Souris

36 souris vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal recoit une puce sous-cutanee sous anesthesie, passe des tests comportementaux (Live Mouse Tracker en arene, apprentissage sur ecran tactile) puis une injection d'un produit convulsivant qui provoque des myoclonies et quelques crises, avant d'etre tue par perfusion intracardiaque de fixateur pour prelever le cerveau. Le porteur fait l'hypothese d'alterations moderees du comportement, proches des troubles autistiques, et affirme qu'etudier le developpement du cerveau impose un "organisme entier". Les benefices avances relevent de la comprehension de maladies neurologiques dont l'autisme.

Objectifs

L’hormone thyroïdienne est essentielle pour le bon développement du cerveau chez les mammifères. Un défaut de celle-ci au cours du développement du cerveau induit des troubles neurologiques tels que retards mentaux, défauts de concentration, épilepsie, défauts de contrôle du mouvement. Les mécanismes par lesquels l’hormone thyroïdienne agit sur le cerveau sont mal compris. Il a été montré récemment qu'un récepteur de l’hormone thyroïdienne joue un rôle majeur, notamment dans les neurones dits inhibiteurs. Parmi ces neurones inhibiteurs, une sous-population particulièrement sensible a été identifiée : des neurones qui expriment une protéine appelée parvalbumine. Chez l’homme, des pathologies telles que l’autisme, l’épilepsie et la schizophrénie sont associés à un déficit de neurones à parvalbumine. De plus, chez la souris, l’invalidation du gène de la parvalbumine induit des altérations du comportement qui évoquent les troubles du spectre autistique. L’objectif de ce projet est d’évaluer si le blocage de l'hormone thyroïdienne uniquement dans les neurones à parvalbumine induit des modifications de comportement chez la souris. Nous faisons l’hypothèse que ces souris pourraient présenter des altérations modérées de leur comportement, potentiellement en lien avec les troubles autistiques.

Bénéfices attendus

L'étude du rôle de l’hormone thyroïdienne dans les neurones à parvalbumine permettra de mieux comprendre le développement du cerveau chez les mammifères. Plus précisément, les résultats de ce travail contribueront à mieux comprendre ce qui se passe chez les patients atteints de pathologies affectant cette hormone thyroïdienne. Plus largement, comme les neurones à parvalbumine jouent un rôle majeur de coordination de l’activité dans le cerveau, les résultats de cette étude devraient améliorer notre connaissance de l’origine de plusieurs maladies neurologiques, dont l’autisme.

Procédures

Une implantation sous-cutanée d'une puce constituera la seule intervention que subiront les animaux. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique durant une durée de 30 minutes maximum. Les animaux consommeront de l'eau acidifiée pendant le test Touch Screen (21 jours). Une injection d'un produit pro-convulsivant: durée moins d'une minute. Une injection de produits anesthésiques: durée moins d'une minute

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux subiront une implantation d'une puce, permettant l'identification par radiofréquence, en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse. Lors des périodes d'analyse du test Live Mouse Tracker, ils seront simplement transférés dans une arène de 50 cm de côté qui disposera de sciure, boisson et aliment qu'ils pourront explorer. Pour le test du Touchscreen, l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test (21 jours). Suite à l’injection d'un agent pro-convulsivant par voie intrapéritonéale, les animaux présenteront des myoclonies (contractions rapides et brutales des muscles) et peu de crises cloniques (spasmes rythmés) et toniques (augmentation accrue du tonus musculaire ou raideur). Enfin, les animaux seront anesthésiés avec un mélange d'anesthésiques avant d’être perfusés par voie intracardiaque avec une solution tampon et un fixateur de tissus afin de préléver leurs cerveaux pour réaliser des analyses histologiques.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin de réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

L'objectif de ce projet étant d'étudier le rôle de l'hormone thyroïdienne dans le dévelopement du cerveau, il est nécessaire de travailler sur un organisme entier, car il est actuellement impossible de reproduire in vitro le développement du cerveau. A cet égard la souris est un modèle pertinent, car elle présente une organisation du système nerveux proche de celle de l'Homme. Des études in vitro sont réalisées en parallèle, notamment pour aborder les aspects moléculaires de l'hormone thyroïdienne.

Réduction

D’après notre expérience, les paramètres comportementaux présentent en général une grande variabilité interindividuelle, il est nécessaire de prévoir 12 souris par groupe pour pouvoir conclure statistiquement. En fonction de la répartition des données nous utiliserons des tests paramétriques ou non paramétriques pour mettre en évidence des différences significatives dans les résultats des tests comportementaux entre les groupes expérimentaux (mutants vs contrôles). A l’issue de l’étude comportementale, nous avons prévu de prélever les cerveaux de 6 souris de chaque groupe, de façon à disposer de matériel biologique qui permettra de prolonger l’étude par une exploration histologique, si les tests comportementaux révèlent des différences entre souris exprimant la mutation et souris témoins. Cela évitera de générer une nouvelle cohorte de souris pour l’histologie, le cas échéant. Le nombre de 6 par groupe est suffisant pour conclure statistiquement sur les paramètres histologiques.

