Souris

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une première chirurgie abdominale avec réveil, puis 24 heures plus tard une seconde chirurgie sans réveil pour prélever un caillot et du sang, avec une exposition de six heures à une hypoxie reproduisant les conditions d'un vol long-courrier. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer des douleurs post-opératoires dans les heures suivant le réveil. Il justifie l'animal par l'impossibilité de reproduire in vitro la complexité d'un vaisseau sanguin entier.

Objectifs

Evaluation en préclinique des effets de l’hypoxie sur la thrombose veineuse profonde. L'’intérêt est d'’identifier les acteurs cellulaires et protéiques impliqués dans la formation du thrombus après une exposition à un environnement hypoxique hypobare similaire à un vol d’avion long-courrier (minimum de 4 heures)

Bénéfices attendus

Ce projet d’expérimentation permet de reproduire in vivo la formation d’un thrombus sous l’effet d’une hypoxie hypobare et donc de simuler au mieux les conditions environnementales auxquelles sont exposées les passagers d’un vol long-courrier. Cette approche permettrait d’identifier les acteurs cellulaires par lesquels l'hypoxie joue son rôle pro-thrombotique et donc de révéler à terme de nouvelles cibles thérapeutiques pouvant être spécifiques pour les personnels de bord et les « grands voyageurs ».

Procédures

Les animaux sont dans un premier temps soumis à une chirurgie abdominale avec réveil. 24 heures après ces mêmes animaux sont soumis à une deuxième chirurgie qui cette fois est sans réveil permettant le prélèvement du thrombus et du sang. Les deux chirurgies ainsi que les prélèvements ne sont réalisés qu'une seule fois par animal. Un groupe d’animaux sera également soumis à du gavage sur 3 jours à raison d’une fois par jour.

Impact sur les animaux

Cette procédure est une procédure avec réveil et nécessite une chirurgie abdominale qui peut engendrer des douleurs post-opératoires les heures suivants le réveil des animaux. Les chirurgies ont une durée de 40 minutes et l'exposition à l'hypoxie hypobare ou normoxie normobare dure 6 heures. Le gavage ainsi que le phénotype bloquant l’activation plaquettaire rendent les chirurgies plus longues d’environ 10 minutes car les animaux ont un risque de saignement plus élevé que la normale.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure après prélèvement sanguin et prélèvement de caillot sanguin.

Remplacement

A ce jour l’étude in vitro des neutrophiles, des plaquettes et des cellules endothéliales ne permet pas à elle seule de reproduire l’intégralité du vaisseau sanguin. De plus, l'induction de l'hypoxie à l'échelle cellulaire ne reproduit pas la complexité des pathologies thrombotiques veineuses auxquelles sont exposés les passagers d’un avion.

Réduction

Dans le cas où une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant l’utilisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas d’expérimentations supplémentaires. L’analyse du thrombus et des composés sanguins sera réalisée dans les mêmes animaux afin de respecter la règle des 3R (Reduction).

Raffinement

Les animaux seront utilisés 7 jours après leur arrivée dans l'animalerie pour leur laisser le temps de s'acclimater. Afin de limiter le stress, les animaux seront transférés 24h avant la chirurgie dans la cage qui les hébergera tout le long de la procédure. Ceci aura pour but de les habituer à leur nouvel habitat et de les acclimater à la prise d'eau gélifiée. Au cours de la chirurgie, les animaux suivants attendront dans une pièce d’hébergement afin de ne pas être perturbé par la chirurgie en cours. Les animaux seront opérés sur un tapis chauffant (37°C) afin de maintenir leur température pendant la chirurgie. Pour améliorer les conditions de réveil, les animaux seront placés sur une bouillotte dans la cage pour les maintenir au chaud. Une surveillance accrue sera réalisée après la chirurgie toute la journée ainsi que pendant l'exposition à l'hypoxie hypobare pour le groupe concerné pour évaluer le bien-être des animaux et détecter rapidement tout signe de souffrance. Une première dose d'anti-douleur sera administrée aux animaux 30 minutes avant la chirurgie et une deuxième dès la fin de la chirurgie. Une troisième dose est injectée à la fin de la journée afin de limiter les douleurs durant la nuit. Le lendemain matin, soit 12 heures après, une dernière injection d'anti-douleur est réalisée avant de placer les souris en normoxie normobare ou en hypoxie hypobare. En cas de signes de souffrances chez un animal une nouvelle injection d'anti-douleurs lui sera administré.

