Souris
Caractérisation des effets du tamoxifène sur la fonction musculaire chez un modèle murin reproduisant une forme récessive de myopathie centronucléaire causée par des mutations dans le gène Ryr1
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont une partie atteint un niveau de souffrance sévère. Ce modèle transgénique de myopathie congénitale développe dès quatorze jours, selon le porteur, une perte de poids, une scoliose, une cyphose et une atrophie musculaire, la plupart des animaux mourant avant sept semaines. Les souris subissent des tests moteurs répétés et des mesures de force sous anesthésie pour évaluer le tamoxifène comme traitement, le porteur affirmant qu'aucune douleur n'a été rapportée malgré ces atteintes. Il conclut qu'aucune méthode ne permet d'évaluer une molécule sur un "organisme entier" et euthanasie les souris pour prélever leurs organes.
Objectifs
Les myopathies congénitales sont des maladies génétiques rares qui affectent notamment la fonction des muscles squelettiques. A ce jour aucun traitement n’est disponible pour les patients atteints de ces maladies qui impactent grandement leur survie ou qui sont handicapantes au quotidien. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique d’un agent pharmacologique déjà utilisé en clinique dans d’autres maladies pour le traitement de myopathies congénitales.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de fournir des informations relatives aux effets d’une molécule pharmacologique déjà approuvée et utilisée en clinique dans d’autres pathologies pour le traitement de myopathies congénitales. Ce projet permettra de proposer un traitement pouvant avoir une application en clinique rapide.
Procédures
Des tests de comportement peu invasifs, qui permettront d’évaluer les performances et capacités motrices de l’animal, seront réalisés une fois par semaine chez l’animal vivant à partir de 3 semaines pendant 5 semaines (i.e. jusqu’à l’âge de 8 semaines). Chaque test sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque essai. Chaque essai durera entre 10 secondes et 5 minutes selon le test comportemental. L’activité locomotrice spontanée et la posture debout de l’animal seront acquises pendant 24h, période au cours de laquelle les animaux seront hébergés individuellement. La production de force sera mesurée sur une durée maximale de 30 minutes chez l’animal anesthésié par inhalation d’un mélange gazeux ou par injection intrapéritonéale d’un anesthésique et d’un anti-douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux présentent une perte de poids à partir de 14 jours après la naissance, une scoliose et une cyphose, une atrophie musculaire, une faiblesse musculaire et une durée de vie réduite par rapport à des animaux contrôles (les animaux ne survivent pas plus de 57 jours). Les mâles et les femelles sont affectés. Aucune douleur n'a été rapportée chez ces animaux. Les animaux seront identifiés et génotypés à partir d’une biopsie prélevée à partir de 14 jours suivant la naissance. Les animaux seront isolés. Les animaux seront mis sous anesthésie générale.
Devenir
Les animaux utilisés pour les tests seront euthanasiés après prélèvement des organes nécessaires pour les analyses au niveau cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Dans ce projet qui consiste à évaluer les effets d’un agent pharmacologique sur le muscle, le modèle murin est privilégié car l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer la contractilité du muscle. D’autre part, il n’existe pas de méthode alternative qui permette d’évaluer sur l’organisme entier et dans des conditions in vivo les effets d’une molécule. L’évaluation des effets d’un agent pharmacologique in vivo est un prérequis indispensable avant toute application clinique.
Réduction
Pour la partie accouplement, le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle et en faisant plusieurs portées par femelle. Pour la partie expérimentale, les tests comportementaux peu invasifs offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Ce point est essentiel car il permet de réduire de manière drastique le nombre d’animaux. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement en fin de traitement, ce qui permet non seulement de collecter les différents tissus sur ces mêmes animaux mais également de s’affranchir de générer une cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. Ce point est important car il est à l’origine de la réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. Les tests comportementaux seront peu invasifs et permettront un suivi longitudinal. Afin de diminuer le stress lié à ces tests, une session de familiarisation sera effectuée. Pour les tests nécessitant une anesthésie générale de l’animal, la respiration sera contrôlée visuellement, la température de l’animal sera régulée et maintenue à sa valeur basale à l’aide d’une lampe chauffante et un gel ophtalmique sera appliquée sur les yeux de l’animal afin de limiter l´assèchement des cornées. La phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé est modèle transgénique non disponible sur le marché qui reproduit les caractéristiques principales de la maladie étudiée. Le modèle développe des symptômes de myopathie dès 14 jours après la naissance. La durée de vie maximale est de 57 jours et la majorité des animaux meurt avant l’âge de 7 semaines, nécessitant la mise à mort entre 5 et 8 semaines du fait de la perte de poids et de la faiblesse musculaire sévère. Les tests comportementaux seront réalisés une fois par semaine sur des animaux âgés de 3 semaines sur une période de 5 semaines (donc jusqu’à l’âge de 8 semaines). Les animaux utilisés pour l’évaluation de l’espérance de vie seront maintenus en vie jusqu’à l’âge de 7 mois.
Réponse au traitement et nouvelles thérapies contre l’infection par le VHD
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Une greffe de cellules de foie humain injectées dans la rate, des traitements quotidiens par injection ou par gavage, six prises de sang en douze semaines : 98 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Environ 10 % des greffes échouent, selon le porteur, et ces souris développent en deux à trois semaines une insuffisance hépatique aiguë, avec une perte de poids rapide, avant d'être mises à mort. Hors témoins, les souris greffées sont ensuite infectées par les virus des hépatites B et D, pour chercher des marqueurs de réponse au bulevirtide et tester l'upadacitinib, une molécule de l'arthrite rhumatoïde, et les prises de sang peuvent leur causer inflammation et cécité, le gavage une perforation de l'œsophage ou de l'estomac. Seul le chimpanzé s'infecte naturellement par ces virus, rappelle le porteur, et l'interdiction de son utilisation par la directive européenne lui laisse les souris chimériques au foie humanisé.
Objectifs
Le virus de l’hépatite Delta (VHD) est un virus satellite qui repose sur la présence du virus de l’hépatite B (VHB) pour sa multiplication. Les co-infections VHD-VHB représentent la forme la plus sévère des hépatites virales entraînant une accélération de la progression de la fibrose hépatique vers la cirrhose et le cancer du foie. Si certains traitements permettent aujourd’hui le contrôle de l’infection par le VHB, les traitements disponibles contre le VHD sont non satisfaisants, malgré le développement récent de nouvelles molécules. Notamment, le bulevirtide, inhibiteur d’entrée du virus dans les cellules, bénéficie d’une autorisation conditionnelle d’utilisation en Europe depuis 2020. Cependant, tous les patients ne répondent pas au traitement bulevirtide et les causes de cette variation entre patients est inconnue. De nouvelles stratégies de traitements contre le VHD et la compréhension de la réponse au traitement par bulevirtide sont indispensables. Dans ce contexte, nous avons récemment caractérisé l’activité anivirale d’une molécule utilisée dans le traitement contre l’arthrite rhumatoïde, l’upadacitinib, contre le VHD. Ce projet combine à la fois une analyse de la réponse au traitement par bulevirtide chez les souris co-infectées par le VHD et le VHB, à la recherche de marqueurs de la réponse au traitement, et le test in vivo de l’upadacitinib.
Bénéfices attendus
La thérapie antivirale de dernière génération pour l'infection par le VHD est le bulevirtide, qui conduit à une diminution significative de la charge virale dans les études cliniques chez 70% des patients. Cependant, aucun marqueur de réponse au traitement n'est disponible et des antiviraux plus efficaces sont nécessaires pour améliorer la durée de vie et la qualité de vie des patients infectés par le VHD. Cette étude vise à identifier des marqueurs pour la réponse au traitement par le bulevirtide et le risque de cancer. De plus, l'étude fournira une preuve de concept préclinique en utilisant une nouvelle molécule antivirale comme candidat médicament.
Procédures
Les animaux recevront tout d’abord une injection intraveineuse afin d’améliorer la prise de greffe. Cette injection est réalisée sur animaux anesthésiés ayant reçu une analgésie locale et prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux seront ensuite soumis à une petite chirurgie permettant la greffe de cellules de foie humain. L’injection de cellules de foie humain est réalisée dans la rate des animaux après anesthésie générale et analgésie. Cette chirurgie est réalisée en moins de 10 minutes. Un prélèvement de sang sous anesthésie générale et analgésie locale sera réalisé 3 mois après la greffe afin de nous assurer de la prise de greffe. Ce prélèvement prend moins d’une minute à être réalisé. L’infection par le VHB et le VHD sera réalisée par inoculation des virus par une injection unique dans le péritoine sur animaux vigils après désinfection à l’alcool de la zone à piquer. Cette injection prend moins d’une minute à être réalisée. Les traitements seront administrés de façon quotidienne par injection sous-cutanée après désinfection à l’alcool, ou par gavage oral sur animaux vigils. Injections et gavages oraux sont réalisés en moins d’une minute. Les animaux seront également soumis à un prélèvement de sang une fois toutes les 2 semaines pendant 12 semaines, soit un total de 6 prélèvements. Ces prélèvements sont réalisés sur animaux anesthésiés ayant reçu une analgésie locale et prennent moins d’une minute à être réalisés. Un prélèvement de sang terminal sera effectué en fin de protocole sous anesthésie générale, réalisé en 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les souris chez lesquelles la prise de greffe sera infructueuse (environ 10% des animaux) vont développer une insuffisance hépatique aigüe en 2-3 semaines du fait de la mort des cellules du foie murin, qui se traduit par une perte de poids rapide. Les prélèvements sanguins peuvent entrainer inflammation et cécité. Les injections sous-cutanées peuvent entrainer l’apparition d’une inflammation et/ou d’une induration. Le gavage oral peut également entrainer une inflammation et des saignements/perforation de l’œsophage ou de l’estomac. Les traitements peuvent entrainer une augmentation temporaire de la concentration en acides biliaires dans le sang, qui est asymptomatique et sans conséquence sur la santé. Les traitements peuvent également être associés à une élévation de niveau des enzymes du foie dans le sang ainsi qu’à une augmentation des lipidiques et cholestérol dans le sang.
