de nouvelles thérapies ciblées, dont le GBM a urgemment besoin puisqu’ aucune amélioration thérapeutique pertinente n'a été apportée ces 15 dernières années. Malgré les efforts massifs déployés dans le domaine clinique et de la recherche, le traitement du GBM reste l'un des défis les plus difficiles à relever en oncologie clinique. Presque tous les patients atteints de GBM reçoivent le protocole de Stupp, qui est la norme en matière de soins ; par conséquent, beaucoup d'entre eux bénéficieraient de stratégies thérapeutiques visant à accroître son efficacité. Dans ce contexte, il s'agit d'une approche entièrement nouvelle issue d'une idée novatrice. Les résultats de ce projet jetteront les bases des objectifs futurs : déterminer de nouvelles voies et stratégies pour cibler les voies de résistance gliovasculaire post-Stupp et améliorer le traitement en collaboration avec les cliniciens. La compréhension de la résistance des GBM au protocole Stupp et de la biologie de l’unité gliovasculaire pourraient transformer considérablement notre vision actuelle du traitement des GBM dans le but ultime d’améliorer la survie des patients.
Procédures
L’objectif 1er de cette étude est d’établir un modèle pré-clinique de traitement du GBM chez la souris (protocole de Stupp). Pour cela, différents groupes de souris seront constitués. Groupe 1 : dans cette première procédure visant à mettre au point le retrait chirurgical de la tumeur, des cellules tumorales sont injectées dans le cerveau (durée de l’anesthésie : 30 min). Après le développement de la tumeur les souris sont opérées afin de procéder au retrait de la tumeur (durée de l’anesthésie : 30min). Groupe 2 : Après mise au point du retrait de la tumeur avec le groupe 1, nous implanterons des cellules tumorales dans de nouvelles souris. Après développement de la tumeur, elle sera retirée. 3 jours après la résection de la tumeur, les animaux anesthésiés seront traités par radiothérapie (durée 15 minutes). Un traitement sera également administré directement dans l’abdomen de l’animal vigile (5 minutes). Ces traitements (radiothérapie et chimiothérapie) seront répétés au maximum 3 fois sur 3 jours consécutifs. Groupe 3 : sur certaines souris du groupe 2, une fenêtre d’observation sera posée après la résection (durée d’anesthésie 30 min). Ces animaux seront également traités par chimiothérapie et radiothérapie selon le même protocole décrit plus haut. Les animaux seront suivis par imagerie une fois avant le début du traitement puis en fin de traitement à raison d’une fois par semaine pendant 3 semaines. Des prélevements de sang seront réalisés à raison de 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (durée du geste inférieur à 30 sec).
Impact sur les animaux
Lors de l’injection : Les animaux greffés avec les cellules tumorales vont développer une tumeur cérébrale dont la taille sera évaluée fréquemment par dosage sanguin. Lors la résection : L’os du crane étant peu innervé, la craniotomie est à l’origine d’une douleur mesurée. La résection de la tumeur en elle-même ne provoque pas de douleurs puisque le cerveau ne possède pas de terminaisons nerveuses. Cependant, la craniotomie peut engendrer un changement de pression intracrânienne et la résection en elle-même peut être à l’origine de petites hémorragies. Suite à cette intervention, une réduction des mouvements et de la mobilité de l’animal, une perte de coordination peuvent subvenir dans les heures qui suivent la chirurgie. Dans les jours suivant, une perte de poids peut également être observé. Le traitement aux rayonnement ionisants n’entraine pas d’inconfort en lui-même et est réalisé sur des animaux anesthésiés Les nuisances attendues suite à l’injection de la chimiothérapie seront celles liées à l’injection (douleur légère de courte durée). D’après notre expérience aucune douleur n’est attendue suite à l’administration de ce traitement. Les prélèvements sanguins réalisés au niveau de la queue de l’animal provoqueront une douleur légère et un stress de courte durée chez la souris.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Des résultats préliminaires du laboratoire couplés à des données de la littérature nous mènent à penser que les modifications de comportement des cellules tumorales après traitement (protocole de Stupp) sont intimement dépendantes de leur environnement. Or, le microenvironnement tumoral est un système complexe aux paramètres extrêmement nombreux et dont la plupart sont inconnus : il est aujourd’hui impossible de recréer totalement cet environnement ex vivo. C’est pour cela que nous devons avoir recours à des études sur l’animal dans lequel tous les paramètres sont réunis. Notre hypothèse est qu’après le traitement les cellules tumorales résiduelles localisées au sein de l’unité gliovasculaire protectrices sont à l’origine de la récidive. Nous avons développé des méthodes alternatives pour éviter au maximum d’avoir recours aux animaux. Ainsi, nous avons au préalable observé in vitro que des cellules de GBM acquéraient un phénotype de résistance lorsqu’elles étaient au contact de vaisseaux sanguins. Cependant, ce modèle ne représente qu’une version simplifiée du microenvironnement tumoral. En effet, le microenvironnement tumoral est un système complexe aux paramètres extrêmement nombreux et dont la plupart sont inconnus il nous est donc impossible de recréer totalement cet environnement ex vivo.