Souris

52 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par différentes voies, dont l'injection dans la cavité abdominale, trois fois à deux jours d'intervalle, avec prélèvements sanguins sous sédation, avant d'être tuées pour analyse des organes. Le porteur indique que l'injection abdominale de tamoxifène provoque une péritonite systématique et une inflammation douloureuse souvent négligée. Il présente ce travail comme un projet de raffinement destiné à établir des recommandations pour les nombreuses souris soumises chaque année à ce type d'administration, ces mêmes souris étant ici tuées pour le documenter.

Objectifs

Le tamoxifène est un anticancéreux majeur utilisé en particulier pour le contrôle du cancer du sein chez la femme. Chez la souris, des constructions génétiques ont été créées pour permettre l’induction d’une modification génétique suite à une administration de tamoxifène. Il s’agit là d’un outil génétique très utilisé pour générer une modification génétique à un moment précis. L’induction de cette modification génétique par le tamoxifène nécessite une dose importante, sur plusieurs jours. Le tamoxifène est une molécule soluble dans les lipides très bien absorbée par voie orale, ce qui permet de l’administrer par l’alimentation ou par gavage. Cependant, à l’échelle mondiale et notamment en France, le tamoxifène est la plupart du temps injecté, à plusieurs reprises, dans la cavité abdominale après dissolution dans une huile (huile de maïs le plus souvent). Or en bonnes pratiques vétérinaires, un excipient huileux n’est pas censé être injecté dans la cavité abdominale et notre expérience personnelle de vétérinaires en animalerie nous a amenées à observer une péritonite systématique, clinique ou subclinique, chez tous les animaux injectés avec du tamoxifène dans la cavité abdominale, même une seule fois. Il s’agit là d’une cause de douleur, souvent négligée, et d’une cause d’inflammation systémique, susceptible d’interférer avec la question scientifique posée. Nous souhaitons donc conduire une étude robuste documentant les effets inflammatoires de l’injection dans la cavité abdominale de tamoxifène, comparés à ceux générés par d’autres voies d’administration, également décrites dans la littérature pour leur efficacité et a priori moins délétères, à savoir la voie sous-cutanée, orale et transdermique, afin de permettre d’établir des recommandations pour une utilisation du tamoxifène chez la souris qui respecte au mieux le bien-être des animaux.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour but de démontrer le risque d’interférence scientifique et de réduction du bien-être des souris suite à l’injection dans la cavité abdominale de tamoxifène et de proposer des voies d’administration alternatives, connues dans la littérature pour être également efficaces, et qui ne présenteront pas ces inconvénients. La publication de ces résultats permettra d’éditer des recommandations en matière d’administration du tamoxifène afin d’améliorer la condition des souris impliquées dans des stratégies de recombinaison induite par le tamoxifène, ce qui correspond à un grand nombre d’animaux chaque année dans un pays comme le nôtre. Il s’agit donc d’un projet de raffinement destiné aux souris.

Procédures

Les animaux subiront les interventions suivantes : - Administrations d'une solution soit dans la cavité abdominale, soit par voie sous-cutanée, soit par gavage, soit par application transdermique. Ces administrations seront réalisées 3 fois à 2 jours d’intervalle et chaque administration durera environ 30 secondes. - Si besoin d’une sédation ou d’une anesthésie pour ces administrations, elles seront induites par une injection sous-cutanée puis une seconde injection sous-cutanée sera réalisée pour induire le réveil (environ 30 secondes par injection). - Deux prélèvements de sang seront réalisés à 2 semaines d’intervalle à la veine mandibulaire, avec sédation et analgésie. La sédation avec analgésie sera induite par une injection sous-cutanée (environ 30 secondes pour l’injection) et sera effective en 10 min environ. Le prélèvement de sang durera alors environ 30 secondes. Une seconde injection sous-cutanée d’un antagoniste permettra le réveil de l’animal. - Avant la mise à mort en fin de procédure, les animaux recevront une sédation avec analgésie via une injection sous-cutanée (environ 30 secondes pour l’injection) qui sera effective en 10 min environ.

Impact sur les animaux

Les gestes de prélèvements et d’administration seront susceptibles de causer un stress et une douleur légers aux animaux. Les composés injectés seront susceptibles de créer une inflammation potentiellement douloureuse, d'intensité modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires à de nombreuses analyses anatomopathologiques et biochimiques qui permettront d’évaluer les effets inflammatoires des différentes administrations.

Remplacement

La démonstration des effets inflammatoires de l’injection dans la cavité abdominale de tamoxifène et de l’intérêt potentiel de voies d’administration alternatives nécessite d’utiliser des organismes entiers pour caractériser les lésions des organes et l’inflammation au niveau sanguin. L’étude sera réalisée chez la souris, espèce-cible de l’utilisation du tamoxifène, qui bénéficiera donc directement de l’étude menée.