Raffinement

Afin de réduire l'inconfort et le stress des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test. Des phases de récupérations entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Chaque animal sera ainsi suivi avant les expériences afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt avant l’expérimentation voire l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle pour étudier le rôle de l'hormone thyroïdienne dans l'organisme car elle joue un rôle similaire chez la souris et chez l'homme. De plus, c'est actuellement la seule espèce chez laquelle existent différentes lignées premettant de bloquer cette hormone dans un type cellulaire choisi. Cette étude comportementale sera réalisée sur des souris adultes, âgées de 16 à 20 semaines au début des tests, de façon à ce que le développement du cerveau soit terminé au début de l’étude.

370 souris porteuses d'une mutation de la sclerose laterale amyotrophique vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. A deux jours de vie, les souriceaux recoivent une injection d'un virus dans le cerveau apres anesthesie sur glace, subissent une echographie sous anesthesie, puis sont tues pour analyse histologique du cerveau. Le porteur indique que les injections entrainent une perte d'animaux, liee a leur jeune age et au rejet par la mere, et affirme que le modele murin reste "indispensable" faute de pouvoir modeliser la distribution d'une therapie genique sans organisme vivant. Les retombees pour les patients sont presentees comme un prerequis a d'eventuels essais chez l'homme.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurologique caractérisée par une mort sélective des motoneurones. Son issue est fatale en quelques années après le diagnostic, par paralysie progressive provoquant une insuffisance respiratoire. L'incidence et la prévalence de la SLA sont dans le monde respectivement de 2 et 8/100 000 personnes et concernent principalement les personnes de plus de 40 ans. La durée de vie après le diagnostic est d'environ 2 ans. Malgré les efforts déployés pour comprendre la physiopathologie de la SLA, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. Certains cas de SLA sont présents au sein d’une même famille, on parle de SLA familiale. Elle est due à des mutations de gènes. L'une d'elle provoque des SLA extrêmement sévères, avec un début des symptômes entre l’adolescence et la quarantaine et une progression très rapide menant au décès en quelques mois suivant le diagnostic. Afin de reproduire cette mutation, un modèle de souris SLA présentant la mutation a été généré. Ces souris développent un phénotype moteur associé à une perte progressive des motoneurones. La thérapie génique est une approche prometteuse, notamment par modification du génome pour corriger cette mutation. Les virus adéno-associés (AAV) en thérapie génique servent de « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles. Ils sont souvent utilisés en raison de leur non toxicité et de leur stabilité à long terme dans le cerveau de rongeurs, de primates, mais aussi chez l'homme. Néanmoins, l’injection d’AAV chez des souris de 6 semaines n’a pas permis l’expression du virus chez les souris à l’âge adulte. Une hypothèse serait que l'expression du virus se fasse à un stade trop tard du développement cérébral. L'objectif de ce projet est de réaliser des injections avec des AAV dans un modèle de souris SLA, afin de valider leur effet thérapeutique. Dans un second temps, le comportement moteur des animaux sera analysé afin de valider l'effet de la thérapie génique.

Bénéfices attendus

Cette étude nous apportera une meilleure compréhension de la SLA et des traitements possibles. Le modèle de souris SLA permettra de tester des approches thérapeutiques permettant de reverser les symptômes de ces souris et d’améliorer leur survie. Malgré les efforts déployés pour comprendre la physiopathologie de la SLA et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. La prise en charge des patients repose majoritairement sur des traitements améliorant leur qualité de vie et une thérapie pluridisciplinaire prodiguées par des professionnels de santé. La compréhension de la physiopathologie de la maladie est donc indispensable à la conception d’un traitement adapté à chaque forme de SLA. Cette étude chez un modèle de souris SLA est un prérequis pour tester ces traitements chez l’Homme ensuite.

Procédures

Une seule injection sera réalisée en intracérébrale avec un vecteur AAV ou une solution véhicule (NaCl) chez chaque souris à l'âge de deux jours. Les souris seront anesthésiées sur la glace. Le temps total de la procédure est de 10 min : Anesthésie sur glace de la souris : 10 min (cela inclus le temps d'endormissement de l'animal (état d'inconscience) et la préparation à l'injection (désinfection du crâne, prise de coordonnées.) Injection intracérébrale de la souris : 25 sec Une échographie sera réalisée une fois par souris, elle nécessite que l’animal soit sous anesthésie. La procédure dure environ 20 min par souris.

Impact sur les animaux

Une perte du nombre d’animaux est attendue lors des injections, également à cause du jeune âge des animaux et du rejet de la mère après les injections. L'échographie se déroule quant à elle sous anesthésie à l'isoflurane pendant toute la durée du test. Les animaux seront rasés et une crème dépilatoire hypoallergénique sera appliquée.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin d'effectuer des analyses histologiques.

Remplacement

Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l’aspect intégré des pathologies neurologiques. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l’homme pour réaliser ce projet de recherche. Du fait de la complexité du mécanisme que nous étudions, le modèle animal comme la souris reste indispensable. De plus, on ne sait pas modéliser aujourd’hui la distribution d’un traitement de thérapie génique dans un organisme sans le tester dans un organisme vivant tel que la souris.

