Souris
Étude de l’effet inflammatoire d’émulsions sans et avec vitamines liposolubles chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont gavées et subissent des prélèvements de sang à la sous-mandibule ou en arrière de l'œil toutes les trois semaines, avec une privation d'eau et de nourriture de quatre heures avant chaque gavage, pour comparer l'effet inflammatoire d'émulsions stabilisées par des émulsifiants dits durables. Le porteur qualifie lui-même ces gestes de stressants mais "nécessaires" à l'expérimentation. Il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité du tube digestif et que seul l'animal permet une approche intégrée.
Objectifs
Les vitamines liposolubles sont essentielles pour la santé. Malheureusement, apports et statuts inadéquats en vitamines liposolubles sont très courants. Les émulsions huile dans eau sont souvent utilisées pour encapsuler et délivrer ces vitamines. La plupart des études disponibles reposent sur des études in vitro et mettent en jeu des émulsifiants tels que le polysorbate 80, la carboxyméthylcellulose ou l'hydroxypropylcellulose. Bien qu'il s'agisse d'émulsifiants largement utilisés par l'industrie alimentaire, leur utilisation dans les produits de consommation courante fait l'objet d'une certaine controverse car certaines données suggèrent que ces émulsifiants ont un impact négatif sur le microbiote intestinal, en augmentant sa capacité à pénétrer la couche de mucus normalement stérile, et qu'ils peuvent être à l'origine d'une inflammation intestinale et d’états pathologiques associés. Parallèlement à cette controverse, l'intérêt pour une transition vers des aliments et des ingrédients plus durables est apparue ces dernières années, tant dans la communauté des chercheurs que dans l'industrie alimentaire. Les régimes alimentaires durables sont des régimes alimentaires ayant de faibles conséquences sur l’environnement, qui contribuent à la sécurité alimentaire et nutritionnelle ainsi qu’à une vie saine pour les générations présentes et futures. Ce projet de recherche vise donc à évaluer l'effet inflammatoire/anti-inflammatoire d’émulsions stabilisées par des émulsifiants « durables » (protéines de pois, arabinoxylanes), sans et avec vitamines liposolubles, chez la souris et de comparer leurs effets à ceux induits par une émulsion stabilisée par des polysorbates.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de clarifier plusieurs questions scientifiques, à savoir : • Connaître l'effet inflammatoire/anti-inflammatoire et l’effet sur la perméabilité intestinale de nouveaux émulsifiants « durables » et voir si les vitamines peuvent réguler cet effet inflammatoire.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins à la sub-mandibule, ou rétro-orbitaux au début puis 1 fois toutes les 3 semaines pendant la procédure. La durée de chaque prélèvement sanguin est calculée autour de 5 minutes. Le gavage sera réalisé avec les animaux en état de vigile. La procédure de gavage est estimée à 2 minutes hors la préparation de la seringue.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont : 1) Stress lié à la manipulation pendant les prélèvements, pesées hebdomadaires et des changements de litière 2) Stress pendant les prélèvements sanguins submandibulaires ou retro-orbitaux 3) Stress pendant le gavage. 4) Stress lie à la privation d’eau et de nourriture pendant 4h avant les gavages, et la séparation des individus pendant le temps nécessaire pour collecter les matières fécales (approximativement 1 h) Malheureusement il s’agit de gestes nécessaires pour l’expérimentation.
Devenir
Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques et en micronutriments) pour évaluer les effets des émulsifiants sur l’inflammation.
Remplacement
Les modèles in vitro (culture cellulaire, chambre d’Ussing) ne reproduisent pas la complexité biologique du tube digestif (mucus, mouvement, échange entre organes, présence d’un microbiote). Le recours au modèle animal demeure la meilleure approche pour étudier l’inflammation puisque (actuellement) seul un modèle animal permet d’avoir une approche intégrée du phénomène d’absorption et inflammation intestinale.
Réduction
Ce projet est constitué de 13 conditions au maximum. Ce nombre est choisi en se basant sur les résultats préliminaires physicochimiques qui ont permis d’éliminer les conditions non pertinentes et donc de réduire drastiquement le nombre d’individus. Pour chacune de ces conditions, et compte tenu de la variabilité interindividuelle existant chez la souris et de la difficulté de la mise en place du protocole, des groupes de 10 individus sont nécessaires pour assurer la validité statistique du phénomène observé. Un nombre plus restreint d’animaux ne permettrait pas une finesse suffisante des résultats pour répondre à nos objectifs de recherche.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 2 ou 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Le début des régimes aura lieu après 7 jours d’adaptation dans l’animalerie. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. L’enrichissement sera actualisé toutes les semaines afin d’apporter de la nouveauté aux souris. L’enrichissement sera fait avec des igloos, des tubes, des cabanes, du papier kraft, de la cellulose, du bois ou du foin. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Tout animal présentant des signes de mal-être sera mis à mort. Une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude. Les souris seront observées 15 minutes après la procédure pour détecter des signes de douleur ou de détresse. Dans le cas d’une fausse route lors du gavage ou d’un mal-être des souris, les animaux seront mis à mort. Toutes les procédures invasives (prélèvement sanguins, mis à mort) seront réalisées sous anesthésie générale. Lors des prises de sang, si le saignement venait à ne pas s'arrêter, l'animal serait immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Les expériences de biodisponibilité des micronutriments et évaluation de l’inflammation sont le plus souvent réalisées chez la souris, dont le système de digestion et d’absorption est anatomiquement proche de celui de l’Homme. En effet, les modèles cellulaires disponibles (Caco2) ne disposent pas de couche d’eau non-agitée et de mucus, qui sont très importants dans le contexte des études de l’absorption et de l’inflammation intestinale. Les co-cultures Caco2/ HT29 permettent de reproduire partiellement une couche de mucus mais dans des quantités souvent insuffisantes. Ces modèles cellulaires ne permettent pas non plus d’évaluer l’impact des émulsifiant via le microbiote. Le modèle de souris offre des avantages comme la facilité de la mise en œuvre et le faible coût. Enfin, les souris constituent un modèle in vivo de référence pour l’étude de l’effet d’émulsifiants par rapport à d’autres animaux. L’utilisation de ce modèle permettra la comparaison avec des études scientifiques. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement et rester comparable avec les études déjà faites, qui utilisent aussi de jeunes adultes.
Etude de l’effet bénéfique potentiel d’une souche de lactobacille contre le développement de cellules cancéreuses chez la souris.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
656 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 564 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 92 léger. On leur induit un cancer sous-cutané ou colorectal par un agent cancérigène, ce dernier provoquant une inflammation intestinale avec perte de poids et diarrhée sanglante, pour tester une souche de lactobacille administrée par voie nasale ou orale. Le porteur indique viser un complément probiotique anticancéreux d'abord pour les chiens et les chats, puis un possible dépôt de brevet et une mise sur le marché. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative fiable à ce stade, les cultures cellulaires ne reproduisant pas les communications entre organes.
Objectifs
Le projet a comme objectif d’étudier des alternatives thérapeutiques contre le cancer pour les animaux de compagnie et basées sur une souche bactérienne particulière en les testant d’abord chez la souris. Aujourd’hui, le cancer chez les animaux de compagnie (principalement chiens et chats) est diagnostiqué plus précocement. Le cancer représente 27% de cause de mortalité chez eux, quel que soit l’âge, et la première cause de décès (avec près de 45%) chez les chiens de plus de 10 ans. Les propriétaires demandent souvent une qualité de soins proche de celle utilisée en santé humaine pour leurs animaux. Il existe donc une demande de plus en plus importante pour une prise en charge anticancéreuse et elle va probablement augmenter à l’avenir. Malheureusement, les traitements actuellement disponibles pour lutter contre le cancer chez le chien (curatif ou palliatif) demeurent insuffisants. Les thérapies par chimiothérapie présentent des limites telles que leurs coûts, les effets secondaires et la nécessité d’une hospitalisation de l’animal en clinique spécialisée. Le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses plus accessibles et non invasives semble ainsi nécessaire. Actuellement, il y a un manque en produits alternatifs en cancérologie vétérinaire malgré la forte demande (insatisfaite) vis-à-vis de produits naturels. Des approches dites « non conventionnelles » telles que la phytothérapie, la mycothérapie, l’homéopathie, etc. représentent des stratégies alternatives et/ou complémentaires. Les probiotiques représentent une option intéressante pour traiter et prévenir le cancer chez le chien. En effet, des études récentes ont montré que la consommation de probiotiques peut avoir un rôle préventif et/ou protecteur dans le développement de différents types de cancer chez l'homme. En outre, une étude récente a signalé les potentiels effets bénéfiques de probiotiques sur certains symptômes gastro-intestinaux chez des chiens atteints de lymphome et soumis à une chimiothérapie. Cependant, à ce jour, aucune autorisation de mise sur le marché n'a encore été accordée à un probiotique pour la prévention ou le traitement du cancer chez le chien. Les perspectives à moyen terme seraient de développer un complément alimentaire et probiotique pour prévenir et traiter certaines formes de cancer chez le chien, et à plus long terme et si les résultats sont positifs, de proposer un tel complément chez l'homme.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet qu’il fasse progresser nos connaissances scientifiques sur les biothérapies à base de probiotiques contre le développement du cancer chez les animaux de compagnie et chez l’humain. En se basant sur nos résultats validés in vitro et en complément des essais in ovo (en cours chez l’embryon de poulet), ces expérimentations animales sur les différents modèles souris nous permettront de valider l’effet bénéfique d’une souche bactérienne particulière in vivo. S’ils sont positifs, nous envisageons par la suite un dépôt de brevet portant sur la caractérisation de l’effet anti-cancer de cette souche chez le chien. Actuellement, des discussions avec des partenaires privés sont aussi en cours et les expérimentations animales faisant l’objet de cette demande d’autorisation nous serviront à décider si une demande d’Autorisation de Mise sur le Marché est envisageable à l’avenir.
