Souris

1 224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de mélanome leur sont injectées et laissées proliférer pendant douze à quatorze jours, avec des injections complémentaires et un prélèvement de sang par incision de la queue le jour de la mise à mort. Le porteur indique que la croissance de la tumeur peut provoquer du stress et une douleur et altérer l'état général des animaux. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'étudier ces structures immunitaires tumorales et prélève tumeurs et organes après dissection.

Objectifs

Le mélanome est une tumeur maligne agressive de la peau dont l’incidence ne cesse d’augmenter, représentant aujourd’hui près de 4% des cancers chez l’homme. L’immunothérapie est un nouveau traitement qui représente aujourd’hui l’un des piliers de la prise en charge thérapeutique du mélanome. Malgré les progrès de la prise en charge clinique et thérapeutique au cours des dix dernières années, les réponses obtenues restent insuffisantes et les patients échappent aux traitements lorsque la tumeur est métastasique. Aujourd’hui, des thérapies alternatives plus ciblées sont envisagées en prenant en compte le micro-environnement tumoral. Dans certains types de cancers et notamment dans le cas du mélanome, il a été montré la présence de structures particulières au sein même de la tumeur (TLS) qui sont des agrégats de cellules immunitaires très organisés. Ces structures se forment lors d’une inflammation notamment associée à la croissance tumorale. La présence, le nombre et l’organisation de ces TLS sont des facteurs prédictifs de la réponse au nouveau traitement par immunothérapie Le système endocannabinoïde (ECS) a montré un potentiel anticancéreux en modulant plusieurs voies impliquées dans la croissance, la différenciation, la migration et l'angiogenèse cellulaires et est, de fait, une nouvelle voie thérapeutique potentielle lors de pathologies cancéreuses. Nous avons récemment découvert au laboratoire un nouvel acteur dans l’ECS, l’enzyme GDE3. Nous avons montré que cette enzyme joue un rôle clé dans la migration de cellules immunitaires lui conférant un rôle protecteur lors de pathologies infectieuses et inflammatoires. Le but de ce projet est d'étudier le rôle de l'enzyme GDE3 dans les évènements clés de la progression du mélanome telles que la prolifération cellulaire, la migration des cellules tumorales et immunitaires ainsi que la résistance aux traitements anticancéreux par immunothérapie.

Bénéfices attendus

La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du mélanome et notamment pour l'amélioration de la réponse au traitement de patients montrant une résistance lors d'une immunothérapie.

Procédures

Les animaux utilisés dans ces procédures seront soumis à une injection de cellules en intra-péritonéale ou en intradermique suivies en fonction des lots par une injection en intra-péritonéale. Ils pourront être soumis à un prélèvement de sang par légère incision de la queue afin de réaliser des dosages biochimiques le jour de la mise à mort. Après la mise à mort, les tumeurs et les organes tels que la rate, les ganglions et la peau seront prélevés.

Impact sur les animaux

Durant l'expérimentation, les animaux seront soumis à 1 injection en intra-péritonéale ou intra-dermique suivie, en fonction des lots par 1 injection en intra-péritonéale pouvant provoquer du stress chez l'animal. D'autre part, des cellules tumorales de mélanôme murin étant injectées et laissées proliférer durant 12 ou 14 jours, il est possible que l'augmentation du volume tumoral induisent des nuisances telles que du stress et une douleur chez les animaux. L'état général des animaux pourrait être de ce fait altéré.

Devenir

Tous les animaux inclus dans chaque procédure seront mis à mort et disséquer afin de collecter les organes et la tumeur pour les différentes analyses.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative pour analyser le rôle du système endocannabinoïde dans la progression du mélanome et de la réponse immunitaire anti-tumorale. La formation des structures lymphoïdes tertiaires associées à l'efficacité de la thérapie de point de contrôle immunitaire ne peuvent avoir lieu que sur des modèles in vivo.

Réduction

Nous utiliserons des souris C57BL6 sauvages ou génétiquement modifiées permettant le développement de tumeurs par injection de cellules murines cancéreuses. Le nombre de 12 animaux par groupe expérimental avec 3 expériences indépendantes semble être le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs adaptés.

Raffinement

Pour les 2 procédures, et dans le but d'éviter et atténuer toute forme de souffrance des animaux, un contrôle quotidien sera effectué durant les 14 jours d'expérimentation. Après une pesée initiale le jour de l’injection des cellules tumorales, les animaux seront pesés tous les 2 jours. Durant toute la période d'expérimentation, l'état général et le comportement des animaux seront évalués quotidiennement par le personnel de zootechnie. Un enrichissement du milieu sera ajouté (igloo, carrés de coton) pour permettre aux animaux de faire leur nid. Dans le cas où un animal montrerait une altération de son état général, il sera euthanasié. Tout le personnel de zootechnie et les expérimentateurs sont particulièrement bien formés et attentifs au bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle du fait de la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés déjà disponibles au laboratoire. Pour les deux procédures expérimentales, nous utiliserons des souris âgées d'au moins 8 semaines, c'est à dire adultes et matures notamment pour leur système immunitaire et qui correspond à ce qui est décrit dans la littérature.