Réduction

Les effectifs ont été mis en place suite aux prérequis statistiques et aux résulats de notre étude pilote, permettant tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés d'obtenir une réponse statistiquement significative et exploitable, en prenant en compte la variabilité interindividuelle. Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies d’analyses comportementales nous ont permis de démontrer qu'un nombre de minimum de 18 souris pour le test comportemental est nécessaire. Notre étude pilote nous a montré qu’un taux de 70% de réussite au niveau du site d’injection était obtenu après les injections intracérébrales. Nous avons ainsi défini le nombre d’animaux nécessaires en prenant en compte ces paramètres ainsi que le fait que le génotype sera inconnu au moment de l’injection, les pertes des animaux lors des chirurgies ainsi que le potentiel rejet des mères après les injections. En fonction de la normalité des données (répartition en cloche) les tests statistiques paramétriques ou non paramétriques seront utilisés afin de comparer les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Lors des injections, en cas de signe de souffrance, le personnel qualifié pourra décider de l'arrêt de la chirurgie et de l'euthanasie de l'animal. Lors des chirurgies les mères seront isolées de leur portée. Les souriceaux seront injectés et après le réveil ils seront réintroduits dans leur cage initiale. Ils seront marqués avec leur propre urine afin de masquer toutes odeurs liées à la procédure chirurgicales. Cela évitera un rejet de la mère. Les mères seront réintroduites dans leurs cages une fois la portée injectée et réveillée. Les cages ne seront pas changées lors de la période post-opératoire (48h minimum). Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C). Cette couverture possédant une sonde thermique elle nous permettra de réaliser un retour progressif à 37°de la température corporelle du souriceau. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure. Lors des injections les souris seront anesthésiées sur glace, il s'agit d'une méthode couramment utilisée pour induire une anesthésie chez les rongeurs avant l'âge de 7 jours lors d'interventions chirurgicales. Cette technique a été validée comme sûre et efficace et repose sur le fait que les très jeunes rongeurs sont poïkilothermes (c’est-à-dire régulent leur température avec celle de l'environnement). L'hypothermie profonde fournit à la fois une immobilisation et une analgésie de l'animal.

Choix des espèces

Dans le domaine de recherche sur les maladies neurologiques, la souris est un modèle de choix. Les études réalisées avec ce modèle sont reproductibles et simples d'un point de vue expérimental. Les souris présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l'homme. Enfin, nous possédons une grande expertise avec ces modèles et le matériel chirurgical et médical est adapté à ce modèle. Les animaux seront injectés à P2, à un stade précoce du développement cérébral, pour permettre une expression optimale du matériel génétique.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques d'anorexie mentale, elles subissent une chirurgie d'implantation d'une pompe sous la peau, un isolement de dix-neuf jours, des lavages vaginaux quotidiens pour les femelles et deux IRM de deux heures sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyses. Le porteur indique que la chirurgie et les prélèvements peuvent provoquer de la douleur, prise en charge par analgésiques. Il affirme qu'un animal vivant est "nécessaire" pour étudier l'effet du traitement sur le poids et la prise alimentaire, en vue d'un essai clinique chez l'humain.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier par IRM l’effet d’un traitement pour la prise en charge de l’anorexie mentale (AM) sur la structure et les fonctions cérébrales chez la souris. L’AM est une maladie complexe et multifactorielle avec une auto-restriction de l’apport alimentaire et entrainant des troubles de la reproduction qui persistent même après rémission. La régulation de la fonction de reproduction repose sur la communication entre certains neurones de notre cerveau : les neurones qui sécrètent l’hormone gonadolibérine (neurones à GnRH), l’hypophyse et les gonades (ovaires et testicules). Toute perturbation des neurones à GnRH entraîne une perturbation importante de cette communication. Des études par imagerie par résonnance magnétique (IRM) ont montré une altération de la structure et du fonctionnement de certaines aires cérébrales dans l’AM. Nous avons développé un modèle de souris chez lequel nous bloquons génétiquement la sécrétion de GnRH de ces neurones. Ces souris mangent beaucoup moins que celles qui ont des neurones à GnRH fonctionnels, mais il en résulte des souris femelles plus grosses que des souris sauvages et des mâles plus maigres et plus petits que des souris contrôles. Ce modèle mime une partie des caractères physiopathologiques de l’AM. L’implantation sous la peau de petites pompes délivrant des taux physiologiques de GnRH de manière physiologique chez ces souris, permet de restaurer une prise alimentaire et un poids normal. Ces données laissent penser que les neurones GnRH pourraient être impliqués dans les maladies nutritionnelles comme l’AM ou l’obésité. Les objectifs de ce projet sont : - de caractériser notre modèle de souris sur le plan cérébral, tant anatomique que fonctionnel en se basant sur ce qui est connu sur le sujet dans l’AM. Cette caractérisation servira de référence pour l‘étude des effets du traitement ; - d’étudier l’impact du traitement à la GnRH sur la structure et le fonctionnement du cerveau afin d’obtenir des arguments solides des effets positifs du traitement sur ces paramètres en vue d’un passage en essai clinique chez l’humain. Dans ce but, nous acquerrons en IRM à haute résolution des images anatomiques et fonctionnelles du cerveau de nos souris modèles avant et après traitement à la GnRH.

