Souris

6 900 animaux non-humains, 4 200 souris, 1 800 rats et 900 cobayes, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont sensibilisés à l'ovalbumine et au pollen d'ambroisie, puis reçoivent des gouttes oculaires et des injections répétées, pour tester des substances contre la conjonctivite allergique. Le porteur indique que le nouveau contact avec l'allergène provoque un gonflement de la conjonctive, une hyperémie et un larmoiement, et que des nodules peuvent apparaître au site d'immunisation. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit l'œil dans sa globalité et conclut à la nécessité de recourir à ces animaux.

Objectifs

Comme l’allergie respiratoire, l’allergie oculaire est associée à une hypersensibilité allergique de type immédiat. Elle concerne essentiellement les conjonctivites allergiques bégnines c’est-à-dire la conjonctivite allergique saisonnière et la conjonctivite allergique péri-annuelle. Cette hypersensibilité concerne aussi pour partie les conjonctivites sévères compliquées de kératite comme la kératite conjonctivale vernale et la kératite conjonctivale atopique. Les allergènes responsables sont des pneumallergènes, aussi responsables de symptômes respiratoires, tels que les acariens ou les pollens ainsi que des trophallergènes comme l’arachide ou le blanc d’œuf. Ce projet a pour but de contribuer au développement de nouveaux traitements médicaux en permettant d’identifier et de tester l’efficacité de substances thérapeutiques visant à diminuer l’effet des allergènes dans la conjonctivite allergique. Dans ce cadre, nous proposons de mettre en place un protocole de sensibilisation à deux antigènes (l’ovalbumine et le pollen d’ambroisie) chez la souris, le rat ou le cobaye. Dans un second temps, nous testerons différents types de traitements.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.

Procédures

Les procédures expérimentales nécessitent l'administration de différents produits par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale (anesthésies). Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements de sang se feront par ponction et dureront moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Après un nouveau contact entre l'allergène et l'organisme « sensibilisé » par une précédente exposition, les nuisances attendues se manifesteront au niveau local par un gonflement de la conjonctive accompagné d'une hyperémie et d'un larmoiement. Au niveau du site d'immunisation, une réaction inflammatoire avec potentiellement la présence de nodules sous-cutanés peut être observée. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une gêne transitoire de courte durée.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre des réalisés les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosages...).

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents. Il est de plus soumis à d'importantes variations environnementales mécaniques et physicochimiques, ainsi qu'à d’importantes interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans sa globalité fonctionnelle et environnementale. C'est pour cela que l’utilisation d’animaux vivants dans ces procédures expérimentales sont nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger. Si la procédure expérimentale le permet un abri sera ajouté. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent l’immobilité de l'animal pourront être réalisés pour son confort sous anesthésie légère. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des cobayes ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les rongeurs ont minimum 6 semaines au début de l’étude, les cobayes 8 semaines. Ce qui correspond à de jeunes adultes ayant atteint leur maturité de développement oculaire comme il convient au modèle.

321 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation cérébrale sous anesthésie et une administration intranasale, puis passent des tests de mémoire et de locomotion et des échodopplers répétés sur six mois, avant euthanasie pour prélever leurs structures cérébrales. L'objet est de tester des vésicules issues de cellules souches contre les troubles cognitifs qui suivent une radiothérapie du cerveau. Le porteur indique que les transports entre établissements peuvent stresser et amaigrir les animaux, et juge le modèle in vivo incontournable.

Objectifs

La radiothérapie dans le traitement des tumeurs cérébrales peut conduire à la mort de cellules non tumorales comme les cellules constituant les vaisseaux sanguins et les neurones. En effet, 50% à 90% des patients traités par radiothérapie pour des tumeurs du cerveau présentent dans les 6 mois après leur traitement des troubles neurologiques avec des troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes. De nouveaux traitements permettraient d’améliorer la qualité de vie des patients. Dans ce projet, nous allons évaluer l’efficacité thérapeutique des vésicules extracellulaires issues de cellules souches mésenchymateuses (CSM) pour limiter les impacts de la radiothérapie. Les CSM sont un type de cellules souches très utilisé en médecine dite régénérative. Elles ont la capacité de se renouveler pour créer des cellules spécialisées capable de réparer la fonction d’un organe. Elles sont prélevées chez une personne à partir de la moelle osseuse ou de la graisse corporelle. Elles sont mises en culture puis administrées à l’homme. Cependant, cette stratégie thérapeutique cellulaire a ses limites telles que la transplantation autologue (prélèvement et administration chez la même personne) des CSM. Cette technique limite le nombre de patients pris en charge en raison du temps nécessaire à la mise en culture des CMS. On note surtout une efficacité diminuée en fonction de l’âge et de facteurs de risques associés (hypertension, cholestérol). Les cellules peuvent être aussi inutilisables si elles ont été irradiées lors du traitement par radiothérapie. Des études ont démontré que l’effet thérapeutique des CSM serait majoritairement lié à des vésicules extracellulaires (VE) qu’elles sécrètent. Elles sont produites en grand nombre par les CSM suite à leur activation par des facteurs stimulants. Une production de VE in vitro permet de s’affranchir des limites liées à l’utilisation des CSM via le patient. Les VE sont stockées et conservées sous forme lyophilisée simplifiant leur administration. Les VE permettent de limiter la destruction des vaisseaux sanguins (qui est observée après exposition aux rayonnements ionisants) et pourraient donc limiter le développement des troubles cognitifs. Dans le cadre de ce projet, la mesure du flux sanguin cérébral sera réalisée de façon non invasive dans un autre établissement possédant expertise et équipement adaptés .

