Souris

2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux chirurgies pour implanter puis retirer une pompe diffusant de la bléomycine sous la peau, avec prélèvements sanguins et imagerie, afin de tester des candidats-médicaments contre la sclérodermie. Le porteur indique que les souris développent une fibrose cutanée et interne accompagnée d'une perte de poids. Présentant le projet comme celui d'une "compagnie", il affirme que le recours aux modèles animaux est "indispensable" pour tester l'efficacité de ces thérapies.

Objectifs

La sclérodermie est une maladie chronique d'étiologie inconnue, caractérisée par une fibrose diffuse, des anomalies vasculaires de la peau, des articulations et des organes (œsophage, voies digestives basses, poumons, cœur et reins). Les symptômes fréquents comprennent le phénomène de Raynaud, les polyarthralgies, la dysphagie, le pyrosis et la tuméfaction et, finalement, des sténoses cutanées et des rétractions des doigts. L'atteinte du poumon, du cœur et des reins est la cause de la plupart des décès. Le diagnostic est clinique, mais les examens biologiques confortent le diagnostic et facilitent l'établissement du pronostic. Le traitement spécifique est difficile et l'accent est souvent mis sur le traitement des complications. Le but de notre compagnie est de développer de thérapies capables d'inhiber ces cibles et d'interférer avec l'évolution de la maladie. Grâce à la miniaturisation, nous avons pu mener plusieurs campagnes de criblage à haut débit qui ont permis d’identifier des molécules chimiques ou des cibles biologiques capables de bloquer ces voies de signalisation in vitro. Ces molécules vont être optimisées dans le but d’en faire des médicaments. Dans le cadre de ce projet, les candidats-médicaments qui auront montré un potentiel significatif d’inhibition des voies de signalisation ciblées dans les différentes pathologies seront retenus pour être évalués in vivo sur des modèles animaux de sclérodermie. Ce programme de découverte de médicaments sera mené avec plusieurs séries chimiques agissant via des modes d’action moléculaires différents, mais tous pertinents dans l’objectif de diminuer les symptômes des différentes pathologies d’intérêt. Des combinaisons entre ces modes d’actions seront envisagées au cours de ce programme et testées sur les modèles animaux. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies utilisées. Les études in vitro apportent des informations sur l’efficacité, la puissance et la sélectivité de nouveaux agents thérapeutiques potentiels. En complément de ces modèles, les expérimentations chez l’animal qui permettent de préserver l’intégrité des organes impliqués dans la pathologie, leurs interactions cellulaires et leurs interactions avec les systèmes nerveux, endocrine, circulatoire, gastro-intestinal, immunitaire sont indispensables.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de sclérodermie.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie conduisant à l’implantation puis une deuxième chirurgie pour l’explantation d’une pompe osmotique contenant de la bléomycine sous la peau du dos. Chirurgies réalisées sous anesthésie gazeuse puis suivie d’une administration de buprénorphine (locale et/ou eau de boisson). Un prélèvement sanguin (100µl) sera réalisé à la veine submandibulaire sous anesthésie gazeuse au cours de l’étude. Un suivi de la pression partielle en oxygène pourra être réalisé (jusqu'à 3 fois) au cours de l’étude sur animal vigile (5min) Une évaluations de la fibrose pulmonaire pourra être réalisées par imagerie au rayon X sur animal anesthésié à l’isoflurane (jusqu'à maximum 3 fois au cours de l'étude).

Impact sur les animaux

Les animaux développeront les signes cliniques de la sclérodermie qui se caractérisent par une fibrose cutanée diffuse ainsi qu’une augmentation de la fibrose des organes internes associée à une perte de poids.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour les besoins de prélèvements.

Remplacement

La fibrose tissulaire est une pathologie complexe mettant en scène de nombreux acteurs cellulaires, fibroblaste, cellule épithéliales, cellule endothéliale et cellules immunitaires. Dans ce contexte, l’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité de thérapies anti-fibrotique innovantes pouvant interagir à diffèrent niveaux de la cascade de la pathologie. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro puis leur tolérance a été validée avant d’être utilisées dans des études plus larges.