Bénéfices attendus

L’AM est une pathologie qui touche essentiellement des populations jeunes et représente la pathologie psychiatrique la plus mortelle. A ce jour, aucun traitement pharmacologique n’existe et le risque de rechute est de 41 %. La re-nutrition et la prise en charge psychologique échouent dans la grande majorité des cas. De plus, la prévalence de cette maladie ne cesse d’augmenter, notamment depuis le début de la crise sanitaire liée à la pandémie de Covid-19. Les professionnels de santé qui prennent en charge cette maladie sont démunis face au taux de rechute et à l’inefficacité à long terme de la renutrition. Les patients de leurs côtés ne disposent pas de prise en charge efficace et durable ce qui conduit au décès de 10% des patients. Une meilleure compréhension de l’effet du traitement au GnRH dans le modèle préclinique devrait permettre, à l’issue du projet, de démarrer un essai clinique de prise en charge chez l’humain. Notre but est de potentialiser l’effet de la prise en charge nutritionnelle et psychiatrique par un traitement mettant l’organisme dans de bonnes conditions métaboliques pour favoriser le retour à un état physiologique. Ce traitement porte un espoir de guérison pour ces patients sans solution thérapeutique.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie courte (10-15 minutes) sous anesthésie générale pour implanter la petite pompe sous la peau au niveau de leur dos. Après la chirurgie les animaux seront isolés pendant 19 jours, pour le suivi de la prise alimentaire. Les femelles auront un lavement vaginal d’une durée de moins de 30 secondes par souris et qui seront réalisés tous les matins de la période du traitement soit sur une durée de 19 jours. Pour les mâles, l’indication connue du bon fonctionnement du traitement est le retour d’un taux de présence normale de testostérone dans le sang. Avant et après le traitement, les animaux auront une petite prise de sang pour doser cette hormone dans le sang. Cela représente deux prélèvements d’une durée maximale de 30 secondes par souris. Pour les deux sexes, les souris auront deux sessions d’IRM, l’une avant, et l’autre après le traitement. Le passage en IRM est prévu pour une durée moyenne de deux heures, les souris sont anesthésiées.

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire à l’implantation des pompes sous la peau pour délivrer le traitement peut générer de la douleur chez l’animal. Les lavements vaginaux sont non douloureux mais peuvent être inconfortables pour la souris. Ils seront réalisés par une personne formée et habituée à les réaliser. La prise de sang peut générer une douleur ponctuelle au moment de la piqûre. Elle sera réalisée par un expérimentateur formé. Les animaux seront suivis très scrupuleusement pluri-quotidiennement tout au long du protocole afin de repérer tout signe de douleur et d’y pallier par l’administration d’analgésiques dans les plus brefs délais. Enfin les animaux seront placés en hébergement individuel après la chirurgie afin de mesurer leur prise alimentaire.

Devenir

A l’issue des deux IRM toutes les souris du protocole seront euthanasiées afin de procéder aux analyses anatomiques et histologiques des organes après traitement

Remplacement

Nous étudions les effets d’un traitement sur la modulation de la structure et du fonctionnement du cerveau chez d’un modèle préclinique de souris pour un test d’efficacité du traitement juste avant le transfert chez l’humain. Cela nous limite dans la possibilité de remplacer les animaux utilisés par des solutions alternatives qui ne soient pas des animaux vivants. De ce fait, nous avons besoin d’un animal vivant pour étudier l’effet du traitement sur les améliorations des paramètres pertinents comme le poids ou la prise alimentaire, ce que l’on ne pas reproduire autrement. Il faut aussi pouvoir détecter d’éventuels effets néfastes, déterminer les durées idéales du traitement, analyser ses effets positifs et comprendre les mécanismes d’action du traitement pour permettre son utilisation en clinique humaine.

Réduction

Notre recherche vise à explorer des processus physiologiques et physiopathologiques de l’anatomie cérébrale et des fonctions cérébrales en réponse à l’administration du traitement à la GnRH. Nous avons déterminé le nombre maximal d’animaux en fonction des nécessités expérimentales pour réaliser des statistiques significatives. Les analyses des IRM se feront pour chaque souris juste après le passage dans l’imageur sans attendre que toutes les souris aient été examinées. Nous avons choisi une méthode permettant de faire un suivi longitudinal. Ainsi, les mêmes souris sont utilisées pour la première IRM, pour le traitement et pour l’observation des effets du traitement après la seconde IRM. De plus, l’IRM est une méthode qui permet d’étudier de nombreux paramètres sur un même animal : la structure et le fonctionnement du cerveau et tous les paramètres cérébraux qui pourraient être modulés par le traitement. Cela permet de réduire considérablement le nombre d’animaux et le nombre d’expériences à réaliser pour obtenir ces informations si nous n’avions pas recours à l’IRM.