Bénéfices attendus

Les bénéfices que ce projet pourrait apporter sont multiples tels que : -une nouvelle thérapie non-invasive -une réduction des troubles cognitifs (troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes) -une amélioration de la qualité de vie des patients vis-à-vis des troubles cognitifs

Procédures

Aucune chirurgie. Prélèvement sanguin 1 fois sous anesthésie avant euthanasie, durée du prélèvement sanguin 15 secondes. Perfusion intracardiaque sous anesthésique, durée 15 minutes. Irradiation cérébrale sous anesthésie: 10 min.Administration intra-nasale sous anesthésie : environ 5 min par administration, 1 seule administration. Les animaux subiront plusieurs fois les interventions qui suivent à différents temps. Tests comportementaux 3 à 10 min (mémoire, locomotion) réalisés 4 fois sur une période de 6 mois): Analyse echodoppler 1 fois par mois sous anesthésie : 10 min.

Impact sur les animaux

Pour les irradiations, les animaux étant anesthésiés pour limiter les mouvements, il peut y avoir un effet des anesthésies répétées et les effets potentiels de l’anesthésie sur les variables physiologiques. Pour les administrations, même si les animaux sont légèrement anesthésiés, il est possible de noter un inconfort transitoire après l’administration. Pour les transports, il peut être noté un stress chez les animaux suite aux changements des conditions environnantes. Après irradiation, un animal peut développer des difficultés à se déplacer et/ou une apparence extérieure piloérection, dos rond ou amaigri Après injection nasale, les effets indésirables peuvent être un écoulement nasal important et/ou une tête penchée, difficultés à se déplacer, amaigrissement Le transport des animaux peut également conduire à du stress et de l’angoisse conduisant à un amaigrissement

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements des structures cérébrales.

Remplacement

Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles précliniques (modèles animaux). En effet, lors des demandes d’Autorisation de mise sur le marché (AMM) ou des médicaments de thérapie innovante auprès de l’ANSM les études précliniques (modèle rongeurs, porcins ou primates) sont demandés. De plus, les modèles in vitro (culture isolée de cellules en boîte de pétri) ne permettent pas d’évaluer le réseau vasculaire ni les troubles cognitifs. Par conséquent l’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour valider notre approche thérapeutique.

Réduction

Les modèles d’expérimentation animale présentent une certaine variabilité de réponse. De plus le retour d’expérience des médecins, chercheurs et biostatisticiens déterminent qu’un nombre de 12 ou 15 animaux dans chaque groupe expérimental est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes afin de valider notre nouvelle thérapie.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera réalisé par les personnes compétentes impliquées dans ce projet, afin d’appliquer les points limites pour réduire la souffrance des animaux. De plus, lors de leur transport, les animaux seront placés dans des boites avec sciure, coton et gel qui remplace l’eau et les croquettes (4 animaux par boites de transport, nous ne mélangeons pas les groupes d’animaux). Si un animal présente des signes de souffrance, son euthanasie anticipée sera réalisée.

Choix des espèces

Nous avons déjà démontré dans différents modèles murins soumis aux rayonnements ionisants l’efficacité thérapeutique des VE-CSM dans les processus de néovascularisation et la réparation tissulaire. Pour cette étude nous utliserons un modèle pré-clinique murin à l’age de 8 semaines. Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge qui pourrait modifier les paramètres étudiés. Enfin, nous maîtrisons, chez la souris, les techniques et les équipements afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires (anticorps) et cognitifs indispensable pour démontrer l’efficacité de notre traitement. L’utilisation d’un modèle in vivo est aujourd’hui incontournable pour développer et proposer des thérapies innovantes. En effet, lors des demandes d’Autorisation de mise sur le marché (AMM) ou des médicaments de thérapie innovante auprès de l’ANSM les études précliniques (modèle rongeurs, porcins ou primates) sont demandés.