Procédures
Dans ce projet nous utiliserons des souris et deux modèles de maladies cancéreuses : un modèle de cancer sous cutané pour évaluer un effet bénéfique à distance de la souche bactérienne qui sera donnée par voie intra-nasale et un modèle de cancer colo-rectal où la bactérie sera donnée par voie orale. Pour le modèle d’induction de tumeur sous-cutanée / test d’un effet bénéfique à distance (systémique) : Chaque animal recevra sous anesthésie (anesthésie faite par injection dans l’abdomen sur animal vigile, environ 15 secondes de manipulation de l’animal) 3 administrations intra-nasale des produits à évaluer (10µl de liquide) espacées de 2 semaines et une administration sous-cutanée de cellules tumorales, qui génèreront une tumeur par la suite au site d’injection. Chaque animal sera placé quelques minutes toutes les deux semaines en pot transparent afin de récolter des déjections. Chaque animal sera pesé régulièrement (au moins une fois par semaine, environ 15 secondes de manipulation de l’animal). La taille des tumeurs sera mesurée pour chaque animal chaque semaine avec un pied à coulisse électronique (environ 30 secondes de manipulation de l’animal). En fin d’essai, un prélèvement sanguin sur animal vigile (environ 30 secondes de manipulation de l’animal) est effectué avant la mise à mort et la collecte d’organes. Pour le modèle d’induction de tumeurs colo-rectales / test d’un effet bénéfique local : Chaque animal recevra une administration orale par gavage quotidienne des produits à évaluer pendant toute la durée de l’expérimentation, soit un total de 58 administrations (animal vigile). Chacune de ces administrations est réalisée rapidement (environ 15 secondes de manipulation par animal). Chaque animal recevra une injection dans l’abdomen d’un agent cancerigène (animal vigile) une fois (environ 15 secondes de manipulation par animal). Chaque animal sera placé quelques minutes par jour en pot transparent afin de récolter des déjections. Chaque animal sera pesé quotidiennement (environ 15 secondes de manipulation par animal) et évalué sur un ensemble de paramètres d’état général par des observations. En fin d’essai, un prélèvement sanguin sur animal vigile (environ 30 secondes de manipulation de l’animal) est effectué avant la mise à mort et la collecte d’organes.
Impact sur les animaux
En ce qui concerne le modèle d’induction de tumeur sous-cutanée : Suite à l’injection des cellules tumorales, les souris développeront une tumeur localisée au site d’injection, non douloureuse. Dans certains cas, il peut y avoir formation d’une plaie susceptible de s’infecter. Le modèle d’induction de cancer colorectal déclenche dans un premier temps une inflammation intestinale qui entraine une perte de poids modérée pour une souris (10-15%) et une modification de la consistance des déjections pouvant aller jusqu’à une diarrhée accompagnée de saignements. Cette inflammation reviendra de manière cyclique et sera suivie de périodes de récupération qui permettent la disparition presque complète de ces symptômes. En fin de protocole, il y a apparition d’une ou plusieurs tumeur(s) de taille proche de 2mm3 au niveau du côlon.
Devenir
Le prélèvement des différents organes est incompatible avec la survie de l’animal
Remplacement
Nous avons effectué de nombreux essais in vitro et in ovo (dans des œufs de poule) avant d’envisager une confirmation dans deux modèles souris pour valider ces résultats et passer aux étapes suivantes de caractérisation du produit d’intérêt (une souche de bactérie probiotiques). A notre connaissance, il n’existe pas d’alternatives fiables à l’utilisation des animaux à ce stade. De telles expériences ne peuvent être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes. De plus, les paramètres inflammatoires et cancéreux tels que la modification de la consistance des fèces, la perte de poids, le développement des tumeurs coliques ou cutanées ne peuvent pour le moment être quantifiés que sur l’animal.
Réduction
Comme mentionné précédemment, les microorganismes à tester sont issus d’un programme de sélection in vitro au préalable. Ce programme est par ailleurs complété par des essais in vivo sur des embryons de poulet. A partir d’une collection contenant près d’une quinzaine de souches de microorganismes, ces essais ont permis d’identifier une souche de bactérie particulièrement intéressante. Nous avons donc retenu une approche permettant de limiter les tests in vivo à la meilleure candidate que nous avons pu identifier jusque là. Par ailleurs, nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. Nous effectuerons des tests statistiques adaptés pour évaluer les performances de la souche bactérienne en comparaison des groupes témoins.
Raffinement
Tout au long des procédures expérimentales, les animaux sont observés et pesés régulièrement : suivi hebdomadaire pour le modèle d’induction de tumeur sous-cutanée et suivi quotidien pour le modèle de cancer colo-rectal. De plus, pour le modèle de cancer colo-rectal, un score clinique quotidien est réalisé. Toutes ces mesures représentent une surveillance accrue nécessaire lors de ces phases expérimentales. Par ailleurs, les animaux sont hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas exposer ces animaux sociaux à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux sont séparés ne représentent qu’un temps très faible (5-10 minutes, environ une fois par semaine, pour les collectes de fécès des animaux de la procédure 1 et quotidiennement pour les animaux de la procédure 2). Des anesthésies sont prévues lors des phases qui pourraient être stressantes/douloureuses pour l’animal vigile (administrations intra-nasales ou injection sous-cutanées des cellules tumorales pour l’induction de la tumeur sous-cutanée). Nous veillons toujours à ce que les durées d’anesthésie soient limitées au minimum nécessaire (30-45 minutes environ). Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à dechiqueter et permettant la création de nids, bâtons à ronger et maisonnettes en carton (sans encre). Le matériel que nous utilisons (sonde de gavage) est adapté à nos animaux. Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin (diamètre externe voisin du millimètre), à bords arrondis et de taille adaptée (4cm) pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Enfin, des points limites sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie; disciplines au carrefour desquelles la thématique du laboratoire nous positionne. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies cancéreuses et inflammatoires humaines. Elle est également pertinente pour envisager une approche vétérinaire pour les animaux de compagnie. Les animaux sont utilisés à un âge de 8 semaines (adultes). Cet âge est régulièrement utilisé par d’autres laboratoires. Cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature.
Essais thérapeutiques de composés immunomodulateurs
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte des cellules tumorales puis des composés immunomodulateurs testés pour des laboratoires clients, avec suivi de la tumeur et prises de sang répétées, l'étude n'autorisant ni anti-inflammatoire ni analgésique jugés incompatibles avec les molécules évaluées. Le porteur affirme que les doses injectées n'induiront aucun effet indésirable et que des points limites précoces limiteront la gêne liée à la tumeur. Il indique devoir se placer à l'échelle de l'"organisme entier" et écarte toute méthode substitutive.
Objectifs
Le domaine d’expertise de notre unité de service est centré sur la caractérisation et l’étude fonctionnelle des populations du système immunitaire murin en conditions normales, inflammatoires ou dans un contexte tumoral. En tant que prestataire de services, nous réalisons ces études pour des laboratoires partenaires publics ou privés. L’objectif principal du projet décrit dans cette demande, est l’évaluation de la réponse immunitaire suite au développement d'une tumeur dans des souris contrôles ou génétiquement modifiées, en présence ou non d'un traitement thérapeutique de composés immunomodulateurs. Les essais thérapeutiques récents utilisant des composés immunomodulateurs ont donné des résultats extrêmement prometteurs sur certains types de cancers comme les Mélanomes métastatiques. Certaines immunothérapies ont des effets spectaculaires sur l’inhibition de la croissance tumorale. La recherche s’intéresse donc de très près à la caractérisation de nouveaux composés immunomodulateurs et aux thérapies combinatoires pour atteindre un taux de succès plus élevé. Ce projet s’inscrit non seulement dans la validation de nouveaux anticorps thérapeutiques mais également dans la description exhaustive de toutes les cellules immunes infiltrant la tumeur et leur rôle dans le contrôle de la pousse tumorale sous l'effet d'un traitement immunothérapeutique. Dans cette dernière optique, nous envisageons de caractériser de façon plus précise les cellules ayant infiltrées la tumeur et les cellules nouvellement circulantes qui viennent de rentrer dans la tumeur.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer de façon qualitative et quantitative la capacité d’un modèle murin à rejeter une tumeur après traitement immunothérapeutique en comparaison avec des animaux contrôles sans traitement. Ainsi, nous pourrons valider de nouveaux candidats dans le cadre d'immunothérapies anti-tumorales. Nous pourrons également déterminer l'action anti-tumorale de ces nouveaux composés grâce à l'étude du système immunitaire et définir la dose optimale à administrer. Ces études présenteront une avancée majeure dans le traitement des cancers par immunothérapie.
Procédures
Les souris seront régulièrement manipulées lors de ce projet à raison d’un jour sur deux pour différentes raisons : 1/ Les suivis de poids et de mesures tumorales : les souris seront manipulées à l’état vigile pour être déplacées dans une balance à pesée dynamique puis contenues par un manipulateur pour la mesure du volume tumoral au moyen d’un pied à coulisse. La contention sera la plus courte possible (inférieure à une minute au total par souris pour une pesée+mesure) pour limiter les contraintes subies par l’animal. 2/ Les injections de cellules tumorales (injection unique) : une contention sur souris vigile sera réalisée pour l’injection de l’anesthésique (15 à 30 secondes maximum par souris). Les souris seront ensuite manipulées une fois endormies pour l’injection des cellules tumorales et de l’Antisedan qui permettra d’écourter le temps total d’endormissement à environ 15 minutes, afin de permettre une meilleure récupération des souris. L’anesthésie par voie chimique permet d’assurer une reproductibilité de l’injection des cellules tumorales et d’éviter les grattages au niveau du site d’injection qui pourrait impacter l’implantation de la tumeur. 3/ Les injections de composés immunomodulateurs ou d’anticorps conjugué à un fluorochrome : Ces injections seront réalisées soit sur souris vigile, soit sur souris anesthésiée par voie gazeuse. Les injections pourront être réalisées de façon hebdomadaire, bi-hebdomadaire ou journalière en fonction du mode d’administration choisi ainsi que des recommandations des laboratoires porteurs de projet. Sur souris vigile, le temps de contention et d’injection n’excèdera pas 30 secondes. Selon la voie d’injection, une boite de contention pourra être utilisée. Le temps de contention sera alors le plus bref possible compte-tenu du temps de mise en place de l’animal dans la boite de contention et du temps d’injection. Sur souris anesthésiée, la phase d’induction de l’endormissement durera 3 minutes. Après sortie de la boite, le temps de manipulation et d’injection sur souris endormie sera de 10 à 20 secondes maximum. La souris se réveillera au bout de 30 secondes. 4/Les prélèvements sanguins : Les animaux seront soumis à l’état vigile à quatre ou cinq prélèvements sanguins au cours de la procédure expérimentale. La durée d’un prélèvement n’excèdera pas 30 secondes par souris. Tous les gestes techniques seront réalisés par un manipulateur expérimenté afin de limiter la durée de contention et le stress subi par l'animal.
