Souris

1 010 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime gras pendant quinze semaines, des injections quotidiennes, des tests métaboliques dont un test à l'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie sévère, et des séances de nage forcée deux fois par jour, avant mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur étudie le remodelage cardiaque lié à l'obésité et au vieillissement et attend une amélioration des fonctions cardiaques par un composé testé. Il présente l'analyse de la fonction cardiaque, décrite comme celle d'un "organe entier", comme impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

Dans un premier temps, il s’agit d’effectuer une analyse in vivo et histologique de modèles murins pour les tissus d’intérêt comme le cœur, le rein, le foie et le tissu adipeux dont le but est de : 1) comparer la reproductibilité des données en utilisant un protocole unique et standardisé sur les modéles murins de diabète de type 2 induit par un régime riche en graisses, 2) mettre en place une bio-banque d’échantillons de sang et de tissus pour réaliser des analyses multi-translationnelles, 3) étudier le rôle des macrophages résidents du coeur dans un contexte d’obésité. Le deuxième objectif du projet est de définir des nouvelles stratégies thérapeutiques prévenant le développement de cardiomyopathie dont la formation est liée aux altérations induites par des troubles métaboliques (l’obésité et le diabète) et le vieillissement accéléré du cœur dans ce contexte d’obésité (inflammation, dommages faits à l’ADN, dysfonction mitochondriale). Etape 1) Evaluer l’effet de molécules à fin thérapeutique modulant spécifiquement l’action de molécules impliquées dans le métabolisme sur la fonction cardiaque. Etape 2) Valider et optimiser la molécule cible sur les troubles métabolliques. Etape 3) Définir les mécanismes d’action spécifiques de la molécule thérapeutique sur l’amélioration de la fonction cardiaque et sur la résolution de l’inflammation.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à tester la reproductibilité des données en comparant dans différents laboratoires en Europe l’impact d’un régime riche en graisses chez des souris mâles et femelles de type C57BL/6 sur la structure et la fonction cardiaque ainsi que l’évaluation métabolique et l’impact sur d’autres organes comme le foie, le rein ou le tissu adipeux. L’identification du rôle des macrophages dans le vieillissement cardiaque permettra d’identifier de nouvelles voies pathophysiologiques et donc d’envisager de nouvelles thérapies. Enfin, nous attendons une action géroprotrectrice et plus généralement une protection renforcée des tissus avec une haute tolérance du produit chez les animaux traités. De plus, de façon plus spécifique, nous attendons une amélioration des fonctions cardiaques avec une action anti-fibrotique ainsi qu’une amélioration des dommages faits à l’ADN. Ces données pourraient permettre de repositionner certaines molécules dans le traitement des cardiomyopathies métaboliques, pourvoyeuses d’insuffisance cardiaque en pathologie humaine.