1 576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules tumorales issues de patients, puis des traitements par gavage, dans l'eau de boisson ou par voie intrapéritonéale, avec une imagerie hebdomadaire, avant sacrifice pour analyser l'infiltration tumorale. Le porteur indique que l'injection de cellules tumorales peut provoquer une perte de poids rapide et une hépatite, et vise à tester des traitements contre un lymphome intestinal compliquant la maladie cœliaque. Il affirme que la réponse des cellules malignes ne peut être reproduite in vitro.

Objectifs

La maladie coeliaque est une maladie intestinale inflammatoire fréquente induite par l’ingestion de gluten un protéine présente dans les farine (blé, orge, seigle). Une complication rare mais sévère est l’émergence de lymphomes intestinaux chez des patients ne répondant pas au régime sans gluten. L'accumulation de lymphocytes intestinaux peut donner naissance, chez certains patients coeliaques à un lymphome intestinal aussi appelé maladie coeliaque réfractaire de type II. Les cellules formant le lymphome contiennent des mutations hautement récurrentes augmentant l'activité d'une enzyme et/ou d'un facteur de transcription ainsi qu’un spectre de complémentaire d’autres mutations. Notre hypothèse est que ces mutations confèrent un avantage dans l’environnement intestinal inflammatoire des patients coeliaques. Le clone de cellules mutées pourrait ainsi s’expandre aux dépends des cellules normales et aboutir à un lymphome intestinal. Ce lymphome évolue initialement à bas bruit mais peut dans 40-50% des cas évoluer vers un lymphome invasif de très mauvais pronostic. Un objectif important est la mise au point de traitements capables d’éliminer les cellules mutées précocement avant l'aggravation de la maladie. Il semble en particulier important de tester les inhibiteurs spécifiques de l'enzyme et du facteur de transcription muté. Néanmoins la présence d’un nombre important de mutations additionnelles expose au risque de résistance des cellules au traitement. Notre but est de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques dans un modèle de souris obtenu par injection de lignées cellulaires malignes issues des biopsies intestinales de patients atteints de maladie coeliaque réfractaire de type II. Nous chercherons à évaluer leur efficacité sur le développement tumoral mais aussi le risque de sélection de cellules tumorales résistantes aux traitements, ceci afin d’évaluer les bénéfices et risques des traitements pour les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de tester l’efficacité des différentes molécules ciblant les voies de signalisations impliquées sur le développement des cellules tumorales et de tester un possible échappement. Seules des drogues déjà autorisées en clinique humaine seront utilisées, suggérant qu’il n’y aura pas de toxicité excessive. A terme, ce projet pourrait permettre de développer des traitements permettant de prévenir ou stopper le développement de lymphomes chez les patients coeliaques.

Procédures

Injection de cellules tumorales de patient (réalisée sur 1576 souris) : Les lignées cellulaires humaines transduites ou non seront injectées par voie intraveineuse rétro-orbitaire avec des seringues menues d’aiguilles à insuline(durée de l’injection : 5 secondes). Administration de traitements (réalisé sur 1176 souris) : - un traitement délivré en per os dans l’eau de boisson tous les deux jours (réalisé sur 294 souris) (durée de l’injection : 5 secondes) - deux traitements administrés par gavage oral tous les jours à l’aide d’une aiguille de gavage d (réalisé sur 588 souris) (durée de l’injection : 5 secondes). - un traitement administré par voie intra-péritonéale deux fois par semaine (réalisé sur 294 souris) (durée de l’injection : 5 secondes). Imagerie intra-vitale (réalisée sur 616 souris) : Les souris seront imagées à l’aide de l’IVIS spectrum 1 fois par semaine depuis l’injection des cellules tumorales jusqu’au sacrifice. Le temps d’imagerie dépend de la puissance du signal mais ne dépasse pas 30 min par animal.

Impact sur les animaux

Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles sont inclus les animaux est modéré. Les souris génétiquement modifiées que nous souhaitons utiliser ne présentent pas de phénotype dommageable dans nos conditions d'utilisation. L'injection de cellules tumorales humaines est succeptible d'entrainer une perte de poids rapide ainsi qu'une hépatite.

Devenir

Les animaux seront tous sacrifiés à la fin de chaque procédure afin d'analyser l'infiltrat de cellules tumorales dans les différents organes (rate, foie, sang, rein et intestin).