Réduction

Nous utilisons des modèles établis dans la littérature . Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05. Les paramètres mesurés seront gardés ou exclus selon qu'ils suivent une distribution normale et présentent une variabilité acceptable. L'analyse statistique concerne des séries indépendantes, supérieures à 2 groupes. L'analyse de variance (ANOVA) sera suivie d'un test paramétrique ou non paramétrique en fonction de la configuration de l'étude, permettant des comparaisons multiples (e.g. Dunnett). Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec des aspens, igloos, et feuilles de cellulose à déchirer ou du sizzle-dry. Afin de pallier l'inconfort lié à la procédure incluant de la chirurgie cutannée, un programme d'anesthésie sera envisagé par inhalation d’isoflurane (induction 4%, maintien 2%) et un schéma à base de buprénorphine à 0,01-0,2 mg/kg/8h en sous cutanée sera utilisée avant et après la chirurgie. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée dans le cadre de ces recherches est la souris. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour ce modèle, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-fibrotique, sur un système immunitaire mature

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intracrânienne de lentivirus pour induire un gliome, avant d'être mises à mort en raison du développement tumoral. Le porteur, dont les rubriques restent très brèves, n'annonce pas d'effets indésirables et vise à valider la protéine Rad18 comme cible contre le glioblastome. Il affirme que la validation in vitro ne suffit pas et qu'un contexte plus global reste "indispensable".

Objectifs

Obtenir une preuve de concept pour valider Rad18 comme nouvelle cible thérapeutique pour le traitement du glioblastome

Bénéfices attendus

Améliorer l'espérance de vie des patients atteint de glioblastome

Procédures

Injection intracranial de lentivirus

Impact sur les animaux

Pas d'effets indésirables

Devenir

Mis à mort car développement tumorale

Remplacement

La validation de la cible par approche in vitro ne saurait être suffisante pour étudier l’effet de l’inhibition de la protéine Rad18 sur l’efficacité de la chimiothérapie. En effet, la réponse à la thérapie est également contrôlée par le microenvironnement tumoral. Les modèles de culture in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs ni la difficulté pour une molécule d’atteindre les cellules cibles. Il est donc indispensable de valider notre preuve de concept dans ce contexte plus global qu’il est impossible de reproduire à l’heure actuelle in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux est maintenu au strict minimum (5 par conditions) afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

L’hébergement, l’enrichissement et la manipulation des animaux répondent à la règlementation pour le bien-être des animaux. Pour les protocoles expérimentaux, lorsque cela est nécessaire, l’animal est manipulé sous anesthésie (induction des tumeurs et traitement thérapeutique des animaux). Une grille d’évaluation de la douleur avec des points limites spécifiques du protocole est mis en place pour assurer une prise en charge adaptée de l’animale en expérimentation (perte de poids supérieure à 15% de leur masse en quelque jours, changements de comportement et des réactions de l'animal, un déficit moteur, déshydratation, entre autres).

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris transgéniques Knock-out Rad18 (rad18 -/-) de fond génétique C57bl6. L’invalidation du gène Rad18 ne donne lieu à aucun phénotype dommageable à part une stérilité partielle chez les mâles. Rad18 est surexprimé dans les cellules souches de cancer comme le glioblastome. La protéine Rad18 intervient dans les mécanismes de réparation d’ADN et de la tolérance aux lésions de l’ADN. La dérégulation de Rad18 peut avoir un potentiel oncogénique inattendu sur l’efficacité de la thérapie. Cela fait de cette lignée, un modèle pertinent pour les expérimentations de xénogreffe de lentivirus induisant des gliomes malins ayant des caractéristiques histologiques et morphologiques similaires au glioblastome multiforme de l’homme. Des souris de 8 semaines seront utilisées pour ces expériences. La prise tumorale est plus efficace chez des animaux jeunes et à ce stade du développement ces souris sont sevrées et leur âge n’affecte pas les résultats obtenus.

3 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lignées génétiquement déficientes en facteurs de coagulation subissent l'induction d'un saignement articulaire par une aiguille dans le genou ou d'une lésion musculaire par injection de cardiotoxine, pour étudier les atteintes osseuses et musculaires de l'hémophilie. Le porteur indique que la douleur est gérée par une échelle de score et de la buprénorphine, une souris atteignant le score maximal étant mise à mort. Il rattache le projet à des financements des laboratoires Baxter et Takeda et affirme que l'accès limité aux échantillons humains rend le recours à la souris "nécessaire".

Objectifs

Ces pathologies étant des maladies rares orphelines, il est nécessaire d'avoir recours à des modèles animaux (souris) mimant la pathologie humaine pour pouvoir mieux comprendre l'impact de la déficience de ces facteurs et de proposer des approches thérapeutiques complémentaires. Ce projet a pour objectifs : 1) de caractériser l’impact d’un saignement ou d’une blessure sur la biologie des tissus ostéoarticulaires et musculaires ; 2) de caractériser l’impact des facteurs recombinant de modulation de la coagulation (utilisés en clinique) sur la régénération des tissus musculaires et les tissus ostéoarticulaires ; 3) de tester l’efficacité de facteurs de substitution aux facteurs de coagulation sur la protection tissulaire.