Impact sur les animaux
Les tests de toxicité des composés immunomodulateurs seront effectués en amont par les laboratoires demandeurs. Les doses injectées n'induiront donc aucun effet indésirable sur les animaux dans le cadre de ce projet. Les effets indésirables liés à la croissance tumorale seront limités grâce à la mise en place de points limites précoces pour limiter la gêne et l'inconfort des animaux dû à la présence de la tumeur. Cette étude ne permet pas l’addition d’anti-inflammatoires ou d’analgésiques, incompatibles avec les immunomodulateurs testés et l’étude de la réponse immunitaire associée. Les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress (pesée, anesthésie, injections ou mesure tumorale). Les contentions seront réalisées par du personnel expérimenté et expert dans ces actes afin de limiter les contraintes subies par l’animal.
Devenir
Pour les deux procédures expérimentales, quel que soit le protocole choisi, tous les animaux sélectionnés pour l'Immunophénotypage seront mis à mort afin de procéder au prélèvement des organes et à leur analyse. Les animaux ne rentrant pas dans les critères de sélection définis dans les procédures expérimentales seront également mis à mort. Dans le cas où une expérience de rechallenge serait envisagée, une partie des animaux ayant rejetés la tumeur (6 maximum par groupe à la fin de la première expérience d'immunophénotypage) seront maintenus pendant 60 jours au minimum (post-injection tumorale) avant de procéder au rechallenge tumoral. Après le rechallenge, les animaux seront soit maintenus 60 jours maximum pour vérifier le rejet tumoral puis euthanasiés, soit euthanasiés 3 jours après le rechallenge pour le prélèvement des organes et leur analyse.
Remplacement
Concernant le principe de « Remplacement », dans ce modèle il n’est pas envisageable d’utiliser une méthode alternative et/ou substitutive. En effet, nous devons nous placer à l’échelle de l’organisme entier pour permettre la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de modèle ainsi que pour caractériser la réponse immunitaire des animaux.
Réduction
Concernant le principe de « Réduction », les méthodes de standardisation développées au sein de notre laboratoire nous permettent de réduire le nombre d’animaux tout en ayant des résultats statistiquement significatifs. Cette standardisation est caractérisée par l’utilisation d’automates et d’instruments de mesure calibrés ainsi que d’outils d’analyse automatisés limitant les variations liées aux manipulateurs. En se basant sur ces procédures standardisées, le bio-informaticien de notre service a ainsi déterminé un calcul de puissance nous permettant de définir le minimum de souris nécessaires pour caractériser les différentes populations d’intérêt pour chaque mutation étudiée et chacune des conditions testées. De plus, certains animaux seront conservés dans plusieurs étapes des protocoles définis pour éviter d’avoir à générer à chaque fois une nouvelle cohorte d’animaux.
Raffinement
Pour ce qui est du principe de « Raffinement », les souris seront hébergées par groupe de 5 au maximum, l’aliment et l’eau seront distribués ad libitum et les cages seront systématiquement enrichies par l’ajout d'un carré de coton et d'un bâtonnet de papier ou « Enrichment Diamond Twists » que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Un temps d’adaptation d’une semaine minimum sera également respecté entre la réception des animaux et le début du protocole expérimental. Pour permettre aux souris un meilleur réveil et une meilleure récupération après l’anesthésie, de l’Antisedan sera administré aux animaux à la fin de la greffe des cellules tumorales. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de zootechnie formé et qualifié et des points limites précoces seront préalablement établis. En ce sens, une grille de score sera utilisée prenant en compte le comportement naturel et provoqué de l’animal, la variation pondérale et la caractérisation expérimentale (aspect et volume tumoral). Des points limites terminaux sont établis pour chaque observation (valeur maximale de la grille de score) qui entraîneront la mise à mort de l’animal s’ils sont atteints.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle murin car ce sont des mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. C’est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose à ce jour d’une bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles. Nous avons en effet à notre disposition un grand nombre d'anticorps marqués par une grande variété de fluorochromes permettant un phénotype du système immunitaire à très haut contenu. Pour ces expériences nous utiliserons des animaux adultes de 10 à 12 semaines avec un poids supérieur ou au minimum égal à 22g. Les animaux doivent en effet avoir un système immunitaire mature et un poids suffisant pour être stable au début du protocole et éviter les variations physiologiques non dues à la procédure expérimentale.
Evaluation des conséquences de la surexpression de CYP04X dans le métabolisme striatal et sanguin dans deux modèles murins de la maladie d’Huntington.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
308 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Modèles de la maladie de Huntington, elles développent des troubles moteurs et subissent une chirurgie d'injection dans le cerveau de soixante-dix minutes, avant leur mise à mort pour analyser sang et tissus. Le porteur décrit des mouvements involontaires, des tremblements, des crises d'épilepsie et des vocalisations inhabituelles liés au phénotype. Il affirme que seuls les modèles murins reproduisent assez fidèlement la maladie et que ces étapes sont exigées par l'agence du médicament avant tout essai clinique.
Objectifs
Le but principal de cette étude est d’investiguer les conséquences générales, de la surexpression du gène thérapeutique dans la région cible du cerveau (striatum), sur le métabolisme cellulaire des souris de deux modèles pour la maladie d'Huntington (MH). Pour répondre à cette question, différentes molécules du métabolisme présentes dans les tissus et dans le sang seront analysées par chromatographie. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients à un stade précoce de la maladie d'Huntington. En effet, l’objectif est d’évaluer si la diminution de Huntingtine mutée (agent causal de la maladie d'Huntington), présente dans le striatum des modèles de souris de la MH (maladie d'Huntington), est corrélée à une diminution de la concentration de Huntingtine mutée soluble dans le sang (plasma) ainsi que d’autres biomarqueurs liés à la progression de la maladie/efficacité du traitement. Les prélèvements de sang et de tissus seront effectués suite à la constatation de la mort de l’animal.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de comparer dans deux modèles de souris de la maladie d’Huntington la concentration de biomarqueurs (métabolites) dont le profil est modifié à la suite de l’injection d’un virus adeno-associés exprimant le gène thérapeutique. Le métabolite ou les métabolites qui seront identifiés par spectrometrie pourront être utilisés comme marqueur d’efficacité de ce traitement dans le cadre d’un futur essai clinique.
Procédures
Les animaux développent un phénotype dommageable avec troubles moteurs. Une chirurgie avec injection d'une substance dans le cerveau sous anesthésie générale et sous analgésie (Durée 70 minutes). Une euthanasie sera réalisée par une méthode réglementaire d'une durée de 3 minutes. Il s’agit d’une procédure sous analgésie.
Impact sur les animaux
Pour minorer toutes douleurs post-chirurgie suite à la mise en barre d’oreille, une crème antalgique est appliqué au niveau des oreilles en préventif. Une perte de poids due à la chirurgie pourrait être observée (5 à 10% du poids de référence de l’animal). Un risque d’arrêt/détresse respiratoire, hypothermie ou bien un risque infectieux lié à la chirurgie pourrait être observé. Des effets neurologiques liés au phénotype dommageable sont attendus chez ses animaux tels que : les mouvements choréiformes, les mouvements stéréotypés involontaires, les tremblements et les crises d'épilepsie, ainsi que les composantes des troubles non liés aux mouvements, y compris les vocalisations inhabituelles.
Devenir
Les animaux intégrés dans la procédure d’injection de virus adéno-associés seront euthanasiés pour l’étude des différents métabolites dans le plasma et les tissus. Les prélèvements de sang et de tissus seront effectués suite à la constatation de la mort de l’animal.
Remplacement
A ce jour, seuls les modèles murins de la maladie d’Huntington permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie et donc d'être utilisés dans des études d'efficacité de nouveaux traitements. Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de l’approche thérapeutique chez l’Homme, nécessite une preuve de concept chez les rongeurs (souris modèle). Ces étapes sont requises par l'agence nationale de Sécurité du medicaments et des produits de santé (l’ANSM) pour toute demande d’autorisation d’étude clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (308) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses. Afin de limiter le nombre total d’animaux essentiels au projet, et les analyses histologiques, biochimiques et moléculaires post-mortem seront dans la mesure du possible réalisés sur les mêmes animaux. Le design expérimental a pour but d’obtenir un maximum d’informations en utilisant un minimum d’animaux. Les différents paramètres (biochimiques, histologiques, etc) seront analysés grâce à des essais appropriés en fonction des contraintes expérimentales. De plus, un plan statistique complet a été rédigé et validé. Des résultats préliminaires nous ont également permis d’estimer, la puissance statistique de nos analyses et l’échantillonnage nécessaire pour caractériser les effets biologiques souhaités.