Remplacement

La réponse de cellules malignes à un traitement est un mécanisme complexe qui ne peut être récapitulée in vitro. Nous avons dans un premier temps utilisé des cultures primaires in vitro pour cerner les drogues d’intérêt, nous permettant de réduire fortement l’utilisation d’animaux. Les cellules de patients étant fragiles et difficiles à cultiver in vitro, l’utilisation de modèle murin nous permettra de les amplifier dans un contexte riche en IL-15 afin de tester plusieurs stratégies thérapeutiques et de déterminer les effets de ces molécules sur les cellules transformées et d’évaluer le risque d’échappement tumoral favorisant leur progression vers des lymphomes invasifs.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible en tenant compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse, incluant pour chaque série d’expériences le nombre nécessaire de contrôles et de la nécessité de reproduire les résultats. Le nombre de 5 souris/lot est choisi pour permettre les analyses statistiques. Afin de limiter le nombre de souris, la viabilité cellulaire sera quantifiée avant toute injection pour optimiser la prise de greffe.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages adaptées aux rongeurs, mâles et femelles séparés, et le nombre d’individus par cage limité entre 2 et 5 individus pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes d'agréssion ou de stress engendrés par une population trop importante. Nous serons aussi très attentifs au bien-être des animaux. Nous veillerons à l’enrichissement de l’environnement par la mise à dispositionde boules de coton, de maisonnettes en carton, de bâtonnets à ronger et d’un tunnel. La surveillance du bien-être des animaux sera assurée au quotidien par le personnel de l’animalerie et hebdomadaire par les expérimentateurs. Les expériences et en particulier l’injection de cellules seront réalisées par des personnes expérimentées et qualifiées afin d'éviter toutes fausses manipulations ou un éventuel stress pour les animaux. Les procédures d’injection sont peu douloureuses mais l’utilisation d’anti-inflammatoires ou analgésiques pourrait compliquer l’interprétation des résultats sur la progression tumorale. Les animaux seront alors particulièrement surveillés lors de ces procédures. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux souris, les prélèvements de sang se dérouleront sous anesthésie locale avec de la tétracaïne et les injections de cellules malignes humaines sous anesthésie générale . Le réveil se déroulera dans un environnement calme et silencieux. Des points-limite ont été établis, consuisant à la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera surveillé de façon quotidienne et selon la progression des symptômes observés via une grille d’évaluation, la prise de greffe et les variations de poids corporel.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes constituent un modèle d’étude reconnu pour la réalisation de greffes humaines. L’expression d'un facteur de croissance humain que nous savons indispensable à l’expansion des cellules malignes in vitro et qui assurera l'expansion des cellules de patients après injection chez la souris immunodéficiente. Les souris utilisées seront des souris adultes d’environ 8 semaines.

1 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des immunisations uniques ou répétées par diverses voies, jusqu'à trois sites par jour, avec prélèvements sanguins et anesthésies multiples, avant euthanasie pour prélever leurs organes. L'objet est de vérifier que des candidats vaccins déclenchent une réaction immunitaire avant des essais d'efficacité ultérieurs. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne modélise l'immunogénicité d'un produit dans un organisme entier vivant.

Objectifs

Selon l'OMS, en 2017, les maladies infectieuses sont responsables dans le monde de 17 millions de décès par an, soit un tiers de la mortalité et 43 % des décès dans les pays en voie de développement (contre 1 % dans les pays industrialisés). Les maladies infectieuses recouvrent un large spectre de pathologies bénignes comme le rhume ou l’angine, mais également très graves comme l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine, les hépatites, le paludisme, la tuberculose, etc. Si la recherche a permis l’éradication de certaines d’entre elles grâce à la mise au point de vaccins spécifiques et des antibiotiques, il reste encore beaucoup de chemin à parcourir pour que toutes ces pathologies soient traitées. Dans le cas du développement d'un vaccin anti-infectieux, il convient de s'assurer que le candidat vaccinal permet d'induire une réaction immunitaire spécifique chez l'animal sain après injection, permettant le développement d'anticorps spécifiques contre la pathologie visée, avant la réalisation d'études d'efficacité (challenge vaccinal). Il n’existe pas de méthode alternative à l’heure actuelle permettant de modéliser de manière fiable l'immunogénicité d'un produit injecté dans un organisme vivant. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire à l’objectif de ce projet. Ce projet a pour objectif de caractériser l'immunogénicité de candidats vaccins après administration chez la souris. Plusieurs études pourront être réalisées pour répondre à cet objectif.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de sélectionner de nouveaux candidats vaccins à visée anti-infectieuse pour les phases d'efficacité, et à terme, pour la mise sur le marché de nouveaux vaccins.