Raffinement

Les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulées par le même chercheur, qui s’en occupera quotidiennement et ne changera pas au cours du protocole. Cela permet aux souris de s’habituer à la présence et à l’odeur de l’expérimentateur et de limiter le stress des animaux lorsqu’ils commenceront le protocole. Les souris devront voyager entre leur animalerie d’élevage et l’animalerie du site où le projet se réalise. Un temps de 15 jours sera laissé pour leur permettre de s’habituer à la nouvelle animalerie et se remettre du stress généré par le transport. Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée conventionnelle, en groupe jusqu’à la chirurgie, puis isolés. Les animaux disposeront de matériel d’enrichissement (papier pour faire un nid, morceau de bois à ronger) et maisonnettes en plastique pour les animaux en groupe. Une fois isolés les animaux n’auront plus de maisonnette à disposition, la pompe en gênant l’accès. Les animaux seront de nouveau manipulés par le chercheur pour se réhabituer à lui dans la nouvelle animalerie. Une première IRM sera réalisée par une personne qualifiée et spécialiste de la pratique de cet examen chez la souris. L’IRM n’est ni invasive, ni douloureuse et se déroulera sous simple anesthésie générale. Les souris subiront ensuite une chirurgie courte pour implanter les pompes sous cutanées permettant de délivrer le traitement. La chirurgie se fera sous anesthésie générale avec application d’un antiseptique sur la plaie pour éviter tout risque d’infection. Par la suite, du paracétamol sera délivré dans l’eau de boisson pour pallier aux douleurs liées à l’acte chirurgical, jusqu’à cicatrisation de la plaie. Les animaux seront suivis tous les jours pour repérer et prendre en charge immédiatement tout signe de douleur. Si des signes de douleurs persistants se manifestent, l’animal sera sorti du protocole. La seconde IRM se pratiquera dans les mêmes conditions que la première. L’euthanasie sera effectuée par un chercheur habitué à réaliser cette intervention et après injection d’un analgésique et sous anesthésie.

Choix des espèces

Le protocole d’étude du traitement de la GnRH a été mis au point chez la souris. Nous utilisons la même espèce pour permettre d’obtenir une répétabilité du protocole dans des conditions identiques. Le traitement est étudié chez un modèle de souris génétiquement modifiée qui permet d’obtenir un phénotype mimant des traits pathologiques de l’anorexie mentale, pathologie pour laquelle nous étudions le traitement. L’utilisation de souris génétiquement modifiées est donc indispensable à l’étude du traitement en phase préclinique. Les animaux utilisés sont de adultes de 4 à 8 mois parce que l’étude des effets de l’hormone GnRH nécessite d’utiliser des animaux adultes. Le vieillissement agit sur la fonction de reproduction et la régulation de la prise alimentaire, c’est pourquoi nous ne dépasserons pas l’âge de 8 mois. Nous avons déjà des données préliminaires chez des animaux dans cette tranche d’âge et la nécessité de pour pouvoir comparer les données impose de respecter cette limite d’âge.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles d'une maladie osseuse pédiatrique, elles subissent des radiographies sous anesthésie à quatre reprises, un isolement de deux heures en cage à urines et des injections de fluorochromes, avant d'être tuées pour prélever leurs os. Le porteur décrit ces actes comme une simple gêne passagère, malgré la gravité modérée déclarée. Il affirme que l'effet de l'inhibition de l'inflammation sur l'os ne peut être caractérisé qu'à l'échelle d'un "organisme entier".

Objectifs

La maladie osseuse pédiatrique rare qui nous intéresse est caractérisée par le remplacement de l’os des mâchoires par un tissu mou fibreux appelé granulome. Cette pathologie se met en place vers 3 à 5 ans et est d’origine génétique. Les lésions caractéristiques de cette maladie sont toujours symétriques et bilatérales et peuvent ne concerner que des zones restreintes de la mandibule ou au contraire toutes les mâchoires jusqu’au plancher de l’orbite. Cette pathologie est caractérisée par une inflammation chronique qui serait responsable de la dégradation de l’os des mâchoires. L’hypothèse que nous avons émise est qu’en inhibant l’inflammation par l’invalidation d’un gène de l’inflammation, le phénotype osseux serait résolu. Ainsi les souris modèles du chérubisme ont aussi été invalidées pour ce gène impliqué dans l’inflammation. Nous allons étudier le phénotype osseux de ces souris à 4, 6, 8 et 10 semaines

Bénéfices attendus

L’impact de l’inhibition de l’inflammasome sur le phénotype osseux (dégradation de l'os des mâchoires) ne peut être caractérisée qu’à l’échelle d’un organisme entier. L’étude de l’effet de l’inhibition de l’inflammasome sur le phénotype osseux pourrait ouvrir des pistes de thérapie pour le chérubisme, une maladie pédiatrique rare et pour le moment ne bénéficiant d’aucun traitement.

Procédures

Le phénotype osseux des souris est exploré par un examen radiographique à 4, 6, 8 et 10 semaines qui nécessite une anesthésie et qui dure 5 minutes, un seul recueil d’urines en cage métabolique (durée maximale 2h) pour l’analyse des marqueurs osseux urinaires, l’injection de 2 fluorochromes pour analyser la formation dynamique de l’os (2 minutes par injection).