Réduction

Le nombre de groupes et sous-groupes proposé a été pensé pour répondre au plus près aux attentes des chercheurs quant à la démonstration des effets inflammatoires de l’injection dans la cavité abdominale de tamoxifène et à la proposition de voies alternatives. Au sein de chaque sous-groupe, le nombre d’animaux utilisé est aussi réduit que possible, tout en permettant d’atteindre une pertinence statistique.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Les animaux auront un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Le comportement des mâles est particulièrement surveillé et en cas de bagarre grave amenant à des plaies, le mâle agresseur est séparé de ses congénères et ses congénères sont pris en charge de manière adaptée (mise à mort compassionnelle si blessures trop graves, soins dans les autres cas). Le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft ou du coton, un bâton de bois à ronger et une maison en carton. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Tous les gestes seront réalisés avec une attention très forte au respect physique et émotionnel des animaux. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice, au besoin pharmacologique, et en cas d'absence de bénéfice, nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie par les animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce-cible de ce projet de raffinement. En effet, cette espèce pour laquelle de nombreux outils génétiques ont été développés est celle utilisée pour des modifications génétiques induites par l’administration de tamoxifène. Les animaux utilisés auront entre 2 et 4 mois, soit un âge classique pour une modification génétique induite par le tamoxifène par des équipes de recherche.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour pendant quatre semaines une statine à une dose connue pour provoquer des troubles musculaires proches de ceux observés chez l'humain, associée à un composé en développement, avec prélèvements sanguins, tests de force de préhension et mesures d'activité locomotrice. Le porteur indique que la statine réduit la force de préhension et altère la locomotion, et que les manipulations et prélèvements sont sources de stress. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet ce type d'étude, les retombées pour les patients, prolonger le traitement par statines, étant renvoyées à d'éventuels essais cliniques.

Objectifs

Les statines sont l’un des médicaments de première intention pour le traitement des troubles du cholestérol chez l’homme. En plus d’induire une diminution des taux plasmatiques de lipides, de cholestérol et de LDL, de nombreuses études ont rapporté que les statines protègent considérablement des maladies cardiovasculaires. Néanmoins, malgré l’efficacité inégalée des statines, ces dernières induisent des effets secondaires graves et environ 50% des patients ne peuvent continuer leur traitement après 6 mois et seuls 20% des patients continuent leur traitement plus de 5 ans. Parmi ces effets secondaires, les symptômes musculaires associés aux statines sont les effets indésirables les plus fréquents. De nombreuses données de la littérature suggèrent que les troubles musculaires liés aux statines sont dues à une altération du fonctionnement des mitochondriale. D’intenses recherches sont ainsi actuellement menées afin de développer des composés capables d’inhiber les effets secondaires des statines dans le cadre de co-traitements. Le présent projet s’inscrit dans ce contexte. Il vise à étudier la capacité d’un composé en développement (composé X) à inhiber les effets secondaires musculaires d’un traitement chronique avec une statine de référence. Le projet sera mené sur des souris ApoE-/- (souris déficientes pour le gène codant l’Apolipoprotéine E). La délétion présente chez ces souris induit la formation de plaque d’athérome, tout particulièrement lorsque ces souris sont soumises à un régime alimentaire enrichi en lipides et en cholestérol. Pendant 4 semaines, les souris seront traitées avec une statine à des doses connues pour induire des troubles musculaire similaires aux effets secondaires observés chez l’homme, ainsi qu’à l’aide du composé X. Pendant le co-traitement, la prise alimentaire, la prise de poids corporel, l’activité locomotrice et la force de préhension seront mesurés. Les résultats seront comparés à des souris traitées à l’atorvastatine seule.

Bénéfices attendus

Si la présente étude permet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur les effets secondaires d'un traitement chronique par les statines, ce dernier sera employé ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché. Ainsi, ce type de médicament pourrait permettre aux patients atteints de troubles des lipides de prolonger la durée de leur prise en charge thérapeutique par les statines du fait de l'inhibition de ses effets secondaires musculaires, et ainsi grandement améliorer leur qualité de vie.

Procédures

Les animaux seront soumis à : 1) une administration orale quotidienne d'une statine et du composé test, ou de placébo pendant 4 semaines- 4) une pesée quotidienne de D-18 à D-1 - 2) des prélèvements sanguinq à la veine de la queue à D-2 et D15 - 3) des mesures de prise alimentaire et de poids corporel une fois par semaine sur toute la durée de l'étude - 4) trois analyses de leur composition corporelle à D-3 et D14 et D28 (

Impact sur les animaux

Tout d'abord, le phénotype des souris ApoE n'est pas dommageable, mais le traitement avec la statine est connu pour induire des effets secondaires musculaires qui se traduisent par une réduction de la force de préhension et d'une altération légère de la locomotion. Ceci est une source de nuisance pour les animaux. Les traitements journaliers par voie orale pendant 4 semaines sont une source de nuisance pour les animaux. Le grip test est un test très rapide et indolore pour l'animal. Néanmoins, la manipulation des animaux nécessaire pour réaliser le grip test pourrait être source de test. Les 2 prélèvements sanguins réalisés à D-2 et D15 pourront également être source de nuisance. Enfin, les mesures de composition corporelle et de l'activité locomotrice, bien que non invasives, peut engendrer un stress chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements terminaux post mortem sont nécessaires pour une étude complète des effets du composé test.