Bénéfices attendus

Ces pathologies étant des maladies rares orphelines, il est nécessaire d'avoir recours à des modèles animaux (souris) mimant la pathologie humaine pour pouvoir mieux comprendre l'impact de la déficience de ces facteurs et de proposer des approches thérapeutiques complémentaires. Ce projet a pour objectifs : 1) de caractériser l’impact d’un saignement ou d’une blessure sur la biologie des tissus ostéoarticulaires et musculaires ; 2) de caractériser l’impact des facteurs recombinant de modulation de la coagulation (utilisés en clinique) sur la régénération des tissus musculaires et les tissus ostéoarticulaires ; 3) de tester l’efficacité de facteurs de substitution aux facteurs de coagulation sur la protection tissulaire.

Procédures

Lésion articulaire : Induction d’un saignement par l’introduction d’une aiguille de 30,5 gauge et injection de 5 microlitres de solution saline dans la cavité articulaire du genou. Ce geste sera pratiqué au maximum 1 fois par animal. Lésion musculaire : Induction d’un saignement intramusculaire à l’aide d’une aiguille intramusculaire ou induction d’une lésion musculaire par injection intramusculaire de 0,1 mL de cardiotoxine. Ce geste sera pratiqué au maximum 1 fois par animal. Il n'y aura pas de prélèvements sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les patients hémophiles (déficience en FVIII ou FIX, déficients en facteur von Willebrand) ont des troubles de la coagulation mais présentent également une ostéopénie, une sarcopénie et des altérations du processus inflammatoire. Les aspects moléculaires de ces troubles restent mal connus. Ces pathologies étant des maladies rares orphelines, il est nécessaire d'avoir recours à des modèles murins mimant la pathologie humaine pour pouvoir mieux comprendre l'impact tissulaire de l’hémophilie et de proposer des approches thérapeutiques. Ce projet a fait l’objet d’un premier financement par les laboratoires Baxter (travail franco-américain) et deux financements actuels par Takeda. Selon la procédure interne de ces laboratoires, un projet complet a été déposé intégrant la justification de la problématique des pertes musculosquelettiques dans l’hémophilie et des approches expérimentales proposées (incluant l’expérimentation animale décrite ici). Ces dossiers ont été expertisés et a fait l’objet d’échanges avant d’être validé par la direction scientifique de ces 3 laboratoires.

Devenir

Ils seront tous mis à mort

Remplacement

L’hémophilie et la maladie de von Willebrand sont des maladies rares. L’accès aux échantillons humains est très limité en particulier en lien avec les risques hémorragiques et est essentiellement restreint à des cohortes de sérums. Ce faible accès rend impossible l’étude du rôle des facteurs de coagulation sur les différents tissus. Des souris génétiquement invalidées pour ces facteurs miment la pathologie humaine et permettent de mieux appréhender la pathogenèse de la maladie et le développement de nouvelles approches thérapeutiques en particulier les pertes osseuses et musculaires. Le nombre d’animaux utilisés pour caractériser l’effet de ces facteurs sur les tissus osseux, musculaire et immunitaire et développer de nouvelles approches thérapeutiques sera limité au strict minimum afin d’obtenir des résultats fiables.

Réduction

Pour la réduction d'animaux, nous optons pour des études avec plusieurs molécules testées en parallèle pour avoir un groupe contrôle pour plusieurs molécules. Le nombre d'animaux utilisé pour mener à bien ce projet sera réduit au strict minimum pour pouvoir aboutir à des résultats fiables.

Raffinement

Concernant le raffinement, le bien-être des animaux sera primordial durant les expérimentations, notamment par une phase d’acclimatation de minimum 7 jours, un enrichissement de l’environnement (un tunnel et un carré de cellulose pour permettre la conception d'un "nid"), une visite quotidienne, une gestion de la douleur suivant une échelle stricte et des points limites bien établis. Les souris seront hébergées par 4 ou 5 selon la procédure. Les points limites de l'étude dépendent des résultats de l'évaluation clinique, de l'observation d'une douleur non gérable suite à la mise en place d'un protocole analgésique. De façon générale, les différents points limites observés sont, la diminution de poids corporel, l'apparence physique et le comportement de l'animal sans intervention humaine. Ces 3 critères sont évalués sur une échelle de 0 à 3. A partir de deux scores de 2, une injection de Buprénorphine à 0.05mg/kg en injection intra-musculaire sera administrée et la fréquence d’administration sera adaptée en fonction des signes de la douleur avec une fréquence toutes les 12h et pouvant être accrue toutes les 8 heures. Si une souris atteint un score de 3, elle sera alors sacrifiée.