Procédures

Les animaux seront immunisés par injection unique ou répétée (maximum 1 fois par semaine) du produit à tester par voie per-os (vigiles), sous-cutanée, intramusculaire, intrapéritonéale (vigiles ou anesthésiés) ou intratrachéale (anesthésiés). Sur animaux vigiles, l’immunisation est de l’ordre de la minute, en comptant l’anesthésie la durée est d’environ 5 minutes. Au maximum, 3 sites/souris par jour pourront être utilisés en respectant les volumes d’injections recommandés et un espacement de 7 jours. Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 1 fois par semaine (et avant euthanasie) jusqu’à la fin de l’étude en respectant les volumes éthiques. Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront présenter des réactions immunitaires différentes selon les produits testés. Il est possible que leur système immunitaire soit affaibli entrainant l’apparition de signes cliniques. Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes (pesées, administration des produits, prélèvements de sang) et pourront subir plusieurs anesthésies au cours des études susceptibles d’induire un stress supplémentaire.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole afin de prélever les organes pertinents nécessaires aux mesures et analyses menées pour déterminer l’immunogénicité des produits testés.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire afin de pouvoir caractériser l'immunogénicité d’un produit dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique). Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable la réaction immunitaire induite d’un produit dans un organisme vivant.

Réduction

Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant de conclure sur un réel pouvoir immunogène du traitement testé, des groupes d’au moins 5 animaux seront constitués.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 6 jours minimum sera respectée. Les animaux seront hébergés en cage de manière collective durant toute la durée de l’étude (sauf exception en cas de bagarre ou blessure), avec des enrichissements appropriés (abris, matériel de nidation, bois à ronger…). En cas d’hébergement individuel (pour cause de bagarre entre congénère par exemple), les cages seront réorganisées de manière à permettre à minima un contact visuel avec les animaux adjacents. Ce type d’hébergement présente l’avantage de mieux vérifier la prise alimentaire et l’abreuvement de chaque animal, et ainsi vérifier leur état général. Les injections pourront se faire sur animaux vigiles ou sous anesthésie (anesthésie systématique pour les voies d’injection intramusculaire et intratrachéale) en fonction de la voie d’injection et du protocole. Une attention particulière pourra être apportée au site d’injection durant les jours post-injection afin de détecter d’éventuels signes locaux ou d’irritation cutanée. Au cours de l’étude, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre le plus rapidement possible, les mesures nécessaires : mesure de soutien (désinfection de plaies, isolement, réchauffement, etc…) ou la mise à mort des animaux ayant un état clinique jugé moribond. Des critères d’interruption ou points limites seront appliqués tout au long de ces études (basés sur la perte de poids, l’état de santé général et d’éventuelles lésions au site d’injection de l’animal). Des examens cliniques approfondis pourront également être réalisés. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi. Les signes cliniques observés seront pris en charge (injection de fluides, analgésiques, antibiotiques, etc…) dans la mesure où les actions n'influent pas sur l'immunogénicité des produits injectés (en fonction des connaissances des produits).

Choix des espèces

Différentes espèces animales sont nécessaires pour tester l'immunogénicité de candidats vaccins car les pathologies infectieuses présentent des tropismes particuliers vis à vis de certaines espèces animales dans lesquelles ces pathologies infectieuses se développent ou non. Dans ce projet, des souris seront utilisées car il s’agit d’une espèce cible judicieuse qui est sensible aux modèles de pathologies comme la grippe, les rotavirus, la coqueluche, le tétanos, etc. (liste non exhaustive) et qui va donc induire une réaction immunitaire spécifique pour ensuite pouvoir réaliser des tests de challenge vaccinaux. La première injection se fera sur des animaux âgés de 7 à 13 semaines (stade jeune adulte). Ce stade de développement est celui habituellement utilisé pour ce type d’étude.

Toutes tuées à la fin de chaque procédure pour des analyses cellulaires et moléculaires, 270 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour savoir si des lymphocytes T régulateurs contrôlent la douleur par les enképhalines qu'ils produisent. Chacune reçoit cinq injections de tamoxifène dans l'abdomen et passe huit mesures de sensibilité à la pression aux filaments de Von Frey. Selon les groupes, s'y ajoutent sous anesthésie une injection dans le coussinet de la patte, une greffe de tumeur sous la peau ou, pour 126 d'entre elles, une constriction chronique du nerf sciatique. Le porteur écrit qu'"Une douleur modérée sera induite" dans toutes les procédures et exclut tout analgésique opioïde, qui pourrait interférer avec la lecture des résultats. Il prévoit du méloxicam, de la lidocaïne et de la bupivacaïne autour de la chirurgie du nerf, et affirme ailleurs que "L'administration d'analgésique est impossible ici".