Remplacement

Le présent projet vise à contrer les effets secondaires au niveau musculaire d'un traitement chronique avec une statine chez la souris atteiinte de troubles des lipides. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant ce type d'étude.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt compte tenu des patramètre mesurés dans la présente étude mais également de l'hétérogénéité connue du modèle utilisée. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté e de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés (principalement Grip test, activité locomotrice et masse musculaire) avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en groupes de 3 par cage (les deux sexes étant maintenus dans des cages séparés). Par ailleurs, nous avons remarqué que la litière en cellulose permet non seulement une bonne absorbance mais également un enrichissement (nidification). Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. En cas de signe de souffrance de l'animal, un analgésique (buprénorphine) sera administré. Si aucune amélioration n'est constaté passé un certain délai, l'animal sera euthanasié. Enfin, afin d'éviter toute angoisse ou souffrance des animaux lors de l'euthanasie, les animaux seront préalablement anesthésiés avant dislocation cervicale.

Choix des espèces

Nous avons opté pour un modèle de souris déficientes en apolipoprotéine E (Souris ApoE-/-) nourri avec une alimentation enrichie en lipide et en cholestérol (HFHC). Ce dernier est trés bien caractérisé dans la littérature et s'avère classiquement utilisé dans les études précliniques visant à développer des traitements de l'atherosclérose. Ce modèle est un modèle très prédictif dans ce cadre. Il représente également un modèle de choix car il exprime, lors d'un traitement chronique aux statines, des effets secondaires musculaires très similaires à ceux observés chez l'homme. Les animaux seront utilisés au stade adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

225 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 200 mâles tués à l'issue et 25 femelles réutilisées pour d'autres projets. Les mâles subissent une chirurgie stéréotaxique ouvrant la boîte crânienne pour injecter un vecteur viral supprimant le récepteur aux androgènes, puis des tests de comportement sexuel, d'anxiété, de locomotion et de fertilité. Les 25 femelles, utilisées comme animaux stimulus, subissent une gonadectomie et des injections de progestérone. Le porteur affirme que l'étude du comportement de reproduction ne peut se faire que sur "l'organisme entier" et signale des risques de douleur post-opératoire, d'hypothermie et d'arrêt cardio-respiratoire liés à la chirurgie et à l'anesthésie.

Objectifs

Ce projet vise à identifer les cibles cérébrales des androgènes nécessaires à la régulation de la fonction et du comportement de reproduction chez la souris adulte mâle. La survie des espèces dépend de la capacité des individus à se reproduire. Une reproduction réussie requiert la production de gamètes mais également l’expression des comportements de reproduction mâle et femelle afin d’optimiser la fécondation. Chez le mâle, la fonction de reproduction ainsi que le comportement de reproduction sont contrôlées par le cerveau sous l’action des androgènes. Des études précédentes ont démontré un rôle de la signalisation androgénique au sein du cerveau contrôlant la fonction de reproduction ainsi que l’expression du comportement de reproduction mâle. Ces études ont utilisé des souris dont la délétion du récépteur aux androgènes ciblait l’ensemble du tissu neural tout au long de la vie sans distinction du type cellulaire (i.e. cellules gliales versus neurones) ni de la région cérébrale. Ici, nous souhaitons décrypter plus en profondeur les phénotypes cellulaires et les régions cérébrales régulées par les androgènes dans la fonction et le comportement de reproduction mâle à l’âge adulte. Dans ce but, nous déléterons spécifiquement le récepteur aux androgènes au sein d’une région spécifique du cerveau, la region préoptique médiane, dans les cellules gliales ou neuronales à l’âge adulte puis nous étudierons la fonction et le comportement de reproduction suite à ces délétions.

Bénéfices attendus

Les perturbations hormonales au cours de la vie peuvent avoir un impact majeur sur les réponses neuroendocrines et comportementales liées à la reproduction par le biais d’altérations des structures cérébrales impliqués dans ces réponses. Cette étude participera à faire progresser la compréhension des mécanismes d’action sous-tendant cette régulation. Les modèles transgéniques utilisés nous permettront de comparer les mécanismes neuraux des deux voies de signalisation majeures impliquant les récepteurs des oestrogènes et des androgènes chez le mâle.