Devenir
Les animaux de la colonie de reproducteurs seront mis à mort lorsque la qualité de reproduction déclinera. Les 2 animaux d’un couple sont mis à mort si aucune portée n’est obtenue depuis plus de 3 mois. Les animaux greffés chez qui la prise de greffe n’est pas efficace seront mis à mort car ils ne pourront pas être utilisés pour d’autre procédures. Les animaux inoculés avec les virus de l’hépatite B et D ainsi que les animaux contrôles non infectés sont mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le foie et le sang qui nous permettront de réaliser les différentes analyses nécessaires à ce projet.
Remplacement
Afin de remplacer l’utilisation d’animaux, une majorité d’expériences sont menées en amont sur des lignées cellulaires et sur des cellules du foie humain afin de nous assurer de la réelle nécessité de poursuivre sur ces modèles animaux greffés. Il est toutefois nécessaire d’utiliser des animaux pour ce projet car les lignées cellulaires sont dérivées de cellules cancéreuses et présentent de nombreuses modifications de leur ADN par rapport à des cellules normales du foie. De plus l’utilisation de cellules du foie issues de patients nécessiteraient un nombre très élevé de cellules fraichement isolées, les cellules congelées étant très difficiles à infecter in vitro. L’utilisation de biopsies humaines n’est également pas envisageable car les patients diagnostiqués avec une infection VHD sont très rares, et leur condition de conservation et la quantité de tissu n’est pas compatible avec nos besoins permettant d’analyser les modifications de l’ADN. Dès lors, notre modèle de souris au foie humanisé est une alternative indispensable à l’identification de nouvelles voies dérégulées par les virus et potentiellement cibles thérapeutiques.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, seul le nombre requis de souris seront greffées pour ce projet. Nous avons déterminé au préalable le nombre d’animaux nécessaire à ce projet sur la base de 2 critères principaux à savoir le taux de repeuplement du foie par les hépatocytes humains greffés, déterminés par dosage de l’albumine humaine sérique, et les charges virales VHB et VHD qui peuvent être très variables. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé grâce aux données d’une étude précédente sur des souris humanisées. Nous avons donc estimé qu’un nombre de 8 souris par groupe est le minimum requis afin d’obtenir des résultats intra et inter-groupes comparables et interprétables.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tube de coton pour nidifier et des briques de tremble pour ronger, les animaux sont maintenus en groupe de 3 minimum afin d’éviter tout stress de l’animal isolé, les souris greffées auront un suivi quotidien adapté et tous les moyens nécessaires seront mis en œuvre pour éviter tout stress ou douleurs des procédures expérimentales (anesthésie, analgésie), des points limites adaptés et précoces ont été établis afin de soustraire les animaux à toute forme de souffrance inutile. Le nombre d’animaux inclus par groupe sera suffisant pour arriver à une conclusion claire et des résultats statistiquement fiables.
Choix des espèces
Seul le chimpanzé peut-être naturellement infecté, comme l’homme, par les virus VHB et VHD. L’utilisation du chimpanzé étant interdite depuis la nouvelle directive européenne relative à l’utilisation d’animaux en expérimentation animale, l’étude de ces virus in vivo est donc restreinte. Seuls les modèles de souris chimériques au foie humanisé peuvent maintenant être utilisés. De plus ces souris au foie humanisé permettent d’étudier précisément l’impact des maladies du foie et virales sur les cellules du foie humain et de tester des approches thérapeutiques pertinentes pour les patients. Les animaux seront utilisés à un âge adulte d’environ 8 semaines pour la greffe, afin de faciliter l’intervention, et à un âge d’environ 20 semaines au moment de l’inoculation des virus, la prise de greffe optimale étant à 3 mois post-greffe.
Comprendre l’implication de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) sur les cellules microgliales dans les processus neuroinflammatoire associés à l’accident vasculaire cérébral (AVC) et au vieillissement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises pour une partie à une ischémie cérébrale, thromboembolique, thrombotique ou photothrombotique, lors d'interventions d'une heure et demie, ou à des injections dans l'hippocampe et le cortex, 814 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. L'équipe étudie le rôle d'une enzyme, le tPA, sur la microglie, les cellules immunitaires du cerveau, au cours d'un AVC et du vieillissement, avec des souris privées du gène du tPA et des souris âgées de 12 et 18 mois. Les effectifs ne concordent pas : les procédures listées totalisent 446 souris, le calcul de réduction en annonce 506, le total déclaré 814. Le texte prévoit la mise à mort pour collecte d'organes à l'issue des procédures numérotées 1 à 5, alors que la liste passe de la troisième à la septième, celle des injections, dont le devenir n'est pas dit. Le porteur affirme enfin n'avoir observé ni douleur ni souffrance après la chirurgie lors de projets similaires, dans un projet déclaré en partie sévère.
Objectifs
Les microglies sont des macrophages tissulaires résidant dans le cerveau où leur rôle est de détecter les changements dans l'environnement. Ce sont des cellules multifonctionnelles qui peuvent interagir avec d'autres cellules du système nerveux central (SNC), notamment les neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes. L'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est un zymogène exprimé par les cellules endothéliales mais également par les neurones et les cellules gliales dans le SNC où il peut avoir diverses fonctions qui peuvent être dépendantes ou indépendantes du plasminogène. Il a été démontré que le tPA est impliqué dans la physiologie cérébrale, mais joue également un rôle essentiel lors de diverses pathologies. Cependant, son rôle exact dans le SNC reste à comprendre, en particulier sur la microglie. Des résultats du séquençage de l'ARN de souris tPA-null ont révélé une diminution de gènes impliqués dans la fonction microgliale. Le but de ce projet est de déterminer comment le tPA influence la microglie dans le contexte de la neuroinflammation associée à un accident vasculaire cérébral (AVC) et au vieillissement, un facteur de risque qui modifie la réponse microgliale. Le premier objectif sera de déterminer comment le tPA agit sur la réponse microgliale. Un deuxième objectif sera d'étudier comment le tPA influence la neuroinflammation associée au vieillissement par des techniques d'imagerie et de transcriptomique. Dans un troisième objectif, l'influence du tPA sur l'activation microgliale et la réponse immunitaire sera étudiée dans le contexte des AVC et du vieillissement, facteur majeur de risque pour les AVC. L'objectif de ce projet est d'apporter de nouvelles connaissances sur la contribution du tPA sur la microglie lors de la neuroinflammation impliquées lors des AVC et du vieillissement.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est d'apporter de nouvelles connaissances sur la contribution du tPA sur la microglie lors de la neuroinflammation impliquées lors des AVC et du vieillissement.
Procédures
1) Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale (n=60, durée de la procedure :1.5heures) 2) Modèle d’ischémie thrombotique cérébrale focale (n=60, durée de la procedure :1.5heures) 3) Modèle d’ischémie photothrombotique cérébrale focale (n=70, durée de la procedure :1.5heures) 7) Injections stéréotaxiques intra-hippocampiques et intra-corticales (n=256, durée de la procedure :30 minutes)
Impact sur les animaux
Afin de limiter toutes douleur occasionnée par la chirurgie, nous utiliserons un analgesique lors du protocol chirurgical. Lors de projets précédents utilisant des procédures identiques ou similaires, nous n’avons pas observés de signe de douleur ni souffrance des animaux à la suite de la chirurgie. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de souffrance sont le suivi strict et rapproché des animaux, l’hébergement en petits groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (un rouleau cartonné + une feuille de papier essuie-tout), et la manipulation uniquement par des personnels expérimentés. Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, dans un environnement stabilisé en température (21°), hygrométrie (55%), luminosité (100 lux), et durée du cycle de lumière (12h/12h).
Devenir
A l'issue des procédures 1, 2, 3, 4 et 5, les animaux seront mis à mort pour collecte d'organes.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 506 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrale et l’inflammation cérébrale permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards
Choix des espèces
Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques tPA WT et tPA Null. Ces modèles transgéniques ne peuvent être réalisés que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’homme. Les souris tPA WT et tPA Null utilisées dans cette étude seront âgées de 3-4 mois correspondant à un stade jeune adulte. De plus, des souris tPA WT agées de 12 et 18 mois seront aussi utilisées. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature dans l'étude de la neuroinflammation et du vieillissement.
Evaluation de l’effet de candidats médicaments pour retarder la mise-bas de femelles gestantes (modèle physiologique)
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 12240
26 520 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent par plusieurs voies des molécules fournies par des clients, dont le porteur indique ignorer la nature et les effets secondaires, avec pour certaines l'implantation chirurgicale d'une pompe et des prélèvements sanguins terminaux. Ce nombre découle du test en série de nombreuses molécules et doses, à raison de dix animaux par groupe, pour retarder l'accouchement prématuré. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne peut mimer un accouchement, et prévoit la mise à mort de toutes les mères pour prélever le sang fœtal et récupérer les fœtus in utero.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de candidats médicaments pour retarder la mise-bas de femelles gestantes (modèle physiologique).
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patiente accouchant prématurément.
Procédures
Les animaux recevront des administrations de composés à tester. Les voies d’administration sont dépendantes du protocole expérimental mais des administrations per os, intrapéritonéales, sous-cutanées, intraveineuses et intramusculaires pourront être réalisées. Les animaux pourront avoir une implantation de pompe type Alzet sous anesthésie. Ils pourront également avoir des prélèvements sanguins terminaux ou en cours d’expérimentation (étude de pharmacocinétique) sur animal éveillé ou sous anesthésie selon la voie de prélèvement utilisée.