Choix des espèces

Le modèle murin est un excellent modèle de thrombose à la fois artérielle et veineux et reproduit au mieux les mécanismes de thrombose présents chez l'humain. Les animaux seront utilisés entre 5 et 12 semaines afin d’avoir un système immunitaire et vasculaire fonctionnel.

775 animaux non-humains, 525 souris et 250 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent de support à des travaux pratiques où des stagiaires s'exercent à la contention, aux injections par plusieurs voies, au gavage et au prélèvement sanguin, non pour produire des connaissances mais pour former de futurs expérimentateurs. Le porteur indique que les animaux sont tués en fin de séance car ils ne peuvent réintégrer l'animalerie, leur statut sanitaire étant jugé dégradé. Il présente cette formation aux "bons gestes" comme une contribution au bien-être des animaux non-humains.

Objectifs

Les formations spécifiques pour les personnes appliquant/concevant des procédures expérimentales sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté défini le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Ce projet décrit cette partie pratique qui a pour objectif de montrer et d'apprendre les gestes de préhension/contention et les différents modes d'administration et de prélèvement utilisés usuellement chez la souris et le rat.

Bénéfices attendus

Cette formation a pour objectif de former les futurs expérimentateurs. Dans cette formation leur sont enseigné les gestes précis, permettant de réduire au maximum le stress de l’animal. Par la formation aux bons gestes, cette formation participe au bien-être animal et permet la diffusion de gestes techniques précis et maitrisés.

Procédures

Les 2 espèces (souris et rat) auront au maximum 1 préhension / contention et 1 injection maximum par voie choisie (intrapéritonéale, gavage, sous-cutanée, intramusculaire et intraveineuse). Les souris auront un seul prélèvement de sang submandibulaire. Chaque technique dure 5 minutes maximum. Après chaque intervention, les animaux sont remis dans leur cage pour une durée minimale de 10 minutes. NB: Tous les apprenants feront obligatoirement la préhension/contention mais en fonction de l'aisance de chaque groupe, toutes les techniques seront effectuées par les formateurs mais pas obligatoirement par chaque stagiaire.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur ses animaux peuvent être un stress généré par l’inexpérience des apprenants. Cette hésitation peut être source de stress pour l’animal. Le stress généré n’est cependant que transitoire et de courte durée. Le gavage per-os peut également entrainer un inconfort pour l’animal, il n'y a pas de risque de fausse route les sondes utilisées ont un embout "rond" ou "olive. Le prélèvement submandibulaire peut dans de rare cas entrainer un risque d’hémorragie s’il n’est pas réalisé correctement, dans ce cas le formateur expert évalue la souffrance de l'animal et si necessaire l'animal est mis à mort. Les injections sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire sans administration provoquent une douleur légère de courte durée.

Devenir

Les animaux ne peuvent être réutilisés pour une prochaine session de travaux pratiques car 2 mois séparent généralement 2 formations, les animaux seront trop gros et difficilement manipulables par les apprenants novices. De plus, on considère que leur statut sanitaire est dégradé du fait de leur sortie de l'animalerie en salle de travaux pratiques ils ne peuvent donc réintégrer l'animalerie. Les animaux sont donc tous mis à mort à la fin de la séance.

Remplacement

L’objectif de cette séance est d’une part de montrer aux stagiaires les bonnes pratiques en terme de contention, d'administrations et de prélèvements, puis de vérifier qu’ils mettent correctement en œuvre ces pratiques. Il est important pour cela, qu’ils soient confrontés à des animaux vivants, tout comme dans les futures procédures expérimentales qu’ils appliqueront. Cela leur permettra aussi d’anticiper les réactions des animaux face aux contentions mais aussi aux injections et prélèvements.