Choix des espèces

- Les souris homozygotes déficientes en VWF sont viables, fertiles, de taille normale et ne présentent aucune anomalie physique ou comportementale grave. Ces souris présentent des défauts dans l'hémostase caractérisés par des temps de saignement prolongés avec des saignements spontanés observés chez dix pour cent des nouveaux nés. Les caractéristiques présentées par les animaux déficients homozygotes sont considérées comme un modèle approprié pour mimer la maladie de von Willebrand sévère humaine. - Les souris déficientes en FVIII (homozygotes) sont viables et fertiles. Ces souris récapitulent les principales caractéristiques de l'hémophilie A humaine et constituent un excellent modèle pour explorer l’impact physiopathologique des troubles de la coagulation. - Des souris déficiente en Tnfrsf11b (ostéoprotégérine : OPG) homozygotes (développent une ostéoporose marquée et une dysrégulation hématopoïétique. Des liens OPG/VWF ont été démontrés et une implication de leur interaction est suspectée dans l’hémophilie. Pour les analyses de phénotype, de pertes musculaires et de caractérisation des populations immunitaires, des souris adultes âgées de 5 et 24 semaines seront utilisées. Pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques des souris adultes. Pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques des souris adultes âgées de 5 ou 24 semaines seront utilisées selon les résultats de la procédure 2. Réception de souris âgées de 4 ou 23 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation (âgées de 5 ou 24 semaines).

24 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de tétrachlorure de carbone deux fois par semaine pendant quatre semaines pour induire une fibrose du foie, avec imagerie TEP puis mise à mort pour prélever le foie. Le porteur décrit une fibrose insidieuse et indolore, tout en signalant une possible irritation du péritoine, une fatigue et une perte d'appétit, la mise à mort étant déclenchée à 20 % de perte de poids. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne permet d'étudier cette pathologie et qu'une étude chez un organisme vivant est "indispensable".

Objectifs

D’un point de vue scientifique, ce protocole expérimental in vivo est justifié d’une part, par la nécessité d’accroître nos connaissances du point de vue des mécanismes impliqués dans la survenue et l’aggravation de la fibrose. D’autre part, il est nécessaire d’identifier de nouvelles méthodes moins invasives que la biopsie du foie pour évaluer correctement l’organe. Les résultats obtenus devraient permettre une étude translationnelle chez l’homme dans les maladies chroniques du foie qui sont caractérisées par une inflammation et une fibrose.

Bénéfices attendus

D’un point de vue scientifique, ce protocole expérimental in vivo est justifié d’une part, par la nécessité d’accroître nos connaissances du point de vue des mécanismes impliqués dans la survenue et l’aggravation de la fibrose. D’autre part, il est nécessaire d’identifier de nouvelles méthodes moins invasives que la biopsie du foie pour évaluer correctement l’organe. Les résultats obtenus devraient permettre une étude translationnelle chez l’homme dans les maladies chroniques du foie qui sont caractérisées par une inflammation et une fibrose.

Procédures

1/ Dès leur réception, les animaux auront une période d’acclimatation d’une semaine pour s’adapter à leur nouvel environnement. 2/ La fibrose sera induite (procédure 1) par une injection IP de 100ul d’un mélange de CCl4 0,5 µl/g reconstitué dans de l’huile d’olive 2 fois par semaine pendant 4 semaines. 3/ Les stades de la fibrose seront évalués de manière non invasive par tomographie par émission de positon au [68Ga]-FAPI la dernière semaine (procédure 2). En fin de protocole, (i) une injection intrapéritonéale de bromodéoxyuridine (procédure 3, marqueur non toxique pour évaluer la prolifération des cellules hépatiques) sera réalisée 2 à 6 heures avant la mise à mort. (ii) une injection d’une seconde dose d’environ 5 MBq dans un volume maximal de 0,1 à 0,2mL de [68Ga]-FAPI sera réalisée une heure avant la mise à mort des animaux (procédure 4), un morceau du foie sera prélevé et analyse par autohistoradiographie.