Procédures

Echocardiographie : Geste non-invasif permettant d’évaluer les fonctions cardiaques, réalisé sur animaux vigiles préalablement épilés, sur tous les animaux. Il s’agit de maintenir les animaux sur le dos pour une durée de 3-4 minutes, le temps d’appliquer la sonde d’échographie et de procéder à l’enregistrement de l’échocardiogramme. Grip test : Test de préhension soutenue non-invasif qui permet d’évaluer la force musculaire. Il sera réalisé sur animaux vigiles pour l’ensemble des animaux. Il s’agit de laisser les animaux s’agrippés par leurs pattes avant en utilisant les barres reliées à un capteur permettant d’enregistrer le temps de résistance musculaire à une force et de quantifier la force maximale du rongeur (en secondes). Glycémie : Mesure du taux de glucose sanguin de tous les animaux. Sur animaux vigiles, on prélève une goûte de sang à la queue que l’on récupère afin de procéder à la lecture de la glycémie. Injections : Sur animaux vigiles, on effectue en quelques secondes une injection quotidienne en i.p. ou en sous-cutané (selon l’efficacité de distribution du produit) en utilisant des aiguilles fines afin de limiter la souffrance chez l’animal. Exercice physique : Séances biquotidiennes de natation en cuve d’eau chauffée à 33°C ± 2°C espacées de 6h et augmentant progressivement de 5 à 40 min pendant une période de 6 semaines. Après la natation, les animaux sont essuyés et laisser sous lampe chauffante le temps du séchage. Régime riche en graisse : Alimentation des souris avec un régime enrichie en graisse apportant 60% de l’apport énergétique sous forme de lipides pendant 15 semaines. Insuline-tolérance test (ITT) et glucose-tolérance test (GTT) : Tests métabolliques permettant d’évaluer la résistance à l’insuline et la tolérance au glucose. Sur animaux vigiles mient à jeun pendant 6h, injection en i.p. (vol max 200µl, calculé en fonction du poids de l’animal) soit d’insuline (ITT), soit de glucose (GTT) et de suivre la glycémie à T=0, T=15min, 30 min, 60 min, 90 min et 120 min. La moitié des animaux seront soumis à un test GTT et l’autre moitié au test ITT en début et fin de régime. Gavage : Technique non utilisée sur les animaux âgés (8 et 24 mois) et uniquement dans le contexte d’un produit ne pouvant être administré en eau de boisson. Sur animaux vigiles, on effectue un gavage quotidien ( maximum 30 sec) pendant 30 jours à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une sonde de gavage adaptée sans induire de souffrance ou détresse chez les souris.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendu lors de la réalisation de l’échocardiographie ou du test de tolérance au glucose. Lors de la réalisation du test métabolique de tolérance à l’insuline, l’injection d’insuline peut entraîner une hypoglycémie sévère qui pourra être détectée par mesure de la glycémie à l’aide d’un glucomètre et qui sera immédiatement prise en charge par l’administration d’une dose de glucose. L’animal sera alors sous haute surveillance jusuqu’au rétablissement d’une glycémie normale, c’est-à-dire à partir de 80 mg/dL. La pratique de l’exercice physique peut entraîner une perte de poids et une fatigue chez l’animal qui est directement lié à la pratique régulière d’une activité physique. À la suite de ces observations, les temps de pratique de l’exercice physique seront ré-évalués chez les animaux concernés. Le régime enrichi en graisse entraîne une prise de poids et peut conduire à des troubles métabloliques. La surveillance hebdomadaire de la prise de poids puis un contrôle de la glycosurie en cas de prise de poids trop importante assurera le suivi nécessaire à cet effet. Les injections quotidiennes peuvent entraîner l’apparition d’un hématome. Pour éviter cela, les injections seront pratiquées en changeant de côté régulièrement pour laisser du temps à la résorption d’un éventuel hématome. L’administration orale du produit se fera autant que possible dans l’eau de boisson. Nous limiterons l’utilisation de la méthode de gavage pouvant entraîner un stress chez les animaux, surtout âgés et afin de limiter les désagréments chez l’animal et le dépôt de la substance dans le poumon ou la rupture de l'estomac ou de l'œsophage.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront anesthésiés pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Le développement d’une cardiomyopathie métabolique liée à l’obésité induite par un régime riche en graisses est un modèle pathologique expérimental bien établi et reproductible chez les souris. Par ailleurs, l’évaluation de l’action combinée de l’obésité et de l’âge sur les mécanismes conduisant au développement d’événements cardiovasculaires nécessite l’analyse de la fonction cardiaque (organe entier) dont la complexité est impossible à reproduire in vitro. Pour cela, nous utilisons le modèle expérimental de la souris. Nous remplaçons les cellules primaires par des lignées cellulaires dans nos tests "in vitro" : soit en utilisant les lignées cellulaires H9C2 de cardiomyocytes, les lignées 3T3L1 d'adipocytes pour les co-cultures, soit des lignées cellulaires de macrophages murins (raw264) comme cible de l’action sénolytique des molécules thérapeutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à notre étude a été calculé pour nous assurer de l’obtention de résultats concluants afin de répondre aux questions posées en tenant compte des expériences antérieures du laboratoire sur le stress métabolique induit par le régime riche en graisse ayant été étudié préalablement sur ce fond génétique: il faut entre 10 à 15 animaux par lot pour obtenir une réponse statistique fiable des expériences puisque nous n'obtenons pas de réponse équivalente chez tous les animaux en expérimentation. De même, le nombre de souris a été optimisé pour chacune de nos procédures expérimentales tout en assurant une reproductibilité et une robustesse dans nos expérimentations, mettant à profit nos connaissances sur les tranches d’âge auxquelles nous devons réaliser nos expérimentations afin d’être le plus pertinent possible dans l’établissement de nos procédures. Enfin, afin d’utiliser au mieux les animaux, nous regarderons simultanément différents tissus d’intérêt dans un même animal (réduction importante du nombre d’animaux prévus)..

Raffinement

Des points limites ont été définis pour chacune des procédures. Tout signe témoignant d’une mauvaise tolérance au régime riche en graisse (par exemple perte de poids non désirée, souffrance, apathie, déshydratation des animaux) conduira à l’interruption de la procédure. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux leur permettant d’exprimer leurs besoins avec leurs congénères et les cages sont enrichies avec une maison en carton et du papier kraft pour leur permettre de nicher. Un examen clinique des animaux sera effectué quotidiennement ou toutes les semaines selon le plan des procédures. De plus, les procédures que nous utilisons ont été optimisées et standardisées, ce qui permet de limiter la répétition des procédures.

Choix des espèces

La cardiomyopathie est bien caractérisée chez les mammifères avec des méthodes d’analyse facilement accessibles et reproductibles. Le développement d’une cardiomyopathie métabolique liée à l’obésité induite par un régime riche en graisses est un modèle pathologique expérimental bien établi et reproductible chez les souris. Par ailleurs, l’évaluation de l’action combinée de l’obésité et de l’âge sur les mécanismes conduisant au développement d’événements cardiovasculaires nécessite l’analyse de la fonction cardiaque (organe entier) dont la complexité est impossible à reproduire in vitro. Le modèle expérimental choisi est donc la souris. Ce modèle murin présente l’avantage de développer un vieillissement relativement rapide et d’offrir des conditions très reproductibles de développement d’une cardiomyopathie métabolique. Enfin, la souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme sur les paramètres liés au métabolisme du glucose et la surcharge pondérale. L’étude se fera sur des souris à un stade de jeune adulte (5 mois) et à deux stades âgés (12, 18 mois) et à un stade très âgé (24 mois). Pour l’étude portant sur le vieillissement cardiaque, nous utiliserons des animaux mâles âgés de 12, 18 et 24 mois. Pour l’étude de l’obésité conjugué au viellissement, nous utiliserons des souris jeunes adultes de 5 mois dont le fonctionnement du système cardiovasculaire commence à subir les effets du vieillissement et de 12 mois d’âge dont leur système cardiovasculaire est altéré spontanément par le vieillissement.

3 840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une molécule induisant une fibrose pulmonaire est injectée dans la trachée après incision et suture, puis un traitement ciblant un récepteur immunitaire, avant mise à mort et prélèvement des poumons. Le porteur indique que la fibrose peut provoquer des difficultés respiratoires, une perte de poids et une mortalité inférieure à 20 %. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser un organe entier et qualifie la souris d'animal "incontournable" pour les enjeux de santé humaine.

