Souris

1200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, des séances d'irradiation localisée et des injections répétées d'immunothérapie, avant leur mise à mort pour analyser les tumeurs, afin d'étudier l'association d'une radiothérapie à faible dose et d'une immunothérapie. Le porteur renvoie au conditionnel d'éventuels bénéfices pour les patients réfractaires à l'immunothérapie. Il présente cette association comme une "source d'espoirs" contre les cancers métastatiques.

Objectifs

Il y a trois objetifs. 1) Evaluer l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie délivrée à faible dose en combinaison avec une immunothérapie en utilisant un modèle préclinique de lignée tumorale murine greffée chez des souris immunocompétentes. 2) Etudier les mécanismes par lesquels la radiothérapie à faible-dose est capable d'induire une réponse immunitaire anti-tumorale potentialisée par l'immunothérapie et ainsi expliquer l'effet synergique du traitement associant radiothérapie à faible dose et immunothérapie. 3) Déterminer le rôle des macrophages dans l'efficacité de la combinaison thérapeutique associant radiothérapie faible dose et immunothérapie.

Bénéfices attendus

Malgré une amélioration sans précédent du pronostic de nombreux cancers grace à l'immunothérapie, de trop nombreux patients présentent une réponse insuffisante à ces nouvelles thérapies. L'optimisation et la compréhension des traitements combinés associant une radiothérapie à faible dose et une immunothérapie pourrait à terme bénéficier aux patients réfractaires à l'immunothérapie et présentant un cancer à un stade avancé inaccessible à une radiothérapie standard qui serait trop toxique pour les organes et tissus sains adjacents. Dans ce cadre, la mise au point du meilleur schéma de radiothérapie faible dose à utiliser en combinaison à l'immunothérapie, ainsi que la compréhension des mécanismes à l'origine de l'efficacité d'une telle association doivent être recherchés sur modèle animal préclinique avant une transposition au patient.

Procédures

Irradiation sur la tumeur uniquement : 1 à 2 séances d'environ 1 minute chacune. Injections sous-cutanées de cellules tumorales: 1 seule injection, 1 minute. Injections intra-péritonéales d'immunothérapie ou d'IgG contrôle : 1 injection d'une minute tous les 3 jours pendant un total de 9 jours, soit 4 injections au total. Injections intra-tumorales : 1 minute, 1 injection unique/souris

Impact sur les animaux

Ils sont liées aux injections en intrapéritonéales ou sous-cutanées sous anesthésie locale, aux injection intra-tumorales après anesthésie gazeuse et aux séances d'irradiations localisées. Les séances d'irradiation seront effectuées sur la tumeur uniquement grâce à des caches adaptés, le risque de dommages aux tissus et organes sains adjacents est donc très limité. Aucun effet indésirable de ces irradiations localisées n'est donc à prévoir.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir procéder à des analyses de laboratoire sur les tumeurs prélevées.

Remplacement

Le cancer est aujourd’hui la 1ère cause de décès chez l’homme et la 2ème chez la femme en France. Malgré la révolution thérapeutique que constitue l’immunothérapie, seul un nombre limité de patients présente une réponse tumorale significative aux inhibiteurs de checkpoints immunitaires utilisés seuls. Un nombre croissant de données suggère que de faibles doses de radiothérapie délivrées sur la tumeur pourraient augmenter la réponse anti-tumorale induite par l’immunothérapie, le tout avec un excellent profil de tolérance. La compréhension des mécanismes soutenant cette stratégie d’association est source d’espoirs pour de nombreux patients atteints de cancers métastatiques présentant une réponse insuffisante à l’immunothérapie et un pronostic réservé. Le recours à un modèle animal est nécessaire car les interactions entre radiothérapie, immunothérapie, tumeur et système immunitaire de l'hôte font appel à des processus cellulaires et moléculaires complexes impossibles à reproduire de façon fiable sur des modèles alternatifs. De plus, l’étude de l’efficacité de l’association entre radiothérapie à faible dose et immunothérapie sur une tumeur constituée ne peut se vérifier que sur un modèle in-vivo.

Réduction

Nous allons tester plusieurs schémas d’irradiation à faible dose délivrés en 1 ou 2 séances, associés ou non à une immunothérapie anti PD-L1. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaire, nous avons réalisé une analyse statistique à priori à l’aide du logiciel GPower, version 3.1. Afin de calculer le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives, nous avons choisi le test ANOVA avec les paramètres suivants : effect size f = 0.25 ; puissance = 0.9 ; risque d’erreur α = 0.05. En considérant un total de 48 lots, nous avons besoin de 25 souris par lot, soit 1200 souris au total : 1) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 1 fraction associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris au total. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle), 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul), 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée), 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée). 2) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 2 fractions associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris au total. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle) 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul) 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée) 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée). 3) Influence des macrophages sur l'efficacité de la combinaison thérapeutique associant radiothérapie faible dose et anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris au total. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec anti PD-L1 + injection intra-tumorale de PBS, 1 lot non-irradié avec anti PD-L1 et injection intra-tumorale de clodronate, 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée) + injection intra-tumorale de PBS, 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée) + injection intra-tumorale de clodronate. Dans le but d’utiliser le moins d’animaux possible, une analyse statistique a été effectuée a priori. Celle-ci a estimé le nombre de souris nécessaire à 1200.