Impact sur les animaux

La fibrose hépatique est un processus insidieux et indolore. Les souris recevant une injection intra-péritonéale de CCl4 ne développent pas de complications sévères. Bien qu’une intoxication à ce produit cause une élévation des enzymes hépatiques et de la fibrose après 4 semaines et de l’hypertension portale avec des saignements digestifs après 8 semaines, ces conditions ne sont pas douloureuses chez la souris. Cependant, l’injection IP est susceptible d’irriter le péritoine avec des adhérences et des spasmes temporaires. D’après la littérature (Scholten D et collaborateurs. The carbon tetrachloride model in mice. Lab Anim. 2015), l’application bi-hebdomadaire de CCl4 jusqu’à 4 semaines ne générant pas d’hépatopathie majeure devrait être classée comme « procédure modérée » selon l’article 15 de la directive européenne de 2010/63. Une fatigue et une perte d’appétit étant concevable, le point limite est basé sur l’identification d’une perte de 20% du poids. Des signes de mal-être définis au préalable par notre vétérinaire référent (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, yeux et abdomen creux, perte des réflexes de fuite) conduiront à une prise en charge de type nursing (modification des enrichissements, facilitation d’accès à la nourriture, applications abdominales de Lidocaïne).

Devenir

A l'issue des procédures: (1) injection IP 2fois par semaine de CCL4, (2) examen d'imagerie non invasive de la fibrose hépatique (3) et injection du bromodéoxyuridine (marqueur non toxique pour évaluer la prolifération des cellules hépatiques) , les animaux seront gardés en vie et A la fin de la procédure 4 ( injection du radiotraceur pour analyse autohistoradiographiques) les animaux seront mises à mort

Remplacement

Il n’existe aucune approche in vitro pour étudier l’évolution d’une pathologie inflammatoire multifactorielle évoluant vers la fibrose du foie combinée à un radiotraceur. Une étude chez un organisme vivant est indispensable.

Réduction

L’étude sera menée avec un nombre total de 24 souris jeunes adultes mâles, basé sur le calcul a priori du nombre de souris nécessaires tenant compte de la variabilité interindividuelle, ainsi que de l’effet du genre, sur l’évolution de la pathologie hépatique.

Raffinement

Dès leur réception, les animaux auront une période d’acclimatation d’une semaine pour s’adapter à leur nouvel environnement. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l’air, …) à leur bien-être. La fibrose sera induite par une injection intra-péritonéale de 100ul d’un mélange de CCl4 (0,5 ul/g) reconstitué dans de l’huile d’olive 2 fois par semaine pendant 4 semaines. Les stades de la fibrose seront évalués de manière non invasive par tomographie par émission de positon au [68Ga]-FAPI la dernière semaine.

Choix des espèces

Nous avons une bonne connaissance des modèles murins et de plus, le choix de l’espèce « souris » se justifie par l’existence de modèles transgéniques concernant les implications futurs de ce projet si les résultats escomptés se confirment. Enfin nous possédons une expertise sur l’utilisation du CCl4 chez la souris. Les souris auront au minimum 8 semaines et pèseront au moins 18 à 20g. Un âge et un poids minimum afin de garantir une bonne tolérance de la procédure expérimental chez des souris jeunes adultes mâles.

252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de cellules cancéreuses coliques greffées, elles reçoivent des injections et des prélèvements sanguins sous anesthésie, pour étudier le rôle des cellules Natural Killer et des macrophages dans l'effet antitumoral de la molécule H89. Le porteur indique que le développement tumoral peut entraîner perte de poids et gêne des mouvements, les souris étant mises à mort si la tumeur devient trop volumineuse ou si elles perdent plus de 20 % de leur poids. Il affirme que le modèle souris ne peut être remplacé car un système immunitaire complet est "nécessaire".