Objectifs

Le système immunitaire regroupe des récepteurs permettant de réguler la réponse immunitaire. L’une des thérapies anti- cancéreuses révolutionnaires consiste à bloquer un sous type des récepteurs immunitaires. La Fibrose Pulmonaire Idiopathique (FPI) est une maladie respiratoire chronique associée à une mortalité élevée. Toutefois, l’étude des récepteurs immunitaires dans la FPI représente un domaine sous-étudié. Nos précédents travaux de recherche ont montré l’implication d’un récepteur X dans le contrôle des maladies respiratoires, telles que l’asthme allergique. Nos nouveaux résultats préliminaires suggèrent aussi une implication remarquable du récepteur X dans la FPI. L’hypothèse qui sous-tend ce projet de recherche est que le ciblage du récepteur X dans la FPI permettrait de reprogrammer les cellules immunitaires vers une fonction anti-fibrosante. Les objectifs du projet sont 1) d’évaluer l’expression de X sur les différentes cellules immunitaires dans deux modèles expérimentaux de fibrose pulmonaire, 2) d’étudier l’effet de l’absence du récepteur X sur le développement de la fibrose pulmonaire dans une souris transgénique et 3) d’étudier l’efficacité d’un traitement ciblant X dans un modèle de souris humanisée. Ces différentes approches fondamentales et précliniques permettraient de valider X comme une nouvelle cible thérapeutique dans la FPI.

Bénéfices attendus

La FPI est une maladie respiratoire chronique et fatale. Dans cette étude, nous investiguerons le rôle modulateur d’un récepteur immunitaire dans des modèles murins de fibrose pulmonaire afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques. Atteindre cet objectif de recherche exige l’étude des mécanismes immunitaires pertinents dans un organisme animal vivant respectant la complexité du système immunitaire qui implique plusieurs organes, types cellulaires et médiateurs. L’étude de ces interactions complexes d’une façon fiable et appropriée dans nos modèles murins de fibrose pulmonaire assurerait une meilleure connaissance de l’immunologie pulmonaire chez les patients FPI. Les résultats des différentes parties du projet seront profitables, notamment via l’amélioration du diagnostic clinique de la FPI et via le développement de nouvelles thérapies efficaces et ciblées.

Procédures

Nous utilisons dans ce projet des souris contrôles, des souris transgéniques n'ayant pas le récepteur X et des souris humanisées ayant un système immunitaire humain fonctionnel. En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture (la totalité de la procédure de l’incision de la peau à la suture durera de 5 à 7 minutes) : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétée. Une semaine plus tard, les souris recevront deux doses d’une protéine thérapeutique permettant de moduler le récepteur X. L’injection se fera via 2 voies non invasives, la voie intranasale (durée 25 secondes) et la voie intrapéritonéale (durée 10 secondes). Pour la voie intranasale, les souris seront sous anesthésie générale afin d’éviter le réflexe de déglutition et ainsi le passage des molécules injectées dans l’œsophage au lieu de la trachée. Avant l’injection thérapeutique un prélèvement sanguin à partir de la veine faciale (sous-maxillaire) est prévu (durée 25 secondes). A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées à des temps différents après anesthésie profonde, après quoi un prélèvement de sang sera réalisé ainsi que le recueil des poumons sur l'animal euthanasié.

Impact sur les animaux

L'induction de la fibrose pulmonaire chez les souris peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Une fréquence respiratoire anormalement élevée ainsi qu’une gêne respiratoire sont des conséquences possibles de la fibrose. Dans les modèles de fibrose adoptés, il existe un risque de mortalité liée au développement de la fibrose, à partir du 7eme jour, et jusqu'au 14eme jour après injection. La mortalité ne survient en règle générale pas au décours immédiat de l'injection ni entre J0 et J7 après celle-ci, ce qui suggère qu'elle est la conséquence du développement de la fibrose et non du geste en lui-même. Cette mortalité est en général < 20% des effectifs.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour le prélèvement des poumons. Ces prélèvements sont nécessaires pour l’analyse des tissus afin d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans la fibrose pulmonaire.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire. Ces affirmations se basent sur des discussions avec des confrères; des conférences en pneumologie/immunologie, et une recherche bibliographique approfondie. Il faut noter que des méthodes alternatives basées sur l'utilisation des cellules humaines sont déjà utilisées dans notre projet mais ne nous permettent pas encore de répondre à l’ensemble de nos questions. En particulier, ces modèles n’intègrent pas les cellules immunitaires et ne peuvent pas reproduire le dynamisme de leur recrutement aux poumons.

Réduction

Des stratégies d’optimisation de l’utilisation de chaque animal seront appliquées afin de respecter le principe de réduction. Nous allons par exemple collecter le maximum d’organes de toutes les souris expérimentales et partager des tissus/organes au sein de notre unité de recherche. Dans ce même contexte, nous adoptons une approche bio-informatique qui permet de prédire une réaction biologique, et ainsi réduire le nombre de souris nécessaires pour la réalisation de ce projet. En outre, des mesures strictes seront prises pour éviter les biais expérimentaux comme la randomisation et le travail en aveugle.

Raffinement

Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les gestes invasifs (injections intratrachéales et intranasales) sont réalisés sous anesthésie. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures. Des antalgiques seront donnés en post opératoire. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture gélifiée facile à ingérer. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. En plus de la surveillance visuelle effectuée quotidiennement par les animaliers, les animaux bénéficieront d'une surveillance clinique après le réveil et jusqu’à la fin du protocole. Cette surveillance clinique sera effectuée au moins 3 fois par semaine par l'expérimentateur. Elle se base sur une grille de points limites évaluant l’apparence de l’animal (yeux, poils, oreilles, posture...), son comportement (motricité, apathie, posture, rythme respiratoire...), la diminution du poids et la fermeture de la suture. La fréquence de surveillance clinique des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. En cas d'atteinte des points limites, une euthanasie sera effectuée par surdosage en anesthésique en injection péritonéale.