1 296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes, une infection chronique par le parasite Toxoplasma pouvant provoquer un syndrome fiévreux de sept jours, jusqu'à deux chirurgies sous anesthésie dont une injection intracrânienne bilatérale, puis des tests comportementaux d'anxiété, d'activité locomotrice, de force et de mémoire. Le porteur indique que les chirurgies stéréotaxiques peuvent entraîner angoisse ou prostration et que les souris sont tuées par dislocation cervicale pour prélever le cerveau. Il affirme que le remplacement "n'est pas applicable" car les études in vitro ne renseignent pas sur le comportement et la cognition.

Objectifs

La réponse aux cassures double-brin de l'ADN (CDB) et les facteurs qui y sont associés jouent un rôle majeur dans les mécanismes liés à l'apprentissage et la mémoire. Dans ce cas, les cassures sont transitoires et efficacement réparées par des mécanismes encore mal compris dans les neurones. Des dérégulations de la production ou de la réparation de ces cassures, qui aboutissent à leur accumulation, contribuent directement aux troubles mnésiques dans la maladie d'Alzheimer. Le projet a pour objectifs de déterminer l’importance de la détection, ou de la réparation des CDB dans les processus mnésiques et comportementaux normaux, et les processus pathologiques liés à la neuroinflammation chronique ou à des infections du système nerveux central, que ce soit dans un modèle trangénique entrainants les symptomes de la maladie d'Alzheimer, ou d'une infection par Toxoplasma ou par l'expression isolée de médiateurs de l'inflammation.

Bénéfices attendus

Comprendre le rôle de la détection des CDB, et de leur réparation dans les neurones au cours des infections du système nerveux central et la réponse neuro-inflammatoire, permettra, sur le plan fondamental d'élucider les mécanismes clés de la réponse aux CDB mis en jeux dans les neurones et leur importance pour la fonction cognitive. Sur le plan médical, ces recherches pourraient déboucher sur de nouvelles stratégies thérapeutiques contre des maladies neurodégénératives dont la maladie d'Alzheimer pour laquelle aucun remède n'est connu.

Procédures

Les interventions concerneront: i) des injections intrapéritonéales répétées journalièrement pendant 5 jours, sur animaux vigiles (Proc 1+2+3=648 souris, 5 jours, chaque injection prend quelques secondes); ii) une infection chronique réalisée par une seule injection intrapéritonéale d'un parasite, dont la phase d'invasion peut engendrer un syndrome fébrile d'une durée de 7 jours, avant de devenir asymptomatique (Proc 2=216 souris, une injection de quelques secondes); iii) à deux types de chirurgies sous anesthésie générale: une de moins de 15 minutes (chirurgie cutanée, Proc 2+5= 324 animaux), ou/et une de moins de 40 minutes par animal (injection intracrânienne bilaterale, Proc 3+4+5 = 972 animaux, 40 minutes); iv) une évaluation comportementale de l'anxiété, l'activité locomotrice, la force et les processus cognitifs ( toutes les souris = 1296, sur 15 jours au total), la perfusion intracardiaque sous anesthésie générale profonde terminale (sans réveil, 1296 animaux, moins de 2 minutes).

Impact sur les animaux

Entre nos mains, nous n'avons observé aucun phénotype dommagable du fait de l'expression de transgène entrainant les symptomes de la maladie d'Alzheimer. Les souris iH2A.X KO ne présentent aucun phénotype délétère au cours de leur vie, ce que nous avons confirmé lors de leur utilisation dans le cadre du premier protocole APAFIS autorisé pour cette lignée. Dans le cas d'infection par Toxoplasma ou l'infusion chronique de cytokines pro-inflammatoires par implantation de pompes sous cutanées, les animaux présentent un syndrome fébrile qui peut durer jusqu'à 7 jours et peut entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les chirurgies stéréotaxiques peuvent parfois entrainer une angoisse ou une prostration pendant les 48 premières heures post-chirurgie. Du fait que les animaux sont acclimatés à l'environnement des tests comportementaux et sont habitués aux expérimentateurs par manipulations régulières des animaux dans les semaines précédents les tests, aucune nuisance n'est constatée durant les tests comportementaux. Seul durant la semaine de labyrinthe de Barnes, où les souris doivent être hébergées individuellement, l'hébergement pourrait devenir anxiogène mais des mesures d'enrichissiment du milieu et de nidification sont renforcées pour limiter l'anxiété potentielle, et l'isolement est limité à 14 jours maximum.

Devenir

Quelle que soit la procédure de 1 à 5, les 1296 animaux au total seront en fin de procédure mis à mort par dislocation cervicale. La mise à mort est nécessaire afin de prélever les organes en post-mortem (dont le cerveau) des animaux pour comprendre ensuite au niveau cellulaire et moléculaire, les causes et mécanismes des changements observés au niveau comportemental, et limiter le double-emploi au maximum. Ces prélèvements post-mortem sont aussi nécessaires afin de confirmer l'efficacité de la procédure (KO de H2A.X, infection chronique par le parasite du cerveau, présence de cytokine dans le parenchyme cérébral, expression localisée de l'amyloid beta ou des FR).

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades conduisant aux cassures doublebrins de l’ADN. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car ces études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition. Par conséquent les études in vitro ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que des groupes de 15 animaux par expérience comportementale étaient nécessaires. En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 3 fois de manière indépendante. La variabilité interindividuelle ne nous permet pas de diminuer davantage le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Les conditions d’expérimentations font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il atteint un point limite caractérisé par l'atteinte d'au moins deux des 3 signes de souffrance décrits dans la section dédiée. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement, cachettes et objets à ronger) . Une surveillance journalière par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux (comme précisé pour chacune des expériences).