Objectifs

Ce projet de recherche a comme but celui d’étudier le rôle de certaines cellules de l’immunité innée (Natural Killer (NK) et macrophages) dans l’effet antitumoral d’un inhibiteur de kinases, le H89. Le H89 est un inhibiteur de kinases non spécifique (Davies et al., 2000), qui inhibe la protéine kinase A (PKA), mais également d’autres kinases. Cette molécule induit la mort des cellules cancéreuses coliques in vitro (Ali-Boina et al., 2013 ; Cortier et al., 2015). Nous avons préalablement montré que le H89 est capable d’inhiber la croissance tumorale dans deux modèles de cancer colorectal chez la souris. De plus, d’autres études effectuées montrent que le système immunitaire est impliqué dans l’effet antitumoral du H89. Le H89 est également capable d’induire le recrutement des cellules T effectrices dans la tumeur, en augmentant la réponse immunitaire antitumorale. Le H89 augmente l’expression du récepteur à l’IL-15, IL-15ra, indispensable dans l’activation des cellules T à activité antitumorale mais également des cellules NK. Pour cette raison nous souhaitons déterminer plus en détail le rôle de ce récepteur (IL-15ra) dans l’activité antitumorale du H89, en effectuant une expérience de blocage de son activité in vivo. Une autre étude réalisée in vivo nous montre que le H89 empêche la prise tumorale dans un modèle de cancer colorectal chez la souris Balb/c. Cela suggère que le système immunitaire inné pourrait également être impliqué dans l’effet de la molécule. Pour cela, nous envisageons de diminuer le nombre de cellules NK et les macrophages, acteurs importants de l’immunité innée, afin d’évaluer leur rôle dans la prévention de la prise tumorale observée sous l’effet du H89. Cette étude prévoit, au total, l’utilisation de 252 souris Balb/c femelles.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettrait de bien établir le lien entre la surexpression du récepteur à l’IL-15 (IL-15ra) observée dans les tumeurs de souris traitées avec H89, et l’effet antitumoral de la molécule. En effet ce récepteur est impliqué dans l’activation des cellules T CD8 effectrices, mais aussi bien des cellules NK, qui sont indispensables à l’établissement d’une réponse immunitaire afin d’éliminer la tumeur. Le rôle des cellules T dans la réponse antitumorale du H89 ainsi que la capacité du H89 à induire le recrutement des cellules T CD8 effectrices, donc des cellules immunitaires à activité antitumorale, ont déjà bien été établis. Cette expérience nous permettrait donc de bien déterminer les mécanismes impliqués dans l’effet antitumoral et du H89. De plus, la déplétion de cellules NK et des macrophages, acteurs de l’immunité innée importants dans le développement de la tumeur, nous permettrait de mieux comprendre l’effet du H89 sur l’inhibition de la prise tumorale in vivo précédemment observé.

Procédures

En plus des injections prévues dans les procédures, des prélèvements de quelques gouttes de sang (sous anesthésie) pourraient être effectués de manière occasionnelle afin de monitorer le bon déroulement de l’expérience.

Impact sur les animaux

Les molécules utilisées ne causent pas d’effets indésirables aux souris. Le H89 n’a pas d’effets secondaires, et cela a déjà bien été établi par nos études précédentes. La seule gêne que les animaux pourraient rencontrer est celle liée au développement tumoral. Cela pourrait entraîner une perte de poids, une difficulté de mouvements, même si cela reste rare. Si un de ces signes apparaît, les animaux seront mis à mort sous anesthésie quand la taille de la tumeur devient trop importante ou si la tumeur gêne les mouvements des animaux. Si la perte de poids est supérieure à 20% du poids initial ou si les animaux présentent le moindre signe de souffrance l’euthanasie sera également effectuée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure

Remplacement

Pour cette étude, nous ne pouvons pas remplacer le modèle souris. En effet, cela s’avère nécessaire car nous avons besoin d’un système immunitaire complet afin de mieux comprendre l’effet du H89 et avancer dans la recherche de nouvelles thérapies anti-cancéreuses en immunothérapie.

Réduction

Nous réduisons au minimum les animaux utilisés pour cette étude, en nous limitant au nécessaire afin d’avoir des résultats reproductibles et statistiquement fiables. Nous effectuerons des tests statistiques (two-way ANOVA) afin de vérifier la significativité des expériences effectuées.

Raffinement

Nous veillons toujours au bien-être des animaux de l’étude. Les animaux seront observés régulièrement, tous les deux à trois jours, afin de vérifier leur bien-être. L’hébergement se fera en groupes pour éviter le stress, étant la souris un animal social. Du matériel d’enrichissement permettant la construction d’un nid sera également fournie et le calme sera maintenu dans la salle d’hébergement. L’injection des cellules cancéreuses se fera sous anesthésie à l’isoflurane afin de réduire le stress des animaux. Si le moindre signe se souffrance apparaît, les animaux seront mis à mort (sous anesthésie) dans les cas suivants : 1) si le volume tumoral devient trop important 2) si les animaux perdent plus de 20% de leur poids ou si des signes montrent une douleur ou une souffrance importante (comportement/posture), 3) si les tumeurs présentent des lésions qui ne peuvent pas être traitées avec produit cicatrisant et causant une gêne aux animaux.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée avec des souris Balb/c porteuses de cellules cancéreuses coliques CT26. Nous maîtrisons parfaitement ce modèle de souris qui nous permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’effet antitumoral de la molécule, ainsi que le rôle de certaines cellules de l’immunité innée. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 8 semaines. Cela permet d’avoir un système immunitaire entièrement développé et des souris assez jeunes pour garantir une réponse immunitaire efficace, que l’on ne retrouverait pas chez les animaux plus âgés.