Impact sur les animaux

Aucun autre dommage que d’être manipulé pour l’injection (anesthésies et injections de fluorochromes) et isolé pendant 2h maximum n’est envisagé dans le cadre de la caractérisation du phénotype osseux. Les injections, peuvent éventuellement provoquer une gêne très passagère mais qui ne nécessite pas de médication particulière.

Devenir

Les animaux concernés par cette procédure sont mis à mort pour réaliser des prélèvements post-mortem des os et des caecum qui permettront de caractériser le phénotype osseux et l’apparition du granulome du chérubisme.

Remplacement

La mutation d’un gène particulier est responsable du développement du chérubisme. La culture de cellules mutées in vitro a déjà fourni des informations sur les voies de signalisation impliquées dans le développement du chérubisme mais toutes ces études préalables in vitro sont menées sur des cellules de patients. Or, ces derniers ne peuvent être diagnostiqués que quand le granulome est déjà installé. C’est pourquoi une souche murine répondant aux besoins de l’étude a été préalablement généré. L’utilisation de ce modèle nous permettra d’observer les interactions entre l’inflammation et le développement du phénotype osseux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques solides. Leur nombre (48) a été restreint au minimum indispensable pour obtenir des données nécessaires à la caractérisation de l’impact de l’invalidation de l’inflammasome sur le phénotype osseux (dégradation de l’os) du chérubisme. L’analyse préalablement publiée du modèle à 10 semaines permet d’estimer la puissance statistique de nos analyses et l’échantillonnage nécessaire pour caractériser les effets biologiques souhaités.

Raffinement

Les mesures de densité minérale osseuse, seront effectuées tous les 15 jours sous anesthésie avec analgésie. Le temps de radiographie sera d’environ 5 minutes par animal et il sera surveillé jusqu’à son réveil. Le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs assureront une surveillance quotidienne. Nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux aux différents temps de la procédure qui se résument à 6 injections intrapéritonéales (anesthésies et injections de fluorochromes dilués dans du sérum physiologique), 2h maximum d’isolement en cage métabolique. L’assurance d’une anesthésie profonde sera vérifiée par un test de l’abolition du réflexe des extrémités. Cependant, dans l’éventualité d’apparitions de points limites mentionnés plus loin, une surveillance plus fréquente et un apport de nourriture gélifiée seront mis en place. Les animaux seront hébergés sous conditions standards - température 20/24°, cycle jour/nuit 12h/12h, hygrométrie entre 50/55%. Enrichissement : tunnel de carton, nids en papier kraft, maisonnette rouge, bâtons à ronger.

Choix des espèces

Suite aux raisons déjà invoquées dans la section 5.10 / item « remplacement », il a été nécessaire pour mettre en œuvre ce projet de générer un modèle murin répondant aux besoins de notre étude. La densité minérale osseuse des animaux sera évaluée à 4,6, 8 et 10 semaines, dernier temps de l’étude où les animaux seront euthanasiés pour l’analyse plus précise car le phénotype osseux d’ostéolyse est clairement observable.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales puis peut être traité par chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie, avec prélèvements sanguins et imagerie sous anesthésie, avant d'être tué pour prélever organes et fluides. Le porteur reconnaît que le développement de la tumeur et des traitements encore mal connus peut provoquer des effets délétères et des douleurs. Il affirme qu'aucune méthode de substitution n'existe pour évaluer une nouvelle molécule contre le cancer du sein, l'animal restant selon lui un "passage obligatoire" avant l'humain.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments dans des modèles pertinents de cancers du sein.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de démontrer que les traitements testées sont actifs dans un modèle de cancer du sein et aussi d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage chez l'être humain.

Procédures

Les animaux recevront une greffe de cellules tumorales. Dès lors, ils pourront être traité par chirurgie, radiothérapie et/ou traitements chimiothérapeutiques. En cas de prélèvement de sang ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à 1 par semaine et à un volume inférieur à 10 %. Un suivi par imagerie pourra être réalisé sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne < 10 min) ou encore par IRM (durée moyenne = 30 min).

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères. De même, l’utilisation de traitement novateur pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les procédures chirurgicales d'exérèse induiront des douleurs suite à l'incision et à la cicatrisation. Les effets de la radiothérapie.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués le développement de la tumeur ou encore par le produit / modèle chez les animaux.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le cancer du sein. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : classiquement 10 par groupe en fonction de l’effet thérapeutique attendu. L’analyse statistique sera par la comparaison des groupes d'animaux en fonction du traitement réalisé.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • des conditions d'hébergements garantissant la non-contamination des animaux immunodéficients