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, nous avons fait un travail de recherche bibliographique rigoureux. De plus, notre expérience passée nous permet de limiter le nombre d’animaux. En effet : 1-Nous avons identifié le nombre de cellules à injecter pour obtenir une tumeur qui sera résécable environ un mois après l’injection. Nous ne testerons donc pas différentes concentrations de cellule. 2-Nous maitrisons la résection de la tumeur 3-Pour le traitement radio et chimiothérapeutique, nous avons mené de nombreuses expériences in vitro qui nous permettent de cibler les doses et le timing de traitement ce qui réduit considérablement le nombre d’animaux utilisés. 4-Le suivi régulier de la progression tumorale grâce à la mesure d’un marqueur sanguin nous permet de savoir quand effectuer la résection mais également de monitorer la récurrence de la tumeur ce qui réduira également le nombre d’animaux utilisés. 5-Les analyses requièrent une faible quantité de matériel et permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
En accord avec les recommandations internationales, en particulier dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis individuellement et ce plusieurs fois par semaine (2 à 3 fois) afin d’assurer leur bien-être. Celui-ci sera évalué selon une grille de score. Si nécessaire, les expérimentations seront stoppées avant toute souffrance. Les manipulations lourdes sont faites sous anesthésie et les animaux recevront systématiquement les traitements antibiotiques et analgésiques adaptés pendant et après les opérations. Dès l’apparition d’une tumeur de taille importante (évaluée par un marqueur sanguin) les animaux sont suivis quotidiennement afin d'évaluer leur bien-être selon la grille de score jointe. En cas de signes de détresse les soins adaptés seront apportés (analgésie, hydratation …). Si aucun soulagement n’est possible ils seront mis à mort.
Choix des espèces
Nos expérimentations seront menées chez la souris, modèle de choix pour les expériences en cancérogenèse. Leur petite taille, et la méthodologie expérimentale bien établie en font une espèce animale pertinente pour les expériences de laboratoire. Nous étudierons des lignées cellulaires humaines et murines. Deux souches de souris seront utilisées dont des souris immunodéficientes pouvant recevoir des injections de cellules humaines sans développer de réactions immunitaires contre celles-ci. A l’inverse, l’autre lignée de souris est immunocompétente et permet donc de réaliser notre étude dans un contexte de réponse immunitaire complète. Adulte de 7-8 semaines, un âge qui permet une bonne prise tumorale mais également avec un potentiel de croissance limité afin d’éviter que les dispositifs chirurgicaux (fenêtres crâniennes) ne gênent leur croissance ; les animaux à cet âge supportent mieux l’anesthésie et la chirurgie.
Influence des odeurs sur le réseau de neurones hypothalamiques impliqué dans le contrôle de la prise alimentaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
564 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Elles subissent jusqu'à quatre mises à jeun de seize heures, des tests olfactifs et un régime hyperlipidique, puis une mise à mort par exsanguination sous anesthésie pour prélever les tissus. Le porteur étudie comment l'odeur de nourriture module des neurones de l'appétit et situe d'éventuelles voies thérapeutiques contre l'obésité dans le futur. Il affirme que la souris est le seul modèle permettant les modifications transgéniques et l'étude de ce comportement alimentaire.
Objectifs
Dans ce projet nous nous intéressons à la régulation de la prise alimentaire. Cette régulation implique notamment un réseau de neurones situé dans le noyau arqué de l’hypothalamus. Les expériences menées dans ce projet porteront sur une population de neurones, les neurones POMC ayant pour action supposée de limiter la prise alimentaire. Ces neurones s’activent au cours des repas et diminuent leur activité lorsque les réserves énergétiques baissent. De précédentes études réalisées sur des souris ont révélé la capacité de ces neurones à répondre non seulement lorsque le cerveau détecte la présence de nutriments mais également à des signaux sensoriels issus notamment de la nourriture. Ainsi les neurones POMC peuvent être modulés par l’odeur de nourriture avant même qu’un aliment ne soit ingéré. Le présent projet propose de caractériser les mécanismes à l’origine de cette modulation des neurones POMC par les odeurs de nourriture chez la souris. Différentes odeurs présentes dans des nourritures palatables seront utilisées pour tester leur attractivité sur les souris, leur capacité à modifier la prise alimentaire ainsi que leur effet sur la physiologie des neurones POMC.