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. La souris est l’hôte naturel du parasite Toxoplasma gondii, ce qui nous permettra d’étudier les mécanismes physiopathologiques la réponse aux CDB dans les neurones dans le cadre d’une infection naturelle. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle dans ce type de projet: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés (KO inductibles, et modèles exprimant les protéines humaines responsable de la pathologie Alzheimer). Aucune autre espèce d’animaux déficients pour H2A.X n’est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Seuls des animaux adultes d'âge supérieurs à 4 semaines seront utilisés. Les recherches s'intéressent à l'impact de manipulation sur un système nerveux central mature et adulte, avec un impact de l'âge.

238 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de cadmium cinq jours par semaine, des greffes sous-cutanées de cellules de cancer du pancréas ou du foie et des injections de candidats-médicaments. Le porteur indique qu'un point limite est fixé au volume tumoral de 1 500 mm3, à une perte de poids dépassant 20 % ou à une ulcération de la tumeur, seuils au-delà desquels les souris qui se dégradent sont mises à mort. Il affirme que la cinétique de cette progression cancéreuse ne peut être reproduite in vitro et prélève tumeurs et organes après la mise à mort.

Objectifs

Les différents objectifs sont de tester l’effet du cadmium sur l’apparition et la progression des stades néoplasiques (appelés pancreatic intraepithelial neoplasia = PanIN) et de caractériser les rôles des gènes d’intérêt et de tester de nouveaux candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet seront une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires du cancer et identifier à terme de proposer de nouveaux candidats médicaments dans une pathologie qui manque de traitement efficace.

Procédures

Nous réaliserons un modèle d'exposition au Cadmium (par injection intrapéritonéale) sur des souris normales et sur un modèle préclinique de lésion néoplasique pancréatique . (Procédure 1) Lot1: Effet Cadmium sur souris contrôles. Injection 5x par semaine pendant 2 (4 condtions = 24 souris) ou 4 semaines (24 souris) Lot2: Effet Cadmium sur souris développant des lésions néoplasiques dans le pancréas. Injection 5x par semaine pendant 1 mois (4 conditions = 40 souris) ou 3 mois (40 souris) Nous réaliserons un modèle de xénogreffe sous cutanée de cellules d'adénocarcinome pancréatique (par injection sous cutanée sur le flanc des souris) (Procédure 2). Certaines de ces souris recevront des injections hebdomadaires de candidats médicament (ciblant des interactions de recepteurs à la surface cellulaire) (Procédure 3). Lot3 à 6 xénogreffes de cellules de cancer pancréatiques (panel de 4 lignées représentatives de l'hétérogénéité des cancer pancréatiques) non traité (PBS) et molécule X (traitement 1 fois par semaine pendant 6 semaines). Les lots 7, 8 et 9 sont un modèle de xénogreffe sous cutanée de cellules de cancer du foie. (Procédure 2). Ces souris sont ensuite suivies pendant 2 mois jusqu'à la fin de l'expérience (mesure du volume tumoral). Le Lot10 concerne des souris développant des lésions néoplasiques dans le pancréas pour lesquelles une injection heddomadaire du candidat médicament est réalisé (procédure 3). 2 conditions (traitées, non traitées) = 20 souris suivies pendant 2mois. Récapitulatif des durées: procédure 1: 4 semaines à 3 mois (selon la condition, voir ci dessus); procédure 2: 6 à 8 semaines (selon la condition); procédure 3: 2 mois

Impact sur les animaux

Les injections de cadmim (procédure 1) sont réalisées en intra-péritonéal. induction éventuelle d'une douleur légère de très courte durée. Les xénogreffes sous cutanées (procédure 2) sont réalisées par une injection en sous cutanée. induction éventuelle d'une douleur légère de très courte durée. Les injections de candidat médicament (procédure 3) sont réalisées en intra-péritonéal. induction éventuelle d'une douleur légère de très courte durée. Concernant les xénogreffes, un point limite (1500mm3) sera appliqué (taille de la tumeur au-delà de laquelle, l’expérimentation est stoppée). (1) la masse de la tumeur ne devrait augmenter ni au point d’interférer significativement avec les fonctions normales du corps ni au point d’induire, du fait de son emplacement, souffrance et/ou détresse (tumeurs solides). (2) une perte de poids dépassant 20 % du poids du corps d’un animal normal (en tenant compte de la masse tumorale) ; (3) une ulcération/infection à l’emplacement de la tumeur ; - la charge tumorale ne devrait pas excéder 10 % (typiquement à un diamètre de 17 mm pour une souris de 25 g).

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin des procédures. Nous prélevons la tumeur et/ou le pancréas et les sites majeurs de métastases (foie, poumon) pour des études de biologie moléculaire et de biochimie.

Remplacement

Il s’agit de l’étude d’un modèle physiopathologique préclinique de progression carcinogénétique dont la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro. Toutefois, la selection des gènes d'intéret et des candidats médicaments ciblant MUC4-ErbB2 sera réalisée au préalable sur des modèles in vitro et d'organoïdes d'adénocarcinomes pancréatiques ou hépatiques

Réduction

e nombre d’animaux par groupe est prévu pour avoir un effectif suffisant (suivant la règle des 3R) permettant une analyse statistique significative. Pour l'apparition de lésions néoplasiques (appelées PanIN), nous analyserons 6 souris par groupe car il s'agit d'une analyse qualitative (présence ou absence de PanIN). Pour l'étude de progression des lésions néoplasiques, nous analyserons 10 souris par groupe car les modèles transgéniques de cancer pancréatiqeus présentant une plus grande hétérogénéité de surface de lésions néoplasiques . Les effectifs ont été calculés statistiquement. Pour l'analyse Les xénogreffes donnant des résultats homogènes seront étudiées sur des cohortes de 6 souris par groupe.