Procédures

Un nombre de 200 souris mâles subiront une chirurgie sous anéthésie générale avec réveil qui durera entre 30 et 45 minutes maximum. Après 3 semaines de rétablissement, les souris subiront différents tests de comportements sexuels, d’anxiété et de locomotion ainsi que des tests d’étude de leur fertilité. L’ensemble de ces tests n’a pas d’effet indésirable. Un lot de 25 souris femelles subira des gonadectomies sous anesthésie générale avec réveil qui durera entre 15 et 30 minutes maximum. Ces femelles subiront également 2 injections sous-cutanées de progestérone avant les tests de comportement sexuels.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, nous pratiquerons sur les animaux des chirurgies sous anesthésie générale à l’isofluorane pendant lesquelles une ouverture de la boîte cranienne est réalisée afin d’injecter dans une région cérébrale donnée un vecteur viral qui nous permettra de déléter le récepteur aux androgènes (AR). Les éventuels nuisances et effets indésirables à court et à long terme liés à cette chirurgie sont : - Une hypothermie - Arrêt cardio-repsiratoire liée à l’anesthésie - Une douleur post-opératoire se traduisant par une apparence, une position et des comportements anormaux - Une perte de poids rapide. La délétion de l’AR dans l’ensemble du système nerveux dès la conception n’entraîne pas d’effets indésirables : nous ne nous attendons donc pas à des nuisances ou des effets indésirables suite à la délétion restreinte de l’AR dans la région préoptique à l’age adulte.

Devenir

Au sein de cette demande d’autorisation de projet 200 animaux seront euthanasiés à la fin des différentes procédures afin de réaliser des prélèvements et analyses post-mortem nécessaires à l’étude du role du récepteur aux androgènes dans la régulation de la fonction et du comportement de reproduction mâle. Les animaux stimuli nécessaires à l’étude du comportement sexuel mâle (25 femelles) seront réutilisés pour des projets au sein de l’équipe de recherche ou par des collaborateurs afin de respecter la règles des 3Rs.

Remplacement

L’étude des fonctions et comportements de reproduction ne peut se faire que sur l’organisme entier. Dans cette étude, nous souhaitons identifier les cibles cérébrales des androgènes nécessaires à la régulation de la fonction de reproduction et l’expression du comportement sexuel mâle. Cela nécessite des modèles animaux afin de pouvoir étudier les structures et populations cellulaires contrôlant la reproduction et les méthodes alternatives et/ou substitutives ne peuvent remplacer l’animal entier pour ce projet. La souris est le modèle animal sélectionné afin de tirer profit des techniques récentes (transgénèse conditionnelle et transduction virale) pour l’étude de la fonction des gènes dans le cerveau

Réduction

Dans cette demande d’autorisation de projet, nous utiliserons un total de 1125 animaux (225 souris adultes et 900 souriceaux) sur 4 procédures qui nous permettront d’étudier le rôle du récepteur des androgènes dans la régulation de la fonction et du comportement de reproduction mâle. Pour chaque procédure, nous avons eu à cœur de calculer au plus juste le nombre d’animaux dans chaque groupe afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la puissance statistique de l’étude. Pour les études comportementales, 8 à 12 animaux par groupe sont nécessaires pour des résultats fiables et consistants. Un même groupe d’animaux est utilisé pour plusieurs tests. De plus, nous utiliserons les mêmes cohortes d’animaux pour les analyses comportementales et immunohistochimiques. Nous péléverons également d’autres organes et les garderons pour de futures études ou nous les proposerons aux collaborateurs de l’équipe.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie spécialisée sous la supervision des soigneurs et du vétérinaire-référent. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne en termes d’espaces et d’environnement. Les souris seront soumises à un cycle de lumière-obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l’enrichissement, un nid végétal sera placé dans la cage. Au cours des chirurgies, les animaux seront anesthésiés par anésthésie gazeuse. Afin de minimiser les effets indésirables de la chirurgie, les animaux seront injectés en sous-cutané avec un analgésique en pré-opératoire 30 minutes avant la chirurgie et avec un analgésique anti-inflammatoire en post-opératoire toutes les 24h pendant 3 jours suivants l’opération. Par la suite, un suivi journalier sera réalisé afin d’observer les signes potentiels d’un mal-être animal. Les critères absolus suivants seront observés : - Apparence et position anormale : poil ebouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie - Comportements anormaux : aggressivité soudaine, abbatement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déhsydratation (mesure du poids des biberons et observation des signes physiologiques de déshydratation) - Une perte de poids rapide et supérieur à 20 pourcents du poids corporel de l’animal mesuré avant la chirurgie. Les animaux seront pesés tous les jours pendant 5 jours après le protocole de chirurgie stéréotaxique puis 1 fois par semaine. - Etat de choc, léthargie, inconscience, immobilité - Difficulté respiratoire Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s’assurer que toute souris présentant une perte de poids excessive (-20 pourcents du poids corporel au début de l’étude) ou une détresse seront euthanasiées. Suite à l’observation de ces critères et au diagnostic d’une douleur ou d’un mal-être animal, celui-ci sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris est l’un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et comportementales grâce à la disponibilité d’outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques, vecteurs viraux, …) et de données dans la litérature permettant de comparer les résultats obtenus avec ceux d’autres laboratoires et ainsi d’implémenter les connaissances sur cette thématique. Les animaux utilisés sont issus d’accouplements réalisés au sein de notre établissement utilisateur et seront utilisés à l’âge adulte lorsque leur maturité sexuelle est atteinte (à partir de 8 semaines). Chaque souris est identifiée soit par tatouage soit par encoche aux oreilles.