Bénéfices attendus
Les expériences proposées permettront une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques de la régulation de la prise alimentaire. Dans le contexte de l’augmentation forte du nombre de personnes en surpoids ou obèses dans le monde, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques pour le contrôle de la prise alimentaire s’appuyant sur l’utilisation d’odeurs modulatrices des circuits neuronaux régulant la prise alimentaire.
Procédures
La procédure 1 implique au maximum 4 mises à jeun de 16h sur chaque animal espacées de 48h au moins. Les test olfactifs durent moins de 20 min par souris. Dans la procédure 2, les animaux seront exsanguinés par perfusion intracardiaque avec une solution saline au cours de leur euthanasie. Dans la procédure 3, les animaux seront maintenus en cages individuelles pendant une semaine et consommeront quelques croquettes de régime hyperlipidique.
Impact sur les animaux
Les odeurs utilisées proviennent d’aliments ou d’arômes alimentaires et seront utilisées à des doses faibles (les doses nécessaires à leur détection par les souris) et sur des durées inférieures à 2h. Cette exposition est donc inoffensive pour les animaux. Le régime hypercalorique entrainera une prise de poids qui sera mesurée une fois par semaine. Durant les 8 semaines d’administration du régime hypercalorique, la prise de poids sera limitée et ne causera pas de souffrance à l’animal. Les exsanguinations seront réalisées sur animal en cours d’euthanasie à la suite de l’administration d’un antalgique (Carprofène) 30min avant.
Devenir
Mise à mort des animaux sous anesthésie générale pour récupérer les tissus vivants en vue de l'étude de leur fonctionnement.
Remplacement
L’objectif général du projet vise à comprendre chez l’animal l’effet d’odeurs sur le contrôle de la prise alimentaire. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude du comportement de recherche de nourriture et de prise alimentaire reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.
Réduction
Plusieurs éléments permettent de répondre au principe de réduction tout en évitant de compromettre l’obtention de résultats interprétables : i) les tests non paramétriques envisagés, ii) la variabilité couramment observée permettant d’avoir au maximum n=15, iii) l’utilisation des animaux en mode longitudinal.
Raffinement
En accord avec la structure chargée du bien-être animal au sein du laboratoire, nous avons défini les meilleures conditions d'hébergement possibles ainsi que les points limites précoces. Dans ce projet, nous avons 5 à 10 souris par cage, présence de différents enrichissements (batonnet de bois, dôme en carton et Sizzle nest), surveillance quotidienne et soins apportés rapidement si nécessaire. Nous appliquons les méthodes recommandées pour l’analgésie (Carprofène 5 mg/kg sc) et l’euthanasie (Exagon 300 mg/kg ip). Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience.
Choix des espèces
Le projet proposé porte sur l’étude d’une population particulière de neurones hypothalamiques ayant un rôle clé dans le contrôle de la prise alimentaire. Les expérimentations seront réalisées sur des souris transgéniques nous permettant de cibler cette population neuronale afin d’en comprendre le fonctionnement. La souris est le seul modèle animal permettant les modifications transgéniques nécessaires à la transformation ou à la visualisation de la population neuronale étudiée dans ce projet. D’autre part, la souris est un animal à l’odorat très développé qui utilise les odeurs dans son comportement alimentaire. Enfin, sa physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues servent les explorations thérapeutiques chez l’humain. Les procédures expérimentales débuteront à l’âge de 8 semaines. Ce projet sera réalisé sur des souris adultes sexuellement matures. Le système olfactif de l’animal se développe au cours de sa croissance et atteint un équilibre lorsque l’animal a terminé sa croissance.
Le rôle des Fc récepteurs dans la physiopathologie des leishmanioses cutanées
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le parasite de la leishmaniose est injecté dans l'oreille, puis les lésions sont suivies pendant plusieurs mois, le porteur indiquant que des ulcérations peuvent se développer et durer jusqu'à douze semaines. Il étudie le rôle d'un récepteur immunitaire dans cette maladie et situe le bénéfice, une thérapie, à long terme. Il affirme que les mécanismes inflammatoires ne peuvent être étudiés de façon intégrée que dans un organisme entier.