Raffinement

Le nombre de cohorte a été optimisé pour réduire le nombre de souris. Une surveillance accrue est effectuée avec un suivi régulier de l'état général des souris. Nous serons particulièrement attentifs à la détection précoce de tout signe de douleur. Nous surveillerons les courbes de poids de souris et rechercherons les signes de stress et de douleur. Une injection sous cutanée de buprénorphine sera realisée en cas de douleur. Si les signes de douleur persistent, un sacrifice anticipé sera effectué. Pour les xénogreffes, un point limite sera appliqué (taille de la tumeur au-delà de laquelle, l’expérimentation est stoppée).

Choix des espèces

Modèle de souris transgénique référence pour l'apparition de lésions néoplasiques pancréatiques (appelées souris KC). Les expériences seront réalisées sur des souris agées de 3 mois pour les souris KC. Ces souris présentent une mutation Kras constitutivement active qui contruit à pancréas comportants des lésions néoplasiques (appelées PanIN). Modèle standard de xénogreffes en souris immunodéprimées (Scid) permettant l’implantation de lignées cellulaires

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie crânienne stéréotaxique d'environ deux heures et demie sous anesthésie pour l'implantation d'électrodes dans une région du cerveau, puis vit isolée en cage individuelle jusqu'à la fin du protocole. Le porteur indique que la chirurgie peut entraîner une angoisse ou une prostration et qu'une infection reste possible, et que les souris sont tuées pour prélever le cerveau à des fins de contrôle histologique. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'existe pour étudier le sommeil et que les cataplexies nécessitent "l'animal entier vivant".

Objectifs

La narcolepsie de type 1, avec cataplexie, est une maladie neurologique rare qui se caractérise par une hypersomnolence pendant la journée et une intrusion de composantes du sommeil paradoxal pendant l’éveil. L’un des symptômes majeurs est la cataplexie. Les épisodes de cataplexie sont des pertes de tonus musculaire induites pendant l’éveil, lors d’un contexte émotionnel positif, provoquant souvent la chute de la personne. Les chutes peuvent être brutales et conduire à des blessures. Le circuit neuronal exécutif des cataplexies est encore très mal connu. Des données récentes suggèrent que le pons dorsal pourrait jouer un rôle clef. Nous testons ici l'hypothèse qu'au sein des noyaux du pont dorsal, il existe une sous-population neuronale encore non identifiée responsable du déclenchement de la cataplexie. L’objectif de notre projet de recherche est donc d’identifier les neurones du pons dorsal dont le mode de décharge électrique est modulé au cours des cataplexies. Pour cela nous utiliserons une approche d’enregistrements électrophysiologiques multi-unitaires couplée à l’enregistrement polysomnographique du sommeil.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, la prise en charge des cataplexies est uniquement symptomatique, du fait du manque de connaissance scientifique des circuits neuronaux exécutifs. L’identification précise de ce circuit permettra le développement de traitements ciblés.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une seule intervention chirurgicale stéréotaxique implantatoire, sous anesthésie générale, d’une durée approximative de 2h30. Brièvement, un dispositif d’enregistrement de l’activité cérébrale sera positionné sur la tête de l’animal. Trois électrodes seront placées sur le crâne pour enregistrer l’activité corticale. Une électrode profonde, fixée sur un petit vernier (nanodrive) et inclus dans le dispositif sur la tête de l’animal, sera positionnée dans la structure cérébrale cible (le pons). Cette électrode permettra d’enregistrer les neurones présents dans cette structure et pourra être déplacée de quelques microns grâce au nanodrive, sans aucune conséquence pour l’animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances expérimentales seront: - une chirurgie crânienne sous anesthésie générale. - une mise en cage individuelle après la chirurgie et jusqu'à la fin de la procédure. Les nuisances attendues sur les souris seront : - un isolement du fait de la présence de leur implant. - une maladie par infection n'est pas à exclure, bien que ce genre de cas ait été observé que très rarement (par expérience, moins d'une souris sur 100).

Devenir

Les souris seront mises à mort pour prélèver le cerveau à des fins de contrôles histologiques, étape indispensable pour la validation des résultats obtenus.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de modèles in vitro d’études du sommeil. Le sommeil et les cataplexies sont des phénotypes complexes nécessitant l’animal entier vivant.

Réduction

Les données qui seront acquises étant originales, nous ne pouvons pas nous appuyer sur des études antérieures pour calculer la taille du lot nécessaire pour l’obtention d’une puissance statistique suffisante. La taille du lot de souris est donc définie de façon empiriquement sur la base de nos expériences physiologiques antérieures en tenant compte du nombre de cataplexies par session d’enregistrement, du nombre de neurones enregistrés par session, de la finalisation de la mise au point de la chirurgie (encombrement des électrodes sur la tête etc..), et des échecs éventuels. Les données expérimentales générées seront traitées à l’aide des tests d’analyses adoc.