Raffinement

Des stratégies d’expérimentation et d’observation visant à réduire au minimum la souffrance des animaux ont été instaurées. Dans ce cadre, les administrations d’immunothérapie s’effectueront sous anesthésie locale pour réduire le risque de stress et de douleur. L'administration intra-tumorale de clodronate sera effectuée après anesthésie gazeuse à l'isoflurane 3%. Par ailleurs, les souris seront hébergées en groupe, avec nourriture et eau ad libitum, ainsi qu’un environnement enrichi en coton et nids en carton pour respecter leur bien-être. Une surveillance du poids et du volume tumoral sera effectuée régulièrement. Le respect des points limites et d’un volume tumoral limite seront strictement observés.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie, utilisée dans la quasi-totalité des études dans ce domaine. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues, ce qui facilite le transfert en clinique des résultats acquis lors des expérimentations précliniques dans cette espèce. Les animaux seront utilisés entre l’âge de 8 et 10 semaines bien après sevrage, âge à partir duquel les souris peuvent supporter les rayonnements ionisants.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies cérébrales avec injection de virus et pose d'une fenêtre crânienne pouvant durer deux heures, une restriction d'eau et de nourriture et une contention de la tête, pour étudier la mobilité de récepteurs au glutamate dans la plasticité des synapses. Les objectifs restent une meilleure compréhension du fonctionnement des synapses, sans application annoncée. Le porteur affirme qu'il est nécessaire de passer par des animaux vivants pour observer le cerveau en fonctionnement.

Objectifs

Le but de ce projet est d’étudier le rôle de la mobilité et de la nano-organisation des récepteurs à glutamate hétérotétramère formé de quatre sous-unités dans la physiologie des synapses, les fonction cérébrales et le comportement. Dans ce but nous utiliserons des outils moléculaires et génétiques qui permettent d'induire l'immobilisation de récepteurs à glutamate contenant les sous-unités A2 ou A1 . Précédemment, nous avons démontré que la diffusion de surface de ces recepteurs est impliquée dans la régulation de la potentialisation synaptique à long terme et de la mémoire dépendante de l'hippocampe. Nous voulons étudier ce phénomène plus précisément et premièrement, examiner l'implication de la diffusion latérale des AMPAR dans différentes formes de plasticité synaptique comprenant non seulement la plasticité synaptique à long terme mais aussi la plasticité synaptique à court terme, dans différentes régions du cerveau. Deuxièmement, nous voulons également identifier d’autres acteurs moléculaires, répertoriés comme protéines auxiliaires de ces récepteurs, impliqués dans la régulation de leurs mobilités et pouvant modifier la plasticité synaptique. Troisièmement, nous voulons étudier les processus physiologiques qui agissent sur la mobilité de ces derniers pour réguler la plasticité synaptique. Enfin, nous voulons rechercher des paradigmes comportementaux qui sont régulés par la mobilité des recpetuerus à glutamate in vivo.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons découvrir le rôle et la régulation de la mobilité de surface des AMPAR dans la plasticité synaptique et la fonction cérébrale, ce qui contribuera à une meilleure compréhension de la manière dont la transmission synaptique est régulée dans le cerveau. Grâce à l'approche expérimentale conçue, nous voulons découvrir comment les effets de la mobilité de la surface des AMPAR sur la plasticité synaptique sont régulés dans le tissu cérébral intact et in vivo. De manière générale, cela nous permettra de mieux comprendre la fonction des synapses dans le cerveau.

Procédures

Procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 10 et 20 min - procédure chirurgicale avec implantation fenêtre crânienne : entre 1 et 2H- régime avec contrôle de la consommation hydrique et alimentaire

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 2/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte 3/Risque de perte de poids qui ne depassera pas 10% du poids initial de l'animal

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure

Remplacement

La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Le concept de l’importance de la mobilité des récepteurs dans les phénomènes de plasticité synaptique a été identifié par notre équipe avec des approches in vitro de culture de neurones de souris de type sauvage comme de neurones de nos lignées transgéniques. Pour vérifier ce concept dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement.

Réduction

La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique.

Raffinement

A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimenter a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du systéme nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.

53 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux greffes de tissu adipeux humain sur les flancs, est anesthésiée à quatre reprises pour la chirurgie et des scanners, puis tuée au bout de deux mois pour analyser le greffon, afin de tester un dispositif de lipofilling destiné à être commercialisé. Le porteur relie le projet à un "réel besoin" en chirurgie reconstructrice. Il affirme qu'un modèle in vitro ne peut pas reproduire la rétention du greffon dans un organisme vivant.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester le dernier dispositif de lipofilling de notre sponsor. Un modèle de xénogreffes sur souris immunodéprimées a été choisi, en s’appuyant sur la bibliographie existante. 100 xénogreffes (2 par souris, sur 50 souris) seront réalisées à partir du tissu adipeux prélevé sur 10 patients par lipoaspiration à l’aide du nouveau dispositif testé. Un lot de 5 souris sera utilisé pour chaque lipoaspiration. Nous avons décidé de travailler sur un modèle de souris nude, athymique et donc immunodéprimée. Ceci nous permettra de nous abroger des risques de rejet de la greffe. Notre étude bibliographique a permis de mettre en avant divers obstacles au maintien des xénogreffes. Ainsi, tous les paramètres physiques liés aux étapes d'aspiration, de préparation du tissu adipeux mais aussi d'injection influencent la prise de greffe. Les paramètres physiques choisis par notre sponsor seront donc ici testés. De même, divers paramètres biologiques influencent la prise de greffes : le statut des donneurs et la présence de maladies métaboliques notamment. De même, la mise en place d’une vascularisation de qualité améliore la rétention de la greffe et donc son maintien. Les donneurs prélevés lors des liposuccions seront donc exempts de maladies métaboliques et seront tous d’un IMC inférieur à 30. La vascularisation mise en place au niveau de la greffe sera observée après récupération du tissu et coloration. D’autres paramètres seront alors étudiés en histologie (quantité et diamètre des adipocytes dans le tissu greffé, qualité et quantité de la matrice extracellulaire mise en place, présence de zones de nécrose éventuelles, …). Enfin, l’emplacement de la greffe ainsi que son suivi par imagerie a fait l’objet d’une recherche bibliographique. Nous souhaitions pouvoir suivre son évolution et quantifier son éventuelle résorption au fil du temps. Le suivi par micro-CT (examen tomodensitométrique par rayons X) a été mis au point sur un modèle de xénogreffes au niveau du calvarium. Nous souhaitions cependant garder les flancs comme zones de xénogreffes car celles-ci présentent plusieurs intérêts. Cette zone sera donc testée lors d'un premier screening, réalisé sur un premier groupe de 3 souris. L'étude utilisera donc un total de 3+50 = 53 souris sur l'ensemble du projet.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait permettre de valider le nouveau dispositif de lipoaspiration, dans le but de le commercialiser. La technique de lipofilling serait alors utilisée en médecine humaine à la suite d'interventions chirurgicales délabrantes (Tumeurs mammaires par exemple, retrait de masses, ...) pour des chirurgies reconstructrices et répond donc ici à un réel besoin. Une étude clinique sera réalisée en complément de cette étude préclinique afin de valider l'utilisation du nouveau dispositif chez l'homme.

