Souris

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Atteintes de mucoviscidose, elles reçoivent des injections de cellules tumorales ou des injections répétées d'uréthane pour induire des cancers, afin d'étudier le sur-risque tumoral lié à la maladie. Le porteur affirme que ses modèles de culture in vitro suffisent pour la majorité des expériences mais qu'une approche sur "organisme entier" reste "nécessaire" pour la tumorigenèse. Il renvoie les développements thérapeutiques à de possibles pistes futures.

Objectifs

Ces dernières décennies, les nouvelles thérapies de transplantation pulmonaire et celles visant à corriger l’expression du gène responsable de la mucoviscidose, ont permis à ces patients de dépasser les 40 ans. L’augmentation de l’espérance de vie des patients a également accentué l’apparition de nouvelles comorbidités associées à cette maladie, dont un risque accru de développer plusieurs types de cancers (cancers digestifs, pulmonaires, cutanés, etc.). Dans ces comorbidités, la composante vasculaire y est affectée mais encore peu étudiée. Néanmoins, nos travaux ont démontré que le gène responsable de la mucoviscidose avait un rôle insoupçonné dans les cellules endothéliales, en promouvant une dysfonction/inflammation endothéliale qui est également impliquée dans les pathologies menant à l’apparition de cancers (ex : obésité, diabète, inflammation chronique de l’intestin). De plus l’expression du gène responsable de la mucoviscidose est souvent réprimée dans de nombreux cancers et un haut taux de ce gène est corrélé à une mauvaise survie des patients. Notre projet vise donc à démontrer l’augmentation de l’incidence de cancer dans un modèle de souris déficiente pour le gène responsable de la mucoviscidose, puis d’expliquer comment une dysfonction des cellules endothéliales serait associée à ce développement tumoral. Nos différents travaux publiés et en cours démontrent l’implication des cellules endothéliales dans ce phénomène, mais dans une optique de transfert vers la clinique requiert le passage dans des modèles animaux vivants qui reproduisent de façon pertinente la physiologie des tumeurs et les réponses immunitaires systémiques associées.

Bénéfices attendus

Les dernières avancées thérapeutiques ont permis aux patients atteints de mucoviscidose de voir leur qualité et espérance de vie augmentées de façon significative. En revanche de nombreuses comorbidités préjudiciables à leur santé sont également apparues. Parmi celles-ci un risque élevé de cancers gastro-intestinaux, qui est maintenant pris en charge par un dépistage précoce chez ces patients. En revanche la cause principale du risque élevé de développer certains cancers n’est pas bien comprise. Grâce à ce projet, l’utilisation de différents modèles tumoraux, et à différents stades de la tumorigénèse, permettra d’ouvrir de nouvelles pistes pour expliquer l’élévation de l’incidence des cancers chez les patients atteints de mucoviscidose, et mettre en lumière de potentiels développements thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales (1 seule injection), ou à des injections intra-péritonéales répétées de traitements (1 injection hebdomadaire pendant 4 semaines). Chaque injection durera une trentaine de secondes, à raison d'un maximum de 4 injections par animal.

Impact sur les animaux

Les données de la littérature sur le modèle d’induction tumorale par injection intra-péritonéale d’uréthane (4 fois par semaine) ne font état d’aucun effet indésirable notoire pour les animaux lorsque ceux-ci sont euthanasiés au cours du 4ème mois suivant la première injection d’uréthane. Néanmoins, l'établissement et la croissance des tumeurs pourra générer des douleurs qui seront détectées précocement grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure.

Devenir

Des prélèvements de tissus seront nécessaires pour les études histologiques de nos procédures. De fait, tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure. De même, les animaux ne pourront être réutilisés car les procédures précédentes pourraient potentiellement introduire une variabilité indésirable sur les prochaines expérimentations.