Raffinement

Pour favoriser les interactions sociales, les souris sont hébergées par lot de 2-5 par cage. Des enrichissements systématiques sont mis en place pour favoriser le bien-être de l’animal. Après chirurgie sous anesthésie générale et pour toute la durée de la procédure, les animaux sont placés dans des cages individuelles et suivis régulièrement avec une attention quotidienne lors de la phase postopératoire et l’optimisation de la récupération. Notre préoccupation sera ensuite d’évaluer quotidiennement grâce à une fiche de scorage, l’évolution des paramètres physiologiques qui nous permettra de détecter toute dégradation de l’état de santé général. Celle-ci définie également le point limite des expérimentations avec mise à mort des animaux pour prévenir l’apparition d’une quelconque souffrance. Pour minimiser le stress dû au placement en cages individuelles, et éviter que les souris expérimentées soient en isolement social total, trois souris non-expérimentées seront systématiquement placées dans la pièce d’enregistrement. Les souris non-expérimentées issues d’une même cage seront placées ensemble dans un baril transparent, à côté du baril logeant la souris expérimentée. L’objectif est de préserver les interactions visuelles, auditives et olfactives.

Choix des espèces

La souris orexin-knock-out est un modèle animal reconnu de la pathologie étudiée. Elle exprime l’ensemble des symptômes observés chez l’homme, y compris les cataplexies. L’autre modèle animal reconnu actuellement existant est le chien narcoleptique mais nous ne sommes pas en mesure d’étudier cet animal. Il s’agira de souris adultes (10-16 semaines au début de la procédure) ayant atteint leur maturité cérébrale, possédant déjà un système locomoteur mature, un cycle circadien et ultradien veille-sommeil stabilisé et consolidé, en cohérence avec les données rapportées dans nos précédentes publications et d’une manière générale dans la littérature chez la souris dans ce domaine des neurosciences.

351 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une tumeur mammaire greffée sous la peau et reçoivent des injections intraveineuses répétées, réalisées sur animal vigile maintenu en contention, ainsi que des prélèvements sanguins. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une gêne et une douleur légère à la marche et que la contention vigile génère un stress modéré. Il affirme qu'une étude in vitro "ne peut représenter la complexité du vivant" et justifie ainsi le recours à la souris pour tester des immunoconjugués ciblant HER2, dont l'intérêt pour les patientes reste renvoyé à une validation préclinique.

Objectifs

Le cancer du sein (CS) est désormais le cancer le plus fréquent chez les femmes européennes. Parmi tous les différents CS, 1 patiente sur 5 est affectée par un CS qui surexprime le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2). Si ces cancers ont longtemps été de mauvais pronostic, la survie globale s'est nettement améliorée grâce à l’avènement des thérapies ciblées anti-HER2. Cependant, il existe des problèmes de résistance à ces traitements, notamment au stade métastatique, nécessitant le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Dans la perspective de développer de nouveaux traitements, de nombreuses molécules prometteuses étudiées en phase clinique ont dû être arrêtées en raison d’une toxicité élevée, générée en partie par l’utilisation de molécules actives extrêmement cytotoxiques. Ces observations ont ouvert la voie à l’utilisation de plus petites molécules moins toxiques et plus sûres pour le patient. Dans ce contexte, nous avons développé et breveté deux nouvelles méthodes de synthèse de petites molécules stables présentant des propriétés thérapeutiques optimisées et ciblant HER2. Après avoir validé in vitro leur efficacité accrue sur différentes lignées cellulaires de cancers du sein le projet proposé vise à évaluer leur efficacité in vivo (biodistribution et activité anti-tumorale).

Bénéfices attendus

La validation préclinique des immunoconjugués novateurs développés pourrait rapidement aboutir au développement de thérapies ciblées permettant de traiter des cancers agressifs et métastatiques.

Procédures

Injection sous cutanée (anesthésie gazeuse-1 fois) + Injection intra veineuse (Contention - vigile -1 fois) J+28 n=261 Injection sous cutanée (anesthésie gazeuse-1 fois) + Injections intra veineuses (Contention - vigile - 5 fois maximum avec minimum 48h entre 2 injections et alternance des veines caudales) J+28 n=60 Injection intra veineuse (Contention - vigile -1 fois) + prélèvement sanguin (Contention - vigile - 1 fois / jours pendant 3 jours avec alternance des veines caudales) n=30

Impact sur les animaux

La mise en place du modèle (tumeur sous cutanée) peut entrainer une gêne voir une douleur légère en terme de déplacement de l'animal et de ressenti cutanée. Les injections IV se faisant sur animale vigil dans un appareil de contention (durée inférieur à 1 minute), l'animal peut ressentir un stress modéré pendant la procédure.

Devenir

Des analyses ex vivo sont prévues à l'issue de chacune des procédures ainsi, tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune d'entre elle.

Remplacement

Suite aux études in vitro, le développement et la validation préclinique de nouvelles molécules thérapeutiques requière la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats en prenant en compte l’homogénéité du modèle. Ce nombre a été calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. De plus, l’étude dose et schéma d’administration et les examens d’imagerie permettent également de réduire le nombre d’animaux. Le nombre total d’animaux est de 351 souris maximum sur une période de 5 ans.

Raffinement

Les modèles animaux choisis sont reconnus par la littérature pour reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine. Des méthodes sont utilisées afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale – minimum 3 animaux/cage-, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques avant l'atteinte des points limites définis. Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié. De plus, les examens d’imagerie médicale permettent également de raffiner l’étude grâce d’une part au caractère non invasif de la technique et d’autre part à la possibilité d’un suivi longitudinal ou un animal est son propre contrôle au cours du temps.