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles d'une maladie musculaire génétique, elles reçoivent des injections de molécules thérapeutiques, dont des injections rétro-orbitaires, puis sont soumises chaque mois pendant un an à des tests de locomotion et de force sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyser leurs muscles. Le porteur indique n'étudier que les premières étapes des symptômes et tuer les animaux avant la phase terminale de la maladie. Il juge le modèle animal "indispensable" car aucun modèle cellulaire ne reproduit les troubles de la locomotion et de la force.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la correction des altérations locomotrices et de la force musculaire chez des souris modèles d’une maladie humaine musculaire, la dystrophie myotonique, pour laquelle il n’existe pas de traitement. Cette pathologie est due à une anomalie de l’ADN qui entraine un affaiblissement des muscles squelettiques. Ayant précédemment identifié le mécanisme de cette faiblesse musculaire, nous souhaitons désormais développer une approche thérapeutique pour cette maladie. Plus précisément, nous souhaitons injecter en intraveineux différentes molécules thérapeutiques, que nous avons précédemment validées en modèle cellulaire, dans des souris adultes modèle de la dystrophie myotonique, et ceci afin d’étudier la correction du phénotype locomoteur et de la force musculaire de ces animaux. Pour cela nous effectueront une batterie de test non invasif de la locomotion et une mesure de la force musculaire de ces animaux chaque mois sur une période d’environ un an. Nous espérons que cette approche nous permettra d’ouvrir une piste thérapeutique pour cette maladie.

Bénéfices attendus

Nous avons besoin de modèles animaux pour développer une approche thérapeutique pour la dystrophie myotonique, car il n’existe pas de modèle in vitro ou de système cellulaire pour étudier la faiblesse musculaire et les altérations de la locomotion caractéristiques de ces pathologies. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour étudier cette maladie. Enfin, l’analyse de la correction de la faiblesse musculaire dans ce modèle murin a un véritable intérêt pré-clinique pour développer et tester des pistes thérapeutiques pour une maladie humaine musculaire.

Procédures

1 – Les injections en intrapéritonéale, notamment d’agents anesthésiques, requièrent moins d'une minute. 2 – Les injections rétro-orbitaires de virus associés aux adénovirus adénovirales (AAV) ou d’oligonucléotides antisens (ASO), requièrent entre 30 secondes et 1 minute par animal. 3 – L’analyse de la locomotion se fait par une batterie de tests non invasifs réalisés chaque mois et ceci sur une période de 12 mois. Ces tests s’étalent sur une durée de 2 semaines selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal. 4 – La mesure de la force musculaire est réalisée en 4 à 8 minutes sous anesthésie gazeuse. Cette mesure est répétée chaque mois (mais en décalage de 15 jours avec les tests locomoteurs) et ceci sur une période de 12 mois.

Impact sur les animaux

Nous souhaitons étudier une maladie musculaire touchant les adultes, et ceci en utilisant un modèle animal, nous nous attendons donc à l’éventuelle apparition d’altérations locomotrices et de faiblesse musculaire chez ces souris. Toutefois, afin de limiter la douleur induite par les symptômes, nous n’étudierons que les premières étapes de l’apparition de ces symptômes et les animaux seront euthanasiés avant que la phase terminale de la maladie n’apparaisse. De plus, les tests locomoteurs que nous utiliserons pour évaluer l’apparition de ces altérations sont classiques, non invasifs et sans douleur. De même, il est à noter que la mesure de la force musculaire se fait sous anesthésie.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs muscles squelettiques pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie musculaire causée par une mutation génétique, la dystrophie myotonique. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. De plus, nous avons établi précédemment que le modèle souris est un bon modèle animal d'étude de cette maladie.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents nous ont permis d’établir les doses de molécules thérapeutiques à injecter, les temps d'analyses et que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera le type de molécule thérapeutique et compte tenu de notre projet d’analyser 7 types et/ou doses de traitements sous deux conditions (contrôle ou pathologique), nous estimons que l’étude de 168 animaux sur 3 à 5 ans est nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. De plus, afin de limiter d’éventuelles douleur induite par l’apparition de symptômes locomoteurs, nous n’étudierons que les premières étapes de l’apparition de ces symptômes et les animaux seront euthanasiés avant que la phase terminale de la maladie n’apparaisse. Toutefois, si des signes de douleur apparaissaient (réduction de l’appétit, diminution de la mobilité et du comportement exploratoire, tendance à l’isolement, poil terne et hérissé, dos voûté), nous ferons alors un traitement analgésique et anti-inflammatoire. De plus, de la nourriture gélifiée sera de plus mise à disposition de l'animal dans la cage dès les premiers signes de problème moteur pour palier tout risque de réduction de prise de nourriture. Enfin, en cas de douleur forte (isolement, immobilité, automutilation, cachexie, etc.) et/ou d’échec des traitements précèdent ; les animaux seront euthanasiés rapidement pour éviter toute souffrance et l’expérience stoppée.

Choix des espèces

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie musculaire causée par une mutation génétique. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. Nous allons étudier des approches thérapeutiques sur le comportement locomoteur et la force musculaire chez des souris adultes, en effet la maladie musculaire que nous étudions touche les adultes, donc des souris sevrée et adultes. Enfin, nous suivrons le comportement locomoteur et la force musculaire de ces animaux sur une période de 12 mois. Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la maladie étudiée.

102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux mâles reçoivent à deux jours de vie une injection de streptozotocine qui détruit une partie de leur pancréas, puis un régime gras et des prélèvements sanguins répétés, avant d'être tués pour prélever le foie, les mères et souriceaux femelles étant également tués. Le porteur teste un composé contre la stéatose hépatique dans un modèle qu'il indique avoir validé "avec le client". Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'étudier l'efficacité réelle d'un composé sur cette maladie.