Remplacement

Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes (sphéroïdes, puces microfluidiques) et de cellules primaires dérivées de patients qui nous permettent de nous affranchir de l'utilisation d'animaux pour une majorité de nos expériences. Grâce à ces modèles nous avons d’ailleurs validé de nombreux aspects qui soutiennent notre hypothèse. L'approche sur organisme entier nous est en revanche nécessaire pour analyser des processus plus complexe et sur le long terme comme la tumorigénèse.

Réduction

Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons. Notre projet nécessitera 168 animaux au total.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en fin de procédure ou d’atteinte d’un point limite. Des points limites adaptés à l’espèce utilisée ont été prévus pour chaque procédure. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants un signalement sera fait au responsable de la SBEA ainsi qu’au responsable de l’étude ou à son suppléant. Les animaux seront alors euthanasiés directement afin de prévenir toute douleur au stade le plus précoce possible et d’éviter la collecte de données altérées en raison d’un stress chez les animaux. •Critères cliniques : - Mauvais état du pelage (diminution du toilettage, perte excessive de poils, plaies) - Faciès contracté et position anormale des vibrisses - Yeux clos et larmoyant - Gonflement abdominal pouvant être causé par l’accumulation de liquide d’ascites en raison des tumeurs - Fèces liquides ou absence de fèces. - Respiration anormalement rapide et synonyme d’une masse tumorale intrathoracique trop importante (dans le cas des tumeurs thoraciques). •Critères comportementaux : - Position recourbée (dos voûté, prostration) - Diminution de la mobilité interférant avec l’activité de base de l’animal (alimentation, toilettage) - Réduction de l’activité, isolement - Signes de stress (hyper-sensibilité aux bruits, agressivité, stéréotypie) •Critères zootechniques : - Perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental.

Choix des espèces

L’objectif principal de notre projet est de déterminer l’impact d’un défaut du gène responsable de la mucoviscidose sur le développement tumoral. Nos précédents travaux publiés ont utilisé le modèle de souris envisagé dans ce projet, et mis en lumière des défaut vasculaires qui pourraient expliquer l’apparition de cancers. De fait, l’utilisation de ce modèle de souris particulier au travers de différents modèles tumoraux nous apparaît pertinente et essentielle pour apporter une preuve solide étayant notre hypothèse. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines (jeunes adultes). Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes ayant un système immunitaire mature

1 584 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur, des prélèvements de sang hebdomadaires et l'injection d'une molécule d'ADN, pour étudier le lien entre microbiote intestinal et efficacité des immunothérapies anticancéreuses. Le porteur décrit une gêne modérée liée aux tumeurs sous la peau et affirme qu'un animal vivant et "entier" est "indispensable" faute de reproduire l'immunité antitumorale in vitro. Il présente un effet possible sur la survie des patients résistants comme une retombée majeure attendue.

Objectifs

Des études ont montré l’impact de la composition du microbiote intestinal sur la réponse aux traitements anticancéreux par immunothérapies. Ces traitements ont la capacité de restimuler le système immunitaire pour éliminer les cellules tumorales. La prise d’antibiotiques en amont de ces immunothérapies participe à la perte d’efficacité de ces traitements. Nous avons vérifié ce phénomène dans différents modèles murins. Ces études nous ont permis de découvrir le mécanisme biologique impliqué dans la perte d’efficacité des traitements au cours d’une dysbiose intestinale suite à la prise d'antibiotiques. Nous avons déterminé que cette prise ou la colonisation intestinale par certaines bactéries induit la perte de l’expression d'une protéine d'intérêt dans l’intestin. L’altération de l’expression de cette protéine conduit donc à une accumulation de ces cellules immunosuppressives dans la tumeur, ce qui empêche la réponse aux traitements. Afin de montrer le lien de causalité entre la présence des cellules impliquées et la perte d’efficacité des traitement d'immunothérapie, nous souhaitons dans un contexte traitement antibiotiqueou par la colonisation intestinale par certaines bactéries être en mesure d’induire une forte expression de la protéine d'intérêt à distance de la tumeur afin de capter certaines cellules d'importance. Nous envisageons donc d’administrer une molécule induisant l’expression la protéine d'intérêt dans le foie. Le rationnel de ce projet est de confirmer l’effet délétère de ces cellules importantes recirculantes au cours d’une modification du microbiote intestinal en forçant leur rétention dans le foie plutôt que dans la tumeur.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons montrer qu’en l’absence de ces cellules d'intérêt d'origine intestinales dans la tumeur, nous sommes en mesure de restaurer l’efficacité des traitements par immunothérapie, malgré le contexte de changement de microbiote intestinal. Cela aurait donc un impact très important sur la survie des patients résistants aux traitements par immunothérapies.