Raffinement
Afin de réduire la douleur lors de la mise en barre d’oreille nous enduisons préalablement les oreilles de l’animal de crème analgésique. Le geste réalisé pour la craniotomie est maitrisé au sein de l’équipe et les risques de saignement n’apparaissent que rarement. Pour limiter le risque de traumatisme mécanique local, relativement faible lié à l’injection, nous utilisons des aiguilles fines acquises avec l’expérience de nos études précédentes). Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. 6h après l’acte chirurgical, une première injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. 24h après une fiche de scoring est remplie pour tout animal et une deuxième est réalisée. Entre 4h et 5h après cette injection les animaux seront observés par l’expérimentateur pour examiner les animaux et vérifier qu’aucun signe de douleur est détecté. Si besoin, une injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. La prophylaxie de la douleur sera donc adaptée à l’examen clinique de l’animal. Le protocole d’analgésie post opératoire a été décidé avec l’accord du vétérinaire. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. L’application de critères d’arrêts en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé au cours des 48h suivant la chirurgie puis celle-ci est ensuite allégé à 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites. De plus, le suivi du poids et les tests comportementaux étant réalisé de façon hebdomadaire (période de repos d’un jour entre chaque test, favorise un suivi renforcé). Les animaux seront hébergés en groupe et un igloo sera ajouté dans chaque cage stabulée en portoir ventilé.
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèles. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la MH permettent de mimer assez fidèlement la pathologie et donc d'être utilisées dans des études d'efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques. De plus, ces deux modèles présentent des différences pertinentes par rapport aux souris saines et l’une par rapport à l’autre (rapidité d’évolution de la pathologie). Cette étude nous permettra de comparer dans deux modèles de souris de la maladie d’Huntington les modification du profil métabolique suite de l’injection d’un virus adénoassociés exprimant le gène thérapeutique. Nous réaliserons les injections stéréotaxiques à un âge adulte, 4 semaines ou 2 mois en fonction du modèle c'est à dire avant l'apparition des symptômes afin de maximiser les effets bénéfiques du traitement.
Evaluation de l’efficacité de composés sur l’apprentissage et la mémoire ainsi que sur la plasticité synaptique chez le rongeur (2023-E-022)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des composés par gavage quotidien jusqu'à cinquante jours, passent des tests de reconnaissance d'objet, de labyrinthe à quatre bras et de labyrinthe en Y, puis sont mises à mort par décapitation pour des enregistrements sur coupes de cerveau, afin de tester des composés contre la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique de possibles signes d'inconfort et une perte de poids après administration. Il affirme que les tests de mémoire et l'électrophysiologie sur coupes ne peuvent être reproduits en culture cellulaire.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) se caractérise par une perte progressive de la mémoire et des capacités de notre cerveau qui nous permettent d'être en interaction avec notre environnement : percevoir, se concentrer, acquérir des connaissances, raisonner, s'adapter et interagir avec les autres. La zone du cerveau impliquée dans l'apprentissage et la mémoire est l'hippocampe. Dans ce projet, afin d’évaluer l'effet des composés testés par voie orale, des tests comportementaux seront utilisés pour quantifier les déficits de mémoire chez les souris âgées. Puis l’effet des composés testés par voie orale sera évalué sur l’activité électrique des cellules neuronales par la technique d’électrophysiologie, sur coupes cérébrales, chez des rongeurs.
Bénéfices attendus
Ce projet scientifique associé à notre plateforme d'électrophysiologie et de comportement permettra de mieux comprendre la physiologie des cellules neuronales, dans le but de développer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’Homme afin de traiter les pathologies cérébrales et notamment la maladie d’Alzheimer.
Procédures
-Administration quotidienne jusqu’à 50 jours, 1 à 2 maximum/jour par voie orale avec une sonde alimentaire de taille adaptée à l’espèce : 10 secondes -Test de reconnaissance d’objet dans une arène, 3 séances à 24h d’intervalles de 10 minutes avant la fin de l’étude -Test du labyrinthe des 4 bras, 1 séance de 5 minutes 48 h avant la fin de l’étude -Test du labyrinthe en Y, une séance de 15 minutes d’entrainement puis 24 h après une séance de test de 5 minutes avant la fin de l’étude. -Anesthésie pour prélèvement sanguin : anesthésie de la souris par inhalation (induction : 4-5% isoflurane) (maximum 3 minutes) -Prélèvement sanguin : 10 secondes jusqu’à 1 fois par semaine (maximum 5 prélèvements sur animal vigile ou anesthésié) et le dernier jour d’étude sur animal anesthésié : 10 secondes - Euthanasie : Administration intrapéritonéale du mélange d’anesthésiques/analgésiques (10 secondes), ou anesthésie de la souris par inhalation (induction : 4-5% isoflurane, maximum 3 minutes), décapitation (3 secondes)
Impact sur les animaux
Suite à l’administration des composés à tester, il se peut que des signes d’inconfort ou d’intolérance se manifestent (baisse d’activité, perte de poids, poils hérissés, modification des selles...). Dans tous les cas, un suivi quotidien de l’état général des animaux et une pesée hebdomadaire seront réalisés afin de repérer tout signe de mal-être. Les 3 tests comportementaux différents seront réalisés 48h, 24h avant et le jour de l’euthanasie et ne dureront pas plus de 15 minutes chacun. Aucune nuisance n’est attendu pendant ces tests comportementaux qui sont de l’exploration d’objets ou de territoire.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrales sur ces coupes.
Remplacement
Les tests de comportement nécessitent l’utilisation d’animaux vivants pour quantifier les déficits d’apprentissage et de mémoire. L'organisation des réseaux neuronaux peut être étudiée sur des coupes cérébrales de rongeurs par électrophysiologie. Ces expériences ne peuvent pas être reproduites, ni étudiées dans des modèles de cultures cellulaires. Nos expérimentations au sein de la société, même si elles nécessitent l’utilisation d’animaux, sont pratiquées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux et de bien-être pour nos animaux en expérimentation. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect de l'éthique animale.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques. Nous adapterons les tests statistiques en fonction des observations. Les tests comportementaux et les enregistrements électrophysiologiques seront fait sur les mêmes animaux afin de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux plus âgés pourront être placés individuellement pour éviter le risque de bagarre dès leur arrivée, suite à un retour d’expérience et aux recommandations de l’éleveur. Ils resteront toujours en contact visuel et olfactif. Avant toute administration, une période d’acclimatation des animaux d’au moins 5 jours sera respectée. Un suivi quotidien des animaux sera effectué sans exception (Week-ends & jours fériés), les animaux seront pesés une fois par semaine dès la fin de la période d’acclimatation par les expérimentateurs pour suivre l’état de santé général . En particulier, ils seront observés après chaque geste technique (administration, prélèvement), afin de s’assurer de l’absence d’effet indésirable inattendu. En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et il sera soigné selon les recommandations du vétérinaire et en accord avec le directeur d’étude. Ce suivi nous permettra de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. Les animaux seront évalués grâce à la fiche d’observation /points limites et l’atteinte d’un point limite entrainera les actions documentées dans cette fiche. Un entrainement (première exposition dans l’arène ou labyrinthe, présentation des objets) sera réalisé une fois, 24h avant de réaliser un test comportemental afin de diminuer le stress de l’animal et de rendre des résultats fiables. Lors des prelevement sanguins réalisées par du personnel compétent et qualifié, les animaux pourront être sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Nos expérimentations sont réalisées chez la souris dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour la communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes du fonctionnement cérébral. Les animaux seront utilisés de l'âge de 3 semaines à 95 semaines, afin de couvrir tous les âges, du jeune à l'adulte.
Étude du développement embryonnaire issu d’iPs en utilisant un nouveau protocole de développement in vitro
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent par voie vaginale une injection de pré-embryons issus de cellules souches induites, puis sont mises à mort pour prélever les embryons, afin d'évaluer la capacité de ces cellules à contribuer au développement embryonnaire. Le porteur indique un inconfort passager lié à l'introduction des sondes et un stress de contention. Il affirme qu'un modèle in vivo est "indispensable" car le développement embryonnaire ne peut pas être entièrement reproduit in vitro.
Objectifs
Tous les organismes vivants proviennent à l’origine d’une seule cellule, dite « cellule souche pluripotente », car celle-ci a la capacité de générer tous les tissus composant un individu. Néanmoins, ces cellules souches pluripotentes disparaissent extrêmement rapidement au cours du développement de l’embryon. Elles sont remplacées par des cellules souches aux capacités beaucoup plus limitées qui ne peuvent produire qu’un nombre limité de types cellulaires. Actuellement, des méthodes de production de cellules souches pluripotentes in vitro existent, mais les cellules ainsi obtenues soit ne permettent pas de générer la totalité des tissus composant un organisme, soit nécessitent des traitements longs et difficiles à mettre en œuvre. Un des défis de la science est de réussir à créer facilement des cellules souches pluripotentes in vitro permettant de reproduire la totalité d’un embryon. Or, à l'aide de nouveaux traitements innovant, notre laboratoire a réussi à produire in vitro de grandes quantités de ces cellules souches. Cependant, une première étude a démontré la nécessité d'améliorer la technique de production car une fois nos cellules souches pluripotentes induites » (iPS) implantées chez des souris porteuses, nous n'avons pas pu obtenir d'embryons plus âgés que 7,5 jours. Or, de nouvelles techniques de préparation des iPs précédant l'implantation devraient permettre d'outrepasser cette limite. Le but de ce projet est d’évaluer la capacité de nos lignées d'iPs à contribuer au développement embryonnaire, confirmant ainsi leur statut de cellules souches pluripotentes, en associant nos techniques de production d'iPs avec ces nouvelles techniques de préparations.
Bénéfices attendus
La maîtrise de la production in vitro d’iPS vraiment pluripotentes, donc totipotentes (c’est-à-dire capable de donner tous les types cellulaires possibles), permettrait d'éviter d'avoir recours à des cellules-souches embryonnaires. On pourrait ainsi éviter des problèmes éthiques, mais également pratiques en simplifiant la production d'une grande quantité de cellules-souches totipotentes tout en se passant d'embryon. Les recherches utilisant des cellules-souches totipotentes sont particulièrement importantes pour la médecine régénérative, car elles pourraient permettre, à terme, de générer des tissus in vitro pour des transplantations ou réparer des dommages corporels après accident ou maladie, mais également de modéliser la progression de maladies, faire de tests toxicologiques et développer la médecine personnalisée (en testant des traitements sur des tissus provenant des iPS du malade).