Choix des espèces

D’une part, les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques clés de la fibrose humaine. D’autre part, l’étude du système immunitaire murin a conduit vers de nombreuses découvertes dans le domaine d’immunothérapie et a permis de tester la sécurité et l’efficacité des thérapies ciblant les récepteurs immunitaires avant les essais cliniques humains. Les souris offrent aussi la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon. En outre, les souris reconstituées avec des cellules immunitaires humaines permettent la mise en place de modèles bien profitables dans le domaine thérapeutique. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire, ainsi la souris est un animal incontournable pour répondre à des enjeux de santé humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 8 et 16 semaines. La fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.

852 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une chirurgie d'électroporation in utero, les souriceaux une électroporation sous anesthésie par le froid, et la moitié des portées est placée huit jours dans un environnement appauvri en oxygène. Le porteur indique que cette hypoxie provoque un retard de croissance et des lésions cérébrales diffuses, tout en affirmant qu'elles n'entraînent pas de troubles du comportement. Il décrit l'approche in vivo comme "incontournable", les lésions post-hypoxiques dépendant de mécanismes qu'il juge impossibles à reproduire in vitro.

Objectifs

Objectifs fondamentaux du projet : 1) fournir des hypothèses de recherche et des pistes de mécanismes cellulaires pour les chercheurs travaillant sur l’étude du développement cérébral; 2) développer de nouvelles approches permettant de promouvoir la régénération du cerveau après une lésion périnatale.

Bénéfices attendus

Sur un plan fondamental, nos résultats permettront de caractériser le rôle des voies de signalisation morphogéniques (c-à-d les voies impliquées dans le développement du tissu) dans l’induction de quiescence et l’activation des cellules souches neurales du cerveau postnatal. Les données issues de ce projet permettront également de comprendre quels sont les mécanismes qui font que la réparation cérébrale est limitée après la naissance, ce qui pourra conduire à l’identification d’indicateurs biologiques ou de pistes thérapeutiques ultérieures. Nos résultats permettront aussi d’évaluer la pertinence d’une manipulation de ces voies de signalisation pour encourager la régénération du cerveau après une lésion précoce.

Procédures

Des femelles gestantes seront soumises à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie péri/post-opératoire, appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Des femelles et des souriceaux seront soumis à une administration unique de tamoxifène. Des souriceaux seront soumis à une procédure d'électroporation postnatal qui ne nécessite pas de chirurgie, mais qui s'effectue sous cryo-anesthésie. Après la naissance, la moitié des animaux (femelles et portée) seront soumis pendant 8 jours à un environnement appauvri en oxygène Les prélèvements seront réalisés postmortem pour l’étude du cerveau par histologie

Impact sur les animaux

Pour les souris femelles : L’injection de tamoxifène peut entraîner des complications lors de la mise bas, qui sont prévenues par co-injection de progestérone. L’administration se fera par gavage afin d’éviter tout risque d’injection à proximité d’un embryon. L’hypoxie chronique peut entrainer une réduction de la quantité et qualité de lait que produisent les femelles, qui est évitée en échangeant régulièrement les femelles entre les conditions normales et réduites en oxygène. Pour les souriceaux : L’électroporation postnatale implique une anesthésie sur glace. Afin d’éviter toute brulure cutanée, le souriceau est isolé de la glace. L’hypoxie chronique entraîne un retard de croissance transitoire et des lésions cérébrales diffuses, qui n’induisent cependant pas de troubles du comportement spontané des souris élevées en cage.

Devenir

Afin d'effectuer des analyses permettant d'étudier l'impact des manipulations sur le comportement et le devenir des cellules souches neurales, les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour collecter les tissus et effectuer des analyses transcriptomiques ou histologiques.

Remplacement

Une approche in vivo est incontournable pour ce projet de recherche. En effet, les lésions neurologiques post-hypoxiques dépendent de mécanismes complexes (interactions cellulaires, rôle de la réponse immunitaire, inflammation tissulaire) impossibles à reproduire in vitro d’où la nécessité d’un modèle animal pour étudier la pathologie. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de reconstituer la complexité des différents micro environnements dans lesquelles les cellules souches neurales transitent et se développent.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base d’expériences publiées. Les portées seront analysées au fur et à mesure afin d’atteindre au plus vite le nombre d’animaux cible de l’étude, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement. De plus certaines expériences en conditionneront d'autres. Par exemple, si l’électroporation d’une forme inactive d’un récepteur n’induit aucune activation des cellules souches neurales, alors les expériences de knock-out conditionnel de ce récepteur prévues dans la procédure 2 seront abandonnées, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement. La méthode d’échantillonnage utilisée permet non seulement un échantillonnage homogène de notre région d’intérêt, mais aussi l’utilisation des mêmes cerveaux pour des marquages variés, nous permettant de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Enfin, nous avons mis en place dans l’équipe depuis plusieurs années un système de préservation de toutes les séries de coupes non utilisées. Cette banque de tissue permet d’optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (anesthésie et analgésie). Un suivi journalier des animaux post chirurgie ou post hypoxie, permet de déterminer des points limites stricts et spécifiques au projet par le calcul un score d'inconfort à partir duquel l’animal reçoit une injection d’analgésique, un suivi plus fréquent, ou est euthanasié. Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance, au moyen notamment d’un enrichissement varié stimulant la nidation. Les femelles seront régulièrement échangées entre les cages standards et celles réduites en oxygène, afin de préserver la quantité et la qualité du lait qu’elles produisent pour nourrir leurs souriceaux, et de minimiser au maximum le stress conséquent à la procédure sur les animaux.