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux provoqués par les composés. Cependant, les animaux seront mis en cage individuelle et seront traités plusieurs fois par jour ce qui pourrait engendrer du stress d’autant plus que les animaux sont des femelles gestantes. De plus, les animaux pourront subir une chirurgie pour l’implantation d’une pompe osmotique, ce qui pourrait provoquer une hypothermie et du stress à l’animal.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, les animaux seront euthanasiés car du sang fœtal et de la mère sera prélevé. A l’issue de la procédure 2, tous les animaux seront euthanasiés car les fœtus devront être récupérés in utero après sacrifice de la mère et des organes pourront être ensuite prélevés (cornes utérines).
Remplacement
Actuellement, aucune méthode in vitro, ex vivo ou in silico ne permet de mimer un accouchement dans son ensemble et d’évaluer des effets sur les fœtus (malformation, avortement in utero..). Le temps de gestation étant dépendante de facteurs hormonaux, du nombre de fœtus par femelle, du bien-être de cette dernière et de son niveau de stress, aucune technique cellulaire ou autre ne permet de remplacer l’animal, c’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est nécessaire pour comprendre et traiter cette pathologie.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à ce projet sera de 26520 animaux en raison de 10 animaux par groupe, le nombre de groupe étant fonction du nombre de molécules et/ou doses à tester. De par notre expérience sur ce modèle, 10 animaux par groupe est le nombre minimum nécessaire pour observer des différences statistiquement significatives entre les groupes. Les souris livrées qui ne seront pas gestantes (environ 10-15% d’imprécision pour déterminer les femelles gestantes) seront utilisées pour des apprentissages de gestes techniques ou autre. Ces animaux ne seront pas sacrifiés sans avoir été utilisés
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un suivi quotidien de leur état sera réalisé par du personnel qualifié. Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant de réaliser les expérimentations sous caméra afin de suivre un même animal sur quelques jours. Nous apporterons une attention particulière au bien-être des animaux avec une surveillance accrue (au moins 2 fois par jour), une manipulation en douceur par du personnel qualifié du fait que les femelles soient gestantes, une attention particulière à ce que les animaux soient au calme (pièce spécifique pour ces études), un suivi post-opératoire (observation du réveil, animaux sur plaque chauffante thermorégulée pendant la chirurgie pour éviter une hypothermie). Une attention particulière sera réalisée si un animal présentait des difficultés pour boire, se nourrir (ajout de croquettes humides dans la cage), se déplacer ou des signes de souffrance tels que vocalisation, prostration (euthanasie de l’animal si atteinte des points limites). Un enrichissement (type carré de coton, igloo) sera apporté lors du sevrage des petits.
Choix des espèces
L’utilisation de rongeurs pour étudier l’effet de molécules pour retarder les accouchements prématurés est bien décrite dans la littérature et est très souvent utilisée du fait du faible nombre de jour de gestation et d’un nombre important de fœtus lors de la mise bas pour évaluer les effets secondaires possibles des composés à tester. Classiquement nous réalisons cette étude sur des souris mais des demandes clients sur le rat nous ont été demandées donc nous préférons faire une demande d’autorisation chez la souris et le rat, sachant que la technique reste identique. Nous avons besoin de femelles gestantes donc les animaux devront être matures sexuellement, par conséquent âgés d’au moins 8 semaines. Les petits seront observés de leur naissance jusqu’à leur sevrage au bout de 3-4 semaines (soit des animaux de 0 à 28 jours).
Impact de la voie d’administration sur l’incorporation cérébrale d’un acide gras oméga3 (DHA)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
202 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qualifié de léger à modéré. Elles reçoivent des administrations répétées d'un acide gras oméga3 par voies orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intranasale, précédées d'un jeûne de quatre heures, puis une ponction intracardiaque terminale sous anesthésie, pour comparer les voies d'acheminement du DHA vers le cerveau. Le porteur présente ce travail comme une piste de prévention de la maladie d'Alzheimer, avec un éventuel essai clinique renvoyé à terme. Il affirme qu'une étude de biodistribution dans l'organisme ne peut se réaliser autrement que sur un modèle vivant, et prévoit la mise à mort de toutes les souris pour prélever fluides et tissus.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est la forme la plus fréquente de maladie neurodégénérative associée à une démence chez les sujets âgés. L'élaboration et la mise sur le marché de nouveaux traitements pour lutter contre ce fléau est un défi sanitaire et économique majeur. Le stress oxydant induit par de nombreux facteurs environnementaux (notamment l'exposition à des polluants chimiques) est un évènement extrêmement précoce et jouant un rôle majeur dans la dégénérescence neuronale observée chez les malades d’Alzheimer. Notre projet a pour objectif de reconsidérer l’utilisation des acides gras de la famille oméga3 dans une approche de prévention de la MA, en contournant l’obstacle de leur faible biodisponibilité cérébrale par le biais de leur nanovectorisation et de l’utilisation de la voie d’administration intranasale. Cette étude consistera à évaluer et comparer la cinétique de biodistribution d'une forme nanovectorisée de l'acide docosahexaénoïque (DHA, un acide gras omega3) après administration par voie orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, ou intranasale chez la souris. Nous pourrons ainsi déterminer la pertinence de l'administration intranasale par rapport aux autres voies d'administration afin d'enrichir le cerveau en DHA.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'évaluer l'impact de la voie d'administration du DHA sur sa biodistribution et de déterminer si la voie d'administration intranasale offre un bénéfice pour cibler le cerveau par rapport à la voie orale classiquement utilisée (compléments alimentaires). A terme, ce projet a pour objectif de développer une formulation de DHA destinée à une administration par voie intranasale dans le cadre de la prévention de la maladie d'Alzheimer et pourrait donc déboucher sur la mise en place d'une étude clinique.
Procédures
Les animaux, en fonction de leur groupe, pourront être soumis à : -une ou plusieurs administrations de DHA par voie orale -une ou plusieurs administrations de DHA par voie intrapéritonéale -une ou plusieurs administrations de DHA par voie sous-cutanée -une ou plusieurs administrations de DHA par voie intranasale - En fin de procédure, une ponction intracardiaque sera effectuée sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Les administrations seront effectuées par une personne qualifiée et après une période d'habituation à l'expérimentateur. Les nuisances attendues sont liées au jeûn de 4 heures précédent l'administration de DHA ainsi qu' à l'administration (ou aux administrations répétées) de la solution de DHA.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés afin de pouvoir récupérer les fluides biologiques et tissus pour le dosage du DHA.
Remplacement
S'agissant d'une étude de l'impact de la voie d'administration du DHA sur sa cinétique de biodistribution dans l'organisme, il n'est pas envisageable de la réaliser autrement qu'en ayant recours à un modèle vivant. Des études préalables ont été réalisées in vitro afin de sélectionner la forme chimique du DHA (phospholipide, ester de cholestérol, triglycéride, libre) la plus adéquate pour favoriser son incorporation dans les cellules.
Réduction
Le nombre d’animaux (184) est réduit au minimum pour répondre aux objectifs du projet. Le nombre d'animaux dans chaque groupe, ainsi que le nombre de groupes est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe et a été déterminé par une analyse de puissance statistique basée sur nos études précédentes Ici, 8 animaux par groupe seront nécessaires pour observer d’éventuels changements. A ce nombre d’animaux une marge de 10% (+18) sera ajoutée afin de compenser les aléas expérimentaux. Nombre total de souris : 202.
Raffinement
Afin de minimiser les effets du stress, mais également de contrôler l’état général des animaux, les souris seront manipulées chaque jour par l’expérimentateur en charge de l’expérience, avant chaque procédure. Durant la phase expérimentale, les animaux seront observés afin de déceler immédiatement toute souffrance et d'évaluer les potentiels effets indésirables. Les administrations par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intranasale seront effectuées par une personne qualifiée et après une période d'habituation.Tous les incidents et toutes observations anormales (comportement, poids, pelage, plaie,…) seront transmis à l’expérimentateur afin d’être traités dans les plus brefs délais et seront notés dans un tableau de suivi expérimental. Un animal sera euthanasié s’il présente : 1- une perte de poids > 15%; 2- une attitude inhabituelle traduisant un mal être (prostration, agressivité...); 3- l’apparition de toute altération de l’état général (altération du pelage, tumeur, excroissance, prolapsus…).
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études pharmacocinétiques. Ces études de biodistribution chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender la distribution des composés bioactifs chez l'homme dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (6 mois) étant donné que notre projet s'inscrit dans le cadre du développment d'une stratégie de prévention de la maladie d'Alzheimer destinée à être testée chez l'adulte.
Etudes cliniques, pathologiques et virologiques de l’infection de SRAS-CoV-2 chez des souris transgéniques. Evaluation de traitements thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le SRAS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie, reçoivent des injections répétées et des prélèvements sanguins rétro-orbitaux, pour étudier les atteintes cérébrales de la Covid et tester des traitements. Le porteur indique que l'infection peut entraîner une perte de poids allant jusqu'à 20 % et se révéler mortelle en sept jours, avec atteinte du système nerveux central et chute des capacités motrices et respiratoires, les souris M83 développant en plus une paralysie spontanée. Il affirme que l'étude de la physiopathologie ne peut se faire sans inoculer le virus à l'animal vivant, et justifie la mise à mort de toutes les souris par la gestion du risque lié à un agent pathogène de groupe III.
Objectifs
L’émergence de variants de SRAS2 requiert de nouvelles données scientifiques. Des patients continuent à présenter certains symptômes, parfois des mois après leur guérison, et d’autres en développent de nouveaux. Ces symptômes sont regroupés sous le nom de COVID- long. Des signes neurologiques sont observés chez les patients atteints de Covid et pourraient accélérer des pathologies cérébrales à long terme. Par ailleurs, le rôle de la réponse immunitaire innée est questionné dans l’établissement des symptômes de la Covid à court et long terme. Enfin, les mucines, composant du mucus, pourraient avoir un rôle clé dans la diffusion du SRAS2 au sein de la cavité nasale puis vers le tissu pulmonaire. Ce projet a pour objectifs (1) l’étude de la physiopathologie cérébrale des infections à SRAS2, (2) une meilleure compréhension du rôle de la réponse interféron induite par le virus (3) l'exploration du rôle des protéines composant le mucus (mucines) dans l'infection de l'épithélium respiratoire par le SRAS2 et (4) l'évaluation de traitements permettant de diminuer la pathologie cérébrale et l'inflammation à SRAS2. Pour répondre à ces questions, nous utiliserons une souris transgénique qui développe une neuropathologie rappelant la maladie humaine, un modèle de souris qui présente une immunité altérée, et un modèle de souris déficiente pour l'expression de mucines.