Réduction

525 souris seront utilisées pour ce projet. Par session: 1 souris x 18 apprenant + 3 formateurs = 21 souris La souris étant le modèle rongeur le plus utilisé, il est essentiel que chaque stagiaire puisse manipuler et effectuer toutes les techniques enseignées. 250 rats seront utilisés pour ce projet. Par session: 1 rat x (18 apprenants/2) + 3 formateurs = 10 rats. 1 rat pour 2 stagiaires sera utilisé, les stagiaires expérimenteront la moitié des techniques enseignées. Il y a 5 sessions/ an donc sur 5 ans: 21 souris x 25 = 525 souris et 10 rats x 25 = 250 rats Le nombre d’animaux est choisi pour être réduit au minimum tout en gardant la possibilité à chaque apprenant de pouvoir effectuer les différents gestes techniques. Diminuer ce nombre ne ferait qu’augmenter les nuisances pour chaque animal, ainsi que le stress rendant les contentions plus difficiles et les apprentissages plus complexes.

Raffinement

Les animaux seront commandés pour arriver 1 semaine avant le TP, le temps qu’ils s’acclimatent et se remettent du stress du voyage. Ils seront hébergés en groupe avec nourriture et eau à volonté. Leur cage sera enrichie avec des cachettes et de quoi faire un nid. Une surveillance quotidienne sera assurée par les zootechniciens de l'animalerie. Les mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales seront de limiter le temps d’utilisation de l’animal pour chaque geste technique à 5 minutes maximum qui sera obligatoirement suivi par un replacement dans leur cage de 10 minutes minimum. Durant cette période de « répit », le comportement et l’apparence physique seront évalués (grille de scoring). Tout animal dont le scoring identifiera une douleur importante sera immédiatement mis à mort. Les manipulations se feront sous le contrôle du/des responsables de groupe qui veillera à l’exécution du bon geste pour le bien-être animal ce qui permettra de stopper très rapidement les mauvaises manipulations entrainant une douleur. La préhension des souris, en limitant au maximum la prise par la queue, sera enseignée (utilisation de tunnels et main en coupe).

Choix des espèces

La souris reste le modèle le plus utilisé en recherche (60% des utilisations d’animaux), le rat, bien que moins utilisé (environ 10%) reste néanmoins très utilisé notamment dans le cadre des neurosciences, discipline très représentée au sein des chercheurs du CNRS. Les souris seront utilisées à 7 semaines de manière à n’être pas trop grosses afin de pouvoir entrer facilement dans la boite de contention pour l’IV. Les rats d’un poids de 250g ce qui correspond à 6 semaines et les souris de 7 semaines sont aussi utilisés à cet âge de manière à ne pas rendre trop compliquée la préhension et la contention pour les apprenants.

1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sur un ou deux flancs, puis des traitements par différentes voies, avant un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie, pour tester un anticorps contre un modèle de neuroblastome, un cancer de l'enfant. Le porteur décrit une nécrose tumorale qui peut atteindre la surface et former une plaie s'agrandissant par frottement ou "cannibalisme", tout en la présentant comme un signe d'efficacité. Il justifie l'usage de l'animal par une exigence "réglementaire" de tester le médicament sur deux modèles avant l'humain.

Objectifs

La neurotensine (NTS) est une hormone du tractus gastro-intestinal. Son action est transmise à la cellule par des récepteurs, le plus important étant le récepteur de haute affinité, le NTSR1. Nous avons pu démontrer la contribution de ce couple dans l’agressivité tumorale, par ses actions sur la croissance tumorale avec des effets sur la prolifération cellulaire et l’apoptose, mais aussi sur les processus métastatiques en modifiant la migration, l’invasion et l’adhérence cellulaire. Le récepteur est surexprimé dans les cancers solides. Nous avons montré que l’expression élevée de NTSR1 est un marqueur de mauvais pronostic pour les cancers du poumon, et pour de nombreux autres cancers. La présence du récepteur NTSR1 associé à son ligand la NTS sont également associés à la résistance aux traitements anticancéreux. Nous avons donc cherché à développer des stratégies thérapeutiques pour antagoniser ce couple, afin de faire baisser l’agressivité des tumeurs et sensibiliser les cellules tumorales aux traitements thérapeutiques. Dans le but d’inhiber les effets de la neurotensine, nous avons développé un anticorps neutralisant dirigé contre la forme longue de la NTS, la LF-NTS. Notre stratégie est de diminuer l’activité du NTRS1. La preuve de concept expérimentale a été réalisée dans des modèles de cancer du poumon et du sein. Il nous ait demandé de prouver l’efficacité de notre anticorps sur un autre modèle de cancer avant de mettre en place un essai clinique. Nous avons donc décidé de nous orienter vers une maladie orpheline de l’enfant, le neuroblastome. A l’heure actuelle, les données montrent que 50 % des enfants atteints de ce type de cancer récidivent, et 10 % en survivent. Les points forts qui ont orienté ce choix sont d’une part que le récepteur de la neurotensine et les signalisations oncogéniques associées sont activés de manière permanente lors l’exposition chronique à l’agoniste de la neurotensine. D’autre part, l’étude des données publiques montre clairement un lien significatif entre l’expression de la neurotensine, la gravité de la maladie, la résistance aux traitements et la survie.