Procédures
Injection d'une suspension de pré-embryons par voie basse (passage par voie vaginale) a l'aide d'une pipette adaptée. L'injection, qui ne dure que quelques secondes, se fera une seule fois, sur des animaux vigiles, et concernera la totalité des souris.
Impact sur les animaux
Les souris impliquées dans cette étude subiront 2 nuisances mineurs lors de la procédure 1: d'une part un inconfort passagé liée a l'introduction des sondes NSET pour l'implantation des pré-embryons, d'autre part un stress dû à la contention manuelle pour utiliser ces mêmes sondes NSET.
Devenir
Le prélèvement des embryons nécessitera l'euthanasie des souris.
Remplacement
Un modèle in vivo est indispensable car il n’est pas possible de récapituler la totalité du développement embryonnaire in vitro, ce qui est critique dans notre projet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été calculé en se basant sur les pourcentages de réussite d'implantations de pré-embryons connus et publiés.
Raffinement
Nous avons choisi une technique d’implantation ne nécessitant ni chirurgie ni anesthésie, préservant ainsi au mieux le bien-être des souris. 1) les animaux seront observés quotidiennement et leur état de santé évalué à l’aide d’une grille de score standard utilisée par notre équipe et les zootechniciens de l’animalerie. 2) Des points limites ont été définis afin d’anticiper toute souffrance à l’animal. En effet, les souris, comme tout être vivant peuvent développer des pathologies ou se blesser indépendamment des procédures menées. 3) Par soucis de respect de la hiérarchie de l’espèce, les groupes expérimentaux seront formés au moment du sevrage, et conservés intacts jusqu'à ce que les animaux soient utilisés pour la reproduction. 4) Les cages sont enrichies à l’aide de matériaux permettant l’expression des besoins comportementaux et physiologiques de l’espèce (morceau de bois, nestlets, lab nest, maison en carton,...).
Choix des espèces
Les modèles murins, et notamment la souche CD-1, sont parmi les modèles les plus répandus pour étudier le développement embryonnaire et pour pratiquer des implantations de pré-embryons. De plus, les iPs ont été obtenus originellement à partir de cellules murines transgéniques. Enfin, les souris présentent les avantages d'être des mammifères avec un cycle de vie, et notamment une période de gestation très courte, facilitant ainsi le déroulement de l'expérience. Les souris femelles CD-1 devront avoir atteint leur maturité sexuelle et peser au moins 26g avant d'être implantées. Nous estimons donc que 8 semaines est un âge adéquat.
Etude du rôle de RXRg durant la remyélinisation après consommation de Cuprizone.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent de la cuprizone dans leur nourriture pour détruire leur myéline pendant quatre à douze semaines, puis une injection létale afin de prélever leur cerveau, pour étudier le rôle du récepteur RXRg dans la remyélinisation. Le porteur affirme que la cuprizone n'entraîne ni douleur ni inconfort et laisse un comportement normal, tout en déclarant le projet en gravité modérée. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la remyélinisation, processus dynamique qui ne pourrait selon lui être observé que chez l'animal vivant.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune affectant le système nerveux central (SNC). Causée par une dysfonction du système immunitaire, elle engendre des lésions de la myéline qui provoquent des perturbations motrices, sensitives, cognitives, visuelles et autres. Les traitements actuels sont insuffisants pour empêcher la progression du handicap à moyen terme. La myéline est une gaine qui entoure les fibres nerveuses. Cette gaine est nécessaire pour une bonne conduction de l’influx nerveux. Lorsque la myéline est dégradée, elle doit être reformée par des cellules spécialisées. Toutefois, dans la SEP, la myéline est la cible du système immunitaire qui engendre une réaction inflammatoire excessive. A long terme, cette inflammation empêche la myéline de se reformer conduisant aux symptômes cités précédemment. Il est important de comprendre pourquoi la myéline n’est pas reformée. En effet, une stratégie thérapeutique serait de stimuler la régénération de la myéline. Grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées, nous étudierons comment la myéline se forme et comment différents facteurs peuvent stimuler sa régénération dans la SEP.
Bénéfices attendus
La myéline est une gaine biologique qui entoure les fibres nerveuses dans le système nerveux central. Cette gaine est nécessaire pour la transmission des informations entre les neurones. La dégradation de la myéline et son remplacement sont un processus physiologique naturel, toutefois chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP) la myéline est la cible du système immunitaire ce qui entraine différents troubles neurologiques tels que des troubles moteurs, et une réaction inflammatoire importante. Une des conséquences de cette réaction inflammatoire est d’empêcher la régénération de la myéline et donc de contribuer à la maintenance des troubles cités. Différents acteurs ont été identifiés comme facteurs stimulant la formation de myéline dans la SEP. En utilisant des souris modifiées génétiquement, nous déterminerons l’implication de ces facteurs dans la formation de myéline en conditions pathologiques. Ceci pourrait mettre en lumière un mécanisme de remyélinisation précis qui pourrait également ouvrir une nouvelle voie de recherche dans la SEP et vers de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Ici, n=300 animaux recevront un régime alimentaire comprenant de la Cuprizone pour générer une perte de myéline pendant différents temps (4, 5, 6, 12 semaines et un groupe deux fois 4 semaines). A l’issue de ces différents temps de consommation, les animaux ayant consommé la Cuprizone ainsi que les contrôles (n=30) non nourris à la Cuprizone pendant 5 semaines recevront une injection létale d’anésthésique et seront mis à mort. Le cerveau de ces animaux sera prélevé pour réaliser des analyses immunohistochimiques.
Impact sur les animaux
La cuprizone est un traitement introduit dans la nourriture qui induit une démyélinisation des neurones et une activation du système immunitaire. Ce traitement n’entraîne pas de douleur ou d’inconfort chez l’animal, et les symptômes moteurs liés à ce traitement, telle que la coordination motrice, sont faibles. De plus, le traitement à la Cuprizone n'engedrera aucune modification du comportement animal, les animaux auront un comportement tout à fait normal. Toutefois, au début de la consommation, une légère perte de poids peut être observée chez la souris bien qu'il y ait une absence de faim/soif chez l'animal. L’effet de la Cuprizone est également réversible, c’est-à-dire que l’arrêt de sa consommation entraîne la restauration de la myéline. Un dernier effet attendu est le léger stress généré chez l’animal par les injections intrapéritonéales d’anesthésique/analgésique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever les organes pour réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les modèles murins par un modèle in vitro dans cette étude pour trois raisons principales : (i) la myélinisation développementale ou remyélinisation est un processus dynamique et multifactoriel dépendant des activités de types cellulaires différents et ne peut être reproduit que chez un animal vivant dans son intégrité; (ii); une analyse de remyélinisation est espèce-dépendant, cependant la souris reste un très bon modèle de la myélinisation chez l’Homme; (iii) la souris est notre modèle de référence dans la recherche sur les récepteurs de vitamine A car c’est dans ce modèle que nous avons déjà identifié des programmes moléculaires contrôlés par ces récepteurs ainsi que des traitements pharmacologiques pour les futurs développements de nouvelles stratégies thérapeutiques. De plus, ce projet émane des nombreuses analyses menées préalablement in vitro sur des cultures primaires des oligodendrocytes, microglie ou des neurones qui nous ont amenées à proposer ce projet et tester in vivo nos hypothèses de travail.
Réduction
Dans ce projet, nous prévoyons d’utiliser 10 animaux par lot de chaque sexe. Ces effectifs tiennent compte de la variabilité inter-individus ainsi que de potentielles différencies liées au sexe. Les analyses seront réalisées avec des tests statistiques adaptés. Si des différences liées au sexe sont mises en évidence, des études plus poussées seront réalisées dans un second temps. Dans l’éventualité où des complications apparaissent durant l’expérience, 10 % d’animaux supplémentaires par lignée seront prévus (soit n=10 par lignée) afin de conserver un nombre suffisant de réplicat pour réaliser des analyses statistiques. Ceci représente un ajout de n=10 animaux/lignées, soit 30 animaux en plus. A des fins de réduction, les animaux générés en plus pourront servir aux différents temps de consommation de Cuprizone si besoin est. Il est possible que peu voire aucun animal ne meurt durant l’expérience. Dans ce cas, les 10% d'animaux supplémentaires prévus par lignée ne seront pas utilisés.
Raffinement
En vue de raffiner les procédures, les animaux sont hébergés en groupe dans des conditions optimales (dans des portoirs ventilés et avec un nid) et ils font l’objet d’un suivi adapté et régulier et de soins vétérinaires au besoin. Ici, nous ne nous attendons pas à engendrer une douleur/souffrance aux animaux. En effet, la Cuprizone est faiblement concentrée, les dégradations de myéline seront mineures et principalement localisées dans le corps calleux, ce qui ne devrait pas générer de phénotype durant le suivi expérimental. Quelques troubles de coordination motrices peuvent cependant être observés en début de traitement. De plus, une légère perte de poids peut être observée au début de la consommation de Cuprizone. Le poids corporel des animaux sera alors contrôlé avant, pendant, et après consommation de Cuprizone. Si une perte de poids comprise entre 5 % et 10 % est observée, de la nourriture gélifiée sera mise à disposition de la souris pour faciliter sa prise alimentaire. Si une perte de poids supérieure à 10 % est observée, l’animal sera exclu de la procédure. A l’issue de la consommation de Cuprizone, la procédure expérimentale sera réalisée sous anesthésie générale par injection d'un mélange d'anesthésique : analgésique afin d’éviter aux animaux tout ressenti douloureux. Les injections sont peu douloureuses également, et génèrent principalement un stress à l'animal. A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort par un manipulateur expérimenté en minimisant le stress animal.