Bénéfices attendus
L’étude chez le rongeur des infections à SRAS-CoV-2 et des stratégies de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre la COVID-19 et les variants émergents de SRAS-CoV-2. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche. Ce projet va permettre d’évaluer le risque de survenue de troubles de type maladie de Parkinson suite à une infection SRAS-CoV-2, de mieux explorer le rôle de la réponse immune innée dans les infections SRAS-CoV-2 ainsi que de tester des pistes de traitement et de caractériser le rôle des protéines du mucus (mucines) dans l’infection SRAS-CoV-2.
Procédures
Les inoculations par voie nasale sont réalisées sous anesthésie générale. Les administrations par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale ou intramusculaire sont réalisées sur l’animal vigile. Les prélèvements sanguins seront réalisés au sinus rétro orbital sous anesthésie générale et collyre anesthésique. La durée de chacune des interventions décrites est inférieure à 1 minute.
Impact sur les animaux
Selon les données déjà disponibles de la littérature, il a été observé une chute de poids n’excédant pas 20% du poids initial que ce soit suite à une infection avec une souche adaptée à la souris ou un variant du SRAS-CoV-2. Les souris M83 développent spontanément des symptômes. Pour les souris M83, elles seront gardées jusqu’à un âge maximum de 8 mois, sachant que les premiers signes de paralysie spontanés n'apparaissent pas avant l'âge de 8 mois chez ces animaux. Selon la dose administrée et la souche virale considérée l’infection peut s’avérer létale chez la souris transgénique hACE2 à 7 jours post-infection avec une perte de poids et une infection du système nerveux central conduisant à une chute de l’activité motrice et des capacités respiratoires.
Devenir
La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition de l’agent pathogène de groupe III utilisé dans cette procédure
Remplacement
L’étude de la physiopathologie de l’infection ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant. De plus nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur des évolutions sur le long terme (2 mois) qui ne peuvent être mimés in vitro. En revanche, les stratégies thérapeutiques seront validées préalablement sur des modèles d’infection utilisant des lignées cellulaires appropriées. L’effet du traitement antiviral sur la multiplication du SRAS-CoV-2 sera ainsi entériné par des analyses in vitro. Les essais thérapeutiques seront ensuite réalisés chez l’animal dans les meilleures conditions possibles afin d’évaluer l'innocuité et l’efficacité du traitement.
Réduction
Dans le but de suivre le principe des 3R et de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre d’animaux par groupe a été calculé sur la base de notre expérience acquise précédemment et des données bibliographiques (publications scientifiques). Dans notre expérience, des groupes de 6 animaux permettent d’atteindre une significativité statistique. La comparaison des traitements ou entre lignée de souris s’établit à l’aide de tests non paramétriques avec un niveau de confiance de 95%. Les différences entre les groupes seront considérées comme significatives si la valeur P est inférieure à 0,05%. Pour respecter la règle des 3R, les animaux seront utilisés pour plusieurs expériences (études histologiques et moléculaires).
Raffinement
Pour minimiser le stress induit aux animaux, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane avant inoculation intra-nasale du virus. L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide et permet d’assurer un réveil rapide en minimisant l’hypothermie. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Les souris seront hébergées par 6 dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger.
Choix des espèces
La souris exprimant le récepteur murin ACE2 est sensible à l’infection par les souches adaptée à la souris et certains variants du SRAS-CoV-2. Elle présente l’avantage de pouvoir envisager l’emploi de souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt (surexpression ou suppression) nécessaire à l’exploration des mécanismes biologiques impliqués dans la susceptibilité ou la défense de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale. Les modèles de souris transgéniques exprimant le récepteur humain ACE2 au SRAS-CoV-2 permettent le développement clinique et virologique des infections à l’ensemble des souches circulantes et variants de SRAS-CoV-2. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris de moins de 6 mois au moment de l’infection. Cette tranche d'âge permettra de disposer de lots homogènes des différentes colonies de souris transgéniques. L'âge maximal de 6 mois permet également d'éviter l'apparition de signes sévères associés à l'infection.
Caractérisation de marqueurs d’adaptation aux mammifères de virus influenza H1N1 en modèle murin
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de souffrance sévère. Elles sont infectées par un virus influenza H1N1 par voie nasale, subissent des écouvillons buccaux, et servent notamment à déterminer une dose létale 50, c'est-à-dire la dose de virus qui tue la moitié des souris. Le porteur reconnaît une perte de poids pouvant dépasser 20 %, une détresse respiratoire sévère et une léthargie jusqu'aux points limites, et renvoie l'étude des mécanismes à des projets futurs. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe, les modèles in vitro n'ayant pas selon lui la complexité d'une infection touchant plusieurs organes.
Objectifs
Les populations virales sont confrontées à des goulots d'étranglement (événements réduisant la taille de la population virale et, par conséquent, sa diversité génétique) qui peuvent être divisés en deux catégories : les goulots d'étranglement de transmission et les goulots d'étranglement au sein de l'hôte. Des travaux menés par notre équipe sur les virus influenza aviaires, et par d’autres équipes sur les virus influenza humains, ont suggéré que la réponse immunitaire innée imposait un goulot d’étranglement majeur, prévenant l’émergence des variants minoritaires. Pourtant, ceci n’a jamais été formellement démontré expérimentalement. Pour le faire, nous souhaitons utiliser comme virus modèle un virus influenza WSN H1N1, typiquement utilisé en laboratoire. A partir de ce virus, nous avons obtenu trois mutants, possédant un avantage sélectif moindre en culture cellulaire : en comparaison à la souche sauvage, ils se répliquent de manière moins efficace in vitro. Nous avons ainsi un virus adapté aux mammifères (la souche sauvage, que nous souhaiterions utiliser comme variant minoritaire) et plusieurs virus avec un désavantage sélectif, à utiliser comme variants majoritaires. Nous souhaitons ainsi reproduire le phénomène suivant : un mammifère est infecté par un virus aviaire (donc peu adapté aux mammifères) ; au cours de la réplication de ce virus, un variant possédant une mutation d’adaptation aux mammifères apparaît. Ce variant est donc minoritaire par rapport au virus initial : pour que son émergence soit réussie, il doit devenir majoritaire et ainsi échapper au goulot d’étranglement imposé par la réponse immunitaire. Les caractéristiques phénotypiques d’un virus peuvent être différentes entre les modèles in vivo et in vitro : une mutation peut conférer un avantage sélectif à un virus lorsqu’il infecte un tapis cellulaire, sans que cette mutation ait d’impact sur la physiopathologie d’une infection in vivo. Des expériences sont nécessaires pour caractériser in vivo le virus sauvage et ses variants, et répondre aux objectif suivants : - Confirmer que le virus sauvage a un avantage sélectif par rapport aux virus mutés. - Déterminer les doses létales 50 (cet indicateur mesure la dose de virus causant la mort de 50 % d'une population animale donnée dans des conditions d'expérimentation précises) - Déterminer les organes dans lesquels les virus se répliquent préférentiellement.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'identifier un ou plusieurs marqueurs d'adaptation aux mammifères du virus H1N1 étudié dans le modèle souris : nous confirmerons ou non que les mutations identifiées in vitro ont un impact in vivo. Si cela était bien le cas, nos mutants causeront moins de mortalité et se répliqueront moins efficacement chez la souris. Les mécanismes conférant les avantages sélectifs apportés par ces mutations seront étudiés dans les projets futurs, afin de mieux comprendre les déterminants moléculaires de l'adaptation des virus influenza aux mammifères.
Procédures
Les animaux seront infectés par inoculation intranasale du virus après sédation préalable. Les seuls prélèvements effectués sur des animaux vivants seront les écouvillons oropharyngés : il s'agit d'un prélèvement rapide, simple et indolore, où un écouvillon en coton vient frotter l'intérieur de la bouche pour prélever de la salive.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables suivants peuvent être observés jusqu'à atteinte des points limites préalablement définis : perte de poids supérieure ou égale à 20 %, dyspnée sévère, réduction de la mobilité, léthargie.
Devenir
Certains animaux seront euthanasiés pour que leurs organes soient récoltés. Les animaux survivant pour lesquels une autopsie n'est pas nécessaire ne pourront pas être adoptés, ayant été infectés par des virus influenza. Leur réutilisation ne sera pas possible, car les animaux auront développé une réponse immunitaire vis à vis des virus que nous étudions.
Remplacement
Il n’existe aucune méthode alternative permettant d’étudier les interactions entre variants dans différents tissus et l’impact de la réponse immunitaire innée. Les méthodes in vitro et ex vivo n’ont malheureusement pas la complexité d’une infection multiviscérale.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est déterminé de façon à pouvoir évaluer par des tests statistiques les différences entre les groupes d’animaux : selon les données étudiées, des groupes de 5 ou 6 animaux sont suffisants.