Bénéfices attendus

Nous avons établi la preuve de concept de l’efficacité d’un anticorps murin et humain dirigé contre les formes longues de la neurotensine sur la croissance tumorale, invasion métastatique et la réponse aux chimiothérapies. Ces résultats ont été publiés. L’étape suivante est de mettre en place un essai clinique, mais il nous est demandé de prouver l’efficacité de notre anticorps sur un cancer plus rare et au pronostic sombre qui validerait ce que nous avons montré sur d’autres modèles cancéreux (cancer du sein triple négatif, et du poumon non à petites cellules). La règlementation exige que les médicaments destinés à la thérapie humaine soient testés sur des modèles animaux et sur différents cancers. Les tests de l’efficacité thérapeutique de ces anticorps dans un modèle murin sont une étape préalable, nécessaire et obligatoire avant de poursuivre vers les études règlementaires de toxicologie et un essai clinique.

Procédures

Les animaux commerciaux seront acclimatés durant une semaine puis ils seront soumis à une injection sous-cutanée de cellules tumorales sur animal vigile (15 secondes/animal) sur un flanc ou sur les 2 flancs. Après la validation de l’apparition d’une tumeur solide les animaux seront traités avec les molécules thérapeutiques par injection intraveineuse au sinus retro-orbitaire, par injection per os sur animaux vigils 5 jours de suite, et par une injection de notre anticorps thérapeutique à J1, J8 et J15. Enfin, les animaux subiront un prélèvement sanguin terminal unique sous anesthésie profonde (5 minutes) puis seront immédiatement mise à mort sans réveil de l’animal. Le developpement des métastases est possible.

Impact sur les animaux

L’implantation des cellules tumorales sur le flan de l’animal provoque le développement d’une tumeur solide. Les tumeurs ne sont à priori pas innervées et elles n’entrainent donc pas de douleur en tant que telle. En revanche la taille de la tumeur peut provoquer des difficultés de déplacement des souris surtout si après l’implantation en sous-cutanée la tumeur se développe dans le creux de la patte postérieure. Ce phénomène arrive parfois, il n’est pas contrôlable. L’efficacité de la thérapie que nous développons se traduit par une réduction de la taille tumorale, ralentissement de la pousse, mais aussi par une possible nécrose plus ou moins importante qui démarre au centre de la tumeur. Ce phénomène de nécrose peut atteindre la surface de la tumeur et provoquer une plaie. Cette plaie peut s’agrandir soit par frottement soit par cannibalisme. Dès l’apparition d’un point de nécrose, nous appliquons des soins adaptés. Cependant, plus le traitement est efficace plus la nécrose va se développer à l’intérieure de la tumeur. C'est un phénomène inévitable que nous prenons en compte pour évaluer l’efficacité de la thérapie.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.

Remplacement

Nous avons établi la preuve de concept de l’efficacité d’un anticorps murin et humain dirigé contre les formes longues de la neurotensine sur la croissance tumorale, invasion métastatique et la réponse aux chimiothérapies. Ces résultats ont été publiés. L’étape suivante est de mettre en place un essai clinique, mais il nous est demandé de prouver l’efficacité de notre anticorps sur un cancer plus rare et au pronostic sombre qui validerait ce que nous avons montré sur d’autres modèles cancéreux (cancer du sein triple négatif, et du poumon non à petites cellules). La règlementation exige que les médicaments destinés à la thérapie humaine soient testés sur des modèles animaux et sur différents cancers. Les tests de l’efficacité thérapeutique de ces anticorps dans un modèle murin sont une étape préalable, nécessaire et obligatoire avant de poursuivre vers les études règlementaires de toxicologie et un essai clinique.