Objectifs
Les leishmanioses sont des pathologies causées par le parasite leishmania qui font de plus en plus de ravages autour du monde. Aujourd’hui plus d’un milliard de personnes vivent dans des zones endémiques et peuvent donc contracter le parasite et développer la maladie. Les manifestations cliniques des leishmanioses cutanées chez l’homme peuvent varier de nodules, pustules, ulcères, jusqu’à atteindre des défigurations au niveau du visage et parties externes du corps. La nature de la réponse immunitaire dans la physiopathologie des leishmanioses cutanées joue un grand rôle dans la résolution ou la persistance de la maladie. La reconnaissance du pathogène par le système immunitaire se fait grâce à des recepteurs présents sur les cellules immunitaires. L’objectif principal de notre projet est d’étudier l’interaction du parasite avec un récepteur immunitaire pour comprendre le rôle que joue ce dernier dans cette pathologie et suivre la réponse immunitaire qui peut en résulter.
Bénéfices attendus
Les leishmanioses cutanées peuvent être contractées par l’homme de tout âge, comme par l’animale. Plusieurs tentatives ont été faites pour développer des traitements efficaces mais à ce jour il n’existe pas de traitement effectif pour cette pathologie. Il devient donc de plus en plus urgent de se pencher sur cette pathologie car cette dernière risquerait de se propager rapidement dans les prochaines années. Cela serait dû à plusieurs facteurs dont le réchauffement climatique. L’objectif à long terme est de développer une thérapie efficace en ciblant des récepteurs présents sur des cellules immunitaires afin de réduire et limiter ainsi l’invasion parasitaire.
Procédures
-1 Injection dans l'oreille pendant 15 secondes -Suivi hebdomadaire de l'évolution des lésions pendant 15 mois
Impact sur les animaux
Suite à l’injection de parasites, les souris peuvent présenter une douleur modérée, une inflammation localisée au site de l’injection. Par la suite, des ulcérations peuvent se développer à partir de la semaine 2-3 et peuvent durer jusqu’à 12 semaines. La manipulation de souris pour le suivie s’effectuera à partir du moment de l’injection jusqu’à la semaine 20 post injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocol expérimental afin de réaliser diverses prélèvements (tissus, sang, organes...)
Remplacement
Ce projet s’intéresse à la compréhension du rôle du récepteur CD32a dans la réponse inflammatoire dans le cas des leishmanioses cutanées. La pathologie étant cutanée, le développement de lésion est le symptôme dominant observé dans cette pathologie. Ainsi, les mécanismes physiologiques et immunologiques complexes aboutissant à cette inflammation ne peuvent être étudiés de façon intégrée que dans un contexte d’organisme entier, dans des modèles in vivo.
Réduction
Un total de 96 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet permettant de réaliser 3 études de 6 groupes (groupes contrôles et groupes infectés) avec 6 animaux par groupe (pour les groupes infectés) et 4animaus (pour les groupes contrôles) sur une durée de 2 ans. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable de 5. La nourriture, et l’eau de boisson seront fournies. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être ainsi que de l'enrichissement (batonnet de bois, coton, maison en cellulose). Au moment de leur entrée, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation (une semaine) et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité (12h – 12h), d’une température (20 - 24°C). Les souris seront surveillées tous les jours pour vérifier l’absence de souffrance. Toutes les injections sont réalisées sur animaux sous anesthésie gazeuse général et avec un analgésique. Les injections sous la peau seront réalisées avec grand soin pour éviter d’atteindre le muscle. On a mis en place une fiche de scoring comme point limite fafin de prendre en charge l’animal au cas où il y a atteinte à son bien-être et pour éviter la souffrance animal.
Choix des espèces
Deux modèles murins sont choisis pour étudier le rôle du récepteur, des souris sauvages qui n’expriment pas le récepteur et une lignée transgénique de souris exprimant ce récepteur. La souris adulte, agée entre 6 et 8 semaines, est le modèle le plus utilisé dans l'étude de la leishmaniose cutanée puisque c'est un mammifère et qu'il est aussi bien connu. En plus de cela, le comportement de la souris est bien étudié ce qui nous permet de lui administrer les soins nécessaires pour limiter et réduire sa douleur.
Role des neurones de l’hypothalamus pour la régulation de la balance énergétique et de l’olfaction
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale pour injection de virus et implantation d'une fibre optique, un isolement d'une semaine pour la calorimétrie, une restriction hydrique pour les tests d'apprentissage et une aversion olfactive provoquant un inconfort gastrique. Le porteur étudie le rôle de neurones de l'hypothalamus dans la prise alimentaire et l'olfaction, en lien avec l'obésité. Il affirme que ces paramètres comportementaux ne peuvent être obtenus ni in vitro ni chez les invertébrés, dépourvus des structures cérébrales équivalentes.