Procédures

Chaque souris sera anesthésiée une première fois (Durée : 30 minutes), dans le but de réaliser les deux xénogreffes (une sur chaque flanc). 4 injections sous-cutanées seront réalisées :1 injection SC d'analgésique sera réalisée le jour de la chirurgie et 3 injections SC d'antibiotiques seront réalisées à raison d'une par jour à partir du jour de la chirurgie. Les souris seront anesthésiées 3 fois de plus (Durée : 10 minutes), afin de les imager (CT-scan). Elles seront enfin mises à mort à la suite de la dernière imagerie donc au bout de 2 mois afin de récupérer le tissu greffé pour analyses.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues de cette étude sur les 53 souris utilisées seront : - Les deux xénogreffes réalisées sur les souris, à raison d'une greffe par flanc sur chacune des 50 souris - La douleur éventuelle associée à cette chirurgie - Les anesthésies réalisées (1 pour la chirurgie (Durée : 30 min) et 3 pour les imageries (Durée : 10 minutes)) et l'hypothermie éventuelle en résultant - 4 injections sous-cutanées minimum (1 pour l'analgésie, 3 pour l'antibiothérapie) - Le stress éventuel tout au long des différentes étapes de la procédure - La mise à mort en fin d'étude pour la récupération du tissu greffé. Une attention particulière sera cependant portée aux animaux : tout signe de douleur, stress, et/ou tout comportement anormal sera pris en compte. De plus, la chirurgie se déroulera sous anesthésie volatile (Isoflurane) et analgésie (Buprénorphine 0.05mg/kg) et une antibiothérapie permettra d'atténuer voire d'éviter tout risque d'infection (Amoxicilline 15mg/kg, durant 3 jours)

Devenir

Les souris seront maintenues en vie à la suite de la chirurgie et des différentes imageries. Elles devront cependant être mises à mort dans les jours suivant la dernière imagerie afin de récupérer le tissu adipeux greffé et d'en faire une analyse histologique.

Remplacement

Remplacer : Pour répondre à notre objectif scientifique, un modèle in-vitro ne peut être mis en place. Nous avons en effet besoin d’un modèle animal afin d’étudier le processus de rétention des greffes dans son ensemble, avec les contraintes que ce tissu peut subir dans un système vivant (Inflammation locale, nécroses éventuelles, …).

Réduction

Réduire : L’utilisation de l’imagerie nous permet de suivre la rétention de la xénogreffe sans avoir besoin de sacrifier l’animal, ce qui nous permettra de réduire le nombre total d’animaux utilisés. De plus, le nombre d’animaux utilisés a été minimisé grâce au calcul préalable effectué sur R à partir de la bibliographie et de la fonction power.t.test, nous permettant ainsi d’utiliser un nombre réduit de 5 animaux par groupe. De même, le nombre d'animaux nécessaires à l'étape de screening a été minimisé.

Raffinement

Raffiner : Une étude pilote (screening) sera réalisée afin d’optimiser les protocoles de chirurgie, d’imagerie et d’histologie, sur un premier groupe de 3 souris. Elle nous permettra ainsi d’affiner les techniques utilisées pour l'étude. Ainsi, les expérimentateurs pourront s’entraîner à la technique chirurgicale et les comportements anormaux éventuels des animaux suite aux différentes procédures seront pris en compte. La liste des points limites sera de même actualisée si besoin. Elle comprend pour points limites spécifiques au projet : - Mauvaise cicatrisation cutanée suite à la xénogreffe et/ou Infection cutanée suite à la xénogreffe - Hypothermie persistante, avec une température inférieure ou égale à 34°C de façon durable - Réveil incomplet supérieur à 2h à la suite de la chirurgie - Perte de poids supérieure à 20% Afin de diminuer les éventuelles douleurs pouvant survenir suite à la chirurgie et le risque d'infection, une analgésie et une antibiothérapie seront mises en place (par injection sous-cutanée). De plus, les souris seront étroitement surveillées pendant la phase de réveil puis dans les jours qui suivront la chirurgie. Elles seront hébergées en cages groupées afin de satisfaire leurs besoins sociaux, sur des portoirs ventilés afin de tenir compte de leur phénotype dommageable. Un enrichissement adapté à l'espèce (paille, tunnels, dômes, ...) sera mis dans les cages afin de leur laisser exprimer les comportements naturels de l'espèce (enfouissement par exemple).

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour cette étude est la souris. C’est une espèce largement utilisée dans la recherche préclinique, en chirurgie notamment. La lignée nude choisie pour cette étude est une lignée de souris sans poils et athymique. Ceci nous permettra notamment de nous abroger des risques d’incompatibilité inter-espèces et donc de rejet de la xénogreffe. La lignée choisie est de plus facile à élever et à manipuler. Elle est peu coûteuse et largement utilisée dans toutes les disciplines de la recherche médicale. C’est également une lignée ne présentant pas de phénotype dommageable à l’état basal. La physiologie de la souris ressemblant à celle de l’homme, ceci facilitera la translation. De plus, la souris nude étant peu grasse, il sera plus simple de constater l’évolution des xénogreffes de cellules adipeuses sur cette souche. Enfin, le modèle de la souris immunodéprimée est un modèle standard connu pour la xénogreffe. A leur arrivée, les souris seront âgées de 6 semaines. La greffe sera réalisée 2 semaines après réception, afin d'effectuer une semaine de quarantaine puis d'habituation des animaux. Ainsi, les souris nude seront âgées de 8 semaines au moment de la chirurgie, pour un poids moyen de 20 grammes. A ce stade de développement, les organes des souris seront matures. De plus, nous nous abrogeons des problèmes éventuels liés à la vieillesse de notre modèle.