1 140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique injectant du peptide amyloïde dans le cerveau, puis des traitements quotidiens par gavage et injections, et des tests de mémoire dont la piscine de Morris, avant d'être tuées pour analyse des tissus. Le porteur indique que la chirurgie peut causer une souffrance post-opératoire et que les traitements et le test de la piscine de Morris peuvent générer un stress. Il affirme que la complexité de la maladie d'Alzheimer ne peut être atteinte qu'avec un modèle animal et retient la souris de douze mois comme le modèle le plus proche de l'humain, d'éventuels essais cliniques restant conditionnels.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer est la maladie neurodégénérative la plus fréquente. Elle est caractérisée par des troubles de la mémoire et du comportement, ainsi que par une désorientation dans le temps et dans l'espace et touche aujourd’hui 50 millions de personnes dans le monde, dont plus de 1 000 000 en France. L'objectif de ce projet est d'évaluer le potentiel neuroprotecteur de candidats médicaments dans un modèle murin de la maladie de Alzheimer. Les effets des composés seront étudiés par l’analyse des capacités mnésiques des animaux et par analyse histologique. Un composé prometteur devra améliorer la mémoire à court et/ou à long terme des souris, diminuer la perte des neurones dans une région clé pour la formation de la mémoire. En cas de résultats positifs, le développement préclinique des composés pourra se poursuivre.

Bénéfices attendus

Le projet s'intégre dans la phase préclinique du développement de candidats médicaments pour cette maladie incurable. En cas de résultats positifs, le ou les candidats médicaments pourront à terme entrer dans des études cliniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à de la chirurgie stéréotaxique, sous anesthésie générale. Les souris récupèrent bien de la chirurgie. Les procédures incluent des traitements chroniques (quotidiens) par gavage ainsi qu’en intra-peritonéal et en sous-cutanée. La mémoire à court et long terme sera étudiée avec des tests comportementaux. Ces tests seront rapides (maximum 15 minutes par jour), sur une durée maximale de 7 jours, non consécutifs.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirurgie stéréotaxique pouvant causer de la souffrance post-opératoire. Le traitement quotidien des souris peut induire un stress, particulièrement lors des premières administrations. Les tests comportementaux peuvent également induire une nuisance chez les souris, notamment avec le test de la piscine de Morris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus pour des analyses complémentaires (ex. histologie).

Remplacement

Notre but est d'évaluer les effets neuroprotecteurs de candidats médicaments dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. Les processus physiopathologiques de la maladie d’Alzheimer impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires (neurones et cellules gliales) dans différentes structures cérébrales. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal. La souris est le modèle intégré le plus proche de l’humain pour ce projet.

Réduction

Le nombre de souris (n par expérience) sera optimisé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. À cette fin, des études antérieures disponibles dans la littérature scientifique suggèrent un nombre minimal de 12 souris par groupe, afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs en termes de (i) détérioration des fonctions cognitives se traduisant par une perte de mémoire spatiale, et (ii) % de neurones morts (neurodégénérescence); deux caractéristiques essentielles et déterminantes dans la pathophysiologie de la maladie d'Alzheimer. Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec n=12 souris par groupe pour détecter d’éventuel effets significatifs de candidats médicaments dans modèle animal de la maladie d’Alzheimer.

Raffinement

La stratégie de raffinement sera basée sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement (tube en carton, feuille de papier), (ii) des approches d'analgésies pré, pendant et après l'opération, (iii) et le contrôle strict des besoins physiologiques des animaux (température corporelle) pendant et après l'opération (pour assurer un rétablissement rapide). Les animaux seront hébergés par deux au minimum (5 au maximum), en cages ventilées, avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris possède un système cérébral complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. D'après la littérature et l'expérience du personnel du laboratoire, ce modèle d’étude est reproductible et pertinent pour l'étude de la maladie d'Alzheimer. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles. Nous avons le matériel chirurgical et les équipements dédiées aux études impliquant des souris. Comme dans la plupart des cas les symptômes de la maladie d'Alzheimer apparaissent à un âge avancé, nous utiliserons des souris âgées de 12 mois. Ainsi, nous pourrons reproduire plus fidèlement et plus précisément la physiopathologie humaine de la maladie d'Alzheimer dans notre modèle de souris.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux d'un jour sont anesthésiés pour recevoir de l'ADN par électroporation dans les neurones du bulbe olfactif, puis tués entre deux et vingt-huit jours plus tard par perfusion intracardiaque après surdose d'anesthésique. Le porteur affirme pratiquer cette électroporation en routine depuis une douzaine d'années sans jamais avoir observé d'effet nuisible conséquent, et juge très limité le stress de l'injection intrapéritonéale. Il indique que la culture in vitro ne convient pas et retient la souris comme seul mammifère permettant les tests génétiques recherchés, pour éclairer le rôle de mutations du gène Ago2 identifiées chez des patients.