264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent la toxine cholérique par gavage une fois par jour pendant quatre jours, avec un double gavage le dernier jour, puis sont mises à mort six heures après pour prélever l'intestin, afin de comparer des substances mucoprotectrices contre la diarrhée. Le porteur indique que la toxine peut provoquer diarrhée, déshydratation, douleur intestinale et perte de poids, effets qu'il décrit comme transitoires et réversibles. Sur le remplacement, il affirme que le modèle animal donne une image intégrée des dommages intestinaux que les approches sans animaux ne reproduiraient pas.

Objectifs

Notre projet a pour but d’évaluer et de comparer les effets de différentes substances mucoprotectrices (polysaccharrides naturels qui adhèrent au mucus) et leurs associations sur la sécrétion d’eau provoquée par la toxine cholérique dans un modèle d’anse intestinale ouverte chez la souris C57Bl6J.

Bénéfices attendus

La gastro-entérite aiguë caractérisée par une diarrhée reste un motif fréquent de consultation en Occident, et demeure une cause de mortalité dans les pays en voie de développement. La réhydratation orale est le traitement de première intention pour la prévenir ou la traiter. Cependant, la thérapie de réhydratation orale ne réduit pas la fréquence des selles et la perte de liquide et ne raccourcit pas la durée de la maladie. Ainsi les professionnels de la santé s'intéressent à la mise au point de nouveaux produits, à visée préventive et curative, efficaces et peu coûteux qui pourraient renforcer l'effet de la thérapie de réhydratation orale.

Procédures

Les animaux sont soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 4 jours (0.15 ml) et, le dernier jour, un deuxième gavage est effectué 20 min après le premier (0.1 + 0.1 ml). Ils sont mis à mort 6 heures après le dernier gavage.

Impact sur les animaux

La toxine cholérique chez la souris induit une hypersécrétion d’eau dans l’intestin 6 heures après son administration par voie orale. Cela peut donc entrainer, une diarrhée, une déshydratation, une douleur intestinale, une diminution d’activité, une perte de poids. Ces effets sont en général transitoires et réversibles sans autre traitement.

Devenir

Les souris seront sacrifiées 6 h après traitement par la toxine cholérique et des analyses post-mortem seront effectuées. D'une part l’intestin sera clampé au niveau du pylore et du caecum, débarrassé du tissu mésentérique et prélevé. La quantité d’eau secrétée dans la lumière intestinale sera évaluée par pesée du segment intestinal clampé plein, moins le poids de celui-ci vidé. L’état de la muqueuse intestinale par établissement de scores histologiques à partir d’un segment intestinal prélevé après la fin de la mesure de la quantité d’eau secrétée.

Remplacement

Le modèle animal mime les principales caractéristiques de la diarrhée induite par des toxines bactériennes incluant la toxine cholérique et donne une image intégrée des dommages intestinaux provoqués. Parmi ces caractéristiques figurent la sécrétion d’eau et les altérations de la muqueuse intestinale associées (altération des villosités, infiltration par des immunocytes augmentation de la perméabilité intestinale par rupture du complexe des protéines de jonctions serrées intercellulaires…) qui sont les résultats des régulations neuro-humorales et de ce fait observable à l’aide du modèle intégré qu'est le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe expérimental a été optimisé en tenant compte de la variabilité interindividuelle en se basant sur des études utilisant le même modèle. Ces effectifs (n=12) sont suffisants pour atteindre une validité statistique.

Raffinement

Les animaux utilisés seront des animaux sains provenant d’un élevage agréé. Ils seront hébergés dans des conditions normalisées optimales et suivis quotidiennement pour leur apporter tous les soins nécessaires et assurer leur bien-être. Leur milieu sera enrichi en buchettes de peuplier pour satisfaire leur besoin de ronger et un abri en inox leur permettra de s’y loger. Toutes les mesures ont été prises pour réduire l’inconfort (période d’adaptation, habituation) et prévenir toute douleur ou anxiété susceptible d’être subie par les animaux (détection de toute anomalie ou apparition de mal être). Si malgré les mesures prises, une souffrance était constatée la procédure serait arrêtée.