Choix des espèces

L’architecture du cerveau de la souris est proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales ainsi que dans le développement et le fonctionnement du cortex cérébral. Par ailleurs, nous avons établi des méthodes d’étude des cellules souches neurales et des progéniteurs de la zone périventriculaire et un modèle de lésion cérébrale périnatale, qui nous assurent que le projet est faisable et permettra de répondre à la problématique scientifique. Les femelles gestantes seront des adultes entre 8 et 24 semaines. Pour les expériences de manipulations génétiques in utero, des embryons de 15±1 jours seront ciblés. Pour les expériences de manipulations génétiques postnatales, des souriceaux de 2±1 jour seront utilisés. Le choix de ces deux temps d’intervention se fera en fonction de la nature des protéines ciblées, pour permettre une expression maximale au moment de l’hypoxie. Les souriceaux seront placés en condition hypoxique du 3ème jour au 11ème jour après la naissance. Cette période correspond au 3ème semestre de croissance intra-utérin chez l’homme. Ce modèle permet donc de reproduire les périodes d’hypoxie fréquentes observées chez les grands prématurés. Enfin l’administration de molécules thérapeutiques se fera en fin de période hypoxique aux jours 11 et 12, afin de tester leur capacité à régénérer le tissu.

2 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une septicémie provoquée par ligature et perforation du caecum, un modèle que le porteur reconnaît induire une mortalité élevée, avant injection de cellules stromales dans la cavité péritonéale. Les souris sont réparties par âge, jusqu'à deux ans, pour évaluer l'effet du traitement au cours du vieillissement. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de confirmer in vivo des effets déjà montrés in vitro et qu'une étude chez la souris est "nécessaire".

Objectifs

L'objectif du projet est de mettre en évidence l'effet de différentes populations de cellules stromales sur la résolution d'une septicémie induit après une péritonite au cours du vieillissement et de comprendre les mécanismes d'action des différentes populations cellulaires.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mettre en évidence l’effet des cellules stromales mésenchymateuses "naives" ou primées sur l’inflammation et la résolution d'une septicémie induite après une péritonite et d’étudier l’intérêt de ce traitement au cours du vieillissement. En effet, nous espérons que les cellules stromales mesenchymateuses diminueront l’inflammation induite par la péritonite augmentant ainsi la survie des animaux. De plus, notre étude nous permettra de mieux comprendre le mode d'action des différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses et de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de péritonite.

Procédures

La péritonite est induite chez certains animaux par ligature et ponction du caecum. Les souris sont endormies par inhalation d’un gaz et maintenues endormies sous masque sur une table chauffante pendant l’intervention et jusqu’à leur réveil. La profondeur de l’anesthésie est évaluée par l’absence de réponse à la stimulation des extrémités. Une incision cutanée au niveau de l’abdomen est réalisée puis l’ouverture de la cavité péritonéale est réalisée au ciseau. Le caecum est ligaturé et perforé à l’aide d’une aiguille. Après injection de différentes populations de cellules stromales mésenchymateuses dans la cavité péritonéale encore ouverte, la fermeture du péritoine en deux plans est réalisée. Réalisée par une personne entrainée, la chirurgie dure entre 7 et 10 min. Avant l'intervention, un analgésique est injecté sur animaux endormis Pour les animaux chez qui la péritonite sera induite par injection de composés protéiques, les animaux auront 2 injections intrapéritonéales l’une contenant le composés protéiques l’autres les cellules thérapeutiques. Avant l'intervention, une injection sous cutané d’analgésique est réalisée sur animaux vigiles. L'injection d'analgésique sera répétée toutes les 12 heures pendant 3 jours

Impact sur les animaux

Le modèle de péritonite induit par ligature et ponction ceacale est un modèle qui induit une mortalité assez élevée chez les animaux opérés. La douleur induite par la chirurgie et par l'induction de la péritonite est gérée par administration d'analgésiques.

Devenir

Tous les animaux suivant ces différents protocoles seront mis à mort afin de permettre l'analyse de l'effet des différents traitements sur la réponse immunitaire, l'inflammation générale et les lésions des différents organes de la cavité péritonéale.

Remplacement

L'effet immunomodulateur des différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses a été démontré in vitro mais il est indispensable de confirmer ces résultats in vivo, en ayant une vraie situation d’inflammation mettant en jeu l’ensemble des partenaires cellulaires qui interviennent lors de l’inflammation. Une étude chez la souris s’avère donc nécessaire.

Réduction

Notre expérience nous permet de déterminer que le nombre de 5 souris par groupe et la réalisation en triplicat de l'expérience nous permettra d'évaluer l'effet de nos différentes populations cellulaires et de diminuer ainsi le nombre d'animaux utilisés. Nous inclurons suffisamment de souris par groupe et effectuerons trois expériences indépendantes pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. L’expérience de notre laboratoire nous permet de déterminer le nombre optimal de souris à utiliser par lot.