Raffinement
Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, les mesures suivantes sont appliquées : - Les souris seront hébergées par groupes de 6 dans la première procédure et par groupe de 5 dans la seconde (les cages que nous possédons, de la marque Allentown, permettent d’héberger jusqu’à 6 animaux). - Application de conditions d’ambiance en accord avec l’âge et l’espèce (température, éclairage, hygrométrie). - Fourniture d’eau et d’aliment (adapté aux besoins d’entretien ou de croissance des souris) sans restriction et avec enrichissement (abris en cellulose, tunnels en plexiglass, cylindres en coton). - Manipulation des souris et contrôle de l’état des souris deux fois par jour par du personnel qualifié : cette surveillance permettra notamment afin d'identifier les animaux pour lesquels une mise à mort est humainement nécessaire (les points limites définis pour chacune des procédures ayant été atteints). - Inoculation intranasale du virus réalisée après anesthésie intrapéritonéale.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour évaluer la réplication des virus influenza. De nombreux réactifs sont également disponibles pour moduler la réponse immunitaire, ce qui n’est pas le cas des autres modèles animaux utilisés pour l’étude de ces virus. Souris Balb/c âgées de 4 à 6 semaines : il s’agit de la souche la plus utilisée pour les infections par les virus influenza et l’âge est bien adapté car les souris âgées de 4 à 6 semaines ont déjà un système immunitaire fonctionnel.
Etude des réseaux impliqués dans l’anorexie et la perte d’appétit associée aux états de maladie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 113
281 animaux non-humains, 168 souris et 113 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, une partie sous anesthésie sans réveil, le reste en souffrance légère à modérée. Une partie subit une chirurgie stéréotaxique du cerveau pour l'injection de traceurs ou de virus, l'ensemble reçoit des injections de chlorure de lithium qui provoquent délibérément douleurs abdominales et diarrhée, avant la mise à mort pour prélever les cerveaux. Le porteur présente une partie des travaux comme préliminaires, destinés au dépôt d'une demande de financement ANR, et situe l'interprétation en lien avec l'anorexie humaine au conditionnel. Il affirme qu'aucune alternative n'existe et que les résultats "ne nécessitent l'utilisation d'aucun test statistique".
Objectifs
Récemment, notre équipe a caractérisé un réseau neuronal impliqué dans le contrôle cognitif et intéroceptif de la prise alimentaire. Ce projet vise à poursuivre ce travail. Différentes expériences seront mises en œuvre afin de poursuivre l’analyse anatomique du réseau (intégrant d’autres structures cérébrales), à en identifier certains types cellulaires et son développement. Ce projet est effectué en collaboration avec des chercheurs des Etats-Unis et de Suisse. L’objectif de ces travaux dont certains sont préliminaires est le dépôt d’un projet ANR PRCI en 2023/2024.
Bénéfices attendus
Nous prévoyons d’obtenir des données anatomiques et fonctionnelles originales afin d’améliorer notre compréhension du réseau d’une région de l’hypothalamus postérieur : le PSTN (noyau parasousthalamique). Nous étendrons nos connaissances de l’organisation des connexions neuronales qui impliquent diverses régions du télencéphale et diencéphale. Les données fonctionnelles associées concerneront le contrôle cognitif de la prise alimentaire (par la compétition entre stimuli hédoniques et aversifs de divers ordres) et ces résultats pourront être interprétés dans le cadre de troubles psychiatriques du comportement alimentaire observés chez l’Homme (Ex : anorexie, boulimie, …).
Procédures
Une procédure chirurgicale (Chirurgie stéréotaxique) sera utilisée pour l’injection intracérébrale de traceurs ou de virus pour traçage génétique. Cette procédure, d’une durée de 45 min, sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse complémentée par un analgésique en pré-opératoire. Les animaux ne seront opérés qu’une fois soit au total 25 rats et 80 souris. Les autres nuisances notifiables pour ce projet seront des injections intrapéritonéales une à deux fois selon les types de procédures. Les 281 animaux sont concernés.
Impact sur les animaux
Les expériences d’injection stéréotaxique de traceur/virus seront susceptibles d’entrainer un disconfort temporaire et de faible intensité, particulièrement au niveau des sutures. Ce disconfort disparait avec la cicatrisation. Lors des injections de Chlorure de Lithium (LiCl), des douleurs abdominales et une diarrhée mimant une intoxication alimentaire se déclarent dans l’heure suivant l’injection chez les animaux. Ces symptômes temporaires sont nécessaires à la réussite de l’expérience. Certains animaux seront euthanasiés une heure après l’apparition des premiers signes (poil hérissé, réduction de la mobilité, étirement de l’abdomen, dos creusé, apparition de diarrhées). Ceux qui ne seront pas euthanasiés, seront surveillés jusqu’à complète guérison (5-6h).
Devenir
Ce projet contient 5 procédures. Pour les 4 premières procédures, une partie des animaux subiront une chirurgie stéréotaxique, et l’autre partie, des injections intrapéritonéales. Ils resteront tous en vie pour intégrer la dernière procédure. En effet, nos recherches étant menées sur le système nerveux central, tous les animaux seront euthanasiés à la fin des expériences afin d’extraire les cerveaux qui seront ensuite traités pour des approches histologiques et ainsi obtenir les résultats à interpréter.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de modèles animaux pour ces travaux. Toutes les études visant à comprendre l’organisation des réseaux cérébraux impliqués dans l’expression des comportements et l’influence de paramètres cognitifs et sensoriels susceptibles de modifier/perturber cette expression, nécessitent l’utilisation d’animaux vivants.
Réduction
Les résultats obtenus ne nécessitent l’utilisation d’aucun test statistique. La réduction du nombre d’animaux utilisés pour des expériences de traçage de voies nerveuses est dépendante de la qualité du matériel et de l’expérience des expérimentateurs aux méthodes stéréotaxiques (le responsable de projet a presque 40 ans d’expérience dans ce domaine et forme de jeunes exprimentateurs depuis 30 ans). Le nombre d’animaux utilisés dépendra de la précision des injections, qui ne peut être évaluée qu’au moment de l’examen des coupes histologiques des cerveaux. Il faut un nombre suffisant d’injections pour couvrir l’ensemble du territoire d’intérêt, ce qui complique beaucoup l’évaluation du nombre d’animaux requis. La technique BrdU repose sur l’injection de cette molécule à des femelles en gestation ; le nombre d’animaux utilisés sera donc dépendant du nombre de petits issus de ces portées. Au total, il nous faut au minimum 5 animaux par stade issus de 2 portées différentes afin d’obtenir des résultats fiables. Nous allons pratiquer des injections à des rats et des souris à 6 stades de gestation. Il faut savoir qu’il peut y avoir une légère différence de maturité entre des embryons aux deux extrémités des trompes utérines, donc si 5 est un minimum, plus nous observons d’animaux, meilleurs seront nos résultats. En tout état de cause, deux portées par stade et l’analyse des mâles et femelles issues de ces portées font que nous aurons toujours un nombre suffisant de données (Nous attendons de 4 à 12 petits par portée). Les portées n’ont pas à être égalisées à la naissance puisque seul compte le stade auquel l’injection de BrdU est effectuée.
Raffinement
Les principales mesures de raffinement concerneront les soins pré-, per-et post-chirurgicaux apportés aux animaux. Les expériences d’injection stéréotaxique de traceur/virus seront susceptibles d’entrainer un disconfort temporaire. La gestion de la douleur sera traitée de deux manières : 1) injection d’un analgésique ¼ d’heure l’anesthésie. L’injection stéréotaxique étant de courte durée, l’analgésique continuera d’agir pendant la phase de réveil (pendant 3 heures au minimum après la chirurgie) et 2) un analgésique plus léger (Paracétamol, 1g/L) pourra être donné aux animaux au moindre signe de souffrance passé le délai de 24 h. En post-opératoire, le disconfort se situe particulièrement au niveau des sutures. Une application de lidocaïne analgésique sur la cicatrice, juste avant le réveil de l’animal, diminuera les démangeaisons. Par ailleurs, les animaux devant recevoir des injections de LiCl ou de BrDU seront habitués à être manipulés par les expérimentateurs ce qui diminuera le stress lié à ces injections le jour de l’expérience. Les injections de BrDU ne provoquent aucune douleur. Pour le LiCl, des douleurs abdominales et une diarrhée mimant une intoxication alimentaire se déclarent dans l’heure suivant l’injection chez les animaux. Ces symptômes transitoires sont nécessaires à la réussite de l’expérience. Certains animaux seront euthanasiés une heure après l’apparition des premiers signes (poil hérissé, réduction de la mobilité, étirement de l’abdomen, dos creusé, apparition de diarrhées). Ceux qui ne seront pas euthanasiés, seront surveillés jusqu’à complète guérison (5-6h). Un analgésique (Paracétamol, 1g/L) pourra être donné aux animaux au moindre signe de souffrance (prolongation des symptômes cités ci-dessus) passé le délai de 6 h.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les modèles les plus utilisés pour la recherche en Neurosciences. Nos connaissances sur l’organisation du système nerveux central sont les plus approfondies chez ces espèces. Les rats sont des animaux sur lesquels les données anatomiques sont les plus nombreuses : la taille du cerveau facilite l’analyse microscopique et ce modèle permet aussi des observations pour une meilleure extrapolation de ce qui peut être observé chez des espèces plus complexes. La Souris est de plus en plus utilisée car elle permet l’obtention de modèles génétiquement modifiés afin d’obtenir des informations nouvelles qu’il serait impossible d’obtenir autrement. Concernant le stade de développement, seuls des animaux adultes entre 8 et 10 semaines seront utilisés que ce soient les animaux achetés ou nés/élevés dans notre établissement. Les animaux de cet âge ont fini leur croissance et la maturation de leur cerveau. Cela permet d’avoir une reproductibilité pour les structures cérébrales et des poids d’animaux adéquats pour réaliser notamment les expériences de stéréotaxie.
Apprentissage de gestes techniques de base de zootechnie par des étudiants
- Formation professionnelle
Rats : 600
Lapins : 50
1250 animaux non-humains vont être utilisés, 600 souris, 600 rats et 50 lapins, dont 1190 tués à l'issue et 60 adoptés. Chaque souris ou rat sert de support à une vingtaine d'actes, injections, gavages, prélèvements de sang, tests comportementaux, chaque lapin jusqu'à cinquante, pour former des élèves techniciens animaliers, la mise à mort faisant elle-même partie des gestes enseignés et les corps servant ensuite aux dissections. Le porteur reconnaît que des élèves peu familiers des techniques peuvent provoquer hématomes, fausses routes ou perforations du tube digestif. Il indique commencer chaque séance par des méthodes de remplacement, cartons, fausses peaux, vidéos, mannequins, mais juge "impossible" de se passer totalement d'animaux vivants pour former du personnel.