Choix des espèces

Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer. De plus, les souris immunodéficientes porteuses de greffe de lignée tumorale humaine (xénogreffe) sont adaptées pour les études fondamentales et appliquées de développement de traitements des cancers humains. Souris adultes âgées de 5 à 6 semaines pour optimiser la prise de greffe.

1 942 souris vont être utilisées, toutes tuées à la fin de chaque procédure pour des études d'électrophysiologie ou d'anatomie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent par une chirurgie stéréotaxique pour injecter un virus, la pose d'une fenêtre crânienne d'une à deux heures et des séances éveillées la tête fixée, et certaines reçoivent du chlorure de lithium qui leur donne une nausée, pour un test d'aversion gustative de onze jours. Le titre présente ce projet comme le second volet, "(2/2)", d'une étude du cortex insulaire postérieur, dont l'équipe espère des "notions fondamentales" sur le traitement du goût. Le porteur annonce aussi une perte de poids due à une restriction hydrique dont il ne donne ni la durée ni le motif, et des "tests comportementaux spécifiques" qu'il ne nomme pas, hors l'aversion gustative.

Objectifs

L'objectif principal du projet est de déterminer les propriétés des circuits neuronaux du cortex insulaire postérieur (CIP) et les mécanismes par lesquels ces circuits traitent les informations sensorielles. En effet le cortex insulaire est impliqué dans une grande variété de fonctions, notamment l'interoception, les états émotionnels et, dans sa partie postérieure, le traitement sensoriel du goût, du toucher, du son et de la température. Nos connaissances sur les propriétés des circuits neuronaux du CIP et sur sa connectivité fonctionnelle dans des conditions physiologiques et pathologiques sont très limitées. Il a été postulé que la plasticité à court terme est un facteur clé dans le façonnement du traitement sensoriel, permettant par exemple de distinguer des stimuli de nature similaire. Cependant, cette hypothèse n'a pas encore été testée directement. Nous utiliserons une approche multidisciplinaire allant du traçage anatomique et fonctionnel in vitro à l'imagerie fonctionnelle in vivo et enfin nous évaluerons la pertinence de nos résultats avec des tests comportementaux spécifiques. Nous activerons ou inactiverons des voies spécifiques et testerons les conséquences sur la fonction des circuits et le traitement sensoriel. Nous modifierons, au niveau d'une synapse spécifique, la plasticité à court terme en éliminant ou en surexprimant des protéines clés impliquées dans la transmission synaptique et nous testerons les conséquences sur la fonction du circuit, le traitement sensoriel et le comportement.

Bénéfices attendus

Nous espérons identifier les principales projections sous-corticales vers le CIP et comprendre le circuit synaptique par lequel les informations sensorielles sont intégrées dans le CIP. Grâce à l'approche expérimentale impartiale conçue ici, nous espérons acquérir des notions fondamentales sur l'anatomie et la fonction du circuit sous-cortical-cortical impliqué dans le traitement sensoriel gustatif. Dans une perspective plus large, cela ouvrira la voie à une meilleure compréhension de la physiologie du CI, une région proposée pour orchestrer les entrées sensorielles, cognitives et émotionnelles.

Procédures

- 1 procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30 et 60 min - 1 procédure chirurgicale avec implantation fenêtre cranienne : entre 1 et 2H. L'habituation à la fixation de la tête devrait durer entre 5 et 60 minutes par jour sur 2 à 5 jours. L'habituation à la stimulation sensorielle devrait durer de 2 à 5 jours. Les manipulations opto- ou chimiogénétiques des assemblages neuronaux sont réalisées sur un animal éveillé. L'ensemble de la procédure dure environ 1 à 2 heures. Du chlorure de lithium sera injecté une fois aux souris lors d'une procédure de test d'aversion gustative conditionnée, lequel durera au total 11 jours.

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à des procédures dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Des nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la chirurgie stéréotaxique bien que toutes les précautions soient prises pour être dans des conditions d’asepsie et pour réduire au maximum ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse (anesthésie, analgésie, anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi post-opératoire, raffinement des conditions d’hébergement ...). La fixation des souris par la tête peut générer une gêne qui sera minimisée par une habituation lente à l’aide de plusieurs sessions. En ce qui concerne la restriction hydrique, nous nous attendons à une perte de poids qui sera surveillé quotidiennement. L'injection de chlorure de lithium induit une nausée transitoire.

Devenir

Tous lea animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure pour des études d'électrophysiologie ou d'anatomie.

Remplacement

La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent le rôle des propriétés et des plasticités synaptiques dans le traitement sensoriel dans le CIP chez des animaux au comportement éveillé. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici.

Réduction

La solidité de nos hypothèses de travail vérifiées par nos études précédentes, le caractère innovant des méthodes utilisées (imagerie chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l'expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre d'animaux. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du néocortex de la souris présentent de nombreuses similitudes avec le néocortex d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de 3 semaines à 6 mois. Comme la taille du cerveau varie entre 3 semaines et 6 mois, les coordonnées stéréotaxiques seront ajustées en conséquence. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.