Raffinement

Les animaux sont anesthésiés sous gaz et maintenues endormies sous masque sur une table chauffante pendant l’intervention et jusqu’à leur réveil. Un antalgique est placé dans l'eau de boisson des animaux 24h avant l'intervention puis de manière continue après la chirurgie. Vu la stabilité de la molécule, le biberon sera changé tous les jours. De plus, une injection d’un analgésique sera effectuée au moment de la chirurgie sur animaux endormis afin de diminuer la douleur. Cette injection sera répétée toutes les 12 heures pendant 3 jours. Les animaux seront élevés à 5 animaux par cage) afin de limiter le stress lié à la chirurgie et à l'isolement. Du papier type kleenex ainsi que des cabanes type "igloo" seront ajoutés dans la cage afin de respectivement permettre la formation du nid et d’enrichir l’environnement de vie des animaux. Des croquettes imbibées d'eau contenant un analgésique seront placées directement dans la cage afin de limiter au maximum l'extension des animaux opérés. De plus, une grille de score et l’utilisation de point limite adaptés permettront de définir les critères d’arrêt de souffrance et d'entraîner la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle complexe qui nous permettra d'évaluer l'effet de nos cellules d'intérêt sur la réponse inflammatoire locale mais également en systèmique. De plus, le modèle de sepsis chez la souris est très bien décrit nous donnant des informations essentielles au bon déroulement de notre procédure. Enfin, les outils techniques et biochimiques nécessaires à l'analyse des données obtenues sont développées chez cette espèce. Les personnes âgées présentent un risque accru de mortalité lors d’une évolution négative d’une péritonite. L'utilisation d'animaux à différents âges (8 semaines, 1 an, 2 ans) nous permettra d'évaluer l'intérêt d'utiliser les différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses comme traitement d'un sepsis induit après péritonite au cours du vieillissement.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire humaine est greffée dans leurs glandes mammaires, puis elles reçoivent des injections de traceurs radiomarqués et passent plusieurs séances d'imagerie sous anesthésie avant une ponction cardiaque terminale. Le porteur indique que l'inoculation de la tumeur peut engendrer du stress, que la croissance ou la nécrose tumorale peut provoquer une gêne et que les anesthésies répétées peuvent affecter les animaux. Il affirme que les résultats in vitro ne suffisent pas et qu'un modèle animal porteur de tumeurs est "indispensable" pour valider le ciblage de ces peptides.

Objectifs

Le récepteur NeuroTenSine-1 (NTS-1) a été précédemment identifié comme étant une excellente cible dans les tumeurs primaires et les métastases ganglionnaires chez des patients atteints d’un cancer de la prostate et de cancer du sein avec un pronostic plus sombre. Des résultats prometteurs ont été obtenus au cours d'études d'imagerie préclinique PET (Tomographie par Emission de Positons) avec des analogues peptidiques radiomarqués au 68Ga (émetteur beta+). Afin d’optimiser ces séries d’analogues, 2 peptides radiomarqués au gallium-68 et au fluor-18 pour le diagnostic PET et 1 peptide radiomarqué au lutétium-177 pour la radiothérapie ont été étudiés et validés in vitro. Le présent projet de recherche préclinique vise à tester in vivo ces radiopeptides sur des modèles murins de cancers du sein exprimant ces récepteurs NTS-1.

Bénéfices attendus

Si un patient métastatique est imagé avec succès par tomographie par émission de positons suite à une injection de radiopharmaceutique dédié, celui-ci pourrait alors bénéficier d’un traitement ciblé par radionucléides (TRT : Targeted Radionuclide Therapy) utilisant le même ligand radiomarqué avec un radionucléide thérapeutique. Le projet vise à optimiser une série d’analogues en modifiant le radionucléide associé à un peptide sur un modèle de cancer du sein triple négatif.

Procédures

Les différentes interventions sur les 80 souris Balb/c nude sont les suivantes : - xénogreffes orthotopiques de cellules tumorales (cancer du sein) dans les glandes mammaires sous anesthésie gazeuse (10min) - 2 Injections intraveineuses au niveau de la queue de 200µl de solution saline contenant les radiotraceurs sous anesthésie gazeuse pour les 80 souris (5 min) - 1 acquisition PET/CT (18F-FDG) pour les 80 souris sous anesthésie gazeuse (5min CT + 15 min PET) - 1 acquisition PET/CT pour 1 souris sur 2 soit 20 souris du groupe "diagnostic" sous anesthésie gazeuse (5min CT + 15 min PET) - 1 acquisition SPECT/CT pour les 40 souris du groupe "thérapie" sous anesthésie gazeuse (5min CT + 20 min SPECT) - 1 ponction cardiaque terminale pour les 80 souris sous anesthésie gazeuse 3% (5min)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront : 1) l'inoculation des tumeurs au niveau des glandes mammaires pouvant engendrer un stress 2) une pousse de tumeur trop importante ou une nécrose potentielle de la tumeur peut entrainer une gêne localisée 3) les anesthésies répétées pour la mise en place du modèle et pour l'imagerie ([18F]FDG et du radiopeptide étudié) peuvent impactées la souris. 4) la mise à mort en fin d'étude.

Devenir

A la fin de la procédure, les 80 souris seront mises à mort. Le sang et les organes seront prélevés pour un comptage radioactif et analyses immunohistochimiques ultérieures.

Remplacement

Les résultats in vitro ne sont pas suffisants pour valider le devenir de l’analogue radiomarqué in vivo. L’utilisation de modèles animaux porteurs de tumeurs avec une forte expression du récepteur NTS1 est indispensable pour déterminer la faisabilité d’un ciblage oncologique des 3 peptides.

Réduction

les expérimentations ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possibles. 2 peptides « diagnostic PET » et 1 peptide «thérapie » seront étudiés. Pour chaque peptide « diagnostic PET », il est nécessaire de visualiser leur biodistribution in vivo et d’identifier les organes présentant une forte expression des récepteurs NTS-1. Ainsi, 10 souris seront injectées avec le radiopeptide seul et 10 souris avec le radiopeptide + 150 µg de neurotensine pour le « blocking ». Pour l’étude du peptide thérapeutique radiomarqué au 177Lu, 40 souris seront incluses dans le protocole de biodistribution : 1 lot « radiopeptide seul » et 1 lot « blocking » ; 4 temps par lot ; 5 souris par temps.