1780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies cérébrales avec injections stéréotaxiques et pose de fibres optiques ou de lentilles, une restriction d'eau pouvant leur faire perdre jusqu'à 20 % de leur poids sur quatre semaines et un isolement pouvant durer deux mois, pour étudier des circuits neuronaux de l'apprentissage olfactif. Les retombées thérapeutiques évoquées contre les maladies neurodégénératives restent lointaines. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo.

Objectifs

Ces dernières années, de nombreuses études ont mis en évidence l’existence d’un phénomène de production de nouveaux neurones dans le cerveau adulte, dont la déficience semble être liée à des maladies neurodégénératives ou à certaines formes de dépression. De plus, il a été mis en évidence que ces cellules étaient impliquées dans des phénomènes d’apprentissage et de mémoire. Ces découvertes ont suscité un grand espoir dans la communauté biomédicale, celui de pouvoir un jour développer des thérapies basées sur cette capacité du cerveau à produire de nouveaux neurones fonctionnels à tout âge. En particulier, le bulbe olfactif, premier relai central du système olfactif et le gyrus denté de l’hippocampe sont des structures où la neurogenèse à l’âge adulte peut être identifiée dans les conditions constitutives du cerveau sain chez la plupart des mammifères. En conséquence, parmi tous les systèmes sensoriels, le système olfactif se distingue par sa grande plasticité, comprenant entre autres la capacité de renouvellement de ses constituants cellulaires, et ceci y compris à l’âge adulte. Chez les rongeurs, des dizaines de milliers de nouveaux neurones sont intégrés chaque jour dans le bulbe olfactif. Ces cellules sont générées à partir d’une région précise, la Zone Sous Ventriculaire, puis acheminées vers le bulbe olfactif par un Courant de Migration Rostral, pour se connecter avec les circuits bulbaires. De nombreuses études ont décrit les modalités de transmission du message olfactif de l’épithélium olfactif au cerveau, permettant notamment l’établissement d’une mémoire olfactive par l’apprentissage d’une odeur, souvent associée à un autre stimulus sensoriel de contexte pouvant lui-même posséder une valeur émotionnelle. Ainsi, une fois une odeur associée à une situation, une nouvelle rencontre avec celle-ci pourrait raviver les souvenirs inscrits dans les circuits neuronaux et permettre de reconnaître ce même contexte. Nous cherchons donc à déterminer pourquoi les neurones générés chez l’adulte dans le bulbe olfactif jouent un rôle si particulier dans l’apprentissage olfactif et comment ils permettent de modifier la perception ultérieure d’une odeur déjà rencontrée.

Bénéfices attendus

De nombreuses études expérimentales ont étudié les modalités de transmission du message olfactif de l’épithélium olfactif au cerveau, permettant notamment l’établissement d’une mémoire olfactive par l’apprentissage d’une odeur, le plus souvent associée à un autre stimulus sensoriel de contexte pouvant lui-même posséder une valeur émotionnelle. Ainsi, une fois une odeur associée à une situation, une nouvelle rencontre avec celle-ci pourrait raviver les souvenirs inscrits dans les circuits neuronaux et permettre de reconnaître ce même contexte. Dans notre équipe de recherche, nous nous intéressons à un aspect particulièrement inexploré de ces mécanismes : Pourquoi les neurones générés chez l’adulte dans le bulbe olfactif jouent-ils un rôle si particulier dans l’apprentissage olfactif et comment permettent-ils de modifier la perception ultérieure d’une odeur déjà rencontrée ? Pour cela, nous souhaitons étudier une sous-population de neurones inhibiteurs du cortex olfactif innervant les neurones nouvellement générés du bulbe olfactif et leur potentielle modification à la suite d’un apprentissage associatif. En effet, un contrôle à distance de l’activité des nouveaux neurones pourrait être le substrat permettant de définir une nouvelle forme de perception subjective, propre à chaque individu et découlant des expériences personnelles antérieures de chacun. Finalement, une meilleure connaissance des mécanismes de neurogenèse adulte pourrait alors permettre dans le futur la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contrôler cette production neuronale, dans le but de restaurer les fonctions cérébrales de patients accidentés ou atteints de maladies neurodégénératives ou psychiatriques. Dans le domaine complexe des neurosciences modernes, un défi majeur des chercheurs est alors de comprendre précisément les mécanismes qui assurent l’intégration fonctionnelle de ces nouvelles cellules dans un réseau neuronal actif, et de déterminer les conséquences physiologiques de cette production neuronale permanente.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales (injections stéréotaxiques, implantations de fibres optiques ou de lentilles à visée micro-endoscopiques dans le cerveau). Ces interventions ne durent pas plus de 2hs et chaque animal sera soumis à un maximum de deux interversions séparées par un minimum de 30 jours. Ils seront également soumis à des tâches d’apprentissage olfactif de type associatif avec renforcement positif. Ce type d’apprentissage a une durée maximal de 1 mois, avec une session de 30 à 60 minutes par jour, chaque jour.

Impact sur les animaux

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal. Cependant, au cours de nos expériences les animaux pourront subir quelques effets indésirables comme le stress hydrique, la perte de poids associée (< a 20% du poids original pendant un maximum 4 semaines) et le stress dû à l’isolement (maximum 2 mois). Des implants seront introduits par chirurgie sous anesthésie générale chez les animaux. La présence de ces implants pourrait générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort (maximum 2 mois). Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car il est nécessaire de réaliser des études histologiques sur les tissus à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo pour étudier les circuits neuronaux impliqués dans l’apprentissage olfactif. Toutefois, notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal.