Objectifs

Certaines mutations du gène Ago2 chez des patients humains provoquent dans l’embryon des anomalies de formation des neurones (neurogenèse) conduisant ultérieurement à l’apparition de déficits cognitifs. Le présent projet cherche à comprendre les mécanismes qui conduisent les mutations du gène Ago2 à provoquer ces anomalies. Pour mener cette étude, nous utiliserons un modèle de neurogenèse (formation de nouveaux neurones) particulier chez la souris : la formation de nouveaux neurones dans le bulbe olfactif. Ce modèle de neurogenèse, qui perdure tout au long de la vie de l’animal, autorise la modification de l’expression des gènes au cours du processus. Ainsi, en utilisant ce modèle nous pourrons étudier les conséquences de l’expression induite des formes mutantes du gène Ago2 au cours de la neurogenèse sur les propriétés des jeunes neurones qui en sont issus.

Bénéfices attendus

La meilleure compréhension des mécanismes conduisant aux anomalies de formation des neurones liés aux mutations du gène Ago2 est susceptible d’aboutir au développement de nouveaux traitements permettant d’atténuer les effets de ces mutations. Ce projet permettra aussi de mieux comprendre la fonction du gène Ago2 dans les neurones en développement.

Procédures

Pour l'étape d'électroporation, les 300 animaux de ce projet seront traités avec le même protocole: les souriceaux âgés de 1 jour seront anesthésiés et de l'ADN sera introduit par électroporation dans les jeunes neurones du bulbe olfactif en développement. L’ensemble de ces actes ne dure que 30 secondes. Les souriceaux seront réveillés progressivement en les ramenant à une température de 37°C et replacés auprès de leur mère. Les animaux seront euthanasiés à différents temps après l'électroporation par perfusion intracardiaque après injection d'une surdose d'anesthésique. De plus, les animaux du lot 1 recevront une injection intrapéritonéale d'une solution non dommageable 2 heures avant perfusion.

Impact sur les animaux

Les procédures sont appliquées sur des animaux nouveaux-nés qui sont euthanasiés entre 2 et 28 jours après électroporation. Nous pratiquons l’électroporation de cerveau en routine depuis une douzaine d’années et nous n’avons jamais observé d’effets nuisibles conséquents à cet acte sur l'état de santé et le bien être des animaux. Concernant l’injection par voie intrapéritonéale, l’acte entraine probablement un stress des animaux mais au regard de la durée extremement courte de l’intervention (moins d’une minute) nous pouvons estimer que le stress et la douleur induits par l'introduction de l’aiguille sont très limités dans le temps. Les produits injectés n’entrainent pas d’effet indésirable sur les animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin d’analyser au niveau histologique le devenir des jeunes neurones modifiées génétiquement.

Remplacement

Les jeunes neurones peuvent être cultivés in vitro. Cependant nous savons que in vivo leur prolifération et leur développement en neurones matures sont contrôlées par des facteurs extrinsèques ou environnementaux que nous ne savons pas reproduire in vitro. Ces facteurs sont sécrétés par exemple par les cellules gliales ou celles du système vasculaire. D'autre part nous ne sommes pas capables de cultiver suffisamment longtemps les progéniteurs neuronaux et les jeunes neurones qui en découlent pour leur faire atteindre un niveau de maturité suffisant pour qu'ils puissent entrer en communication avec d'autres neurones. Or il est fortement suggéré que les anomalies chez les patients causées par des mutations du gène Ago2 soient dues, au moins en partie, à un défaut de connectivité entre neurones. Pour ces raisons, le modèle de la culture in vitro n'est pas approprié à ce projet.

Réduction

Nous utiliserons une approche expérimentale simple et rapide qui permet de modifier l’information génétique des jeunes neurones directement dans le cerveau de souris nouveau-nés sans avoir besoin de créer des animaux transgéniques. Cette méthode par électroporation des cerveaux in vivo est utilisée en routine depuis plusieurs années dans le laboratoire. Grâce à notre expérience et notre maitrise de cette technique, notre taux de réussite est optimal et la variabilité entre échantillons réduite au minimum. Les résultats seront analysés par des tests statistiques dédiés aux petits échantillons (tests non paramétriques) que nous maitrisons grace aux formations en biostatistique que nous avons suivies. Les animaux des 2 sexes seront utilisés pour ces expériences.