Raffinement

Les souris sont placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour/nuit 12h/12h, enrichissement des cages) au sein d’une animalerie de recherche agréée. Les animaux sont nourris ad libitum et toute manipulation invasive sera précédée d’une anesthésie générale sous isoflurane 2%. Nous avons choisi des points limites clés qui permettent de prévenir une détérioration de l’état clinique générale de l’animal dans le but d’éviter une quelconque souffrance. Les points limites sélectionnés sont les suivants : perte de poids supérieure à 20%, déshydratation, immobilité de plus de 1h (signe d’une douleur aigüe), ulcération et limitation de la taille de la tumeur.

Choix des espèces

Le modèle souris est communément utilisée en oncologie. La Balb/c nude est une souris d’une souche consanguine immunodéprimée et sans poil qui en fait l’un des meilleurs modèles pour la greffe orthotopique de tumeur humaine. Les souris seront réceptionnées à 8 semaines et mises en quarantaines pendant 2 semaines. Les études seront initiées à 10 semaines de développement. L’induction des tumeurs se fera à 10 semaines. Le suivi de la croissance tumorale peut être réalisée en externe par mesure à l’aide d’un pied à coulisse. Lorsque les tumeurs atteindront un volume minimum de 150 mm3, une première acquisition [18F]-FDG sera effectuée pour suivre la croissance tumorale et les métastases potentielles. Les études de 3 radiopeptides pourront être initiées minimum 2j après la première étude PET.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès le lendemain de leur naissance, les souriceaux reçoivent deux injections quotidiennes d'une molécule inflammatoire pendant cinq jours, puis subissent des tests de tolérance à l'insuline et au glucose avec prélèvements de sang à la queue et un isolement d'une semaine en cage métabolique. Le porteur indique une mortalité de 5 à 10 % pendant les injections, un retard de croissance, des troubles du comportement et une douleur locale. Il affirme qu'aucune approche in vitro ou informatique ne peut reproduire les connexions entre le cerveau et le métabolisme et tue tous les animaux pour prélever leurs organes.

Objectifs

La naissance prématurée (avant la fin normale de la grossesse) est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Dans les pays industrialisés, en raison de l'amélioration des soins intensifs néonataux, le nombre des nourrissons prématurés qui survivent au-delà de l’enfance est en hausse. Il existe néanmoins une inflammation importante chez 20 à 40% de ces enfants à la naissance, qui peut entraîner des lésions du cerveau. Ces lésions sont à l’origine de handicaps, de déficits des certaines capacités intellectuelles et de troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte et sont regroupées sous le terme d'Encéphalopathie du Prématuré (EDP). En plus de ces déficits, des études récentes ont démontré qu’1 enfant prématuré sur 5 développe de l’obésité pendant l’enfance. L'obésité est le principal facteur de risque pour le diabète de type 2. Pour comprendre comment une inflammation au moment de la naissance peut favoriser le développement d’une obésité et du diabète, nous utiliserons un modèle de EDP chez le souriceau combiné avec un régime hypergras. Les mères seront soumises jusqu’au sevrage de leurs petits soit à un régime hypergras soit à un régime contrôle sous forme de croquettes plus ou moins riches en graisse.

Bénéfices attendus

Comprendre pourquoi la naissance prématurée et l’inflammation à la naissance peuvent favoriser ensuite l’apparition d’une obésité et d’un diabète peut permettre de proposer des régimes alimentaires ou des traitements pour prévenir et éviter ces maladies chez l’homme.

Procédures

Les souriceaux recevront deux injections intrapéritonéales (au niveau de l’aine) par jour de la molécule inflammatoire ou du contrôle (matin et fin d’après-midi) du jour après la naissance (P)1 à P4, puis une le matin du P5. Cette injection prend quelques secondes. Pour savoir si les animaux développent un diabète, un lot de souris recevra de l’insuline et la glycémie sera mesurée à t=0’, 5’, 10’, 15’, 20’, 30’, 40’, 60’, 90’ et 120’ sur une goutte de sang récupérée par légère piqure au bout de la queue (animal éveillé). Le même test sera reproduit 48h plus tard, en remplaçant l’insuline par du glucose. D’autres animauxseront utilisés pour l’analyse de leur métabolisme. Ceci nécessite leur isolement pendant 1 semaine dans des cages individuelles spéciales appelées « cages métaboliques », permettant le recueil des urines, des selles et des gaz. Une semaine d’habituation en cages individuelles classiques sera réalisée auparavant.

Impact sur les animaux

Site 1: - Une mortalité de 5 à 10% peut survenir en période d’injection de la molécule inflammatoire. - LUne douleur due à infection locale dans la zone d’injection intra-péritonéale - Un retard de croissance, - des manifestations de stress : troubles comportementaux (caractère asocial, hyperactivité, préférence maternelle non visible...), accélération de la fréquence respiratoire. Lors du test de résistance à l’insuline ou au glucose réalisé à 4 semaines : sensation modérée de faim due à la privation de nourriture pendant 5h, puis douleur légère au bout de la queue pour permettre les prélèvements de sang. Comme il y a une seule incision, il y aura peu d’inconfort pour les animaux, à part le stress généré par la manipulation répétée. - Site 2 uniquement : L’isolement en cage métabolique peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure pour permettre le prélèvement des organes et du sang, et comprendre si l’inflammation au début de la vie peut causer un diabète. Le rôle du cerveau, du foie, du pancréas et du système immunitaire sera analysé.

Remplacement

Notre étude s’intéresse aux liens entre le cerveau et l’utilisation des lipides par l’organisme. Il est impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques) toutes les connexions concernées.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été obtenu grâce aux données du laboratoire, de la littérature et d’une estimation statistique. Si les résultats obtenus à mi-projet sont suffisamment clairs, il sera réduit de moitié.