Réduction

L’étude statistique impose des cohortes comprenant un nombre suffisant d’animaux afin d’avoir une évaluation pertinente de l’effet des différentes conditions expérimentales sur le comportement. Le nombre de souris minimum par groupe a été calculé pour pouvoir utiliser des tests paramétriques, plus puissants que les tests non paramétriques grâce à des expériences similaires déjà réalisées dans notre laboratoire. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes avec un risque de p=0.05 et une puissance statistique >80. L’électrophysiologie sur tranche de cerveau permet de changer rapidement le milieu dans lequel baignent les cellules. Il est donc possible d’appliquer successivement et/ou de rincer plusieurs molécules au cours de l’enregistrement d’une cellule donnée. Ceci permet de réaliser des tests statistiques appariés et de réduire le nombre de cellules nécessaire à l’évaluation de l’effet d’un agent pharmacologique. Pour cette partie, deux personnes travailleront en parallèle sur deux postes d’électrophysiologie, ce qui permettra d’optimiser l’utilisation des tissus, de doubler le nombre de cellules enregistrées, et de réduire d’autant le nombre d’animaux nécessaires. Dans la même optique, les expériences d'imagerie permettent d’analyser l'activité des neurones avant et après l’apprentissage, permettant l’utilisation des tests statistiques appariés et le nombre de cellules nécessaire à l’évaluation de l’effet, et ainsi le nombre d’animaux utilisés dans le projet.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse de l’animal. La durée d’acclimatation à l’animalerie sera d’une semaine minimum. Durant la chirurgie, des anesthésiques et antalgiques seront utilisés, ainsi que des antalgiques de nouveau en post-chirurgie. Ceci est indispensable pour le bien-être de l’animal ainsi que pour notre projet qui est principalement basé sur le comportement : il est nécessaire que l’animal puisse effectuer une tâche de comportement sans biais. Les animaux seront donc observés minimum deux fois par semaine, et tous les jours en post-opératoire. Cette surveillance sera coordonnée entre l’expérimentateur et le personnel de l’animalerie. Pour les souris montrant des signes de douleur (absence de toilettage, posture anormale, défaut de nidification, défaut dans le comportement moteur général et du comportement exploratoire dans la cage, accompagnée ou non d’une perte de poids >20%), l’administration de l’antalgique sera renouvelée 12 et 24h après la chirurgie. Ces animaux seront l’objet d’une surveillance quotidienne accrue. En cas de détresse après l’administration des antalgiques les animaux seront mis à mort (événement très rare). Pour réduire le stress associé à l'isolement (parfois nécessaire lors de combats entre les individus ou en présence d’implants), les cages d’hébergement seront enrichies (igloo, coton extra). Dans le cas des souriceaux, après la chirurgie, le poids de chaque animal sera mesuré deux fois par semaine pour vérifier la bonne croissance des animaux. Le comportement maternel vis-à-vis des souriceaux après la chirurgie sera aussi évaluée (allaitement, toilettage, nidification, signes d’agressivité).

Choix des espèces

On étudie le phénomène de contrôle afférent chez l’adulte dans le système olfactif des souris car ce système est impliqué dans une modalité sensorielle très importante chez les rongeurs : l’olfaction. En conséquence, l’utilisation de cette espèce nous permettra d’obtenir des résultats éthologiquement satisfaisants. De plus, les stimuli olfactifs peuvent participer à l’enrichissement de l’environnement des animaux et donc favoriser leur bien-être durant le temps des expériences. Notre objet d’étude étant les fibres afférentes qui contrôlent l’activité des cellules produites par la neurogenèse chez l’adulte, on utilise dans ces expériences des jeunes souris adultes (8 semaines). Cependant, il faudra comparer l’impact de ces fibres sur les cellules produites dans le cerveau post-natal (neurogenèse post-natale). Pour ce faire, des souriceaux de 6 jours seront utilisés.

48 souris diabétiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur inflige des plaies cutanées chirurgicales sur le dos puis on les anesthésie tous les trois jours pendant 21 jours pour suivre la cicatrisation, afin de tester des biopansements et des molécules bioactives. Le porteur situe les retombées à court terme, les produits étudiés étant déjà commercialisés pour d'autres usages. Il affirme avoir besoin d'un animal vivant pour étudier la cicatrisation dans son ensemble, avec les contraintes que subit la peau au quotidien.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’amélioration du processus de cicatrisation par l’usage de molécule bio actives et de nano biomatériaux sur un modèle de plaies cutanées dans un contexte diabètique en utilisant une lignée de souris qui exprime les paramètres physiologiques de la maladie (diabète). Le processus de cicatrisation comporte 4 étapes en condition physiologique : l’hémostase, l’inflammation, la prolifération et le remodelage. Elles se succèdent grâce aux recrutements des cellules immunitaires et la migration de cellules résidentes qui vont sécréter des facteurs permettant d’aboutir à la complète réparation de la lésion cutanée. En situation pathologique, ce processus peut être altéré (infection, maladie métabolique, irradiation…) et entrainer un retard de la cicatrisation et/ou une cicatrisation de moins bonne qualité, avec un risque de réouverture récurrente des plaies qui deviennent alors chroniques. Il est donc important d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l’utilisation de molécules ayant des propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes et anti-microbiennes. A ce titre certaines molécules semblent être de bons candidat innovants. Nous testerons ici deux molécules : les HDL reconstitués (rHDL) ainsi que l’Alpha 1 Antitrypsine (AAT). Ces deux molécules seront incorporées dans un gel neutre miscible (gel neutre Cooper) afin de pouvoir les appliquer et les maintenir sur les plaies. Cependant il manque encore des données scientifiques pour étayer cela. Nous voulons également tester en parallèle deux scaffolds : un scaffold solide et un scaffold sous forme d’hydrogel que nous avons déjà testé sur un modèle de plaies cutanés sur des Rats Wistar, non diabétiques, en amont du projet et dont les résultats préliminaires nous amènent à penser qu’ils peuvent être de bon candidats dans le processus de cicatrisation cutanée dans un contexte pathologique comme le diabète. Nous souhaitons évaluer les propriétés cicatrisantes des rHDL , de l’AAT , de la synergie de ces deux molécules ainsi que certains nano bio matériaux sur des plaies aigües en condition hyperglycémique liée au diabète. Nous pourrons ainsi étudier d’une part la potentielle amélioration de la qualité de la cicatrisation et d’autre part la possible normalisation du processus de cicatrisation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent principalement la santé humaine, et en particulier les personnes souffrant de retard de cicatrisation comme les diabétiques. Les données scientifiques feront l’objet de publications dans des journaux internationaux permettant ainsi une valorisation d’un développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique innovante. Ces bénéfices auront une échéance à court terme puisque les molécules actives étudiées sont déjà commercialisées (pour d'autres applications), et les scaffolds étudiés sont accessibles pour une fabrication industrielle.