Objectifs

Le projet vise à établir le rôle des peptides opiodes générés à partir de la proenképhaline produites par les lymphocytes T régulateurs (Treg) dans la perception de la douleur chez la souris. La signalisation par le TNFR2 pourrait être un facteur clé dans l'expression des enképhalines dans les Treg. Dans un travail publié récemment, le TNFR2 exprimé par les Treg est associé à la perception de la douleur dans le modèle de constriction du nerf sciatique, communément utilisé dans la recherche sur la douleur. Dans ce travail, les auteurs montrent notamment qu'un agoniste du TNFR2 est capable de réduire la sensibilité de la patte lésée mais seulement si les Treg sont présents. L'hypothèse de travail du projet est que le TNFR2 pourrait jouer son rôle sur la douleur par l'intermédiaire des enképhalines.

Bénéfices attendus

En l'absence de production d'enképhalines par les Treg, une douleur exacerbée dans au moins 2 des 3 procédures indiquerait un rôle important des Treg dans le contrôle de la douleur chez la souris. En l'absence du TNFR2 dans les Treg, nous vérifierons que le TNFR2 exerce son action sur la douleur via les Treg dans un modèle sans équivoque. Nous démontrerons alors que l'action du TNFR2 sur la douleur s'exerce via la régulation de la production des enképhalines. Ces résultats pourraient permettre d'améliorer la prise en charge de la douleur chez les patients via une action sur le TNFR2.

Procédures

- Injections intrapéritonéales de Tamoxifène (270 animaux vigiles): cinq injections à un jour d'intervalle. - Injections dans le coussinet plantaire (54 animaux sous anesthésie générale avec de l'Isoflurane): une seule injection. - Injections de tumeurs sous cutanées (90 animaux sous anesthésie générale avec de l'Isoflurane): une seule injection .-Constriction chronique du nerf sciatique ischio-jambier (126 animaux sous anesthésie générale avec Ketamine/Xylazine): chirurgie unique. - Traitement analgésique pré opératoire (126 animaux vigiles): une injection intrapéritonéale de Meloxicam. - Traitement analgésique pré opératoire (126 animaux vigiles): une seule injection locale de Lidocaïne et de Bupivicaïne. - Traitement analgésique post opératoire (126 animaux vigiles): deux injections intrapéritonéales de Meloxicam 24 heures et 48 heurs après la première injection. - Sensibilité à la pression avec les filaments Von Frey (270 animaux vigiles): 8 mesures de 3 à 9 jours d'intervalles. - Injection d'un agoniste de TNFR2 par voie intrapéritonéale (54 animaux vigiles): une seule injection

Impact sur les animaux

Une douleur modérée sera induite chez les animaux dans toutes les procédures. La douleur liée à la chrirugie du nerf sciatique sera prise en charge avec les analgésiques adaptés (Molixicam, Lidocaïne et Bupivicaïne) selon une posologie établie. Aucun analgésique opioide ne sera utilisée, ceux ci pouvant interférer avec la lecture des résultats et compromettre les objectifs du projet.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour analyses cellulaires et moléculaires complémentaires.

Remplacement

Selon la définition de la Douleur par l'Association Internationale de l'Etude de la douleur (1979), " La douleur est une expérience sensorielle et émotionnelle désagréable, associée à un dommage tissulaire présent ou potentiel, ou décrite en terme d'un tel dommage. ", on perçoit le caractère pluridimensionnel et plurifactoriel de la notion de douleur. Au regard de notre thématique faisant appel à des mesures de variation de la nociception, il nous est par conséquent impossible de palier à l’utilisation d’animaux vivants (anesthésiés ou vigiles). Notre projet est basé sur la perception de la douleur chez l'animal sans possibilité de remplacement par des expérimentations in vitro, la douleur n'étant pas quantifiable par des paramètres biochimiques connus.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des analyses des résultats. Nous utiliserons 6 animaux par groupe pour toutes les procédures et on répétera l’expérience 3 fois. Nous utiliserons le test statistique Mann- Whitney de type non paramétrique pour comparer les medianes entre groupes, ou d'analyse de pente par regréssion linéaire pour la croissance des tumeurs. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est aussi de réaliser les expériences sur les deux lignées de souris génétiquement modifiées en même temps afin de les comparer au même groupe témoin.