Objectifs

La stéatose est l’accumulation de graisses à l’intérieur de cellules qui, normalement, n’en contiennent pas ou peu. Le foie, qui comporte très peu de graisses lorsqu’il est sain, peut être le siège de cette concentration. On parle alors de stéatose hépatique. Ainsi, un foie qui contient trop de graisses (triglycérides) est un foie stéatosique. La stéatose hépatique est fréquemment associée à l’obésité mais certains sujets non obèses peuvent présenter cette pathologie. Au début, l’accumulation de triglycérides dans les cellules du foie est responsable d’une stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD - non alcoholic fatty liver disease). Dans cette forme simple, le foie est très riche en graisses et des mesures hygiéno-diététiques permettent la guérison. Le foie retrouve alors son aspect normal. Si la surcharge en triglycérides se poursuit, le foie devient le siège d’une inflammation appelée hépatite. C’est la stéato-hépatite non alcoolique (NASH - Non Alcoolic Steato Hepatitis). L’inflammation ne disparait pas, elle va au contraire s’aggraver avec le temps. Il est possible qu’elle évolue vers la fibrose hépatique. Après plusieurs années, elle peut devenir une cirrhose, avec un risque élevé de cancer hépatique. Malheureusement, il n’existe actuellement aucun traitement médicamenteux approuvé et montrant une efficacité certaine pour la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD - Non Alcoholic Fatty Liver Disease) ou la stéatohépatite non alcoolique (NASH - Non Alcoolic Steato Hepatitis). Le présent projet vise à tester l'efficacité d'un composé en développement visant à traité la stéatose hépatique dans un cadre préclinique. L'objectif est donc d'obtenir une preuve de concept de l'efficacité avant de pousser plus en avant le développement du composé, notamment vers les stades cliniques.

Bénéfices attendus

Si la présente étude permet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur la stéatose hépatique, ces deniers seront employés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché. Ils constitueraient ainsi les tout premiers traitements autorisés pour la prise en charge de la stéatose hépatique.

Procédures

Les souris gestantes seront mise à mort après sevrage des souriceaux. Aucune autre intervention n'est prévue. Les souriceaux recevront une administration de streptozotocine (un agent induisant une destruction partielle du pancréas) à deux jours postnatal (durée de la procédure : 2 minutes envron). Après sevrage, les femelles seront euthanasiées. En effet, il est bien connu que les souris femelles présentent un niveau de résistance élevé au développement de la stéatose comparativement aux souris mâles. Les mâles seront soumis à une alimentation classique (8-10 animaux) ou une alimentation enrichie en graisse (HFD 60% de l'énergie apportée par les lipides; 24-30 animaux) pendant 64 jours (D0-D63). Des prélèvements sanguins seront pratiqués via la veine caudale à D28, D35 et D49 Ces prélèvements ont rapides (durée < 5 minutes). A D63 les mâles seront euthanasiés et un prélèvement sanguin terminal et des prélèvements d'organes seront pratiqués.

Impact sur les animaux

Le modèle employé est un modèle de stéatose hépatique. Le développement de la stéatose est limité dans ce modèle et ne pousse pas jusqu'à la fibrose et aux carcinomes hépatique. Le stade de stéatose (dit "NASH") ne s'accompagne pas d'effet secondaires ni d'effets néfaste. C'est d'ailleurs une des raisons qui expliquent qu'en clinique humaine la stéatose est très mal diagnostiquée avant le stade de développement de cancers du foie. Les administrations de streptozotocine (un agent induisant une destruction partielle du pancréas) et les pélèvements sanguins sont susceptibles d'induire un stress et une légère douleur.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des anayses biochimiques et histologiques sur les foies (y compris femelles reproductrices et souriceaux femelles) qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’efficacité réelle d’un composé sur la stéatose hépatique. Nous avons choisi un modèle utilisant l'espèce souris qui est parfaitement caractérisé dans la littérature scientifique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et la stéatose hépatique. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les femelles gestantes seront hébergées individuellement, et ce jusqu'au sevrage des souriceaux. Un enrichissement sera apporté sous forme d'igloo et de matériel de nidification. Après sevrage, les mâles issus des portées seront hébergés en cages collectives (4 souris/cage) et un enrichissement du milieu sera assuré par l'ajout d'igloos et de briquettes de bois spécifiques pour rongeurs. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis, notamment l'emploi d'analgésie pour soulager la douleur le cas échéant.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6 est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques et de la stéatose hépatique. C'est également ce modèle qui est classiquement utilisé pour l'obtention du modèle STAM. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux mâles seront utilisés entre leur naissance et 12 semaines d'âge. Il est nécessaire de partir de souriceaux puisque le modèle STAM demande une administration de streptozotocine (un agent induisant une destruction partielle du pancréas) deux jours après la naissance. Ce modèle se développe ensuite grâce à la mise sous alimentation enrichie en graisse à partir du sevrage (ici à 4 semaines) et jusqu'à la fin de l'étude.