Objectifs
Le métabolisme et le comportement alimentaire sont en majeur partie régulé par le cerveau. L'expression des certains facteurs au niveau cérébral pourrait en particulier avoir des effets sur le dialogue entre olfaction et métabolisme . Ces mécanismes étant encore très mal connus, le but de cette étude est de les disséquer afin de comprendre leur impact des conditions physiologiques et physiopathologiques (obésité). L’inactivation ou la surexpression ciblée de facteurs de transcription dans des régions précises du cerveau de souris sera mise en place pour mieux comprendre leur rôle. La balance énergétique des animaux (calorimétrie indirecte) ainsi que différents comportements (tests olfactifs) seront alors analysés. L’activité des neurones sera également enregistrée à l’aide d’une méthode optique (photométrie fibrée). Cette étude ne peut être remplacée par d’autre moyen, comme la culture cellulaire, car nous regardons le métabolisme et le comportement de l'animal. Ce projet utilisera le minimum de souris nécessaire (4 études comportant des groupes de 12 à 16 souris (contrôles et traitées); soit 396 souris sur les 4 ans de projet) et respectera le bien-être animal. Lors de ces études la règle des trois R sera respectée, le nombre d’animaux sera réduit au minimum et nous raffinerons les procédures pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux. Nous effectuerons l'administration d'analgésique lors des procédures. Les cages individuelles sont agrémentées d’un nid végétal et quelques croquettes sont mises à même le sol pour éviter les douleurs de tension au niveau de la suture après les opérations.
Bénéfices attendus
En combinant des études comportementales et métaboliques après l’inactivation ou la surexpression ciblée d'une protéine dans des régions précises du cerveau de souris, nous comprendrons mieux les liens entre les régulations neuronales hypothalamiques et la métabolisme en lien avec l'obésité. Nous considérons que cette étude apportera également une information importante concernant la composante olfactive de la prise alimentaire et de la balance énergétique chez la souris dans les différentes conditions décrites. Ce sont des paramètres très sensibles où le bien-être animal est absolument crucial, autant pour l’animal que pour la validité des résultats obtenus.
Procédures
Nous utiliserons différentes procédures de chirurgie pour l’injection de virus et l’implantation chronique de fibre optique pour des études chez les souris éveillées (chirurgie entre 40 min et 1h), Analyse de calorimétrie indirecte (les animaux sont isolés pour environ 7 jours), Analyse métabolisme du glucose (prélèvements de sang sur environ 2h d’expérience), Tests olfactifs (30 min d'habituation à la cage puis 30 min de test le jour suivant), aversion olfactive conditionnée (injection d’une solution induisant un inconfort gastrique de 1 heure environ, test le jour suivant), test d'apprentissage (environ 1 séances de 20 min par jour pendant 8-10 jours, la prise hydrique des animaux est diminuée dans la cage d'hébergement, les animaux boivent dans la cage de test).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pourront se produire lors de la chirurgie cérébrale, lors de la mise en restriction alimentaire ou hydrique, lors de l'isolement des souris. La chirurgie peut entrainer un saignement important au niveau du crâne de l'animal et entrainer douleur et problème de récupération. Pour toutes ces raisons, nous avons prévu des injections d'anti-inflammatoire et une récupération post-chirurgicale sous surveillance pour détecter toute perte de poids ou d'autres problèmes de santé ou de bien-être. Pour les tests métaboliques, des problèmes de volume sanguin prélevé peuvent survenir mais nous avons prévu les prélévements en calculant au plus près les volumes nécessaires aux mesures de l'insuline donc les volumes sont minimes (détaillées dans les procédures expérimentales). Lors de la restriction alimentaire les souris sont surveillées, si un mal être est observé chez un individu il est immédiatement remis ad libitum. Pour la procédure de régime hypercalorique, nous n'avons pas de nuisance attendue. Nous n'avons jamais observé de problèmes de souris ne voulant pas se nourrir avec une nourriture hyperlipidique. De plus, le surpoids induit chez les souris sous régime hyperlipidique n'entrave pas leur locomotion.
Devenir
Mise à mort pour tous les animaux afin de prélever le cerveau pour vérifications des points d'injections et analyses.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et du comportement.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles).
Raffinement
Le soin apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, batons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.
Choix des espèces
Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 3 mois) afin que les réseaux neuronaux soient bien établis et que les expériences ne soient pas perturbées par une plasticité neuronale accrue.