Raffinement

L’état général des animaux sera suivi de manière journalière par le personnel qualifié de l'animalerie ou par les membres habilités de l'équipe. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Une grille de scores cliniques sera remplie journellement pour déceler les animaux en souffrance qui seront immédiatement euthanasiés. Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu sera enrichi avec du carton pour permettre aux souris de faire un nid. Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. Les animaux reçoivent nourriture et eau en quantité non limité. Les animaux provenant de l'extérieur seront acclimatés une semaine avant leur inclusion dans les protocoles. Les animaux sont anesthésiés durant les procédures pouvant engendrer de la souffrance. L'administration d'analgésique est impossible ici, celle ci pouvant avoir des effets sur la lecture des résultats. Une grille de score clinique sera remplie journellement pour chaque animal pour évaluer l'évolution de la santé des animaux des procédures et engager l'euthanaise en cas d'atteinte d'un score définissant le point limite.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces animales utilisées depuis de nombreuses années pour ce type d’étude (1). La souris représente un très bon modèle pour réaliser des expériences de comportement, des études de neuroanatomie, de physiologie et de biologie cellulaire et moléculaire. En outre le choix des rongeurs dans les études portant sur la douleur est admis depuis de nombreuses années et les modèles expérimentaux de douleurs chroniques sont bien caractérisés tant du point de vue des études comportementales que des analyses cellulaires ou moléculaires (1). La disponiblité de souris génétiquement manipulées pour les gènes d'intérêt rend aussi l'utilisation de cette espèce indispensable à la réalisation de ce projet. Dans ce projet 3 lignées différentes de souris génétiquement modifiées seront utilisées. Ces animaux sont issus d'élevage réalisés dans notre animalerie. 1 Larson CM, Wilcox GL, Fairbanks CA. The Study of Pain in Rats and Mice. Comp Med 2019; 69: 555–570. Des souris de 8 à 12 semaines d'âge seront utilisées pour travailler avec un système immunitaire mature comportant des niveaux stables de Treg. De plus, des souris adultes résistent mieux à l'anesthésie, ce qui garantit un réveil rapide et sans séquelles. Les souris mutantes sont génotypés par PCR par prélèvement d'un morceau de tissu caudal au moment du sevrage. Les animaux entrant dans les différents groupes sont identifiés par marquaes aux oreilles avec un poinçon dédié (ref: Fine Science Tools 24212-01 ) et désinfecté avec de l'éthanol 70% selon un code interne à l'expérience (absence de marquage, un ou deux marquages de 1mm aux oreilles droites ou gauches) permettant d'identifier les 6 animaux de chaque cage.

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Déficientes en anticorps IgA ou en leur récepteur, elles reçoivent des gavages quotidiens pendant dix-huit jours et deux prélèvements de sang, avant mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie. L'objet est d'étudier l'effet de ces déficiences sur le microbiote intestinal et de tester un apport oral d'anticorps. Le porteur affirme que les interactions hôte-microbiote ne sont pas reproductibles in vitro et indique qu'aucune alternative n'existe pour ce projet.