Procédures

Les animaux seront tous soumis à une procédure chirurgicale sur le tissu cutanée, d'une durée de 15 minutes environ, sous anesthésie et analgésie. Ils seront tous anesthésiés brièvement (5 minutes) pour l'examen des plaies, tous les 3 jours. La procédure totale aura une durée de 21 jours pour tous les animaux.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances sont celles imputables à la chirurgie à savoir : anesthésie, injections, stress et douleurs. Le suivi des plaies se faisant tous les deux jours sous anesthésie, peut engendrer des réveils difficiles et augmenter le risque d’hypothermie. De plus, le positionnement des pansements peut constituer une gène (risque de retrait du pansement, difficultés à se mouvoir). L’isolement des animaux en cas d’atteinte de points limites peut également constituer une source de stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour analyser les tissus étudiés.

Remplacement

Des tests préliminaires in vitro ont été réalisés préalablement sur un modèle de cellules épithéliales humaines de la peau (HaCat), en condition huperglycémique(MGO) afin d’extrapoler la concentration des molécules à utiliser sur notre modèle animal. De même, les propriétés anti-inflammatoires et de migration cellulaire ont été évaluées in vitro. Afin de répondre à notre objectif scientifique, nous avons besoin d’un modèle animal vivant pour étudier le processus cicatriciel dans son ensemble, notamment les phases telles que l’angiogénèse et la réinnervation, avec les contraintes que peut subir la peau au quotidien à savoir étirement, relâchement, inflammation locale.

Réduction

Nous avons pu réduire au maximum le nombre de souris grâce à une revue systématique bibliographique et à l’utilisation de l’outil statistique R. La taille des plaies induites de 6 mm permettra de réaliser 2 plaies par animal ce qui permettera d’avoir un contrôle négatif pour chaque animal.

Raffinement

Notre protocole a été optimisé afin de minimiser au maximum les contraintes subies par les animaux. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie avec une couverture analgésique en respectant strictement les règles d’asepsie. Le matériel chirurgical utilisé sera rigoureusement stérilisé au préalable. Le gel utilisé comme matrice pour les molécules à tester est un gel neutre et sera appliqué en plus de la plaie sur une partie de la peau du dos rasée préalablement comme contrôle de biocompatibilté. Les animaux seront surveillés et manipulés tous les jours pour détecter tout inconfort lié à la procédure, avec un suivi post-opératoire renforcé dans les premières 48h ainsi que dans les phases de réveil faites en chambre de réveil thermostatée. Nous allons également effectuer un scoring de la douleur.

Choix des espèces

Le modèle souris Db/Db (dabiétique) a été selectionné dans cette étude. La souris Db/Db est un modèle largement utilisé dans la recherche dès lors que nous devons travailler sur un modèle pathologique de diabète. Par ailleurs, la souris possède une architecture de la peau proche de celle retrouvée chez l’Homme : présence d’épiderme, lame basale, derme, hypoderme et présence de follicules pileux. La taille de 6mm de la plaie effectuée nous permettra de faire 2 plaies par souris et donc de réduire notre nombre total d’animaux. Nous travaillerons avec des souris mâles adultes de 8 semaines. Les jeunes souris adultes ont une meilleure récupération post-chirurgicale et nous n’ajouterons pas de biais de cicatrisation lié à l’âge de l’animal qui aura une peau plus souple à 8 semaines. Cela permettra d’avoir un processus de cicatrisation optimal.

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un morceau d'os du crâne leur est retiré par chirurgie, puis elles reçoivent trois injections. Le porteur reconnaît des douleurs post-opératoires liées au défaut osseux, à la coupe du périoste et aux sutures. Il indique qu'il faut prélever l'os pour l'analyser, ce qui impose de tuer les animaux, et présente le modèle du défaut de crâne comme largement validé.

Objectifs

Ce projet a pour but de mieux comprendre comment l'os se répare physiologiquement, afin de pouvoir à plus long terme créer des solutions efficaces pour la réparation osseuse de fractures qui ne se réparent pas seules. Dans un premier temps, des ablations d'un morceau de calvaria (crâne) seront réalisés sur des souris adultes. Les "trous" seront soit laissés vides, soit comblés avec un morceau d'os de calvaria contenant des cellules ostéocytes, soit comblés avec un morceau de calvaria sans ostéocytes, car les cellules seront tuées grâce à une technique de changement de température à plusieurs reprises. L'efficacité et la rapidité de la réparation de ces trous sera comparée à de l'os natif, sur des animaux qui n'auront pas subi de chirurgie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre si les ostéocytes jouent un rôle dans la réparation osseuse. Des études récentes montrent que tel est le cas. Les données apportées par ce travail permettront de créer des biomatériaux et des solutions thérapeutiques efficaces pour mieux traiter les défauts osseux critiques chez les patients malades ou atteints de trauma. Les ostéocytes ont été peu étudiées, bien qu'elles représentent 90 à 95% des cellules osseuses, et les différents biomatériaux permettant de réparer l'os à l'heure actuelle ne sont pas très efficaces.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie (durée de 5 minutes environ ) et à 3 injections intra-péritonéales à différents temps (durée 1 minute pour chaque injection, espacées de plusieurs jours).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir du stress lors de l'anesthésie au gaz (phase d'induction dans la boite) avant la chirurgie et des douleurs pourront être perçues après la chirurgie, dues au défaut osseux réalisé, à la coupe du périoste et/ou aux points de suture réalisés pour refermer la peau.