Réduction

Nous limitons au minimum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 10 souris pour chaque groupe expérimental est prévu afin de pouvoir réaliser des études statistiques. Un total de 796 souris, qui a été défini par une approche statistique, sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. Les 3 phases de ce projet se dérouleront séquentiellement à partir du moment où la phase précédente est validée. Phase 2 sera mise en place si la phase 1 est validée. Phase 3 sera mise en place après la sélection des lignées cellulaires en phase 2. La phase 4 sera réalisée qu’après la validation de la phase 3.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bienêtre animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bienêtre des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites adaptés) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Dans ce projet, l’administration des traitements devrait apporter un bénéfice pour les animaux avec un ralentissement de la progression tumorale. De plus, l’ensemble des gestes techniques qui sont réalisés sur animal vigile sont pratiqués par des personnes formées et expérimentées avec du matériel adapté permettant de réduire significativement les nuisances liées aux actes techniques.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Le choix de l’espèce est justifié à travers différents aspect : - La physiologie de la souris qui est un mammifère comme l’Homme ; - La possibilité de recréer un modèle de neuroblastome - Une espèce couramment utilisée et reconnue en oncologie - Un modèle ayant permis de déterminer l’importance du protocole d’administration, l’influence du volume tumoral et la toxicité des traitements - La réglementation demande à ce que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant administration chez l’humain. Description du ou des modèle(s) : La souris Nude est le standard pour les études précliniques relatives à l'évaluation in vivo des effets anti-tumoraux sur des cellules humaines. Nous utiliserons la souche NMRI Nude-Foxnu afin de faciliter la greffe et le développement de cellules d’origine humaine. Selon la fiche research models de la souche NMRI-Foxn1nu/nu proposée par le fournisseur, le poids des animaux se stabilise entre 28 et 35 jours d’âge. Ce stade de développement est couramment utilisé et validé par la communauté scientifique. Description de l’identification : L’identification par bague est privilégiée, car la plus pratique pour identifier les souris. Elle sera réalisée au cours de la semaine d’adaptation. En cas de perte les animaux seront bagués de nouveau ou à défaut des marquages au feutre de couleur des queues pourront également être réalisées pour sécuriser l’identification.

750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intra-péritonéale d'un composé qui enflamme le péritoine et un prélèvement sanguin, avant d'être mises à mort pour prélever leurs organes et caractériser leur système immunitaire. Le projet répond à des prestations pour des laboratoires privés et publics qui veulent mesurer l'effet de modifications génétiques sur la réponse immunitaire. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucune méthode substitutive ne placerait dans des conditions physiologiques similaires, le modèle devant selon lui être évalué à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaître l’impact d’une inflammation sur le système immunitaire suite à la modification de gènes cibles. L’objectif de ce projet est d’évaluer la réponse immunitaire après l’induction d’une inflammation temporaire dans le péritoine de souris contrôles ou d’animaux génétiquement modifiés. Nous caractériserons les différentes populations du système immunitaire des organes de ces souris afin de déterminer l’impact de la modification génétique sur la réponse immunitaire suite à l’inflammation. Les cohortes de souris génétiquement modifiées que nous caractériserons seront produites indifféremment par notre animalerie ou des laboratoires partenaires extérieurs. Les animaux contrôles pourront quant à eux provenir également d’un fournisseur extérieur agréé. Le présent projet ne concerne que les étapes d’induction de l’inflammation et de caractérisation fonctionnelle des populations du système immunitaire après réception des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet est mis en oeuvre dans le cadre général de la validation de modèles animaux génétiquement modifiés pour des études précliniques in vivo. Il vise donc à évaluer de façon qualitative et quantitative la capacité d’un modèle murin à répondre à une inflammation.

Procédures

La procédure expérimentale consiste en l’injection unique d’un réactif provoquant l’inflammation du péritoine. Cette injection est rapide et dure moins d’une minute par animal. Le jour de la mise à mort des animaux pour l’étude du système immunitaire, un unique prélèvement sanguin est réalisé pour quantifier l’état inflammatoire des souris et pour la récolte du plasma sanguin. Le prélèvement sanguin sera réalisé dans le respect du bien-être animal et ne dure que 30 secondes. Les souris seront ensuite mises à mort pour le prélèvement des organes en vue de de la caractérisation des populations du système immunitaire.