Objectifs
Ce projet décrit les séances de travaux pratiques d'un programme d'enseignement secondaire destiné à la formation diplomante de techniciens animaliers. Le recours à l'animal vivant n'a lieu que dans le cadre global d'une progression pédagogique qui inclut bien d'autres moyens d'enseignement. Les élèves de notre formation doivent devenir des techniciens animaliers de laboratoire en 3 an avec une progression des apprentissages pratiques. Chacune de nos 3 classes sont divisées en 2 groupes d'élèves dont la progression est suivie par un enseignant. Les animaux utilisés changent entre chaque groupe de TP pour respecter des temps de repos définis. Les élèves réalisent les travaux pratiques en binomes, et ils sont noté individuellement dans l'acquisition de la théorie, de la connaissance de la technique et la réussite dans la réalisation de la technique. Quelle que soit l'espèce, chaque séance d'apprentissage se déroule de la même manière, une première partie est consacrée à l'explication des objectifs et des conditions de réalisations illustré par des vidéos ou des essais sur mannequins. Cette phase est nécessaire pour l'acquisition des automatismes. Elle permet également d'espacer les passages sur animaux vivants facilitant les encadrements. A terme, ainsi, nos élèves peuvent être embauchés dans les laboratoires de recherche animale, avec une dextérité suffisante, et une bonne connaissances des règles éthiques, pour réaliser les protocoles expérimentaux qui leurs sont demandés dans les meilleures conditions. Cette progression pédagogique bénéficie à la fois à la qualité des résultats pédagogiques et à l'amélioration du sort des animaux utilisés en recherche.
Bénéfices attendus
Lors de ce projet, les apprentissages permettent d'aborder et de réaliser différentes procédures expérimentales. Il a pour but de raffiner les procédures de prélèvement et d'injection afin d’éviter la souffrance des animaux, de réduire le nombre d’animaux. Les bénéfices sont multiples : le premier concerne l'objectif pédagogique puisqu'il s'agit de former des personnes compétentes et habilitées à travailler avec des animaux de laboratoire : les élèves formés deviennent des professionnels des techniques enseignées et donc peuvent réaliser les procédures dans des conditions normalisées pour le respect de l’animal. Le deuxieme bénéfice est d'inculquer la culture du soin qui est de faire prendre conscience aux jeunes que l'on travaille avec du vivant et que l'on doit tout mettre en œuvre pour favoriser son bienêtre et pour respecter totalement l'animal. Cette culture du soin tient également compte du manipulateur car un personnel à l'aise et en confiance car bien formé sera d'autant plus respectueux de l'animal.
Procédures
Le projet est prévu pour 5 ans avec un renouvellement total des animaux à chaque année scolaire. Les animaux sont donc utilisés entre septembre et juin en n+1. Durant cette période, ils participent au programme de formation des jeunes. Pour les 120 souris par année scolaire, chacune va participer au maximum à 20 interventions parmi la liste suivantes injection sous cutanée, intra péritonéale,intra musculaire, intra veineuse, gavage, prélèvement sanguin (Saphène, submaxillaire, sinus rétro orbitaire, caudale, cardiaque) et tests comportementaux Pour les 120 rats par année scolaire, chacun va participer au maximum à 20 interventions parmi la liste suivantes injection sous cutanée, intra péritonéale,intra musculaire, intra veineuse, gavage, prélèvement sanguin (Saphène, jugulaire, caudale, cardiaque) et tests comportementaux. Pour les 12 lapins par année scolaire, chacun va participer au maximum à 50 interventions parmi la liste suivantes injection sous cutanée,intra musculaire, intra veineuse, gavage, prélèvement sanguin (Saphène, auriculaire, cardiaque). L’ordre des actes peut varier en fonction des années et surtout de l’habilité des jeunes en vue de pratiquer les actes les plus simples en premier pour un meilleur respect de l’animal. Quelque soit l'animal, un délai minimum de 7 jours est respecté avant son utilisation lors d'une autre scéance de TP. Les séances de TP durent 1 h, et chaque animal est utilisé pendant quelques minutes, avec un nombre limité de tentatives pour chaque étudiant. Si l'élève échoue, l'a nimal est laissé tranquille.
Impact sur les animaux
Le maximum de précautions sont prises pour que les animaux ne subissent pas d’effets indésirables. Néanmoins, les élèves n'étant pas familiers des techniques enseignées, peuvent provoquer des nuisances sur les animaux. Elles peuvent être de différentes natures : stress du à des appréhensions des élèves , contention trop lache ou trop ferme, ou erreurs de manipulations pouvant conduire à des blessures (hématome, fausse route ou perforation du tube digestif) ou des douleurs (intramusculaire, intradermique) . Une autre source de stress peut provenir de la succession des actes invasifs même si des délais entre chaque acte sont respectés. D'autres nuisances peuvent également survenir, il s'agit des blessures infligés par des congénères Vu que les animaux sont surveillés et observés chaque jour, la détection d’un effet indésirable sur un animal conduit immédiatement à la mise en place d’une procédure adaptée : information au responsable, recherche de la cause de cet effet, avis vétérinaire si besoin, et si cela est possible : soulagement de l’animal sinon mise à mort pour éviter les souffrances inutiles.
Devenir
Chaque procédure correspond à une espèce, elles sont donc totalement indépendantes l'une des autres. Les animaux à l'issue de chacue des procédures ont le même sort quelque soit l'espèce. La plupart des animaux sont mis à mort pour différentes raisons. Les élèves doivent être formés sur les techniques de mises à mort. Les animaux morts sont réutilisés l'année suivante pour les dissections et les entrainements à la réalisation de points de suture. Un vide sanitaire de l'animalerie est ainsi possible pendant la période sans animaux permettant de maintenir un statut sanitaire propre. Une faible partie des animaux sont adoptés par les élèves car ceux qui sont en seconde et première doivent faire encore des stages en laboratoires animaliers. Il se pose donc des problème de logistique du à la quarantaine du personnel pour rentrer en zone.
Remplacement
Plusieurs méthodes sont utilisées pour éviter d’avoir recours aux animaux : La première consiste à travailler sur des supports inertes tels que des cartons, fausses peaux... qui permettent de s’entrainer à la manipulation des seringues et aiguilles pour trouver les bons angles, pour apprécier la force de pénétration de l’aiguille et pour rester fixe pendant la manipulation du piston. La deuxième méthode permet de visualiser la procédure grâce à la diffusion de vidéos réalisées en interne en précisant les difficultés et solutions. La troisième permet pour certaines manipulations de la réaliser plusieurs fois sur mannequins avant de passer sur animaux vivants. Quelle que soit la séance de TP, elle débute toujours par au moins une des méthodes de remplacement, mais il est impossible de remplacer totalement les animaux car l'apprentissage des gestes techniques pour former des personnes compétentes et habilitées nécessite de se confronter à des situations réelles où l'animal interagit. La vidéo est utilisée en amont mais également en aval de la manipulation. Cette dernière permet de pointer du doigt les difficultés de chaque apprenant pour qu'il prenne conscience de ses erreurs et qu'il les corrige pour les prochaines scéances.
Réduction
Comme chaque année de formation ne travaille pas sur la même espèce chaque semaine, nous pouvons considérer que nous formons 28 élèves par semaine les souris sont utilisées en actes invasifs pendant 20 TP nécessitant donc 120 souris par année scolaire Il en est de même pour les rats. Pour les lapins, le nombre de TP avec actes invasifs est de 15, les élèves travillent par binome et ou trinome permettant de réduire les animaux à 12 car entre chaque TP, au minimum, une semaine de repos est possible, le plus souvent, ce delai de repos est de 15 jours. De plus, le nombre d'actes invasifs est limité à 3 par TP et par animal. La rotation des espèces entre les années de formations et le suivi individuel des animaux permet de réduire au maximum le nombre d'animaux de chaque espèce.
Raffinement
Le raffinement peut être évalué grâce à plusieurs points par un suivi journalier avec sensibilisation à la détection des comportements des animaux et vérification des résultats des procédures précédentes par la mise en place d’un tableau de suivi individuel de chaque procédure réalisée sur l’animal, ce suivi individuel évite également l'utilisation des mêmes animaux car les apprenants prennent l'habitude de vérifier ceux qu'ils peuvent utiliser. Par un apprentissage progressif des techniques en commençant par les plus simples (identification, injection, prélèvement) ; par la prévention de la douleur pour des actes Par le recours à l’anesthésie pour des prélèvements sanguins difficiles (sinus rétro orbitaire, sub mandibulaire, jugulaire) Par le recours à des prélèvements sanguins tels que l’intra cardiaque sans réveil de l’animal Par une alternance des manipulations au cours des semaines Par un encadrement précis (14 élèves par tp) : surveillance rapprochée de l’enseignant pour des nouvelles procédures avec arrêt de la manipulation de l’élève si danger, aide à la réalisation dans les premiers temps (l'encadrant divisent le groupe en 2 pour pouvoir surveiller les actes de chaque apprenant) Par le travail en binôme pour une entraide et par la mise en place de tutorat entre élève lorsque l’enseignant a validé les compétences des élèves tuteurs Par la participation des élèves à la cellule de Bien être animal pour le développement de la culture du soin Par un suivi vétérinaire Par le respect de l’hébergement en groupe unisexe, les paramètres physicochimiques sont contrôlés et surveillés chaque jour. Si après une session de pratique, un animal présente des signes de douleurs ou présente des différences par rapport à son comportement avant la séance, il sera intégré dans un processus de suivi pour verifier régulièrement l'évolution des signes et prendre les mesures approrpiées (description des signes, chronologie de la surveillance avec délai entre chaque observation, avis vétérinaire..). Par le respect de points limite définis (nombre maximal d'utilisation avec acte invasif, delai entre les utilisation, perte de poids, changement morphologique du corps, masse, blessure, examination physique des yeux orifices, grille de score, …). En fonction du type de point limite atteint, trois possibilités de soulagement sont possibles : arret des actes invasifs, analgésie et soins pour soulager l'animal ou mise à mort immédiate en cas d'impossibilité de soulagement.