Choix des espèces

Les souris C57Bl6 sont communément utilisées pour mimer des conditions physiopathologiques observées chez l’homme et appréhender les mécanismes d’action impliqués. Elles sont ainsi utilisées pour l’exploration de la physiopathologie digestive. Le modèle de diarrhée induite par la toxine cholérique ainsi que le modèle de anses ouvertes chez la souris C57Bl6 est décrit et validé par la communauté scientifique (Finkelstein, R 1976, Stephen H. et al. 1983, R.A.Fenton 2019). Les animaux seront des souris C57Bl6J adultes de 5 à 6 semaines (environ 20 à 25g). L’utilisation d’animaux adultes est nécessaire pour évaluer différentes substances mucoprotectrices sur une barrière intestinale parfaitement mature, sachant qu’en condition périnatale la barrière intestinale présente des caractéristiques biologiques complètement différentes de celles observés chez l’animal adulte

480 souris vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal recoit une greffe de tumeur sous la peau puis des injections repetees de traitements, avant d'etre tue pour analyser la tumeur. Le porteur affirme que les souris vivent sans contrainte majeure jusqu'a la fin et suit quotidiennement la taille des tumeurs pour ne pas depasser un point limite. Les rubriques objectifs et benefices reprennent mot pour mot la meme liste d'objectifs, sans decrire le benefice attendu pour les patients.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont: - D'évaluer l'efficacité d'une stratégie vaccinale à base d'ARNm vectorisé sur la prévention et le ralentissement de la croissance tumorale. - D'évaluer l'efficacité d'une stratégie vaccinale à base d'ARNm vectorisé sur la survenue de métastases pulmonaires. - D'évaluer l'efficacité d'une stratégie vaccinale à base d'ARNm en combinaison avec une immunothérapie ou une chimiothérapie sur la croissance tumorale. - D'évaluer l'implication des lymphocytes T CD8 dans la réponse anti-tumorale induite par la stratégie vaccinale.

Bénéfices attendus

Les objectifs de ce projet sont: - D'évaluer l'efficacité d'une stratégie vaccinale à base d'ARNm vectorisé sur la prévention et le ralentissement de la croissance tumorale. - D'évaluer l'efficacité d'une stratégie vaccinale à base d'ARNm vectorisé sur la survenue de métastases pulmonaires. - D'évaluer l'efficacité d'une stratégie vaccinale à base d'ARNm en combinaison avec une immunothérapie ou une chimiothérapie sur la croissance tumorale. - D'évaluer l'implication des lymphocytes T CD8 dans la réponse anti-tumorale induite par la stratégie vaccinale.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection sous-cutané lors de la greffe des tumeurs (1 fois, 20 secondes) et à des injections intrapéritonéales pour l'admisnitration des traitements (entre 3 et 6 sur toute la durée du protocole; 15 sec par injection)

Impact sur les animaux

La greffe des tumeur sous-cutané est un geste rapide et peu douloureux pour l'animal. Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables particuliers en réponse aux traitements. Les immunothérapies, la stratégie vaccinale et la chimiothérapie ont déjà été validées dans des protocoles précédents et ces traitemetns n'ont pas engendré d'effets indésirables notoires. Le niveau de nuisance dûe à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur, cependant, les souris vivent sans contrainte majeure jusqu'à la fin du protocole.

Devenir

A l'issue de chaque procédure le sacrifice des animaux sera effectué afin de procéder aux analyses des tumeurs.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, les évaluations de nouveaux agents thérapeutiques en oncologie doivent être réalisées sur les organismes vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux minimum requis est calculé afin d’assurer une fiabilité statistique. Aussi, afin de réduire l’utilisation de souris, nous évaluerons sur le même animal la fonction des lymphocytes et la croissance tumorale lors d’expérience nécessitant l’utilisation de traitements sur des temps longs.

Raffinement

Le raffinement du protocole prendra en compte le suivi quotidien de la taille des tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse afin de s'assurer qu'elles restent inférieures à la taille classiquement utilisée comme point limite en cancérologie chez la souris. Ce suivi individuel permettra la surveillance du bien-être des animaux qui seront hébergés par groupe de cinq à dix dans un établissement agréé.

Choix des espèces

La souris, outre l’avantage lié à ses caractéristiques physiologiques, est la seule espèce animale pour laquelle des anticorps bloquants variés sont commercialisés (aPD-1 ; aCD8β) facilitant les investigations expérimentales et l’utilisation de combinaisons thérapeutiques. Ces modèles murins sont commercialisés, donc accessibles facilement, et permettent de standardiser au maximum nos expériences. D’autres part le modèle OVA n’existe que chez la souris et nous possédons les lignées tumorales murines exprimant l’OVA. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique chez l’humain. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 10 et 20 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.