Choix des espèces
La myéline est une gaine biologique qui entoure les neurones assurant ainsi leur protection d’une part, et la transmission des messages nerveux d’autre part. La dégradation de la myéline et son remplacement sont un processus physiologique naturel. Cependant, chez des patients atteints de sclérose en plaques (SEP), la myéline est dégradée par le système immunitaire ce qui engendre différents troubles moteurs et cognitifs, et une réaction inflammatoire importante. Cette dernière va empêcher la régénération de myéline et donc maintenir les troubles cités précédemment. Une stratégie thérapeutique serait de stimuler la régénération de myéline. Pour comprendre comment la remyélinisation se met en place, nous utiliserons le modèle murin puisque ce modèle récapitule très bien la myélinisation chez l’Homme. De plus, les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet nous permettent d’étudier des programmes moléculaires importants dans la régénération de myéline, et différents traitements pharmacologiques ciblant ce programme ont déjà été validés chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes (âgées de 8 semaines) pour évaluer la régénération de la myéline dans des conditions pathologiques mimant la sclérose en plaques.
Rôle de la protéine 1 dans les maladies chroniques du foie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 640 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 60 mises à mort sous anesthésie sans réveil. Rendues obèses par un régime gras sur trois à six mois, elles subissent des prises de sang répétées, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, puis une chirurgie de prélèvement des cellules du foie au cours de laquelle elles meurent. Le porteur indique que les injections intrapéritonéales peuvent provoquer des comportements de gêne ou de souffrance et des lésions au site d'injection. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro reproduisant les interactions entre organes et conclut au recours à la souris.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer des maladies du foie. Ces complications hépatiques ont augmenté dramatiquement en France, et affectent essentiellement les individus obèses. Aucun traitement n’est disponible. Il est crucial de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués pour proposer des approches thérapeutiques. Le premier stade de ces complications hépatiques est la stéatose hépatique (« foie gras »), de bon pronostic. Avec les années, les complications hépatiques peuvent progresser vers des stades graves (comme la cirrhose). Les mécanismes moléculaires qui sous-tendent l’évolution de ces maladies restent peu clairs. Parmi les mécanismes impliqués, l'activation d'une voie de stress à l'intérieur des cellules du foie jouerait un rôle crucial. Cette voie est transmise au niveau moléculaire par 3 protéines. Une sur-activation hépatique de ces voies a été mise en évidence dans le développement des complications hépatiques à la fois au sein de modèles murins et de chez l’homme grâce à des prélèvements (biopsies du foie). Nos résultats préliminaires publiés indiquent une activation de la voie de la protéine transmembranaire 1 dans la stéatose et sa transition vers les complications hépatiques, que nous souhaitons étudier dans ce projet. L’objectif est d’étudier spécifiquement son rôle dans les cellules du foie, lors du développement des complications hépatiques Ainsi, nous analyserons si l'absence de la protéine transmembranaire 1 dans les cellules du foie de souris protège du développement de la maladie. Nous prévoyons d'utiliser 700 souris sur une période de 5 ans. La règle des 3Rs est donc prise en compte ici de la façon suivante : pour satisfaire à la réduction, chaque procédure prévoit d'utiliser le nombre minimum d'animaux nécessaires à des études statistiques pertinentes. Pour le raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés et les personnes réalisant les procédures sont autorisées et appliqueront les règles d'éthiques. L'environnement sera enrichi pour diminuer le stress. Le suivi sanitaire régulier permettra d'identifier, le plus rapidement possible, les souris souffrantes et de prendre les mesures nécessaires. Enfin, conformément au principe de remplacement, notre hypothèse a été précédemment éprouvée in vitro. Il faut l'étudier dans un contexte plus physiologique, or il n'existe pas de modèle in vitro qui pourrait remplacer ces aspects.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider in vivo, nos résultats préliminaires obtenus in vitro. Nous pourrons ainsi mieux appréhender les mécanismes moléculaires (inflammation, métabolisme, mort cellulaire dépendants de la protéine transmembranaire 1) et comprendre leur impact dans la progression des complications hépatiques. Il n'existe pas de traitements des maladies hépatiques chroniques. La compréhension de ces mécanismes permettrait d'identifier des nouvelles cibles thérapetiques (IRE1 elle-même mais aussi des voies moléculaires qu'elle pourrait réguler).
Procédures
Pendant les régimes de 3 à 6 mois, les animaux seront soumis à 3 prises de sangs, de quelques minutes. Pour les tests de tolérance au glucose et à l’insuline, 1 seule injection est réalisée (avec le glucose ou avec l’insuline) puis le niveau de sucre dans le sang (glycémie) est mesuré 7 fois (une goutte de sang, lecture instantanée) pendant 2 heures. Le jour de la mise à mort, 1 prise de sang sera réalisée. Après l’injection unique de l’antibiotique, une seule prise de sang est réalisée avant la mise à mort de la souris. Pour la procédure chirurgicale permettant de récupérer les cellules du foie, l’animal est injecté une seule fois avec un mélange anesthésique/analgésique. L’animal meurt pendant la procédure. Après l’injection unique du composé inflammatoire, une seule prise de sang est réalisée avant la mise à mort de la souris.
Impact sur les animaux
Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la prise de poids chez l’animal. Les injections par voie intra-péritonéale pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, ...).
Devenir
Tous les animaux sont morts à la fin de chaque procédure. Le foie et les autres organes indiqués (tissu adipeux..) seront prélévés pour analyse histologique et moléculaire.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes (tests statistiques paramétriques). En utilisant ces tests, nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande de projet un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique (niveau de significativité 0.05) quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience. Si un résultat significatif est obtenu (niveau de significativité 0.05), une seconde expérience ne sera pas réalisée. Cet effectif prédictif est confirmé par G-Power.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, leur bien-être est scrupuleusement pris en compte dans toutes les procédures en termes de conditions d'élevage (température et de l'hygrométrie). L'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique avec présence de tige en coton et d'igloo dans les cages. De plus, les souris seront hébergées en groupe (6 souris par cage, et 5 souris par cage si plus une souris fait plus de 30g). Les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et mises à mort des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières (au moins une fois par semaine ou par jour en fonction des procédures) nous permettront d'identifier précocement tout changement physique (blessure), ou de comportement : animal prostré, animal manquant de soin (qui ne fait pas sa toilette) qui sont des signes de stress et de souffrance, d'appliquer les points limites que nous avons définis pour chaque procédure.
Choix des espèces
La souris est une espèce utilisée dans les études du métabolisme, particulièrement les maladies du foie pour ce projet. Le modèle murin est donc un modèle de choix, bien établit, pour l'étude de ces pathologies hépatiques. De plus, le modèle murin transgénique permet d'étudier précisément notre protéine d'intérêt et de répondre à la question de sa relevance thérapeutique. C'est un modèle disponible et utilisable, de surcroit doté d'une natalité importante. Notre laboratoire a des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. La similitude de son patrimoine génétique, avec celui de l’Homme, permet dans la mesure du possible, d'extrapoler les résultats à l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses biologiques, ainsi que protéiques, génomiques et histologiques. Compte tenu de tous ces arguments, il semblerait que ce soit le modèle le plus approprié dans notre cas. Dans toutes les procédures les souris seront âgées de 8-10 semaines. Le modèle animal de l’obésité nutritionnelle utilisé dans notre laboratoire consiste à mettre les animaux sous régime riche en lipides (à l’âge de 8-10 semaines) pour une durée allant de 12 semaines (3 mois : temps requis pour induire la stéatose) à 24 semaines (6 mois: temps requis pour induire la NASH).
Étude de l’implication de la protéine Pax6 dans l’inflammation du système nerveux à l’aide d’un modèle de souris de sclérose en plaques
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections pour supprimer la protéine Pax6, puis on leur induit une encéphalomyélite proche de la sclérose en plaques, jusqu'à une paralysie des pattes arrière qui déclenche leur mise à mort. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de démontrer le rôle de Pax6 dans un modèle animal et que les données ne peuvent être obtenues autrement. Il attend que la suppression de Pax6 aggrave la maladie et en avance l'apparition.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’implication de la protéine Pax6 dans l’inflammation du système nerveux à l’aide d’un modèle de souris de sclérose en plaques. La protéine Pax6 est essentielle à la formation du cerveau embryonnaire. Nos données récentes non publiées indiquent que cette protéine est importante pour contrôler l’inflammation du système nerveux, ce qui laisse penser que sa régulation puisse aider à traiter certaines maladies neurodégénératrices. La sclérose en plaques (SEP) est une maladie chronique inflammatoire du système nerveux central ou la gaine protectrice des neurones est détruite par des cellules immunitaires. Cela conduit à la dégradation des neurones et la perte de communication entre le cerveau et les organes périphériques. Les cellules immunitaires du cerveau qui participent à la réparation de la gaine protectrice, sont défectives chez les patients atteints de SEP. Toutes les données originales que nous venons d'accumuler des expériences réalisées sur des cellules suggèrent que la protéine Pax6 est présente dans ces cellules immunitaires du cerveau et a un rôle essentiel dans la régulation de l’inflammation dans ces cellules. Afin de confirmer ce lien, il est indispensable de le démontrer dans un modèle animal. Pour la première fois, nous testerons des souris qui présentent une inflammation sévère de type sclérose en plaques en présence ou non de la protéine Pax6.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de comprendre le rôle de la protéine Pax6 dans la régulation de l’inflammation du système nerveux. Elle ouvrira de plus des perspectives concernant toutes les pathologies neuroinflammatoires, de type Alzheimer, Parkinson, la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) et autres. Les données que nous obtiendrons permettront d'identifier de nouveaux outils pronostics et peut-être thérapeutiques pour ces maladies du système nerveux.