Raffinement

Avant sevrage, les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. Des grilles de surveillance en fonction de l’âge des animaux seront utilisées pour s’assurer de leur bien-être et déterminer l’atteinte éventuelle des points limites. Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, et jusqu’à P10, on surveillera quotidiennement l’apparence, le poids, et le positionnement des animaux au sein du nid. A partir de P10, avant sevrage, la surveillance aura lieu deux fois par semaine. Les scores de surveillance prendront également en compte une éventuelle prise de poids susceptible de gêner la locomotion de l’animal. Si le score atteint le niveau du point limite, l’animal sera euthanasié selon les méthodes réglementaires. Le transport d’une partie des animaux entre deux laboratoires sera nécessaire à 3 semaines. Il sera assuré par un transporteur agréé, garantissant les bonnes conditions de trajet pour les animaux. Une semaine d’habituation en cage individuelle classique sera réalisée avant celle passée en cage métabolique.

Choix des espèces

Dans le cas de l’étude de l’inflammation cérébrale, les études scientifiques montrent que la souris est une espèce très fréquemment utilisée pour la réalisation de modèles de lésions dans le cerveau, car les régions principales de cet organe (qui correspondent aux fonctions motrices et intellectuelles), et ses cellules sont très proches de celles de l’homme. Par ailleurs, ce modèle a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré (un souriceau à 5 jours de vie correspond approximativement à un foetus humain de 24-30 semaines de gestation) ; les observations pourront donc être extrapolables au nouveau-né humain. Les différents temps d’exploration et de prélèvements choisis ensuite permettent de suivre les animaux jusqu’au stade jeune adulte.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur colique humaine est greffée sous leur peau, puis elles reçoivent une injection quotidienne cinq jours par semaine pendant trois semaines et sont suivies plusieurs mois. Le porteur indique une possible douleur d'injection, une perte de poids et des tumeurs pouvant gêner la locomotion ou se nécroser. Il affirme que les mécanismes d'échappement à la chimiothérapie sont "impossibles à recréer in vitro" et vise à tester des nanoparticules d'acheminement de médicaments anticancéreux.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d'optimiser les propriétés pharmacocinétiques et la vectorisation sous forme de nanoparticules de silices de molécules induisant la dégradation ciblée d'un facteur transcriptionnel. La dégradation de cette proteine est cruciale car elle a été identifiée comme un marqueur de mauvais pronostic dans de nombreux cancers dont le cancer colorectal. Nous avons démontré que ce facteur de transcription était préférentiellement activé dans les cellules souches cancéreuses et qu’une diminution de son niveau d’expression sensibilise ces cellules à la chimiothérapie et retarde significativement la récidive tumorale. A ce jour il n’existe aucun inhibiteur pharmacologique utilisable en clinique. Ainsi, l’optimisation de molécules capables d'induire sa dégradation ciblée serait une avancée très prometteuse afin d’améliorer l'efficacité thérapeutique des traitements anti tumoraux.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra dans un premier temps de tester et d’optimiser l’efficacité in vivo de nanoparticules dans un modèle préclinique murin. A plus long terme, si ces résultats sont concluants, ils pourront potentiellement bénéficier aux patients comme stratégies adjuvantes afin d’optimiser l‘efficacité des traitements actuels.

Procédures

A l’âge de 7 semaines, les souris seront dans un premier temps greffées (une intervention de

Impact sur les animaux

Nous anticipons de légères nuisances (douleurs provoquées par la piqure avec une aiguille) liées à l'injection de cellules tumorales en sous-cutanée ou aux injections intrapéritonéales des molécules testées, ainsi qu'une possible perte de poids (

Devenir

A l'issue des procédures expérimentales, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever et d'analyser les tumeurs résiduelles : analyses histologiques, analyses moléculaires et étude du potentiel tumorigène.

Remplacement

La croissance tumorale et les mécanismes d’échappement aux chimiothérapies sont des phénomènes complexes, mettant en jeu une multitude de paramètres, impossible à recréer in vitro d’où la nécessité de poursuivre la validation de ces stratégies avec une étude préclinique chez la souris immunodéprimée, modèle permettant de réaliser des greffes de cellules humaines. Cependant nous avons préalablement optimisé les informations obtenues, via notamment la mise en place de procédures de remplacement par des modèles in vitro et in cellulo afin de confirmer et de renforcer les résultats obtenus.

Réduction

Grâce à nos études antérieures, nous avons réduit au minimum le nombre d’animaux requis pour ces expériences sans que cela se traduise par l'obtention de résultats moins fiables.

Raffinement

Les souris étant des animaux sociaux et nerveux, voici les conditions de raffinement qui seront mises en place: - elles seront hébergées en groupe, à raison de 5 souris cage, - l'environnement sera enrichie avec de la litière absorbante, la présence d'une petite maison en carton et ainsi que du matériel (copeaux, cotons) afin qu'elles puissent se fabriquer des nids. Nous allons aussi évaluer au moins deux fois par semaine l'état de santé de chaque souris (poids, taille des tumeurs, locomotion, posture) afin de déceler toute douleur subie. Nous avons aussi identifié des points limites justifiant l'euthanasie des animaux si nécessaire.

Choix des espèces

La souris immunodéprimée est le modèle utilisé couramment pour étudier l’initiation tumorale ou l’efficacité de traitements sur la croissance tumorale. Ne possédant pas de thymus, elle accepte la greffe de cellules tumorales humaines sans présenter de phénomène de rejet. Nous utilisation des souris adultes , âgées de 7 semaines minimum, afin de pouvoir réaliser des greffes avec une bonne prise de greffe tout en assurant aussi la bonne récupération des animaux après l'injection des souris ou les traitements par chimiothérapie.