Choix des espèces
La souris, le Rat et le Lapin sont les mammifères les plus couramment utilisés en laboratoire de recherche. Nous formons nos élèves à l'utilisation de ces animaux, et pour cela que nous les utilisons. Nous recevons des animaux jeunes adultes, qui sont soit utilisés en travaux pratiques, soit mis à la reproduction. Par la suite, nous utilisons en général des animaux jeunes adultes parce que ce sont qui sont le plus couramment inclus dans des protocooles.
Validation préclinique d’une stratégie thérapeutique innovante pour le déficit du transporteur de la créatine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 125
Macaques à longue queue : 6
331 animaux non-humains vont être utilisés, 200 souris et 125 rats tués à l'issue pour prélèvement d'organes, et six macaques à longue queue réaffectés à d'autres projets d'imagerie. Ils reçoivent par voie nasale et intraveineuse un candidat médicament contre un déficit congénital en créatine, les macaques subissant en plus une immobilisation en cadre stéréotaxique pour une IRM de trois heures et demie sous anesthésie. Le porteur reconnaît des douleurs au point d'injection, une perte de poids et une toxicité possible par voie nasale, et situe l'application chez l'humain et les essais cliniques à venir. Il affirme que les tests d'innocuité "ne peuvent être faits que chez l'animal" et les juge "plus que nécessaires".
Objectifs
Le contexte du projet est le développement d’un candidat médicament pour le traitement du déficit congéntial en créatine, maladie pour laquelle il n’y a à ce jour aucun traitement. L’objectif de ce projet est de: (i) - développer une méthodologie IRM pour évaluer la biodistribution et l’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament après son administration in vivo par la voie nasale. -(ii) tester et valider le traitement et la méthode d’imagerie par IRM du deutérium chez le primate sur un IRM. -(iii) valider l’innocuité du candidat médicament et de deux autres molécules chez le rat.
Bénéfices attendus
La démonstration de la présence de créatine chez le primate après une administration intranasale du DCE (Dodecyl Creatine Ester) marqué au déteurium permet d’envisager cette voie d’administration chez l’homme. De même l’évaluation de l’innocuité du traitement DCE chez le rat permet d’envisager les études de toxicologie réglementaire et à terme des études cliniques de phase I ou phase de tolérance chez le volontaire sain et une phase clinique d’efficacité pharmacologique du candidat médicament DCE.
Procédures
Les animaux seront soumis à une administration pendant quelques minutes du candidat médicament DCE par voie nasale et intraveineuse. La durée de traitement est de 30 jours chez le primate et la souris pour le transporteur de la créatine. Cette durée de l’intervention est de quelques minutes et le de traitement est réduite à 15 jours chez le rat. Pour les études chez la souris et le rat, à la fin de chaque traitement les animaux seront mis à mort.. Une seule imagerie sera effectuée chez le macque sous anesthésie d’une durée de 3h30..
Impact sur les animaux
Douleur au site d’injection, stress lié à la durée du traitement, perte de poids, effets indésirables liés à l’inoculation et toxicité voie nasale
Devenir
Les souris et les rats seront euthanasiés à la fin de chaque expérimentation pour des prélèvements d’organes. Les primates seront affectés à d’autres projets d’imagerie avec l’accord du vétérinaire.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes permettant d’évaluer le passage cérébral de candidats par voie nasale en utilisant l’imagerie IRM. De plus, les tests d’innocuité du traitement DCE ne peuvent être faites que chez l’animal. Ces tests sont plus que nécessaires pour valider le mode d’administration du médicament qui sera administré chez le patient et garantir la non toxicité du médicament qui sera administré plus tard chez l’homme.
Réduction
Les procédures d’imagerie utilisées sont non-invasives. Ceci permet des mesures longitudinales, réduisant le nombre total d’animaux. Le nombre total de séances sera limité à 7, avec un minimum de 7 jours séparant les séances. Le nombre de souris (n=20/groupe) a été établi selon notre expérience de la sensibilité des mesures IRM pour détecter un effet sur de faibles concentrations de créatine. Le nombre de primates (n=6) est standard dans la littérature pour mettre en évidence un biomarqueur en mesurant une moyenne et un écart-type pertinent. Le nombre de rats par groupe (n=5) pour l’évaluation de l’innocuité du traitement par voie nasale est le nombre minimal utilisé pour l’évaluation des effets toxicologiques de candidats médicaments. Celui de 25 rats par ester de créatine (3 molécules) pour l’étude vie la voie iv est aussi un nombre minimum pour 5 groupes d’animaux.
Raffinement
L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU : environnement enrichi selon nos procédures standards, hébergement en groupe social dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h, eau/nourriture ad libitum. Les animaux seront examinés quotidiennement par les techniciens animaliers, sous la supervision permanente du vétérinaire clinicien, également en charge du bien-être animal. La douleur liée à la fixation en cadre stéréotaxique pendant l’imagerie sera minimisée par l’application locale de xylocaïne (gel 2%) dans les oreilles. La douleur liée à la fixation en cadre stéréotaxique pendant l’imagerie sera minimisée par l’application locale de xylocaïne (gel 2%) dans les oreilles. Un suivi des paramètres physiologiques est assuré durant les anesthésies afin d’adapter les mesures compensatrices (soutien thermique, perfusion, anesthésique). Pour l’administration du traitement en spray ou en solution dans les narines, les animaux seront soit habitués à la contention vigile (souris), soit soumis à une anesthésie courte (primates, ~15 min). Des données préliminaires montrent qu’il n’y a pas de signe de gêne chez le rongeur suite à l’application quotidienne du produit
Choix des espèces
La maladie d’intérêt est une maladie grave avec des conséquences cognitives importantes chez l’enfant. Seul un modèle transgénique rongeur déficitaire en transporteur de la créatine existe à l’heure actuelle pour évaluer la distribution cérébrale et l’effet thérapeutique de l’apport en créatine exogène. La transposition de l’étude rongeur chez le primate permet de s’assurer et de valider le passage cérébral par voie nasale du candidat médicament l’ester dodécylique de créatine et donc de valider la stratégie thérapeutique qui sera utilisée chez l’homme, étant donné la similitude anatomique de la muqueuse nasale entre le primate non humain et l’homme. De plus, le modèle macaque permettra à terme d'intégrer des méthodes d'évaluation fonctionnelles, de comportement et de signes cliniques, qui peuvent être directement extrapolées à l'homme dans une démarche translationnelle. Le rat est l’animal utilisée dans l’évaluation des effets toxicologiques de candidats médicaments. Ce sera ensuite une des 2 espèces utilisées dans les études réglementaires. Les animaux adultes seront utilisés car le développement cérébral est achevé à ce stade. La maturation du cerveau peut avoir un impact sur la quantité totale de créatine
Travaux Pratiques dans le cadre d’une formation réglementaire « Formation à l’expérimentation animale – Application des procédures »
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 90
180 animaux non-humains, 90 souris et 90 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés d'une séance à l'autre plutôt que tués, avec une adoption parfois envisagée. Chaque animal sert de support à des étudiants qui s'exercent à la préhension, à la contention et à des injections sous-cutanées, jusqu'à douze piqûres réparties sur six séances. Il ne s'agit pas de produire des connaissances mais de valider une formation réglementaire à l'expérimentation animale, le porteur soulignant qu'elle "confère un avantage décisif" aux diplômés sur le marché de l'emploi. Il indique que sur quatre séances une seule recourt à des animaux vivants, les autres utilisant vidéos, mannequins en silicone et cadavres.
Objectifs
L’objectif est de couvrir la partie pratique relative à l’obtention d’une formation spécifique en expérimentation animale, qui permettra à nos étudiants d’obtenir des compétences professionnelles dans le domaine. Dans le cadre d’une Unité d’Enseignement optionnelle, nos étudiants peuvent suivre une formation spécifique destinée aux personnes appliquant les procédures expérimentales aux animaux. Ce type de formation réglementaire à l’expérimentation animale doit permettre l’acquisition de compétences théoriques et pratiques permettant la manipulation d’animaux dans le respect de leur bien-être. Conformément à l’agrément de cette formation par le Ministère de l'Agriculture, il s’agira d’enseigner aux étudiants de bonnes pratiques pour la réalisation des méthodes de préhension, de contention et d’injections chez le rat et la souris de laboratoire. Tous ces actes sont de sévérité modérée pour l’animal. Les travaux pratiques que nous souhaitons réaliser permettent une familiarisation progressive des étudiants avec l’animal de laboratoire. Ils seront réalisés en effectif réduit, sous la tutelle d’enseignants et de techniciens expérimentés portant une grande attention au bien-être de l’animal. Des enseignements plus théoriques d’éthique, de réglementation, de physiologie nociceptive, de bien-être animal, de points limites, d’anesthésie et d’analgésie viennent compléter ces connaissances afin que les étudiants soient en mesure d’adapter leur pratique au comportement de l’animal qu’ils manipulent. Le choix des rongeurs s’explique par l’utilisation majoritaire de ces modèles animaux en expérimentation. Les travaux pratiques se dérouleront en 4 séances, dont 1 seule requière l’utilisation d’animaux vivants, les 3 autres séances se font par des méthodes alternatives. Cette formation est optionnelle dans le cursus des étudiants, seuls des étudiants volontaires seront amenés à manipuler des animaux. Nous formerons jusqu’à 96 étudiants par an, nous aurons recours à l’utilisation maximale de 90 rats et 90 souris soit 180 animaux pour ces travaux pratiques sur 5 années de formation. Ces chiffres correspondent à l’utilisation d’un animal de chaque espèce par étudiant et à un animal surnuméraire prévu pour la démonstration par l’encadrant. Les animaux utilisés seront tous des animaux de réforme. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, après évaluation pour chaque animal de la gravité réelle et sur avis vétérinaire, les animaux seront proposés à l’adoption.