Devenir

Nous travaillons sur la réparation osseuse. Nous avons donc besoin des pièces osseuses pour pouvoir les analyser. De ce fait, comme il n'est pas possible de prélever les os de calvaria et de laisser les animaux vivants ensuite, ils seront tous euthanasiés avant le prélèvement.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'étude in vivo par de l'in vitro. Des expérimentations in vitro seront menées en même temps sur de la co-culture de cellules mais cela ne remplacera pas la compréhension in vivo de la réparation osseuse et ne permet pas de comprendre le rôle des ostéocytes dans ce processus complexe, faisant intervenir différents types de cellules à différents temps de la réparation.

Réduction

Afin d'utiliser moins d'animaux, deux défauts seront créés sur chaque animal, de chaque côté de la suture sagittale. Nous effectuerons les deux premières études sur des mâles et des femelles car leur physiologie est différente. Pour les études suivantes, et afin de nous affranchir du rôle des hormones sexuelles qui affectent l'os, nous utiliserons uniquement des mâles. Cela évite de doubler le nombre d'animaux utilisés pour ce projet, qui nécessitera beaucoup de temps d'analyse par la suite. Les femelles âgées et transgéniques seront étudiées dans un projet ultérieur.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe et dans des cages avec de l'enrichissement naturel afin de leur offrir le meilleur cadre pendant l'étude. Nous utiliserons du gel lacrymal si les chirurgies durent plus de 5 minutes. Celles-ci seront réalisées sous anesthésie au gaz avec de l'isoflurane car le réveil est ensuite très rapide. Afin de diminuer le temps de la chirurgie, nous utiliserons le fait que la souris C57Bl6 est une lignée syngénique. Ainsi, les premiers volets osseux du groupe 3 (défauts laissés vides) seront traités (congélation/décongélation) par une tierce personne présente dans la salle de chirurgie, et réimplantés sur des souris du groupe 1 opérées ensuite. Ainsi, nous éviterons l'attente d'une quinzaine de minutes nécessaire pour tuer les ostéocytes du volet osseux. Il n'y aura pas de couverture chauffante car la table de chirurgie contient des plaques chauffantes que nous règlerons sur 37°C. La douleur sera réduite au maximum grâce à l'utilisation d'analgésique avant et après l'opération si besoin (buprénorphine). Une anesthésie locale type lidocaine pourra également être utilisée ainsi que des AINS. Cette analgésie multimodale sera discutée en SBEA avec le vétérinaire référent. Le stress sera également réduit en manipulant régulièrement les animaux avant l'anesthésie pour qu'ils s'habituent aux expérimentateurs. En cas de signes de douleurs persistantes en dépit des analgésiques, un score sera établi grâce à une échelle spécifique tenant compte des signes d'apparence, de comportement, d'hydratation et de signes cliniques bien spécifiques. Si le score est supérieur à 14 sur un total de 19 points, ce seuil limite entraînera l'euthanasie de l'animal pour abréger ses souffrances.

Choix des espèces

Le défaut de calvaria (ablation d'une petite partie de l'os du crâne) chez le rongeur est un modèle largement utilisé au laboratoire et validé dans la littérature. Ce sont des modèles de choix pour étudier l'influence des cellules et biomatériaux sur la réparation osseuse. Plusieurs lignées de souris seront utilisées dans ce projet: animaux avec ou sans mutations génétiques. Les mutations génétiques utilisées servent à voir les vaisseaux en vert en microscopie et d'autres animaux permettront de comprendre le rôle de la contrainte mécanique sur la réparation osseuse. Nous travaillerons sur des animaux adultes, et âgés car ce sont dans ces populations que l'on retrouve le plus de problèmes de réparation osseuse chez l'homme, en raison de trauma ou d'opération visant à extraire des tumeurs cancéreuses.

129 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats reçoivent un implant de céramique dans l'os par chirurgie, les souris un implant sous la peau, avec suivi par micro-scanner. Le porteur reconnaît des douleurs post-chirurgicales au site opératoire. Il affirme qu'aucun modèle de formation osseuse in vitro ou in silico ne reproduit la complexité de la cicatrisation, et vise à tester des céramiques comme alternative à l'autogreffe.