1 942 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin de chaque procédure pour des études d'électrophysiologie ou d'anatomie, et celles qui passent le test d'aversion gustative conditionnée y restent onze jours, après une injection de chlorure de lithium qui induit une nausée transitoire. Selon les procédures, elles subissent une chirurgie pour injecter un virus dans le cerveau, une chirurgie d'une à deux heures pour poser une fenêtre crânienne, puis des séances éveillées, la tête fixée, pendant lesquelles l'équipe active ou inhibe des groupes de neurones par la lumière ou par des molécules. Hors cette aversion gustative, les "tests comportementaux spécifiques" annoncés ne sont pas décrits. Pour justifier l'effectif, le porteur invoque la "solidité de nos hypothèses de travail" et une "expertise reconnue de l'expérimentateur", sans calcul ni effectif par groupe.

Objectifs

L'objectif principal du projet est de déterminer les propriétés des circuits neuronaux du cortex insulaire postérieur (CIP) et les mécanismes par lesquels ces circuits traitent les informations sensorielles. En effet le cortex insulaire est impliqué dans une grande variété de fonctions, notamment l'interoception, les états émotionnels et, dans sa partie postérieure, le traitement sensoriel du goût, du toucher, du son et de la température. Nos connaissances sur les propriétés des circuits neuronaux du CIP et sur sa connectivité fonctionnelle dans des conditions physiologiques et pathologiques sont très limitées. Il a été postulé que la plasticité à court terme est un facteur clé dans le façonnement du traitement sensoriel, permettant par exemple de distinguer des stimuli de nature similaire. Cependant, cette hypothèse n'a pas encore été testée directement. Nous utiliserons une approche multidisciplinaire allant du traçage anatomique et fonctionnel in vitro à l'imagerie fonctionnelle in vivo et enfin nous évaluerons la pertinence de nos résultats avec des tests comportementaux spécifiques. Nous activerons ou inactiverons des voies spécifiques et testerons les conséquences sur la fonction des circuits et le traitement sensoriel. Nous modifierons, au niveau d'une synapse spécifique, la plasticité à court terme en éliminant ou en surexprimant des protéines clés impliquées dans la transmission synaptique et nous testerons les conséquences sur la fonction du circuit, le traitement sensoriel et le comportement.

Bénéfices attendus

Nous espérons identifier les principales projections sous-corticales vers le CIP et comprendre le circuit synaptique par lequel les informations sensorielles sont intégrées dans le CIP. Grâce à l'approche expérimentale impartiale conçue ici, nous espérons acquérir des notions fondamentales sur l'anatomie et la fonction du circuit sous-cortical-cortical impliqué dans le traitement sensoriel gustatif. Dans une perspective plus large, cela ouvrira la voie à une meilleure compréhension de la physiologie du CI, une région proposée pour orchestrer les entrées sensorielles, cognitives et émotionnelles.

Procédures

- 1 procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30 et 60 min - 1 procédure chirurgicale avec implantation fenêtre cranienne : entre 1 et 2H - L'habituation à la fixation de la tête devrait durer entre 5 et 60 minutes par jour sur 2 à 5 jours. L'habituation à la stimulation sensorielle devrait durer de 2 à 5 jours. Les manipulations opto- ou chimiogénétiques des assemblages neuronaux sont réalisées sur un animal éveillé. L'ensemble de la procédure dure environ 1 à 2 heures. Du chlorure de lithium sera injecté une fois aux souris lors d'une procédure de test d'aversion gustative conditionnée, lequel durera au total 11 jours.

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à des procédures dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Des nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la chirurgie bien que toutes les précautions soient prises pour être dans des conditions d’asepsie et pour réduire au maximum ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse (anesthésie, analgésie, anti-inflammatoire, suivi post-opératoire, raffinement des conditions d’hébergement ...). La fixation des souris par la tête peut générer une gêne qui sera minimisée par une habituation lente à l’aide de plusieurs sessions. En ce qui concerne la restriction hydrique, nous nous attendons à une perte de poids qui sera surveillé quotidiennement L'injection de chlorure de lithium induit une nausée transitoire.

Devenir

Tous lea animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure pour des études d'électrophysiologie ou d'anatomie.

Remplacement

La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent le rôle des propriétés et des plasticités synaptiques dans le traitement sensoriel dans le CIP chez des animaux au comportement éveillé. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici.

Réduction

La solidité de nos hypothèses de travail vérifiées par nos études précédentes, le caractère innovant des méthodes utilisées (imagerie chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l'expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre d'animaux. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L'expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du néocortex de la souris présentent de nombreuses similitudes avec le néocortex d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de 3 semaines à 6 mois. Comme la taille du cerveau varie entre 3 semaines et 6 mois, les coordonnées stéréotaxiques seront ajustées en conséquence.Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, des injections répétées d'une cytokine et d'anticorps jusqu'à trois fois par semaine, parfois de la chimiothérapie, et des prélèvements sanguins répétés à la queue, une partie subissant un prélèvement de sang terminal. Le porteur indique que la croissance tumorale peut gêner la locomotion et provoquer une ulcération menant à un état moribond. Il affirme que les méthodes sans animaux ne peuvent pas remplacer la souris à ce stade et renvoie les retombées pour les patients, validation d'anticorps avant essais cliniques, au conditionnel.