Raffinement

Selon les recommandations règlementaires, les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton, carré de coton et dôme pour la nidification, au sein d’une animalerie dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. Six personnes sont dédiées à l’organisation, l’entretien des élevages et le soin des animaux. Les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute procédure. Après l’expérimentation, ils sont hébergés dans une salle spécifiquement dédiée à la stabulation postexpérimentation, avec un suivi clinique quotidien. Les souriceaux d’une portée continuent d’être élevés tous ensemble avec leur mère. Tout au long de l’expérimentation et de la surveillance post-expérimentation nous nous attacherons à reconnaître douleur et anxiété et à les soulager si elles apparaissent, à agir lorsque les points limites prédéfinis sont atteints, à noter les observations faites et les actions entreprises.

Choix des espèces

Le projet vise à reproduire et à étudier le mécanisme d'apparition de défauts de développement et/ou de fonctionnement des neurones exprimant une forme mutante d’Ago2. Nous privilégions donc un modèle de mammifère pour ce projet. Chez les mammifères, seule l’espèce souris permet de réaliser des tests génétiques sophistiqués tels que ceux décrits dans ce projet. Les animaux seront électroporés à 1 jour après leur naissance (stade P1) car c'est à ce stade que l'efficacité d'électroporation est optimale. Les animaux ayant subi l'électroporation seront euthanasiés pour analyse aux stades P3 (jour 3 après la naissance, les jeunes neurones électroporés sont en pleine phase de prolifération), P15 (jour 15 après la naissance, à ce stade la majorité des neurones électroporé ont atteint le bulbe olfactif mais restent immatures) ou P29 (29 jours après la naissance, les neurones électroporés sont complètement matures).

2 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des injections intraveineuses de candidats médicaments et des prélèvements sanguins répétés à la veine submandibulaire, réalisés sous simple contention sans anesthésie, avant une mise à mort par dislocation cervicale pour analyse des organes. Le porteur reconnaît que la toxicité inconnue des molécules testées peut provoquer des douleurs non prévues et que les manipulations génèrent inconfort et angoisse. Il indique avoir limité la phase in vivo grâce à des modèles cellulaires et des organoïdes, tout en la jugeant nécessaire pour évaluer toxicité et efficacité des cinq candidats anticancéreux.

Objectifs

Le développement de traitements anti-cancéreux demeure un sujet d’actualité. Ce développement comporte différentes phases qui vont de l’identification de la cible thérapeutique jusqu’aux dernières phases d’essais cliniques. Entre la phase de l’identification de la cible thérapeutique impliquée dans l’agressivité de cette maladie et l’entrée en phases d’essais cliniques, il est nécessaire de sélectionner le candidat médicament le plus efficace et le moins toxique (phase de recherche et de développement préclinique). Cette phase préclinique a pour but de bien caractériser le mécanisme d’action du candidat médicament, de valider son efficacité et sa bonne innocuité. Différentes études in vitro sur des modèles de cellules tumorales et des modèles plus « sophistiqués » comme des « avatars » de tumeurs (structures 3D et organoïdes) ont été mises en place afin de bien caractériser les candidats médicaments sur des modèles relevant, et limiter ainsi la nécessité de recours à plusieurs expérimentations sur des modèles animaux in vivo. Ceci a permis de limiter cette phase in vivo au stricte nécessaire pour la réalisation des études de toxicité (identifier la dose maximale tolérée du candidat médicament), des études pharmacocinétiques (caractériser le profil d’absorption du candidat médicament et sa distribution dans l’organisme vivant) et des études pour valider l’efficacité anti-tumorale du candidat médicament. Durant ces différentes études expérimentales, des administrations, des suivis tumoraux et des prélèvements divers sont réalisés sur les animaux. L'objectif principal est de valider le mécanisme d'action de 5 nouveaux candidats médicament (à raison de un candidat/an), de s'assurer de leur bonne innocuité, de bien caractériser leurs paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques afin d’avoir une efficacité antitumorale optimale. Cette caractérisation préclinique est primordiale afin d’identifier les meilleurs schémas de traitement et de préparer au mieux les futurs essais cliniques avec ces nouveaux candidats médicament anti-cancer. Les études se porteront sur les cancers suivants : les cancers du pancréas, du sein, des ovaires et du poumon.

Bénéfices attendus

Ces études représentent une phase essentielle dans l’estimation du bénéfice/risque des nouveaux candidats médicaments développés pour le traitement du cancer.

Procédures

Dans le présent projet, les études sont réalisées sur des souris immuno-déficientes et immunocompétentes. Pour la majeure partie de ces gestes techniques, l’animal vigile est maintenu sous contention. Différents protocoles expérimentaux sont réalisés. Des greffes de cellules tumorales par injection en sous cutanée sur souris vigile (1 injection de 5 secondes). Des administrations en intraveineuses (1 fois par semaine) des candidats médicaments sur souris non anesthésiées (5 à 10 secondes par injection), en utilisant différents schémas de traitement pendant la durée de l’expérimentation. A la suite de l’administration, des prélèvements sanguins (2 prélèvements par souris, 10 secondes par acte) sont effectués à la veine submandibulaire sur souris non anesthésiées à différents temps (9 temps). Le sang est recueilli dans un tube de prélèvement adapté et est par la suite analysé selon les besoins de l’étude. Les organes ainsi que les tumeurs seront récupérés pour les analyses ex-vivo. Une contention manuelle est réalisée pour l’injection de cellules tumorales en sous-cutanée, le puçage des souris en sous-cutanée (10 secondes par manipulation) pour effectuer l’identification et le suivi tumoral, de l’injection des cellules tumorales jusqu’au prélèvement sanguin à la veine submandibulaire. Une contention mécanique est réalisée pour les injections intraveineuses des candidats médicaments (boites à contention).