Impact sur les animaux

L’induction de l’inflammation du péritoine par injection intra-péritonéale de composé inflammatoire engendre un phénotype modéré chez la souris pendant les premières 24H, se traduisant par un ralentissement de l’activité des animaux. Au-delà de ces premières 24H, un retour à la normale est observé avec une reprise d’activité des animaux. Pour les animaux génétiquement modifiés étudiés, la sévérité du phénotype est évaluée pendant toute la procédure et comparée à celle des animaux contrôles. La non reprise d’une activité normale à 24H entraînera une observation particulière, bi-journalière des animaux pour les 3 jours suivants selon une grille de score et des points limites préétablis. De plus, le prélèvement sanguin avant la mise à mort des animaux pourra engendrer un stress de courte durée. Tous les actes techniques seront réalisés par du personnel technique formé et expert dans le respect du bien-être animal.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’experience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle inflammatoire testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Le nombre utilisé pour ces expériences est de 5 animaux par génotype et par lot expérimental. Trois lots sont quantifiés et comparés, correspondants aux différents temps après induction de l’inflammation : soit 4 jours après inflammation, soit 1 jour après ou soit sans inflammation. Il faudra donc 30 souris au total par expérience (15 animaux par génotype) pour permettre une évaluation complète de l’ensemble du recrutement des populations myéloïdes suite à l’inflammation.

Raffinement

Les animaux en expérimentation sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier, que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début des injections et la surveillance journalière des animaux en expérimentation est assurée par du personnel de zootechnie formé et qualifié.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle murin car ce sont des mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. C’est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose à ce jour d’une bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles. Nous avons en effet à notre disposition un grand nombre d'anticorps marqués par une grande variété de fluorochromes permettant un phénotype du système immunitaire à très haut contenu. Nous utiliserons des souris adultes uniquement, à partir de 8 semaines pour une analyse du système immunitaire mature. L’étude d’un système immunitaire en développement ou vieillissant ne fait pas l’objet de ce projet.

Chaque souris reçoit sous anesthésie une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, puis, une fois la tumeur développée, une injection intraveineuse de nanoparticules lipidiques porteuses d'un ARNm de luciférase, une injection de luciférine dans l'abdomen et une séance d'imagerie. Les 625 souris, dépourvues de thymus pour faciliter la prise des tumeurs, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont mises à mort après l'imagerie pour un prélèvement d'organes. L'équipe veut savoir si ses vecteurs concentrent les nanoparticules dans les tumeurs en limitant leur accumulation dans les autres tissus, et le porteur cite parmi les effets possibles des chocs anaphylactiques, des détresses cardio-respiratoires et la gêne due à la tumeur, mesurée deux fois par semaine. Il ne nomme pas les lignées tumorales et ne fixe aucun volume tumoral maximal.

Objectifs

Ce projet est centré sur l'adressage sélectif de nanoparticules lipidiques vectorisés (LNP-V) vers des tumeurs afin d’en améliorer leur diagnostic/traitement. L’imagerie par bioluminescence permet la détection et la quantification/accumulation in vivo de conjugués ou de cellules développées pour présenter une activité bioluminescente. L'objectif principal de ce projet est donc d’utiliser cette technique pour étudier les effets de l'utilisation de différents vecteurs sur la biodistribution et l'accumulation plus spécifique dans les tumeurs de LNP-V en limitant leur accumulation non spécifique dans les autres tissus. En effet un ARNm codant pour l'enzyme luciferase sera encapsulée dans les LNP-V et servira de read out de l'accumulation des différents LNP-V dans les tumeurs.