Objectifs

Les avancées en termes d’immunothérapies dans les cas de cancers sont très encourageantes mais une recherche accrue est toujours de mise afin d’une part de découvrir de nouvelles cibles mais également d’améliorer les traitements déjà existants. Ce projet a ainsi pour but de continuer à approfondir nos données sur les actions de notre cible, une cytokine (protéine messagère et régulatrice du système immunitaire naturellement présente dans chaque organisme), de son blocage à l’aide d’anticorps candidats et ce dans un contexte de développement tumoral (multiplication des cellules tumorales) chez la souris. Grâce à nos modèles de développement tumoraux, nous pourrons analyser la biodistribution et la dégradation de cette cytokine ainsi que l’impact de son blocage en synergie (effet cumulé) avec d’autres immunothérapies et chimiothérapies déjà connues en clinique. Ces étapes sont indispensables pour valider les anticorps candidats avant de futurs essais cliniques antitumoraux.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal de ce projet, par des études de suivi de la cible en présence ou absence d’anticorps, sera de connaitre les cinétiques d’action de ces différentes molécules. Ces approches sont indispensables pour pouvoir amener ces technologies dans des essais précliniques réglementaires puis des essais cliniques chez l’Homme.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet seront greffés une fois en injection sous-cutanée (15 secondes/souris). Les animaux recevront ensuite différents traitements en commençant par l’injection unique de la cible (la cytokine) (en injection intrapéritonéale : 10 secondes, en injection sous-cutanée : 10 secondes, ou en injection intraveineuse dans de rares cas : 3 minutes). L’anticorps dirigé contre la cible sera ensuite injecté jusqu’à 3 fois par semaine par l'une de ces trois voies. Dans certains cas, les souris auront également une injection de chimiothérapie en dose unique (en intrapéritonéale ou en intraveineuse suivie de l’immunothérapie 2 fois par semaine (en injection intrapéritonéales, en injection sous-cutanée ou en injection intraveineuse). Des prélèvements sanguins seront réalisés à la veine de la queue en gestes répétés sur 24h (sans dépassement du volume maximum autorisé) ou une fois par semaine sur 4 semaines. La durée de chaque prélèvement est estimée à 1 minute / souris. Certains animaux subiront un prélèvement de sang terminal à la veine cave (animal sous analgésie + anesthésie profonde et sans réveil) afin de collecter un volume de sang suffisant pour des analyses plus fines.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont ceux inhérents à la croissance des tumeurs chez la souris avec un problème de locomotion possible au-delà d'un certain volume ou une ulcération de la tumeur pouvant entrainer un état moribond de l’animal si elle évolue trop rapidement. Les injections de chimiothérapie et d’immunothérapie observées lors des études précédentes ne montrent quant à elles aucun effet délétère observable sur l’état clinique de l’animal

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, pour prélever la tumeur et les organes immunitaires périphériques afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués suite aux effets des médicaments (à l’aide de technique d’histologie, de cytométrie ou encore de biologie moléculaire).

Remplacement

Il s’agit du suivi de croissance tumorale, il n’existe pas de méthode alternative à ces expériences in vivo. Ces preuves de concept et ces études de mécanismes d’action ne peuvent s’établir que sur de véritables modèles précliniques dans un contexte de tumeur solide similaire à celui que l’on trouve chez l’homme. Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui a démarré par des études bibliographiques, suivies d’études In Vitro approfondies ayant permis d’affiner et de réduire efficacement les pistes de recherches. Cependant, compte tenu des avancées actuelles, à ce stade du projet, il n’est pas possible de substituer l’animal par un modèle in vitro pour continuer ces recherches.

Réduction

L’analyse statistique permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés est réalisée en collaboration avec une équipe de recherche spécialisée dans les études de biostatistique. L’étude de l’efficacité des traitements testés induit deux types d’analyse : -modélisation de la croissance tumorale et -analyse de la survie des animaux. Compte tenu de ces analyses et des données obtenues lors de précédentes expériences réalisées au sein du laboratoire le nombre de souris est limité à 10 par groupe et chaque étape est reproduite une fois afin de supprimer le biais pouvant être induit par un problème technique et ainsi avoir un résultat de deux expériences indépendantes.

Raffinement

Pour la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats obtenus dans le strict respect du bien-être animal. Les points limites ont été établis dans chaque procédure expérimentale et le suivi clinique des animaux se fera quotidiennement sur la base de la fiche de scoring. Les souris seront surveillées quotidiennement y compris les week-ends et jours fériés : suivi du développement de la tumeur (point limite volume >1500 mm3 ou nécrose tumorale précoce), pesée (toute perte de poids ne devra pas excéder 20% du poids normal attendu de l’animal) et détection du moindre signe de souffrance et/ou de détresse de l’animal. En fonction des observations, des décisions allant de l’adaptation des conditions d’hébergement à l’injection d’analgésique jusqu’à une décision d’euthanasie, seront prises. D’autre part, une fiche de soins est utilisée pour la prise en charge des animaux. Pour l’ensemble du projet nous avons prévu un nombre total de 1440 souris incluant (par type de souris = 480) : 480 souris immunodéprimées et 960 souris immunocompétentes.

Choix des espèces

Ce projet nécessite des modèles de souris immunocompétentes et immunodéficientes afin de comprendre le rôle du système immunitaire et de suivre la cinétique de la cible au sein de la tumeur et dans la circulation sanguine. Le choix s’est porté sur les modèles les plus caractérisés et sur lesquels nous avons déjà un recul important : C57Bl/6, BalbC (immunocompétentes) et athymic nude (immunodéficientes). Les souris seront au stade de développement adulte et âgées de 6 à 12 semaines afin d’avoir des animaux d’âge mûr avec un système immunitaire complètement fonctionnel (pour les souris immunocompétentes) et permettant une prise tumorale optimale.