Objectifs

La réparation du squelette après perte de substance osseuse demeure un problème lorsque les défauts sont de grande taille. Si le traitement par autogreffe (prélèvement d’os chez le même patient) reste la référence, il a cependant des inconvénients. Les matériaux à base de céramiques en phosphate de calcium (CaP) sont une bonne alternative à l’autogreffe osseuse car supportent bien la repousse osseuse mais, généralement qu’aux abords des berges osseuses limitant leur efficacité à des défauts de faible volume. Une stratégie prometteuse pour améliorer le potentiel régénératif de ces matériaux est de mieux mimer la composition chimique de l’os (partie minérale), qui contient de nombreux oligo-éléments sous formes d’ions (tels carbonates, fluor, magnésium, manganèse…). L’insertion d’ions dans les céramiques de CaP est une approche de plus en plus étudiée permettant de moduler les propriétés physico-chimiques et microstructurales du matériau, et ainsi ses propriétés biologiques. Parmi les éléments ‘traces’ présents naturellement dans l’os, le silicium (principal élément composant le sable) joue un rôle essentiel dans le développement, la croissance et la calcification du tissu osseux (une alimentation déficiente en silicium engendre un retard de croissance accompagné d’un développement crânien anormal chez le rat alors qu’un régime enrichi en silicium améliore leur croissance squelettique). Le silicium est présent dans le corps sous forme d’ions silicates. Des études in vitro démontrent que les ions silicates favorise la différenciation de cellules qui produisent le tissu osseux et inhibe les cellules osseuses qui résorbent l’os. L’incorporation d’ions silicates dans ces matériaux a été déjà étudiée ces dernières années mais en raison de la faible dégradation des céramiques de CaP in vivo, les ions Silicates (qui pourraient influencer les cellules osseuses) ne sont en fait jamais libérés. L’incorporation d’ions carbonates, (ions naturellement présents dans le tissu osseux à 5-8%) dans les céramiques augmente leur dégradation in vivo. Considérant les avantages de chacun, l’incorporation simultanée d’ions silicates et carbonates dans la structure des céramiques rendrait le matériau dégradable, libérant ainsi les ions Silicates bioactifs pour stimuler les cellules osseuses et promouvoir l’ostéogénèse. L’objectif de ce projet est d’évaluer la dégradation des différentes céramiques (+/- ions) in vivo et leur potentiel à réparer un défaut osseux.

Bénéfices attendus

Plusieurs données de la littérature ont montré le bénéfice de céramiques contenant des ions silicates sur la formation osseuse ; mais une controverse persiste dans la communauté scientifique en raison de la faible/absence de dégradation des céramique in vivo, limitant la libération des ions silicates bioactifs. Le co-insertion d’ions carbonates et silicates a pour objectif d’obtenir des matériaux dégradables et donc plus bioactifs. Ce projet permettra de valider (ou invalider) l’intérêt d’insérer des ions silicates dans une biocéramique pour la réparation osseuse. Le bénéfice attendu à plus long terme est l’optimisation de la synthèse et fabrication d’implants en biocéramique pour le comblement de grands défauts osseux en remplacement de l’autogreffe.

Procédures

Pour les souris : 1-Implantation sous cutanées de matrices ( 1X ; durée ~20 min) 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (max 7X; durée 15 min) Pour les rats : 1- Implantation intraosseuse au niveau du condyle (1X, durée 40 min) ; 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (6X; durée 15 min) 3- Injection d'agent fluochromes (2X ; durée 5 min)

Impact sur les animaux

Nuisances attendues causées durant les actes expérimentaux : stress dû à la contention puis lors de la perte de connaissance par le gaz anesthésiant (souris et rats) ; Injection en sous cutané (souris et rats); Injection en intrapéritonéal (souris et rats); Chirurgie en sous-cutané (sous analgésie et anesthésie) (souris) ; Chirurgie en intra-osseux (sous analgésie et anesthésie) (rats). Nuisances attendues engendrés suite aux expérimentations : douleurs post-chirurgie (niveau du site opératoire) (souris et rats)

Devenir

Mise à mort car fin de protocole ; les explants seront récupérés et traités selon l’étude (analyse expression génique, histologie, analyse au scanner à plus haute résolution, mesure de la masse de la céramique restante).

Remplacement

Aucun modèle de néoformation osseuse in vitro n’est disponible aujourd’hui. La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel orchestré complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire ; à cela s'ajoute l'impact d'un système hormonal complexe. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénués de système vasculaire qui joue un rôle clé dans la réparation osseuse. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

4 ou 2 implants seront implantés par animal pour diminuer le nombre d’animaux utilisé. L’imagerie non-invasive pour petits animaux (suivi de la formation osseuse par micro-scanner) sera utilisée pour suivre les mêmes animaux dans le temps et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisé. Une analyse statistique en préalable a permis de déterminer qu’il nous fallait 10 animaux par groupe testé pour espérer obtenir une différence statistique entre au moins 2 groupes.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’une semaine sera effectuée entre l’arrivée des animaux et la chirurgie. Le manipulateur viendra les voir et manipuler au minimum 3 fois avant la chirurgie. En vue d’éviter le stress, les souris et les rats initialement hébergés ensemble (3 animaux/cage) le resteront du début à la fin du protocole. La souffrance sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire pendant les 3 premiers jours. Après anesthésie et avant chirurgie, un gel sera est appliqué sur chaque œil pour éviter le dessèchement des yeux. Après chirurgie, les animaux seront surveillés en per-opératoire puis régulièrement jusqu'à la fin de l'expérimentation. Pour chaque analyse par micro-scanner, les souris et rats seront anesthésiées par inhalation d’un gaz anesthésiant dont les effets se dissipent 1 à 2 minutes après l’arrêt du contact direct avec le produit. Les points critiques (plaie, démarche..) seront surveillés, notés et reportés sur une feuille de score permettant de quantifier la douleur ou la gêne de l’animal. Les mesures à prendre pour chaque situation clinique (Perte de poids, Comportement général altéré, Apparence extérieure altérée, Site d’implantation infecté) et si les points limites sont atteints, sont listées sur cette feuille de score. Un environnement enrichi sera fourni avec briques de bois (usure des dents), dômes (pour souris) et papier afin de contribuer au fouissement des animaux. La température sera maintenue et contrôlée entre 20 et 22°C et le rythme veille/sommeil sera de 12h/12h. Eau et nourriture seront fournies ad libitum.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour les implantations sous-cutanées est la souris immunodéprimée Nude (ayant un système immunitaire adaptatif altéré, mais inné non-altéré) car une procédure implique l’association de céramiques avec des de cellules humaines formatrices de tissu osseux; son poids à 8 semaines (~30 g) permet l’implantation de 4 implants par souris ou 2 chambres de diffusion par souris sans problème. Le modèle animal choisi pour les implantations intra-osseux est le rat Wistar. La taille du rat est plus pertinente que la souris pour évaluer la réparation d’un grand défaut osseux. La souche Wistar est non consanguine ayant une variabilité génétique plus importante qu’un modèle consanguin.