Bénéfices attendus
Les objectifs pédagogiques des séances de travaux pratiques sont : - la familiarisation des étudiants avec les animaux, sensibilisation au respect du bien-être animal - l’acquisition des compétences techniques de préhension, contention et injection sous-cutanée sur animal vigile - l’apprentissage des règles d’hygiène et sécurité propres à la pratique de l’expérimentation animale - la connaissance du matériel nécessaire aux injections, préparation de ce matériel, notions d’asepsie - une mise en situation dans des conditions réelles de l’expérimentation animale De plus, l'obtention du diplôme de licence ou master incluant la certification à l'expérimentation animale confère un avantage décisif aux diplômés en recherche d'emploi sur des postes de R&D
Procédures
Chaque animal sera manipulé pour la préhension, la contention et une injection sous-cutanée à chaque séance. La durée de la séance de TP a une durée totale de 4h comprenant : - le temps d’équipement des étudiants (surchausse, blouse, etc), - la familiarisation avec la pièce de manipulation (odeur, température), - les explications et les démonstrations fournies par les encadrants, - la réalisation des gestes (durée contention / injection SC : max 1 min) - la validation des gestes (évaluation pratique de la formation réalisée à l’aide d’une grille). Un même lot d’animaux sera utilisé une fois par semaine pour ces TP, avec un minimum de 5 jours de récupération entre 2 séances. De plus, nous veillerons à alterner les sites d’injection droite et gauche pour limiter la douleur des animaux. Au total, les TP étant étalés sur 6 semaines, un lot d’animaux sera injecté 12 fois maximum en SC, à raison de 2 injections sous-cutanée par séance
Impact sur les animaux
Douleur momentanée due à l’introduction de l’aiguille lors de l’injection sous-cutanée. Inconfort des animaux selon les difficultés d’apprentissage des étudiants et stress dû au nombre d’étudiants dans la pièce. Ces éventuelles nuisances sont compensées par une surveillance des animaux dans les heures et jours qui suivent le protocole. Les actes pratiqués ici sont d’un degré de sévérité modérée, à moins d’un accident de contention trop forte ou de piqûre dans un organe conduisant à sa lésion accidentelle. Notre expérience nous indique cependant que ceci peut parfois se produire chez un étudiant malhabile et stressé, il nous faudra donc rester très vigilant. L’enseignant veillera au bien-être immédiat de l’animal si de tels accidents survenaient. De plus, le nombre d’injections sur chaque animal sera limité à 2 par séance et chaque séance de TP sera espacée de la suivante avec un intervalle minimum de 5 jours. Afin de réduire les nuisances possibles, chaque animal sera utilisé au maximum pour 6 séances. En parallèle, une grille d’évaluation du bien-être des animaux sera employée.
Devenir
Les animaux pourront être réutilisés après avis vétérinaire. Une adoption pourra être alternativement envisagée par le biais associatif
Remplacement
Le recours à l’animal vivant n’est prévu que pour la séance 4. Pour les 3 autres séances, des méthodes alternatives ont été retenues. La séance 1 est basée sur l’utilisation de vidéos illustrant des tests comportementaux. La séance 2 est prévue sur des rats Koken, mannequin grandeur nature en silicone. La séance 3 utilisera des cadavres d’animaux et des vidéos.
Réduction
Cette formation est proposée seulement en option et a effectif maximum de 96 étudiants, alors que le contingent total est compris entre 450 et 550 étudiants inscrits en troisième année de licence et en Master 1ère année. Cependant, afin de restreindre les effectifs animaux employés, et les actes pratiqués étant de sévérité modérée, ces animaux ne seront pas euthanasiés mais seront réutilisés pour d’autres travaux pratiques se déroulant au sein de notre établissement, ou dans le cadre de projets autorisés, ce qui va dans le sens d’une réduction du nombre d’animaux manipulés. De plus, nous réaliserons une utilisation en continu de 2 lots d’animaux de chaque espèce, chaque animal sera utilisé 6 fois avec un intervalle de 5 jours minimum entre chaque séance.
Raffinement
Les pratiques expérimentales proposées sont de gravité modérée et des points limites ont été définis afin d’éviter toute souffrance de l’animal. Un retour d’expérience sera dressé pour répertorier les réussites et les difficultés des apprenants, ainsi qu’une liste des incidents/événements liés aux animaux.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés en expérimentation. La souris et le rat sont les animaux modèles les mieux caractérisés dans des domaines variés (physiologie, neurophysiologie, pharmacologie et toxicologie, etc.). Adultes de plus de 6 semaines, plus faciles à manipuler que de jeunes animaux
Etude du rôle de PCSK9 dans l’anaphylaxie passive chez les souris BALB/c et C57Bl6/J
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intradermiques et intraveineuses sous anesthésie, des sensibilisations à la gliadine, puis un test d'anaphylaxie passive consistant à injecter de l'histamine dans l'oreille pour en mesurer le gonflement, avant une mise à mort par ponction cardiaque au trente-cinquième jour. L'objectif est de préciser le rôle de la protéine PCSK9 dans l'allergie et d'élargir une piste thérapeutique, retombée que le porteur situe au conditionnel. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'évaluer ce traitement et que seul un modèle murin allergique le permet.
Objectifs
PCSK9 (Pro Protein Convertase Subtilisine/Kexine de type 9) appartient à la famille des proprotéines convertases et est sécrétée par les hépatocytes dans le sang. Elle est un régulateur naturel du récepteur au LDL en l’envoyant à la dégradation lysosomale. Depuis une dizaine d’années, différentes études se sont intéressées au rôle inflammatoire de cette protéine. L’allergie étant une maladie inflammatoire chronique, nous souhaitons étudier le rôle de PCSK9 dans le cadre de l’allergie. Par une précédente étude, nous sommes en train de caractériser l’effet de PCSK9 dans l’allergie alimentaire. Ayant pu déterminer son rôle sur certaines cellules immunitaires liées à cette pathologie, notamment les mastocytes, nous souhaitons poursuivre cette approche par une expérimentation qui ne peut s’effectuer que chez la souris : le test d’anaphylaxie passive. Ce test consiste en l’injection auriculaire d’un médiateur inflammatoire (l’histamine) et d’en mesurer les conséquences chez la souris par la mesure d’un changement anatomique de l’oreille (gonflement et hypervascularisation).
Bénéfices attendus
Actuellement, aucun traitement ne permet soigner la cause de l’allergie, de plus, les effets secondaires liés aux corticoïdes sont notables et la désensibilisation n’est pas efficace chez tous les patients. PCSK9 devient une cible de plus en plus privilégiée dans le cadre de maladies inflammatoires, de plus, notre première étude sur le traitement anti-PCSK9 soigne les symptômes de l’allergie alimentaire chez la souris. Cette étude permettrait de comprendre le mécanisme par lequel PCSK9 agit sur le mastocyte et ainsi, élargir la thérapeutique de l’anti-PCSK9.
Procédures
Les animaux seront soumis des injections intradermiques et intraveineuses sous anesthésie à l’isoflurane et à des sensibilisations à la gliadine par voie intrapéritonéale. Pour finir, un prélèvement du sang terminal sera effectué par ponction intracardiaque après anesthésie sous isoflurane.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont une perte de poids. Une observation régulière des souris sera effectuée, les souris serons également pesées 3 fois par semaine.
Devenir
A la fin du protocole d'allergie au jour 35 post sensibilisation, toutes le souris seront mises à mort pour analyses.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle cellulaire permettant d’évaluer le bénéfice du traitement anti-PCSK9 dans le cadre de l’allergie. Seul un modèle murin allergique nous permettra de mesurer l’amélioration des symptômes via ce traitement et comprendre les effets de PCSK9 dans la physiopathologie de l’allergie. Les principes de raffinement et de remplacement contribuent à réduire le nombre d’animaux utilisés tout au long du protocole. Le projet étudiera l’allergie respiratoire dans des modèles déjà établis dans le laboratoire.
Réduction
Le modèle animal utilise a été soigneusement conçu et évalué pour permettre de réduire au maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et la précision des paramètres observés selon la règle des 3R. Le projet étudiera l'allergie dans des modèles déjà établis dans le laboratoire. Un test non paramétrique et non apparié de type Student test, Mann-Whitney ou une analyse de la variance par un test de Bonferroni sera realisé. Une p-value inferieur a 0.05 sera considérée comme significative.
Raffinement
Le projet étudiera l’allergie dans des modèles déjà établis dans le laboratoire. Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Une observation journalière des souris sera effectuée, les souris serons également pesées 3 fois par semaine. Ainsi, les souris seront hébergées 5 par cage ventilée maximum. Elles auront accès à l’eau et à la nourriture de manière illimitée et suivront un cycle de lumière et d’obscurité de 12h. Des frisottis seront placées dans les cages. Les souris seront anesthésiées à l’isoflurane au moment de l’anaphylaxie passive.
Choix des espèces
Au cours de cette étude seront utilisées des souris de souche C57/Bl6 et Balb/c. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire et du métabolisme lipidique du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Des analyses métaboliques seront réalisées. L’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages ainsi qu'à de nombreux outils de biochimie (ELISA, dosage colorimétrique...). Souris C57/B6 et Balb/c femelles âgées de 5 semaines au début du protocole ce qui correspond à des souris sevrées donc adultes ayant un système immunitaire mature ou quasi-mature.