Impact sur les animaux

Un des protocoles peut induire des douleurs non prévues, inhérentes au fait de la toxicité des candidats médicaments n'est pas connue. Un autre protocole peut induire un inconfort et une angoisse liés à la manipulation de la souris et aux prises de sang effectuées. Les deux derniers peuvent induire un inconfort, une angoisse liée à la manipulation des souris, des douleurs liées à l'administration des cellules tumorales et aux injections en intraveineuses.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale pour analyses des organes principaux.

Remplacement

Différentes études in vitro sur des modèles de cellules tumorales et des modèles plus « sophistiqués » comme des « avatars » de tumeurs (structures 3D et organoïdes) ont été mises en place pour permettre de bien caractériser les candidats médicaments sur des modèles relevant, et limiter ainsi la nécessité de recours à plusieurs expérimentations sur des modèles animaux in vivo. Ceci a permis de limiter cette phase in vivo au stricte nécessaire qui sont les études de toxicité (pour identifier la dose maximale tolérée du candidat médicament), les études pharmacocinétiques (pour caractériser le profil d’absorption du candidat médicament et sa distribution dans l’organisme vivant), et les études pour valider l’efficacité anti-tumorale du candidat médicament. Toutefois, l’évaluation du rapport entre la dose toxique et la dose efficace sur des tumeurs nécessite le recours à des organismes modèles de l’Homme. En effet, l’efficacité antitumorale est liée à la disponibilité de la molécule dans la tumeur. L’essai de nouveaux traitements sur des patients nécessite une évaluation préalable de l’efficacité et de la tolérance sur des animaux conformément à la directive 2001/20/CE.

Réduction

Les études visant à déterminer la DMT (dose maximale tolérée) sont menées sur 6 souris par groupe. Ce nombre est lié à la variabilité intrinsèque des signes cliniques observées chez des souris d’une même cage. Ces études ainsi que les études de pharmacocinétiques et d'efficacité antitumorale sont menées avec des analyses statistiques afin de s'assurer de la significativité statistique des résultats obtenus en fonction du nombre de souris par groupe et du nombre de groupes. Par conséquent, pour les études d'efficacité, le nombre d’animaux sera fixé de 15 animaux par groupe. Ce nombre est issu d’un compromis entre la variabilité du succès de l’induction tumorale et du volume tumoral nécessaire pour la détection d’un effet.

Raffinement

Une phase d’observation et un suivi quotidien des animaux est réalisé pour évaluer leur état général. Ce suivi régulier de l’état clinique des souris est nécessaire pour tous les protocoles. L’utilisation d’une grille unique de scoring est mise en place et est décrite dans tous les protocoles. Pour les souris porteuses de tumeurs, la taille de la tumeur sera mesurée 3 fois/semaine afin de surveiller l’aspect et la croissance tumorale. Toutes les observations liées à l’aspect et au volume tumoral sont décrites dans la grille de scoring. Les critères concernant l'apparence, la mobilité et le comportement des animaux sont détaillés. Le changement de poids de l'animal est analysé. Les animaux bénéficient de raffinement tel que : maisonnette, carrés de coton, bâtonnets à ronger. La détermination des points limites et l’utilisation d’une grille de score permettent de réduire, supprimer ou soulager au maximum l'inconfort, la douleur et l'angoisse subis par les animaux. Dès l’atteinte d’un point limite, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie à l’isolflurane.

Choix des espèces

Dans le présent projet, nous utiliserons comme petit modèle de rongeur la souris, car les études règlementaires de toxicité et de pharmacocinétique requièrent un modèle rongeur et un modèle non rongeur. Pour les études d’efficacité antitumorale (procédure 3), la souris est un modèle de choix car la majorité des modèles tumoraux sont développés sur des souches de souris. De plus, la souris est un modèle de mammifère dont le profil pharmacologique permet une utilisation préclinique. Jeunes adultes de 6 semaines. Les animaux plus âgés ne sont pas souhaités dans la mesure où la présence de graisse peut entrainer une modification de la biodisponibilité de la molécule. Ces souris (jeunes adultes de 6 semaines) peuvent finir leur croissance ; les animaux à cet âge supportent mieux le transport de l’élevage jusqu’à l’animalerie ainsi que l’anesthésie.