Procédures

Greffes de tumeur: une injection sous anesthésie locale, durée 1 minute. Prélèvements de sang sous anesthésie générale (1 fois/semaine, durée 3 minutes) - Injection du produit (molécule d'ADN d'intérêt) sous anesthésie générale (1 fois, durée 3 minutes), prostration de courte durée suite à l'injection.

Impact sur les animaux

Les contraintes principales pour les animaux seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs, d’administration orale de bactéries et l’injection du plasmide, ainsi qu'une gêne modérée du fait de la présence de tumeurs sous la peau.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvements d'organes (tumeur, foie, intestins, ganglions, rate, ...) pour analyser les tissus, doser des protéines ou de l'ADN. Le maximum de prélèvements sera réalisé pour obtenir le plus de résultats au cours d'une seule expérimentation.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons définis un nombre maximal théorique de 18 animaux par groupe. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes entre eux. Le nombre d'animaux par groupe pourra être diminué à 12 (analyses en cours de procédure) si nous obtenons une résultat statistique. Ce résultat statistique sera basé sur la réduction du nombre de cellules a4b7 dans la tumeur ou leur augmentation dans le foie en présence du plasmide. Enfin, les dernières procédures envisagées se seront réalisées que si les premières procédures donnent les résultats attendus.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être, avec enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi du comportement (prostration, auto-agressions, etc). Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale . Les souris auront un examen clinique quotidien avec pesées. Les points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. - Génétique proche de celle de l’Homme et bien connue - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Animaux à maturité sexuelle, entre 6 et 12 semaines.

Une perte de poids de plus de 15 %, ou de plus de 10 % pendant plus de trois jours, constitue un point limite pour les 25 500 rongeurs de ce projet : 12 500 souris, 12 500 rats, 300 hamsters dorés et 200 gerbilles de Mongolie, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les composés testés, froids ou radiomarqués, leur sont administrés par la bouche, le nez, la trachée, le muscle, la peau, l'abdomen, la veine porte, le cerveau ou la vessie, cette dernière voie après jusqu'à quatre heures de privation d'eau, ou par minipompe implantée par chirurgie. La phase in vivo peut durer jusqu'à 12 mois, avec des jeûnes jusqu'à 16 heures et un hébergement individuel sans enrichissement pour recueillir urines et fèces, afin de mesurer la distribution et l'élimination de composés que le résumé ne nomme pas. Le porteur déclare 10 220 rongeurs réutilisés, et réserve ce maintien en vie à ceux qui n'ont reçu qu'une administration unique de composé non radioactif et sont restés moins d'une semaine en procédure, les autres étant mis à mort pour prélever leurs organes et de grands volumes de sang.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat, hamster, gerbille) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. Ce projet permettra d’une part de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide. Une seconde partie du projet aura recours à la forme radiomarquée de la molécule. Dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations du comité d’éthique. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc., dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, ou des paramètres métaboliques (insulinémie, glycémie) et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem. Dans le cas de l’insulinémie et de la glycémie ou d’autres paramètres métaboliques, une injection de glucose en IP ou SC ou une administration PO pourront être réalisées au préalable des prélèvements sanguins.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.

Procédures

Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par voie: intranasale, intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire, intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte d’1min environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ 1h); injection intraportale ou minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ 1h). Les implants pourront être retirés au plus tôt une semaine plus tard (chirurgie d’environ 15min, anesthésie d’environ 1h). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’1h) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Pour les administrations orales où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h,Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit non radioactif et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vis sur avis du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous attendons n’attendons pas d’effets indésirables particuliers chez les animaux. Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité (diarrhée, perte de poids, douleur, signes neurologiques), ce qui sera surveillée. Une douleur transitoire modérée pourrait être générée par les chirurgies. Un stress de courte durée et une douleur légère sera générée par les administrations de produit. Les mises à jeun pourraient générer un stress léger et une déshydratation légère.

Devenir

Les animaux seront la plupart du temps mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés. Les animaux ayant reçu une administration unique de composé non radioactif et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Des analyses statistiques seront réalisées sur les paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement et une de l’alimentation et de l’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. • Entre 10 et 15% du poids : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA et le comité d’éthique (document de référence) sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les administrations intracérébrales, intrathécales, intravésicales, intraportales, les prélèvements de liquide cérébrospinal et les poses et retraits de mini-pompes osmotiques ou d’un implants seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire (buprénorphine au moins 30 minutes avant). Pour les pompes et implants, les animaux seront hébergés individuellement et suivis quotidiennement le temps de la cicatrisation de la plaie suturée (en général 3-4 jours) et des soins locaux seront apportés si nécessaire. Les administrations IM et ID seront réalisées après administration d’un analgésique (buprénorphine).

Choix des espèces

Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Pour certaines études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.

Toutes les souris subissent une chirurgie d'environ 15 minutes destinée à provoquer des microhémorragies disséminées dans tout le cerveau, par des cyclodextrines à forte dose qui ouvrent la barrière hématoencéphalique en "érodant" les membranes cellulaires, puis une IRM de 30 minutes sous anesthésie sept jours après l'injection. Les 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont des souris de lignées hémophiles ou atteintes de la maladie de von Willebrand, pour observer si leurs microhémorragies se transforment en hémorragie cérébrale. Le porteur présente l'hémorragie intracérébrale comme "le type d'Accident Vasculaire Cérébral (AVC) le plus dévastateur", et n'envisage chez les souris opérées qu'une possible "gêne" : perte d'appétit, de motivation, anxiété accrue. Toutes sont mises à mort à la fin de la procédure, et leur cerveau est prélevé pour des analyses histologiques et immunohistochimiques.

Objectifs

Notre projet repose sur l'utilisation d'un modèle pré-clinique de microhémorragies cérébrales (MHC) disséminées dans tout le cerveau du rongeur, modèle se rapprochant ainsi des cas cliniques retrouvées dans certaines maladies neurodégénératives. Ce modèle repose sur l’utilisation de cyclodextrines (CD) qui, à forte dose, ouvrent les barrières biologiques comme la barrière hématoencéphalique (BHE), en « érodant » les membranes cellulaires endothéliales jusqu'à obtenir des MHC disséminées. Ce modèle a été validé chez la souris. Les MHC sont des constructions radiologiques qui se présentent sous la forme de foyers hypointense visibles et qui sont prédicteurs d'une future hémorragie intracérébrale (HIC), le type d'Accident Vasculaire Cérébral (AVC) le plus dévastateur sans traitement validé à ce jour. Le but de ce projet est d'évaluer dans quelles mesures les troubles hémostatiques influencent l'incidence des MHC et leur transformation en HIC. L'existence d'un trouble hémostatique favorise-t-il la transformation en macro-saignement? Par quels mécanismes? Les anomalies hémostatiques congénitales telles que l'hémophilie et la maladie de von Willebrand sont des situations uniques, dans lesquelles l'HIC est fréquente et dévastatrice. Grâce à l'utilsation de lignées murines d'hémophilie et de maladie de Von Villebrand, nous explorerons la transformation potentielle des MHC en HIC et étudierons le rôle de ces défauts hémostatiques sur la réponse inflammatoire autour du saignement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l'influence de troubles de l'hémostase (défaut de coagulation ou de l'hémostase primaire) sur la fréquence et la taille des MHC, ainsi que les mécanismes impliqués dans leur transformation en HIC, notamment sur la réponse inflammatoire autour du saignement. L'identification des facteurs prédictifs d'une future hémorragie cérébrale est de la plus haute importance chez les personnes atteintes de graves déficiences hémostatiques et peut conduire à une modification du régime de traitement préventif des patients, et peut aussi, en cas d'HIC, leur permettre de bénéficier de traitements innovants pour lesquels ils sont actuellement exclus par principe de précaution. A partir d'un scénario plutôt caricatural d'une maladie génétique rare, ces nouvelles connaissances peuvent également profiter à tous les patients présentant d'autres anomalies hémostatiques (par exemple les personnes traitées par anticoagulants oraux).

Procédures

Tous les animaux subiront la chirurgie permettant d'induire les MHC (environ 15 min par intervention), ainsi qu'une IRM à 7j de l'injection (chaque IRM dure 30 min).

Impact sur les animaux

L'induction des MHC chez les animaux se fait par une chirurgie réalisée sous anesthésie. Malgré nos précautions, il se peut que que cela entraine une gêne chez l'animal à plus ou moins long terme (perte d'appétit, de motivation, augmentation de l'anxiété). De même, les animaux subiront une IRM nécessitant une anesthésie non invasive sous isoflurane pouvant entrainer un stress et un mal-être chez l'animal mais qui reste proche de l'induction et dont les effets sont minimes et à court terme. La mise en place d'une surveillance rapprochée et de points limites permettra de limiter au maximum ces gènes potentielles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Le cerveau sera ensuite prélevé dans le but de réaliser des études histologiques et immunohistochimiques.

Remplacement

L’expérimentation proposée vise à comprendre les mécanismes impliqés dans la survenue de MHC dans un contexte de troubles hémostatiques Il s’agit de l’étude d’un modèle physiopathologique intégré faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux mécanismes donc la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro.

Réduction

L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 450 animaux. Le nombre minimal nécessaire d'animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats (différences statistiquement observables entre les animaux traités et les animaux contrôles). Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l'analyse en pharmacologie.

Raffinement

Dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une vigilance particulière sera réalisée sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique, ou seront mis à mort dans une salle dédiée. La structure BEA (Bien-Etre Animal) ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin. Les conditions d'hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression, humidité de l'air) et de l'enrichissement dans les cages.

Choix des espèces

Le retentissement des conséquences neurologiques induites par cette ces procédures varie en fonction des espèces choisies. En accord avec ces données de la littérature et surtout afin de stabiliser la reproductibilité des lésions cérébrales contribuant à terme à réduire le nombre d’animaux opérés, nous avons choisi des souris C57bl6 homozygotes stables. Le choix de cette espèce de rongeurs repose sur les recommandations STAIR et est adapté à l’évaluation expérimentale. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 4 mois, âge nécessaire pour permettre la mise en place des troubles hémostatiques.

1 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, un suivi de la croissance tumorale trois fois par semaine au pied à coulisse et des injections de traitements, pour étudier l'épuisement des lymphocytes T face aux tumeurs. Le porteur indique que la croissance tumorale et les injections peuvent provoquer stress et douleurs de courte durée. Il affirme que la complexité de l'étude des tumeurs interdit de la reproduire in vitro et espère identifier des cibles pour surmonter la résistance aux immunothérapies.

Objectifs

Chez l’homme, les réponses immunitaires développées contre les cancers sont souvent insuffisantes. Cela est notamment dû au développement d’un épuisement des réponses immunitaires. Ce phénomène est en partie lié à l’expression par les lymphocytes T de protéines bloquant leurs fonctions, aussi appelés «points de contrôle ». Depuis une dizaine d’années, le développement de traitements dirigés contre ces points de contrôle a permis d’améliorer considérablement le pronostic de certains cancers. Malheureusement, seule une fraction des patients répond à ces traitements. Certaines molécules sécrétées en contexte inflammatoire contribuent au développement d’un épuisement des réponses immunitaires, notamment via la baisse d'expression d'une protéine aux fonctions multiples. L'objectif est d'identifier les molécules de l'inflammation responsable de cet épuisement, ainsi que les acteurs associés afin d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles permettant d'améliorer l'efficacité des traitements existants.

Bénéfices attendus

Au terme de ce projet, nous pourrons déterminer si le traitement testé pourrait avoir une efficacité anti-tumorale. De plus, nous espérons que ces nouveaux traitements permettent de rattraper une résistance éventuelle aux thérapies existantes.

Procédures

Injection sous-cutanée de cellules tumorales (30 secondes/injection/souris). Mesure trois fois par semaine de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse pendant 3 semaines environ (1 minute/mesure/souris). Pour certains animaux seulement, injection intrapéritonéale de un ou deux traitements (30 secondes/injection/souris) pendant 4 à 5 injections espacées de 3 jours, soit 15 jours de traitement au total.

Impact sur les animaux

Les injections sous-cutanées peuvent entraîner une douleur légère de courte durée. Les injections par voie intrapéritonéale peuvent entraîner un stress et une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peut également induire un stress de courte durée chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de prélever les organes pour analyser les cellules immunitaires et l'expression de plusieurs protéines d'intérêt.

Remplacement

La complexité inhérente à l'étude des tumeurs ne permet pas de récapituler les évènements immunologiques impliqués dans des systèmes in vitro, obligeant à utiliser l’expérimentation animale. Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et en se basant sur des données publiées de la littérature.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie, et minimum trois fois par semaine par le responsable du projet. Des mesures pour remédier à la souffrance seront mises en œuvre si nécessaire (mise à mort et analyse des animaux).

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de différentes voies de signalisation dans le développement tumoral. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier l’impact des traitements sur le développement tumoral.

530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de deux formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, elles reçoivent des injections de vecteurs viraux dans la moelle épinière ou les muscles des pattes arrière, puis passent des tests locomoteurs nommés rotarod, gait, Von Frey et grip, pour évaluer une thérapie génique. Le porteur décrit des injections à faibles effets et une classification modérée liée au cumul du phénotype et des tests. Il renvoie les retombées cliniques au conditionnel et au long terme, et affirme que seuls des modèles souris permettent d'établir la preuve de concept.

Objectifs

Ce projet a pour but de tester des approches de thérapie génique sur des modèles souris de la maladie de Charcot Marie Tooth (CMT). Il s'agit notamment de déterminer l'effet bénéfique d'injection ciblée de vecteurs viraux médicaments exprimant un gène thérapeutique.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si les approches de thérapie génique proposées ont un effet bénéfique pour améliorer ces deux formes de Charcot Marie Tooth (CMT). Il s'agit d'une étude préclinique qui permettra, en cas de bénéfices thérapeutiques, d'établir la preuve de concept de l'efficacité de ce type d'approche de thérapie génique ciblée pour la maladie de Charcot marie tooth (CMT). A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT et déboucher sur des essais cliniques pour les patients atteints de CMT.

Procédures

L'ensemble des animaux (n=530) subiront des injections ciblées au niveau de la moelle épinière ou dans les muscles des pattes arrières. Ces interventions sont de courte durée (de l'ordre de 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les deux types d’injections se feront sous courte anesthésie gazeuse. Ces injections seront réalisées au moyen de fines seringues à insuline et ne nécessite pas d’incision de la peau ou du muscle au préalable. En se basant sur notre expérience et celle de nos collaborateurs ,ces injections entrainent peu d'effets indésirables. Nous espérons notamment retarder voire prévenir l'apparition des symptômes grâce à l'approche thérapeutique que nous proposons. Néanmoins, elles peuvent occasionallement induire une inflammation locale ou légères irritations et ainsi un léger inconfort qui sera surveillé dans les jours suivants l’intervention. Par la suite, les fonctions locomotrices de ces souris seront évalués au cours du temps au moyen de 3 ou 4 tests permettant d'analyser la démarche de la souris tels que le rotarod et le gait, la sensibilité de ces pattes avec le test VonFrey ou encore la force de ces muscles avec le test du grip. Ces tests entrainent peu d’inconfort aux souris. L’ensemble de ces tests pour un stade donné, seront effectué sur 3 ou 4 semaines afin de ne réaliser qu’un test par semaine et assurer une récupération aux animaux. Une grille de score sera utilisée pour évaluer différents critères (poids, apparence, comportement général, blessure etc.) rendant compte de l'état de santé général de l'animal. La classification modérée des procédures prend en compte le cumul du phénotype de la souris CMT et des injections et tests effectués chez ces animaux.

Devenir

A l'issu des études comportementales l'ensemble des animaux seront euthanasiés afin de déterminer l'effet bénéfique des thérapies proposés au niveau cellulaire sur les tisssus atteints dans la pathologie de Charcot Marie Tooth (CMT) (diminution de la dégénérescence axonale, réduction des défauts de myéline, etc.).

Remplacement

Il est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann) et particulièrement les cellules de Schwann qu'il est impossible de différentier à partir de cellules pluripotentes humaines. Ainsi seuls des modèles souris nous permettent à l'heure actuelle d'établir la preuve de concept des thérapies que nous proposons pour envisager par la suite un essai thérapeutique chez l'homme

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion, force musculaire et vitesse de conduction nerveuse. De plus il s'agit d'une étude longitudinale c'est-à-dire que les mêmes groupes d'animaux seront suivis à différents stades (3,6 et 12 mois) afin de suivre à long terme l'effet bénéfique des thérapies

Raffinement

Afin d'améliorer le bien être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture à volonté, enrichissement (maisonnette et sizzle pad), stabulation en petit groupe, analgésiques avant et après injection ainsi que réalisation des expériences sous anesthésie. Des points limites seront définis et les animaux seront mis à mort lorsqu'ils atteindront le critères d'interruption.

Choix des espèces

La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont identiques). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neurodégénératives ou neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, les lignées utilisées pour la CMT2A et la CMT4H reproduisent de manière progressive (entre 6 mois et 1 an) la majorité des anomalies cellulaires et comportementales, observés chez ces patients telles que une dégénérescence axonale, des défauts locomoteurs et des anomalies de myéline.

1 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de tamoxifène et une alimentation à la doxycycline, après une biopsie digitale pratiquée dès l'âge de 7 à 10 jours pour les génotyper, afin de suivre le devenir des noyaux des cellules musculaires marqués par fluorescence. Le porteur ne décrit comme nuisance que la biopsie et affirme que le tamoxifène ne fait pas plus mal qu'une injection d'anesthésique, sans détailler d'autre atteinte pour une gravité classée modérée. Il conclut que ces conditions ne peuvent pas être reproduites in vitro et que seule la souris permet cette étude.

Objectifs

L'homéostasie tissulaire est maintenue par la génération de nouvelles cellules et la perte de cellules existantes. La génération de nouvelles cellules est généralement assurée par les cellules souches des tissus, qui se divisent continuellement et dont les cellules filles se différencient en cellules matures. Les cellules musculaires ont un défi très particulier à relever pour maintenir l'homéostasie tissulaire car elles possèdent des centaines de noyaux dans un cytoplasme partagé. En outre, les noyaux musculaires se différencient pour remplir des fonctions spécialisées, comme les cellules mononucléées différenciées des tissus ordinaires. Lorsque les cellules souches musculaires se divisent, des cellules filles fusionnent avec une cellule musculaire existante pour former de nouveaux noyaux. Malgré cette propriété intrigante, nous ne connaissons pas le sort des noyaux des cellules souches musculaires et des noyaux musculaires existants : que deviennent les noyaux musculaires nouvellement fusionnés ? quelle est la cinétique de la perte des noyaux musculaires pour chaque sous-type nucléaire spécialisé ? Dans ce projet, nous voulons répondre à cette question en marquant les noyaux des cellules souches et des muscles avec des protéines fluorescentes et en suivant leur devenir.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet donneront un tout nouvel aperçu de la façon dont nous pensons à l'homéostasie des tissus musculaires. Ceci, à son tour, aura un large impact sur la compréhension des maladies musculaires ou des mécanismes de l'exercice.

Procédures

Le groupe expérimental d’animaux A recevra une injection intrapéritonéale (IP) de tamoxifène par jour pendant 5 jours. Le groupe B sera nourrit avec une alimentation contenant de la doxycycline pendant 1 mois. Et le groupe C sera nourrit avec une alimentation contenant de la doxycycline pendant 1 mois puis recevra une injection IP de tamoxifène par jour pendant 5 jours et continuera d’avoir une alimentation contenant de la doxycycline. Les injections IP sont faites très rapidement en quelques secondes. Tous ces animaux auront été préalablement identifiés et génotypés par le prélèvement d’une biopsie digitale à l’âge de 7 à 10 jours. Cet acte est très rapide, il ne dure que quelques secondes.

Impact sur les animaux

La seule nuisance attendue est celle provoquée par le prélèvement de biopsie digitale pour l’identification et le génotypage : Il s'agit d’une procédure très rapide qui prend moins d'une minute par animal et qui sera faite très tôt sur les animaux âgés de 7 à 10 jours par du personnel qualifié. Les souris seront remises dans leur cage après l'expérience où elles seront surveillées pendant leur rétablissement. L'alimentation à la doxycycline est supposée ne provoquer aucune gêne. L’injection intrapéritonéale de tamoxifène ne sera pas plus douloureuse qu’une injection intrapéritonéale d’anesthésique qui correspond à la douleur causée par l’aiguille.

Devenir

Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçerons pas et ne ferons pas adopter les animaux.

Remplacement

Notre projet porte sur la dynamique cellulaire entre les myofibres et les cellules souches musculaires et nécessite la présence des cellules souches musculaires, des myofibres, des tendons (pour la JMT) et des motoneurones (pour la JNM) fonctionnels dans des conditions physiologiques normales. Ces conditions ne peuvent pas être reproduites actuellement in vitro, ce projet ne peut être étudiée que chez des animaux vivants.

Réduction

Nous prendrons des mesures permettant de minimiser le nombre d'animaux utilisés. 1. Dans un premier temps des analyses histologiques approfondies seront effectuées pour déterminer à quels périodes après la dernière injection IP de tamoxifène ou après un mois sous doxycycline réaliser le séquençage d’ARN de noyaux uniques. 2. Nous collecterons tous les tissus musculaires pertinents de chaque souris.

Raffinement

L’alimentation à la doxycycline est supposée ne provoquer aucune gêne et les injections IP de tamoxifène ne seront pas plus douloureuse qu’une injection IP d’anesthésique qui correspond à la douleur causée par l’aiguille. Aucune mesure particulière n’est jugée nécessaire. Néanmoins d’une manière générale, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère, dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente, dans ce cas un analgésique sera administré à la souris et elle sera sous surveillance. Niveau 3 : douleur intense, dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront surveillés régulièrement. Ils seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Les souris seront surveillées régulièrement et plus particulièrement après les injections IP de tamoxifène. Le suivi de nos souris comprend une observation du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés).

Choix des espèces

Nous utiliserons plusieurs stratégies de marquage des lignées pour suivre le devenir des noyaux des cellules musculaires et des noyaux des CSM. Tous ces marquages ont été développés dans des modèles de souris et nécessitent la création de lignées mutantes. La souris est donc le meilleur choix pour mener cette étude. Comme notre projet porte sur la régulation de la dynamique cellulaire dans le muscle mature, nous devons utiliser des souris dont le développement est terminé. Par conséquent, l'âge de 10 semaines (avant administration de doxycycline et injection de tamoxifène) est l’âge le plus approprié.