Bénéfices attendus

L'utilisation de nanoparticules lipidiques vectorisées (LNP-V) permets de protéger la molécule thérapeutique de la dégradation et de permettre une distribution plus spécifique. D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos molécules constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Chaque souris sera implantée avec un modèle de cellules tumorales par une injection en sous cutanée sur le flanc de l’animal anesthésié. Après croissance tumorale, les souris recevront une injection par i.v. de nanoparticules lipidiques (LNP) vectorisées (V) contenant un ARNm codant pour la luciférase (protéine émettant de la lumière en présence de son substrat la luciférine), en solution isotonique stérile, sous anesthésie gazeuse. Vingt-quatre heures après, pour induire la bioluminescence, une injection intrapéritonéale de luciférine sera réalisée sous anesthésie, juste avant l’imagerie. Les imageries bioluminescentes dureront environ 10-15min et les animaux seront maintenus sous anesthésie pendant la totalité de l'acquisition.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pour les souris sont principalement le stress causé par la capture, l'implantation des cellules tumorales en sous-cutanées (réalisé une seule fois) sous anesthésie, les injections en i.v. des molécules (réalisé une fois) et en i.p du susbtrat Luciferine (réalisé une fois) sous anesthesie, ainsi que le développement de la tumeur primaire chez l’animal en tant que pathologie. Ce developpement de la tumeur en sous cutanée peut entrainer une gène physique, avec de possibles grattages et demangeaisons. Les animaux seront soumis à la mesure bi-hebdomadaire des volumes tumoraux. La pousse de la tumeur peut eventuellement entrainer chez l'animal une gêne physique au déplacement ou à la toilette par exemple. Les LNP-V peuvent (éventuellement) causer des effets secondaires observés post-administration comme des chocs immunitaires (anaphylactique), des réactions allergiques, des détresses cardio-respiratoires et des troubles comportementaux.

Devenir

A l'issue de chaque procédure d'imagerie les animaux seront mis à mort et certains organes seront prelevés afin de valider ex vivo la biodistribtuion des LNP-V.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos LNP-V ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement en mesurer le bénéfice. L'utilisation de rongeurs (ici, n= 125 souris/an) impose la prise en compte de la règle des 3 R, la conformité vis à vis des recommandations et cahier des charges.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le nombre total de souris pour cette étude s'élève à 625 souris. Il tient compte du suivi des modèles expérimentaux développés dans le projet et de la variabilité de développement des tumeurs qu’il peut exister dans les différents modèles. L’optimisation de nos vecteurs in vitro nous permet aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure. Le nombre total d’animaux répartis sur des études necessitants 25 souris chacune sera de 625 souris décomposé en 5 études de 25 individus/an sur 5 ans. Ce nombre sera suffisant pour appréhender la détection et l'accumulation de nos molécules dans les tumeurs. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Ce nombre d'animaux pour ces procédures nécessaire à l'obtention d'une significativité statistique a été défini en déterminant le test statistique et l'effet biologique et la dispersion escomptés.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et/ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal, appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien, personne dument qualifiée, pour exercer dans le respect des 3R. Nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Dès leur arrivées les souris sont placées dans une pièce cyclée (12h/12h), insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 5 individus par cage, litières (copeaux de bois) et alternance d'enrichissement, dômes, tubes, fibres pour faire des nids. Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Une personne compétente (formation en experimentation animale) réalisera les injections des cellules tumorales qui se feront sous anesthésie gazeuse (Sévoflurane). Une observation bi-hebdomadaire des animaux par les expérimentateurs (poids, douleurs/souffrance) sera faite ainsi qu'une surveillance du volume des tumeurs, en plus de leur observation quaotidienne par les animaliers. Toute perte de poids, signe de douleur (analgésiques prévus en cas de nécessité) ou souffrance notable (cardiaque, respiratoire) de l'animal éveillé après anesthesie ou au cours du developpement tumoral constituera un point limite. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs de deux fournisseurs extérieurs.

Choix des espèces

- Facilité d'utilisation en général, espèce athymique (sans thymus) comme modèle in vivo, pour faciliter la mise en place et la prise de tumeurs solides (facilité et maîtrise de l’injection, déficience du système immunitaire), ainsi que pour le suivi de leur croissance. - Modèle d’injection de lignées tumeurs en sous-cutanée bien décrit dans la littérature et déjà utilisé dans le passé par des membres du laboratoire ou membres du projet collaboratif. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de lignées cancéreuses, c’est à dire des souris athymiques « jeunes adultes » âgés de 6 semaines au moment de l’implantation de la lignée tumorale et 10 à 12 semaines au moment du traitement (injection du candidat imagerie) en fonction de la taille des tumeurs.

195 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes d'un candidat médicament, puis sont soumises à des tests de mémoire dont un test d'évitement passif où un stimulus aversif est appliqué à leurs pattes, avant leur mise à mort pour analyser leur cerveau, afin de préciser l'action d'une molécule contre la maladie d'Alzheimer développée par une société. Le porteur situe les retombées avant un éventuel développement clinique. Il affirme que le modèle murin reste "indispensable" pour ces réponses comportementales.

Objectifs

Trouver un traitement contre la maladie d’Alzheimer est aujourd’hui une priorité, notamment parce que les médicaments disponibles s'avèrent d'effet limité et présentent de nombreux effets secondaires invalidants. Suite à au faible niveau de service rendu au patient, les 4 médicaments commercialisés dans la maladie d'Alzheimer ont fait l'objet d'un déremboursement par la sécurité sociale en France. Une société Montpelliéraine développe donc une nouvelle molécule, qui s'avère, dans les modèles animaux précliniques de la maladie, très efficace, plus anti-inflammatoire, sans effet secondaire sur la mémoire et de plus longue durée d'action que les médicaments actuels. Pour préciser la nature de son activité pharmacologique, deux expériences de comportement sont aujourd'hui nécessaires : l'une pour analyser ses effets directs sur la mémorisation, l'autre pour confirmer son action pharmacologique particulière sur un système neuronal particulier.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de préciser les effets pharmacologiques in vivo d'un candidat médicament et apporter des informations importantes avant le développement clinique de cette molécule de nouvelle génération potentiellement efficace pour modifier de façon durable le décours de la maladie, car neuroprotectrice.

Procédures

Les animaux recevront une injection intrapéritonéale (moins d'une minute) des molécules à tester pendant 6 jours lors de l'expérience 1 et pendant de 1 à 12 jours pendant l'expérience 2. Suite au traitement les capacités de mémorisation des animaux seront testées, avec des tests comportementaux qui dure 15 secondes pour le test d'évitement et pour la préférence de place, deux fois 30 minutes pour le conditionnement et 10 minutes pour l'analyse.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés dans ces deux expériences subiront deux types de stress modéré : une ou deux injections intrapéritonéales quotidiennes. Pour l'expérience 1 reposant sur un test d'évitement passif permettant d'évaluer la mémoire à long terme, un stimulus aversif sera administré au niveau des pattes de la souris. Les animaux ont la possibilité de remonter sur la plate-forme pour échapper au stimulus. . Pour l'expérience 2, les animaux sont placés dans une boite à 2 compartiments pendant une session de 30 minutes par jour durant la phase de conditionnement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure et les cerveaux prélevés pour des analyses biochimiques ultérieures.

Remplacement

La molécule est ici testée sur des réponses comportementales spécifiques (phases de mémorisation, dépendance d'état chimique pour le test de préférence de place) au moyen de tests standardisés et très prédictifs. Par exemple, l'ensemble des phases de la mémorisation (acquisition, consolidation, rappel, extinction, reactivation) sera examiné en une seule procédure comportementale au moyen du test d'évitement passif. Les gammes de doses testées seront réduites à 3-4 doses autour des effets anti-amnésiants déjà déterminés dans les études précédentes. L’utilisation du modèle murin reste par ailleurs indispensable car il permet de préciser des réponses comportementales très proches de celles observées chez l'homme.

Réduction

Les molécules sont administrées dans une gamme de doses réduite (généralement 0.3 - 1 - 3 mg/Kg en fonction des résultats antérieurs). Les animaux sont testés sur des tests comportementaux adaptés au paramètre à mesurer (mémoire à long terme non-spatiale pour l'évitement passif et dépendance d'état chimique pour le conditionnement préférentiel de place). Les analyses statistiques sont optimisées aux données générées de façon à limiter le nombre d'animaux par groupe (15 souris/groupe). Ce nombre de 15 souris par groupe a été déterminé de façon empirique mais a été depuis confirmé en analysant nos données antérieures à l'aide de logiciel statistiques.

Raffinement

Les animaux seront reçu une semaine avant le début de l'expérimentation et gardés en groupe de 8-10 individus par grande cage. Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Les traitements pharmacologiques envisagés ont déjà été utilisés et ne sont pas à l’origine de douleur visible ou de détresse. Un examen quotidien sera fait et un formulaire de suivi du bien-être sera complété. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur.

Choix des espèces

Le modèle souris est adapté aux protocoles comportementaux et utilisé dans les expériences antéreiures. Les doses et mode d'administration sont donc connus. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit à partir de 6 semaines. C'est à cet âge que les effets de la molécules ont été caractérisé dans les phase antérieures du projet.