Procédures
- Les souris recevront une injection dans le ventre pendant 4 jours consécutifs d’un produit qui permet de supprimer la protéine Pax6 dans les souris qui ont une modification génétique spécifique pour ceci. Cette injection dure moins de 2 minutes. - Les souris recevront au moins 8 jours plus tard, deux injections en dessous de la peau et dans le ventre d’une combinaison des substances qui produisent le modèle de sclérose en plaques chez l'animal (EAE). Ce traitement consiste à injecter deux produits qui induisent une inflammation du système nerveux. Cette intervention dure moins de 15 minutes sur des souris anesthésiées pour ne pas induire du stress chez la souris. Toutes les souris seront quotidiennement observées pour le niveau de gravité de la pathologie et ceux qui présentent une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou souffrent de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pates avant seront immédiatement sacrifiées et analysées. Les autres seront sacrifiées au bout de 30 jours pour analyse.
Impact sur les animaux
Les souris permettant d’obtenir les souris étudiées après injection du produit, vivent normalement. Il a été démontré que ces souris continuent à vivre normalement après l’injection avec le produit et ne présentent aucune souffrance. Cependant, l’injection du produit pendant 4 jours consécutifs peut être une source de stress pour les animaux. Par la suite, l'induction de la maladie peut entraîner des souffrances aux animaux si la paralysie complète des pattes arrières et partielle des pattes avant est atteinte. Dans ce cas, les souris seront immédiatement euthanasiées et analysées. Enfin, nous nous attendons que la suppression de Pax6 après injection du produit dans les souris, va probablement induire la maladie plus tôt avec des symptômes plus forts.
Devenir
Les 120 souris étudiées (souris d’intérêts et souris contrôle) seront euthanasiées à la fin de l’étude, sauf celles qui présentent une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou souffrent de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pattes avant qui seront immédiatement euthanasiées et analysées. Toutes les souris seront euthanasiées. Des études post-mortem seront réalisées sur les cellules immunitaires prélevées à partir de cerveaux de ces souris.
Remplacement
Toutes nos données réalisées dans des cellules montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine Pax6 est exprimé par les cellules immunitaires du cerveau. Pax6 est connue comme essentielle au développement normal du cerveau et nos travaux récents démontrent qu'il régule aussi la réponse inflammatoire du cerveau. Nous utilisons une lignée de souris qui permet de supprimer la protéine Pax6 chez l'adulte car sa suppression au cours du développement de l'embryon est létale. Par ailleurs, le modèle de sclérose en plaques que nous utilisons chez la souris est simple expérimentalement. Il permet de mimer au mieux la sclérose en plaques chez l’homme, une des maladies sévères du système nerveux qui est liée à une inflammation des cellules immunitaires du cerveau. Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être actuellement obtenues par d’autres méthodes compte-tenu de la complexité physiologique du développement de l’inflammation du système nerveux. La suppression de la protéine Pax6 ne peut être fait que chez l'animal et la complexité du cerveau et des interactions entre les nombreux types cellulaires impliqués (neurones, cellules immunitaires) ne peut être reproduit par des cultures en trois dimensions à partir des cellules souches.
Réduction
Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir une puissance statistique pour tester nos hypothèses. D'après la littérature du domaine, le nombre d’animaux pour le modèle de sclérose en plaques que nous proposons est normalement fixé à 10 par groupe de témoins et d’animaux d’intérêt avec au moins 2 expériences reproductibles. Cependant, compte tenu de la variabilité de l’efficacité de la suppression de la protéine Pax6 par le produit injecté, nous avons besoin d'augmenter sensiblement le nombre de souris traitées pour obtenir suffisamment de souris à comparer en présence et absence de Pax6. Donc, nous allons utiliser 10 souris par groupe pour 4 expériences indépendantes. Si dans la première expérience, l’efficacité du produit injecté et le développement de la maladie présentent peu de variabilité, nous pourrons réduire le nombre d’expériences. De plus, pour réduire le nombre total de croisement et donc de souris, nous utiliserons aussi bien des femelles que des mâles, le modèle de sclérose en plaques ne montrant pas de différence dans le développement de la maladie due au genre.
Raffinement
Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées dans des portoirs ventilés, 5 individus par cage. La température, l'hygrométrie, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec 1 bâtonnet en bois, des cotons et du kraft. Avant les injections sous la peau, les souris seront anesthésiées, pour éviter l’induction de stress. Des points limites suffisamment précoces et prédictives ont été définis pour éviter toute douleur, souffrance et angoisse infligée aux animaux. Ces points limites concernent l’apparence, le poids, le comportement et les signes cliniques de chaque animal. D’ailleurs nous avons choisi une dose des substances injectées pour induire la maladie, qui permet un bon développement des symptômes sans induction de douleur et sans perte significatif de poids. A partir du moment où les souris présentent une queue molle et faiblesse des pattes postérieures après l’induction de la maladie, nous veillerons à disposer de la nourriture dans la cage sous forme d’hydrogel (gel rempli d'eau). Cela permettra aux souris de continuer de s’hydrater et s’alimenter sans difficulté. Dans des cas rares des petits ulcères formés sur les sites d’injection, ceux-là seront traités avec une pommade cicatrisante après désinfection. Le suivi quotidien de l'état des souris permettra de réagir immédiatement en cas de souffrance par leur mise à mort dès la détection d’une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pates avant. Ces points limites seront surveillés 1 fois par jour (état général et pesée). Enfin, nous nous attendons à ce que la suppression de Pax6, qui est un facteur anti-inflammatoire, va probablement induire la maladie plus tôt avec des symptômes plus forts. Si notre hypothèse est correcte, nous allons raccourcir la durée de l’expérience.
Choix des espèces
Nous travaillons sur la souris car c’est le meilleur modèle pour réaliser des animaux avec des mutations génétiques et comparer les phénotypes de ces animaux avec les pathologies humaines. Les souris avec des mutations génétiques sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques des différentes maladies. L’objectif du projet est d’étudier le développement de l’inflammation du système nerveux en présence ou absence de la protéine Pax6 grâce à un modèle de sclérose en plaques chez la souris. Toutes nos données obtenues dans des expériences réalisées sur des cellules démontrent que la protéine Pax6 est présente dans les cellules immunitaires du cerveau. Cette protéine a un rôle essentiel dans la régulation de l’inflammation dans ces cellules. Afin de confirmer ce lien, il est indispensable de le démontrer dans un modèle animal. Nous utilisons une lignée de souris qui permet de supprimer la protéine Pax6 chez l'adulte, alors que sa suppression à la naissance est létale (développement précoce anormal du cerveau). Par ailleurs, le modèle de sclérose en plaques chez la souris est simple expérimentalement. Il permet de mimer au mieux la sclérose en plaques chez l’homme, une des maladies sévères du système nerveux qui est liée à une inflammation des cellules immunitaires du cerveau. Toutes les souris seront adultes, âgées de 6-8 semaines pour le traitement avec le produit. L’efficacité de la suppression de la protéine Pax6 induite par le produit aura atteint son maximum 8 jours après la dernière injection, donc les souris auront de 7 à 12 semaines au moment d'induire la maladie.
Manipulation des enzymes de synthèse de la dopamine en conditions inflammatoires et dimensions motivationnelles
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont maintenues à 90 % de leur poids pendant environ huit semaines, subissent une chirurgie stéréotaxique de quatre-vingt-dix minutes, un régime hypercalorique de treize semaines puis une injection de lipopolysaccharide, pour étudier le lien entre inflammation, dopamine et "fatigue". Le porteur indique que le lipopolysaccharide provoque un comportement de maladie avec fièvre et perte d'appétit pendant une douzaine d'heures. Il affirme que ces dimensions comportementales ne sont pas modélisables in vitro ou in silico.
Objectifs
De nombreuses études cliniques montrent que l'inflammation peut conduire au développement de symptômes dépressifs, en particulier la "fatigue". Ce projet vise à déterminer si et comment la manipulation d'enzymes de la voie de synthèse de la dopamine sélectivement au sein de la voie mésocorticolimbique est suffisant pour restaurer les troubles motivationnels induits par un état inflammatoire.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de comprendre comment l'inflammation perturbe la transmission dopaminergique, et si manipuler la voie de synthèse de la dopamine mésocorticolimbique pourrait permettre de réverser les troubles motivationnels induits par l'inflammation.
Procédures
Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) durant environ 8 semaines - 1 chirurgie stéréotaxique d'environ 90 minutes- Exposition chronique à des régimes hypercaloriques pendant environ 13 semaines- Administration aigue de lipopolysaccharide (quelques secondes).
Impact sur les animaux
Une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) a des effets très limités pour l'animal. Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. L'exposition chronique à des régimes hypercaloriques conduit au développement d'une obésité. L'administration aigue de lipopolysaccharide induit un comportement dit "de maladie" (fièvre, perte d'apétit, etc..) pendant une douzaine d'heure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons une stratégie de croisements génétiques qui permettra l'utilisation de tous les animaux de la descendance et comparerons les mâles et les femelles. Du fait de cette stratégie, tous les animaux (génotypes et sexes) issus de nos croisements seront utilisés. Le nombre d'animaux nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes.
Raffinement
Tous les efforts seront faits pour réduire la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en cages collectives et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage: - Perte de poids anormale (15% score 1, 15-20% score 2) - Comportements anormaux (poil hérissé, prostration,...) score 3 - Signes neurologiques score 2 Si un score entre 9 et 12 persiste pendant plus de 48h les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale suivie de décapitation. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h.
Choix des espèces
Ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris. Les animaux expérimentaux seront utilisés à l'âge adulte (>8 semaines) puisque le projet vise à évaluer les conséquences fonctionnelles des manipulations de la synthèse de dopamine sur le cerveau mature.
Raffinement d’une technique chirurgicale pour l’étude du développement cérébral chez la souris EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des femelles gestantes subissent une électroporation in utero de trente minutes, puis des animaux sont anesthésiés et mis à mort par injection intracardiaque d'un fixateur, l'objet du projet étant de comparer des méthodes de mise à mort pour prélever du tissu cérébral. Le porteur indique que l'électroporation peut entraîner jusqu'à 10 % de mortalité fœtale et de rares difficultés de mise bas. Il présente ce travail comme un "raffinement" servant aussi le bien-être des animaux non-humains, tout en le classant en gravité sévère.