Objectifs

Les immunoglobulines A (IgA) et M (IgM) sont abondamment produites dans le chorion de la muqueuse intestinale, avant d'être sécrétées dans la lumière intestinale. Les Immunoglobuline sécrétées (SIg) comprennent donc les SIgA et les SIgM, et façonnent le microbiote intestinal, notamment en offrant une protection contre les pathogènes, en permettant l'implantation de certaines souches bactériennes, et en favorisant l'échantillonnage des bactéries commensales au niveau des plaques de Peyer ; des organes lymphoides secondaires impliqués dans la réponse immunitaire mucosale. Ainsi, la déficience en IgA chez les humains est associée à une baisse de la diversité microbienne dans les fèces, et ce malgré la compensation de cette déficience par une sécretion augmentée de SIgM. Ce projet a pour objectif d'étudier l'effet de la déficience en SIgA seules ou en SIgA et SIgM, sur la composition du microbiote intestinal de souris. De plus, la possibilité del'administration passive d'IgA par voie orale Pour cela, nous disposons au laboratoire de deux modèles différents : - Des souris IGHA-/-, de fond génétique BALB/C, qui ne produisent pas d'IgA que ce soit en périphérie ou dans la muqueuse intestinale. De façon similaire à la déficience en IgA chez l'homme, qui est l'immunodéficience humaine la plus commune, les SIgM seront toujours présentes dans la lumière intestinale, mais les SIgA en seront absentes. - Des souris pIgR-/- de fond génétique C57bl/6, qui sont déficientes pour le récepteur pIgR, nécessaire au transport des immunoglobulines vers la lumière intestinale, et donc à la production de SIg. Ces souris n'ont ni SIgA ni SIgM dans la lumière intestinale. Ce modèle reflète plutôt les immunodéficiences transitoires chez l'homme, notamment celles induites par l'utilisation d'immunosuppresseurs. Ces souris transgéniques sont déjà présentes dans l'animalerie du laboratoire. Ces souris sont de fond génétique différent, et il est préférable de comparer chacun des modèle à des souris sauvages du même fond génétique. En effet, des différences basales du système immunitaire pourraient expliquer des variations du microbiote intestinal, qui seraient alors indépendantes de la présence ou non de SIg. Des souris contrôles différentes seront donc utilisées pour chaque modèle. Afin de limiter les différences de microbiote entre les souris, ces dernières seront traitées par antibiotiques puis traitées par transplantation fécale (FMT) à partir de fèces de souris, ou de fèces humaines.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est double : -D'un point de vue fondamental, il permettra de mieux comprendre l'impact de la compensation de la perte des SIgA par les SIgM, en comparant la dysbiose (ou déséquilibre de la flore intestinale) entre les souris pIgR-/- déficientes en SIgM et SIgA et IGHA-/-, uniquement déficientes en SIgA. De plus l'utilisation de modèles murins permet d'étudier la composition du microbiote intestinal dans les fèces, mais aussi directement dans l'intestin, ce qui permet une analyse plus précise que ce qui a déjà était fait chez l'homme. Ces résultats seront complétés par l'étude des métabolites dérivés du microbiote dans les fèces de ces souris. En effet, ces métabolites jouent un rôle important dans le métabolisme de l'hôte et dans la stimulation de son système immunitaire. - Cette étude apporte également un intérêt pour les applications cliniques d'administration orale d'IgA. La possibilité de limiter la mise en place d'un déséquilibre de la flore intestinale par un transfert passif d'IgA par voie orale a un intérêt clinique majeur. Si cette solution se révèle efficace, elle pourra en effet être testée chez des patients déficients en IgA ou sous immunosuppresseurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à des gavages par voie orale réguliers (1 fois par jour pendant 18 jours). La manipulation par animal dure entre 20 secondes et 1 minute. En début et fin d'expérimentation, du sang sera prélevé de chaque animal au niveau de la veine saphène (2 prélèvements à J4 et J18).

Impact sur les animaux

Les mutations portées par les modèles transgéniques pIgR-/- et IGHA-/- n'entachent pas la qualité de vie des animaux. Les gavages oraux réalisés fréquemment seront réalisés par un personnel particulièrement habitué au geste, de façon à ne créer aucune lésion et à diminuer la durée du geste.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés par dislocation cervicale après anesthésie à l'isoflurane.

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas d'étudier finement les interactions entre un hôte et son microbiote intestinal. Ce dernier est composé d'une grande quantité de taxons différents, qui peuvent être aérobie ou anaérobie, et qui varient le long du tube digestif. Leur implantation dépend de nombreux facteurs parmi lesquel l'alimentation de l'hôte, la réponse immunitaire, la sécrétion de mucus, la compétition inter-espèces etc. Ces facteurs ne peuvent pas être contrôlés in vitro. Il n'y aucune possibilité de réaliser ce projet sans l'utilisation de modèles animaux.

Réduction

Les effectifs de 6 souris par groupe représentent la quantité minimale de souris nécessaire pour avoir assez de puissance pour conclure.

Raffinement

Les souris sont suivies attentivement par un personnel qualifié. Leur douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont. Les animaux sont hebergés en groupes harmonieux (par 2) et dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). L'eau et la nourriture sont mis à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée pour couvrir les bruits parasites.

Choix des espèces

La souris présente plusieurs avantages pour ce projet. Premièrement, elles produisent des IgA à la structure proche des IgA2 humaines (la sous classe majoritairement retrouvée dans les sécrétions mucosales), ce qui n'est par exemple pas le cas des modèles invertébrés. De plus, la grande majorité des travaux effectués sur les SIgA est conduite chez la souris, et notre travail pourra être analysé plus finement grâce à la vaste littérature qui existe sur ce sujet et avec ce modèle. Enfin, Les modèles IGHA-/- et PIGR-/- sont déjà présents dans notre animalerie, et permettront d'observer l'effet des IgA administrées oralement. Les souris auront entre 5 semaines et 6 mois, car avant 5 semaines les souris ne disposent pas d’un système immunitaire complet et après 6 mois la réponse immunitaire risque d’être altérée.