Objectifs
Le cortex cérébral est la région du cerveau responsable des fonctions cérébrales les plus élevées comme par exemple la perception sensorielle, le langage, la mémoire, les actions volontaires et la motricité. L’organisation du cortex cérébral repose sur des milliards de cellules appelées neurones, qui forment des connexions appelées synapses. L’étude de la formation du cortex cérébral pendant le développement embryonnaire est essentielle pour comprendre le fonctionnement cérébral dans des conditions normales, mais également pour comprendre pourquoi le cerveau dysfonctionne dans un certain nombre de maladies telles que l’épilepsie ou le retard mental, qui touchent presque 1 enfant sur 100 dans les pays industrialisés. Ce projet entre dans le cadre général d'études du développement du cortex cérébral, et en particulier de la fonction de gènes qui participent à la régulation de la production d’énergie neuronale. Pour atteindre ce but, il est nécessaire de prélever des tissus neuronaux chez des embryons de souris ou chez des souriceaux. Ce projet a pour but de raffiner la méthode par laquelle nous réalisons la mise à mort de souris pour prélever du tissu cérébral au laboratoire. afin d’identifier la méthode qui minimise la souffrance des animaux, tout en garantissant des résultats scientifiques de qualité.
Bénéfices attendus
Ce projet répond à une problématique scientifique et une problématique de bien-être animal. Il permettra d’optimiser les conditions expérimentales pour une expérience utilisée par de nombreux laboratoires en neurosciences, afin de garantir la robustesse et la validité des résultats scientifiques. Par ailleurs ce projet permettra de choisir les conditions expérimentales minimisant les souffrances subies par l’animal, constituant en cela un raffinement de la procédure expérimentale.
Procédures
Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie péri/post-opératoire, appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Des animaux seront anesthésiés et mis à mort par injection intracardiaque d'un agent de fixation histologique (durée entre 5 et 10 minutes selon la méthode testée).
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes subiront une procédure chirurgicale avec réveil, sous anesthésie, une seule fois, d’une durée de 30 minutes. Dans de rares cas, nous pouvons observer une difficulté à la mise bas. Les infections sont en théorie possibles, mais en pratique jamais observées. L’électroporation peut entraîner une mortalité fœtale (estimée à 10 pour cent maximum des embryons électroporés). La procédure n’a pas de conséquence sur le développement du souriceau et il est impossible de distinguer après la naissance les souriceaux électroporés de souriceaux non électroporés, en dehors de l’expression de protéines fluorescentes.
Devenir
Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique et seront donc mises à mort en fin de procédure. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements postmortem.
Remplacement
L’étude des tissus par microscopie est indispensable pour comprendre l’organisation d’un tissu complexe tel que le cortex cérébral. Puisque ce projet a pour but de raffiner lune méthode réalisée sur l'animal, il est impossible de remplacer ce projet par une méthode alternative n'utilisant pas l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base de notre expérience préalable. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation de la fluorescence au moyen d’une lampe LED au moment de la naissance, ce qui permettra de détecter très tôt un éventuel problème expérimental (échec de l’électroporation) et de ne pas réaliser de procédure de perfusion intracardiaque inutilement sur un souriceau qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude. Pour ce projet, il nous faudra réaliser au minimum deux chirurgies. Ces deux premières portées seront analysées immédiatement pour déterminer si nous atteignons le nombre d’animaux cible de l’étude, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement en réalisant d’autres chirurgies. L’histologie cérébrale sera réalisée en aveugle, et les paramètres mesurés seront comparées par des tests statistiques appropriés. Nous tirerons par conséquent un maximum d’information des animaux inclus dans l’étude.
Raffinement
Ce projet a pour finalité de définir les conditions de mise à mort des animaux pour obtenir un résultat robuste. Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort des animaux. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, nous utilisons dans l’équipe des outils d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information pour chaque animal. Le transport des souriceaux de la zone d'élevage à la zone d'expérimentation est rapide et sera adapté pour limiter le stress subi par les animaux.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des maladies du neurodéveloppement. Nous avons choisi un modèle de souris car il présente les avantages suivants : - une structure proche du cortex cérébral humain, - un développement embryonnaire rapide (21 jours) et un développement postnatal court (21 jours pour des circuits neuronaux « matures »), - une petite taille adaptée à des préparations histologiques (embryon entier) sur une seule lame. Par ailleurs, la méthode chirurgicale que nous souhaitons raffiner est bien établie chez la souris ce qui nous assure que le projet est faisable et permettra de répondre à la problématique scientifique de ce projet et de projets ultérieurs. Les femelles gestantes seront des adultes entre 8 et 24 semaines, selon la disponibilité des animaux chez le fournisseur agréé. Les souriceaux seront utilisés au moment du sevrage (21 jours), correspondant à l’âge utilisé classiquement lors de l’essentiel des études de connectivité corticale.
Caractérisation de l’efficacité de nouveaux agents bloquant les récepteurs CB1R sur l’obésité induite par un régime gras et sur la néphropathie induite par la Streptozotocine chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les unes reçoivent de la streptozotocine par injection cinq jours de suite pour induire un diabète, les autres un régime gras pour devenir obèses, puis toutes sont gavées douze jours avec trois composés bloquant les récepteurs CB1. Le porteur indique un risque important de déshydratation chez les animaux diabétiques et une possible dermatite chez les animaux obèses. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur l'organisme entier et qu'aucun modèle cellulaire ne peut se substituer totalement au modèle animal.
Objectifs
L’obésité et ses conséquences métaboliques sont de plus en plus répandues et souffrent d’un manque de traitements pharmacologiques fiables. Les pathologies liées à l’obésité sont nombreuses et incluent le diabète lui-même facteur de risque de néphropathie. La néphropathie diabétique (ND) consiste en une perte de fonction rénale pouvant déboucher sur insuffisance rénale chronique touche des millions de patients dans le monde et malgré les efforts de recherches, peu d'options thérapeutiques sont disponibles. Récemment, 3 composés visant à bloquer une nouvelle cible (A , B et C) ont été sélectionnés pour être testés in vivo après avoir démontré une absence de toxicité à travers plusieurs approches de modélisation informatique et de tests in vitro. Ainsi, notre objectif est de tester l’efficacité in vivo de ces 3 composés chez 2 modèles animaux différents. Procédure 1 : chez un modèle de souris diabétique de type 1 Procédure 2 : chez un modèle de souris rendue obèse suite à une alimentation riche en graisse.
Bénéfices attendus
Le diabète et l’obésité représentent un véritable enjeu de santé publique ; ces pathologies étant classées parmi les urgences sanitaires du XXIème siècle du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. À ce jour, malgré des efforts et des recherches considérables, peu d'options thérapeutiques restent disponibles pour les cliniciens pour traiter ou ralentir l’évolution de ces pathologies et de leurs complications. L’étude, le développement et la caractérisation de nouvelles cibles et de nouveaux agents pharmacologiques apparaît donc primordial afin de remédier à ce besoin médical non satisfait. Les bloqueurs des récepteurs aux cannabinoïdes 1 présentent un intérêt certain, l’un d’eux est d’ailleurs actuellement en cours d’évaluation au sein d’une étude clinique de phase II avec comme indication, la ND.
Procédures
Pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local et la quantité de sang total prélevée à un moment donné sera d’environ de 2 à 2,5 μL afin de pouvoir réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et n’aura lieu que 2 fois par animal pour la procédure 1 et 7 fois pour la procédure 2. Les injections intrapéritonéale de streptozotocine auront lieu quotidiennement pendant 5 jours consécutifs pour chaque souris. Pour chaque injection, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes. Pendant les 12 jours de traitements, les drogues seront administrées par voie orale via gavage. Pour chaque gavage, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes.
Impact sur les animaux
Tout au long de ce projet, l’état général des animaux obèses et des animaux diabétiques sera surveillé quotidiennement car bien que ces pathologies ne soient pas des points limites, les conséquences qu’elles génèrent peuvent être une source de dérèglements internes. Ainsi les risques de déshydratations sont très importants chez les animaux diabétiques et nécessite une attention particulière. Pour le modèle d’obésité, une prise de masse trop importante peut entraîner une difficulté d’accès à la nourriture et à l’eau de boisson. De plus un excès d’apport alimentaire en lipides peux également entraîné le développement passager de dermatite.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.
Remplacement
L’obésité et le diabète sont des pathologies multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences métaboliques et les pathologies associées, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.
Réduction
Pour le modèle STZ, la sévérité de la pathologie est estimée par la mesure du degré d’hyperglycémie et d’albuminurie développé par les animaux. Dans le cas où un test non paramétrique serait nécessaire, nous utiliserons le test non paramétrique de Mann-Withney. Le minimum d’animaux par groupe pour atteindre la significativité de différence de traitement est de 8-10. Toutefois, ce nombre pourra être réduit dès que la significativité sera atteinte. Pour le modèle d’obésité, la même approche sera employée en analysant la perte de poids et la diminution de quantité de graisse contenue dans le foie.
Raffinement
Depuis leur arrivée en provenance du fournisseur, les souris seront hébergées en groupe afin d’éviter l'isolement. De plus, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Lors des 4 dernières semaines, les souris seront hébergées individuellement afin de permettre l’évaluation quotidienne de la prise alimentaire. A nouveau, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Tout au long de ce projet, plusieurs mesures de raffinement sont prévues.
Choix des espèces
L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Son métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. L’induction du diabète et de l’obésité sera réalisée chez des souris de 6 semaines. Pour le modèle STZ (streptozotocine), les souris seront âgées de 20 semaines au du début des traitements pharmacologiques et de 22 semaines lors de la mise à mort. Pour le modèle d’obésité, les souris seront âgées de 22 semaines au du début des traitements pharmacologiques et de 24 semaines lors de la mise à mort. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique telles que le diabète et ses conséquences sur la fonction rénale normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte.