Souris
Etude des mécanismes physiopathologiques de la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO) et de ses exacerbations
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
5 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à sévère. Elles inhalent de la fumée de cigarette, des particules de polluant et du tabac chauffé quarante minutes par jour pendant douze semaines, puis sont infectées par des pathogènes respiratoires par instillation nasale ou trachéale sous anesthésie, avec des mesures de fonction respiratoire par trachéotomie. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte de poids, baisse de mobilité et poil hérissé, les souris atteignant un score clinique de 6 ou perdant plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. Il affirme que le réseau de médiateurs et de cellules en jeu ne peut pas être reproduit in vitro et conclut à la nécessité du modèle murin, les retombées thérapeutiques restant renvoyées à d'éventuelles études cliniques.
Objectifs
L’objectif de notre projet est d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de la bronchopneumopathies chroniques obstructives (BPCO), et de ses exacerbations dans le but de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques qui manquent cruellement actuellement. Ces exacerbations surviennent principalement à la suite d'infections pulmonaires. La BPCO étant une pathologie multifactorielle faisant suite à l’exposition à des polluants et pouvant se présenter sous différentes formes, il est nécessaire de développer plusieurs modèles conduisant à différents présentation cliniques de la pathologie et de ses exacerbations. Nos travaux antérieurs nous ont permis d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques que nous devons tester dans nos différents modèles et en parallèle, l’identification de nouvelles cibles sera envisagée afin de proposer de nouveaux traitements. Suite à l’exposition à la fumée de cigarettes, aux particules de polluant et au tabac chauffé, l’inflammation pulmonaire se traduit par le recrutement et l’activation de plusieurs types de cellules immunitaires. Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de médiateurs et de cellules de l’hôte qui ne peut pas être reproduit in vitro. Il en est de même pour les infections par les pathogènes à tropisme respiratoire qui sont responsables des exacerbations. Ce type d'études constitue le seul moyen de tester l’efficacité de nouveaux traitements dans ce contexte particulier de développement et de l’exacerbation de la BPCO. Cette difficulté associée actuellement au manque de traitement, justifie l’utilisation de modèles animaux.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront de mieux définir les caractéristiques de l’inflammation pulmonaire et de la réponse immune chez les souris exposées à la fumée de cigarette, aux particules de polluant et au tabac chauffé Nous ferons secondairement le lien avec les altérations de la fonction pulmonaire. Par la suite, ces données permettront d’identifier les mécanismes physiopathologiques responsables des altérations de la fonction pulmonaire, en particulier le rôle de populations cellulaires ou de médiateurs spécifiques et le lien avec l’inflammation pulmonaire. Cette étude est rendue possible par l’utilisation de souris génétiquement modifiées ou l’administration de molécules agonistes ou antagonistes des facteurs préalablement identifiés. Cette définition des mécanismes physiopathologiques nous permettra de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à prévenir l’inflammation et à empêcher le développement de la BPCO induits par la cigarette, les particules polluantes ou encore le tabac chauffé. Différentes stratégies sont déjà envisagées ciblant la réponse immunitaire et faisant intervenir des immuno-modulants ou des agents vaccinaux. Ces nouveaux traitements pourraient être associés au traitement de référence de l’exacerbation que représente l'antibiothérapie. A terme, notre objectif est d’utiliser ces données pour appuyer la mise en place d’études cliniques chez les patients BPCO.
Procédures
Pour la mesure de la fonction respiratoire, les animaux sont anesthésiés et une trachéotomie est pratiquée pour faire les mesures sur une durée de 15 minutes. Pour les infections, l’instillation nasale est réalisée sous anesthésie générale . Après anesthésie, une surveillance des animaux est pratiquée pendant la phase de réveil et pour les traitements, ceux-ci se font directement par voie intrapéritonéale. Pour induire une altération pulmonaire, les souris sont soumises à 40min d’inhalation pour jour.
Impact sur les animaux
Au cours des différentes procédures, nous effectuons sur les animaux des contentions qui engendre un stress, des inhalations régulières et nombreuses de fumée, ce qui peut entrainer à long terme une diminution de la prise de poids et irritation oculaire temporaire. Nous pratiquons les infections par instillation intra nasale ou intra trachéale, sous anesthésie et des injections péritonéales de traitement. Les piqures peuvent provoquer une douleur. Au pic de l’infection, les animaux malades perdent du poids, sont moins mobiles et leur pelage est moins lisse, elles sont stressées. Pour la mesure de la fonction respiratoire, une trachéotomie est pratiquée sur la souris anesthésiée (douleur de la piqure).
Devenir
L'ensemble des animaux, à la fin des différentes procédures, sera euthanasié pour analyser l'impact sur les différents organes.
Remplacement
Afin de minimiser le nombre d’animaux, l’évaluation des différents paramètres recherchés est préalablement réalisée in vitro sur cellules primaires et lignées cellulaires humaines et murines avant validation dans nos modèles murins.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, dans la plupart de nos protocoles, un seul groupe témoin est utilisé et permet la comparaison avec les différentes souris génétiquement modifiées. De plus les analyses statistiques effectuées dans nos travaux précédents nous ont permis de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser, soit 6 souris par groupe, en répétant l’expérience 4 fois afin d’obtenir suffisamment de cellules à analyser ainsi que des résultats statistiquement corrects.
Raffinement
Afin de réduire le stress et la souffrance, un enrichissement de l’environnement est pratiqué dans notre animalerie (maison rouge dans toutes les cages, possibilité de rajouter du carton, des boule de cotonet papier Kraft). Pour diminuer la douleur, les infections se font sous anesthésie et analgésie. De plus, une surveillance régulière et la pesée (journalière ou bi-hebdomadaire en fonction des protocoles) des animaux est effectuée, pour suivre la souffrance due à l'infection. Nous avons mis en place une grille de calcul qui permet d'attribuer un score à l'état clinique général de la souris, et suivre l'évolution quotidienne de l'animal après l’infection. Ce score clinique est compris entre 1 et 6 points, 6 étant le score de gravité le plus élevé. • Niveau d’activité : mobile = 0, mobilité réduite = 1, prostrée = 2 • Catarrhe oculaire : absence = 0, 1 œil = 1, 2 yeux = 2 • Aspect fourrure : lisse = 0, hérissée = 1 • Perte de poids : aucune = 0, 5-10% = 1, 10-15% = 2, 15-20% = 3 • Posture : normale = 0, dos courbé = 1 • Température : normale = 0, froide = 1 Donc : • Les animaux ayant un score de 4 devront être suivis avec une attention toute particulière • Les animaux ayant un score clinique de 6 seront immédiatement euthanasiés. • Les animaux présentant une perte de poids > 20% seront immédiatement euthanasiés
Choix des espèces
L’étude des pathologies pulmonaires est facilitée chez la souris du fait de la grande disponibilité des outils d’exploitation et d’analyse, ce dont les autres espèces sont dépourvues. De plus, nous avons accès à des souris déficientes pour certains de nos gènes d’intérêt ou anticorps spécifiques existent, permettant d’identifier des molécules ou cellules impliquées et des cibles thérapeutiques pertinentes chez l’homme. Comme la pathologie humaine de la BPCO touche les adultes, et non les populations jeunes ou les enfants, les souris utilisées dans le cadre de ces expérimentations seront adultes. Les souris commencent à être exposées à la fumée de cigarettes à partir de 8 semaines d’âge. Le protocole d’exposition à la fumée de cigarettes est de 12 semaines, afin de reproduire une inflammation pulmonaire chronique associée à une altération fonctionnelle pulmonaire. Les souris exposées à la fumée sont donc infectées par les pathogènes à l’âge de 20 semaines. Pour les particules de polluant, l’intranasal se fait sur trois jours, et les souris sont infectées à 8 semaines.
Étude du rejet de greffons modifiés génétiquement pour échapper au système immunitaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une greffe de peau sur le dos sous anesthésie, avec un bandage qui gêne l'auto-toilettage et expose à une infection uro-génitale, avant la mise à mort pour analyser les tissus. Le porteur cherche à imiter dans le greffon un mécanisme de la bactérie Listeria pour échapper au rejet immunitaire, comme alternative aux immunosuppresseurs. Il conclut à la nécessité de la souris, aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui la complexité du rejet de greffe.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de démontrer qu’une alternative aux traitements immunosuppresseurs des patients ayant reçu une greffe d’organe est possible.. Ces traitements à vie présentent des effets secondaires néfastes tels que la sensibilité accrue aux infections et le risque de développement tumoral. Nous proposons d’étudier une stratégie de traitement alternative, consistant à mimer dans le greffon un mécanisme utilisé par la bactérie Listeria monocytogenes pour échapper au système immunitaire. L’induction de cette capacité, de manière localisée au niveau du greffon dans un modèle murin de greffe de peau, devrait permettre de le maintenir à long-terme et d’éviter l’utilisation d’immunosuppresseurs.
Bénéfices attendus
Environ 6.000 patients en France et 130.000 dans le monde reçoivent chaque année une greffe d’organe. De nombreuses autres personnes vivent avec une greffe. Les traitements immunosuppresseurs actuels, indispensables à ces patients, entrainent des effets secondaires importants. Notre projet est une preuve de concept en vue de proposer par la suite une alternative thérapeutique dans laquelle le système immunitaire n’est pas altéré, afin d’améliorer la qualité de vie des personnes greffées.
Procédures
Les souris seront soumises à une greffe de peau au niveau du dos (environ 40 minutes de l’induction de l’anesthésie au placement dans la cage de réveil). Cela implique 2 injections pré-opératoires en sous-cutané de traitements analgésiques (Buprénorphine et Metacam, Lidocaine), une anesthésie par injection intrapéritonéale (Ketamine et Xylazine) et d’éventuelles injections sous-cutanée d’analgésique (Buprenorphine) en cas de persistance des signes de souffrances 3 jours après l’opération. Chaque injection dure 10 secondes environ.
Impact sur les animaux
Les différentes expériences réalisées conduisent à un degré de sévérité modéré. La réalisation de la greffe de peau induit de la douleur chez les animaux. C’est également le cas des injections sous-cutanée ou intra-péritonéales des traitements. La présence du bandage peut aussi être une source de gêne pour l’animal et l’expose à un risque d’infection uro-génitale en empéchant l’auto-toilettage.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les tissus pour des analyses cytométriques et histologiques.
Remplacement
Ce projet a pour but l’étude des mécanismes immunitaires impliqués dans le rejet de greffes. Il n’existe à l’heure actuelle, aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité de ce mécanisme dans son intégralité. Seuls les animaux, tels que les modèles murins, permettent de comprendre le processus dans sa globalité, avec toutes les interactions que cela implique et c’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à ces animaux pour atteindre les objectifs de notre projet. De plus, les modèles murins transgéniques utilisés ici permettent d’étudier l’impact d’une voie de signalisation dans le rejet de greffe de façon globale.
Réduction
Les rejets de greffe seront quantifiés par un score entre 0 et 5 et seront comparés entre les groupes à l'aide de tests de comparaison de moyenne. Les effectifs par groupe (n=4) sont associés à des tailles d'effet de 2.05, pour un test de comparaison de 3 moyennes, un risque de 5% et une puissance de 80%. Ceci correspond à des effets forts, compatibles avec la question biologique. Le plan expérimental mis en œuvre est emboîté. Le problème de dépendance statistique des individus appartenant à une même cage sera minimisé lors de l’analyse des données en ayant recours à des modèles statistiques à effets mixtes.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe avec une litière appropriée, à base de cellulose quand les animaux sont greffés, et des matériaux de nidification. Les animaux recevront un traitement antalgique en prévention de la douleur avant l’opération. Ils seront réhydratés par injection en sous-cutané de sérum physiologique, puis auront accès à des gels de réhydratation adaptés. Les animaux seront maintenus au chaud sur une tablette chauffante pendant toute la phase de chirurgie. Celle-ci est réalisée en condition aseptique, et un antispetique en application locale sera utilisée. Les animaux recevront ensuite un antalgique en suspension orale pendant 3 jours après l’opération. Si des signes de souffrance persistent 3 jours après la chirurgie, une injection d’antalgique sous-cutanée, renouvelable si besoin, sera effectuée. Si des signes évidents de souffrance persistent malgré le traitement antalgique, les animaux sont mis à mort. Les animaux sont observés et pesés quotidiennement afin de détecter les signes éventuels de souffrance, vérifier l’intégrité des bandages et nettoyer la partie génitale régulièrement car le bandage empêche l’accès à cet endroit par l’animal pour l’auto-toilettage.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est un modèle de choix pour l’étude de la réponse immunitaire, processus intervenant dans le cadre des rejets de greffes. En effet, un grand nombre d’outils ont été développés pour étudier la réponse immunitaire des souris. Le recours à ces outils permettra de contrôler et de caractériser les processus conduisant au rejet des tissus transplantés de la façon la plus pertinente possible, en prenant en compte les spécificités du modèle murin par rapport à l'homme. De plus, la souris est un modèle qui peut être modifié génétiquement, ce qui nous permet d’étudier l’impact de l’expression de gènes dans le rejet des greffes. Nous utiliserons des souris adultes, d’au moins 8 semaines. Ces animaux sont suffisamment âgés pour avoir un système immunitaire en place mais également pour favoriser la greffe de peau, que ce soit du point de vue de la réalisation de la procédure que de la prise du greffon.
Investigation du rôle du cervelet et de l’ocytocine intracérébelleuse dans la cognition sociale chez la souris, étude préliminaire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
396 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à sévère, 264 tuées à l'issue et 132 réutilisées comme stimulus social. Les 264 souris expérimentales reçoivent des canules implantées dans le cerveau lors d'une chirurgie de deux à quatre heures, des injections cérébrales répétées, puis dix tests comportementaux, avec isolement social de trois semaines et restriction alimentaire jusqu'à six semaines. Le porteur prévoit leur mise à mort pour vérifier les sites d'injection et étudier le rôle de l'ocytocine du cervelet dans la cognition sociale. Il écarte simulations et cultures cellulaires et retient des souris adolescentes et adultes pour suivre la maturation cérébrale.
Objectifs
Le cervelet est une région cérébrale historiquement associée au contrôle du mouvement. Cependant, depuis plusieurs décennies, son rôle s’est élargi à de nombreuses autres fonctions. Il contribue ainsi aux émotions, à la cognition (savoir se repérer dans son environnement, par exemple), aux addictions et aux comportements sociaux. Parallèlement, dans le cerveau, un neuropeptide, l’ocytocine (OXT), a pour fonction principale de contrôler ces liens sociaux. L’OXT intervient ainsi dans l’attachement aux autres, la confiance ou l’empathie. Si ce rôle a été mis en évidence dans des réseaux neuronaux classiquement associés aux émotions et aux interactions sociales, il n’a toutefois pas encore été exploré au niveau du cervelet. Il est probable que l’OXT contribue à l’adaptation fine des comportements et réactions physiologiques, et ce particulièrement dans les contextes sociaux. Cette adaptation pourrait ainsi être liée à une modulation très fine, dans le cervelet, des fonctions sensorimotrices ou d’apprentissage en conditions socialement dépendantes, à une augmentation de la saillance des stimulations sensorielles pertinentes en contexte social, ou à une contribution spécifique aux interactions avec son environnement lors des contacts sociaux. Pour tester ces différentes hypothèses et déterminer le rôle de l’OXT dans le cervelet dans les contextes sociaux, nous manipulerons d’abord, à l’aide de molécules et chez la souris, l’activité du cervelet (blocage), puis le lien entre cervelet et cortex préfrontal (autre structure-clé de la cognition sociale) et enfin nous activerons ou bloquerons spécifiquement les effets de l’OXT directement dans le cervelet. Nous évaluerons l’effet de ces inactivations/activations spécifiques par de multiples tests comportementaux ciblant les interactions sociales, mais aussi d’autres fonctions (émotions, orientation dans l’environnement, fonctions motrices ou sensori-motrices). Ce projet sera réalisé chez des souris adultes et chez des adolescents (mâles et femelles). En effet les compétences sociales se développent avec la maturation du cortex préfrontal, structure cérébrale qui n’atteint son plein développement qu’au début de l’âge adulte, c’est-à-dire en dernier chez l’homme. Nous évaluerons ainsi l’évolution du rôle de l’OXT dans le cervelet dans les contextes sociaux au cours du développement.
Bénéfices attendus
L’ocytocine est devenue une molécule de grand intérêt en neuroscience en raison de ses effets pro-sociaux. En effet, elle dispose d’un potentiel prometteur comme nouvelle cible thérapeutique pour les troubles neurodéveloppementaux dans lesquels les comportements sociaux sont perturbés ou mal adaptés (troubles du spectre autistique, schizophrénie, troubles déficitaires de l’attention…). L’ocytocine régule la confiance, l'empathie, l'agressivité, l'excitation sexuelle, le sommeil, le stress, l'anxiété, la douleur et le système sensoriel, et ce tout au long de la vie et chez les deux sexes. Elle permet ainsi aux individus d'adapter leurs interactions sociales de manière flexible et en lien avec le contexte. Pourtant, si le rôle de l’ocytocine a été investigué dans les régions cérébrales impliquées dans ces interactions sociales, il ne l’est pas ou peu dans le cervelet. En effet, ce dernier n’était pas considéré durant longtemps comme faisant partie de ces réseaux spécifiques. Or, ces quinze dernières années, de multiples travaux ont démontré que le cervelet n’intervient pas seulement dans le contrôle du mouvement : il participe aussi aux émotions, à nos capacités d’orientation dans l’environnement, aux addictions ou aux comportements sociaux. Grâce à sa vaste connectivité avec le reste du cerveau, le cervelet amorcerait ou orienterait, au niveau du cortex, le traitement des informations motrices, sensorielles, émotionnelles et cognitives dans des directions pertinentes, en particulier dans les contextes sociaux. Avec ce projet, nous serons en mesure de mieux cerner le rôle que jouerait l’ocytocine dans cette structure dans ces contextes sociaux et, potentiellement, de mettre ainsi en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement des troubles du comportement social.
Procédures
264 souris seront utilisées pour implantation de canules intracérébrales. L'implantation se fera sous anesthésie générale et locale, pour une durée comprise entre 2 et 4h. Les mêmes 264 souris auront des injections cérébrales répétées (entre 3 et 12 injections en fonction des protocoles et groupes). Cette partie se fera sous anesthésie générale courte (5 minutes) . Ces 264 animaux seront soumis à une batterie de tests comportementaux. Dix tests seront utilisés au total. Chaque animal, selon son groupe, ne sera testé que dans un nombre limité de tests (3 ou 4) sur une durée de 4 à 8 semaines. Ces tests évalueront le comportement social (3 tests différents), l'état émotionnel des animaux (3 tests), les fonctions sensori-motrices (2 tests), les capacités de discrimination sensorielles (1 test) et les capacités de mémoire et d'apprentissage (1 test).
Impact sur les animaux
- Stress au réveil de l’animal pendant quelques minutes après injections de drogues ou procédure Sham - Stress au réveil dû à l’implantation des canules d’injection intracérébrale - Difficulté pour se déplacer, se nourrir et s’abreuver dans les 2 premières heures suivant le réveil après implantation des canules - Douleur liée à la pose des canules - lsolement des animaux à l’âge adulte pour renforcer leur motivation pour les contacts sociaux dans le test d’interaction sociale. L’isolement débute 3 semaines avant les tests et se prolonge jusqu’à complétion des tests sociaux. - Privation/restriction alimentaire dans le test cognitif spatial (labyrinthe en croix, test basé sur un renforcement alimentaire) et le Novelty suppressed feeding (conflit entre motivation alimentaire et anxiété). La restriction alimentaire dure 6 semaines maximum (diminution progressive du poids sur 15 jours puis apprentissage de la tâche et tests) pour le labyrinthe en croix. La privation se fait sur 24h (NSF).
Devenir
Les 264 souris expérimentales concernées par les 3 procédures (celles ayant des canules guides implantées) feront l'objet d'une étude histologique post-mortem. La totalité des souris visiteurs (stimulus social) seront réutilisées (soit 132 souris).
Remplacement
Les objectifs de ce projet étant d’étudier le rôle d’une molécule (l’ocytocine) au sein de certaines régions cérébrales dans les comportements sociaux, nous devons pouvoir observer et analyser ces comportements chez des animaux sains. Nos travaux de recherche ne peuvent donc se faire que sur animaux vivants, les autres types de procédures expérimentales (simulations informatiques ou cultures cellulaires par exemple) ne permettant pas de répondre à nos questions
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux et optimiser nos résultats, les animaux serviront à plusieurs mesures chaque fois que possible. Ainsi, dans chacune des expériences proposées, les mêmes animaux feront l’objet de tests comportementaux qui seront réalisés dans deux conditions expérimentales. Pour réduire le nombre d’animaux visiteurs nécessaires pour nos tests d’interaction sociale, nous passerons plusieurs fois le même animal en tant que visiteur. Le nombre d’animaux est choisi pour tenir compte des difficultés inhérentes au placement des canules d’injection, de minimiser la répétition des injections intracérébrales, de réduire la durée totale d’expérimentation pour chaque individu et de prendre en compte la variabilité inter-individuelle. Les différentes procédures expérimentales ont ainsi été pensées et élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Les analyses statistiques conduites utiliseront des tests statistiques ANOVA ou non paramétriques en fonction de la normalité de la distribution des valeurs.
Raffinement
Pour minimiser la souffrance et l’angoisse des animaux, les procédures qui le nécessitent se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie (chirurgies implantatoires de canule). Ils seront anesthésiés après induction gazeuse et suivis jusqu’au réveil. Ensuite, chaque animal sera surveillé quotidiennement et le traitement analgésique poursuivi au-delà du réveil si besoin. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s), y compris lors des tests comportementaux. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions et en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal durant toute l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant /anesthésie/analgésie).
Choix des espèces
Le choix de la souris est dû au fait que ces animaux ont des capacités cognitives et sociales adaptées aux questions posées dans le projet. Ces mammifères ont par ailleurs un fonctionnement cérébral qui peut être comparé à celui de l’homme pour les questions abordées dans ce projet (rôle du cervelet et de l’OXT). Notre projet vise à étudier le rôle du cervelet et de l’ocytocine dans ce dernier dans les comportement sociaux à différents stades du développement : avant maturation complète du système nerveux et après. Nous utiliserons donc des souris adolescentes (âge inférieur à 50 jours Post-Natal (PN)) d'une part et des animaux à l’âge adulte (PN> 70 J) d'autre part. Cela se justifie par le fait que le cortex préfrontal est la structure cérébrale dont le développement est le plus tardif chez l'homme (il n'atteint son plein développement qu'au début de l'âge adulte) or ce dernier est une structure-clé de la cognition sociale. La mise en jeu de la voie cérébello-frontale que nous investiguons ici en contexte social particlièrement pourrait donc potentiellement se traduire par des effets différents en fonction de l'âge des animaux.
Étude des effets d’une exposition chronique au champ magnétique statique intense sur le comportement des souris
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à un champ magnétique statique intense vingt heures sur cinq semaines, puis soumises à des tests de coordination et d'équilibre, avant la mise à mort pour analyse du cerveau. Le porteur nomme les indicateurs surveillés, réduction de mobilité, dos voûté, perte de poids, et attend une possible atteinte du système vestibulaire. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité de confirmer sur un organisme entier des effets observés en culture, dans le contexte des IRM à très haut champ.
Objectifs
Grâce à de nombreuses avancées scientifiques et technologiques, l'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est devenue une modalité d’imagerie de diagnostic incontournable et utilisée en routine clinique. Bien que son utilisation ait montré clairement un intérêt dans diverses pathologies, cette technique induit notamment une exposition des patients à des champs magnétiques statiques intenses (quelques dizaines de milliers de fois l'amplitude du champ terrestre). Lors d’examens IRM, des effets aigus et réversibles ont été rapportés par des patients et des travailleurs, tels que des sensations de nausées et de vertiges, un goût métallique dans la bouche ainsi que des images lumineuses dans la rétine (phosphènes). De nombreuses études ont été menées sur des systèmes in vitro, des animaux ou sur l’Homme pour détecter des effets biologiques des champs magnétiques statiques, notamment sur la reproduction et le développement, le système nerveux et la cognition, ainsi que sur la génotoxicité. Cependant, les résultats de ces recherches cliniques et précliniques sont très divergents et/ou peu concluants et ne permettent pas de répondre clairement à ce jour sur la présence ou non d’éventuels risques pour la santé des champs magnétiques statiques. Face à ces interrogations, la Commission Internationale de Protection contre les Radiations non-ionisantes (ICNIRP) a publié des recommandations sur les limites d’exposition aux champs magnétiques statiques des patients et des travailleurs et une directive européenne (2013/35/UE) a été mise en place. Ces institutions insistent sur l’importance de mener de nouvelles études sur l’Homme et les animaux pour apporter des preuves scientifiques sur de potentiels impacts des champs magnétiques statiques sur la santé. Dans ce contexte, notre projet de recherche porte sur les effets sur le système nerveux central et les comportements qui en dépendent, de l’exposition aux champs magnétiques intenses. Il comporte des analyses in vivo chez la souris, pour caractériser les effets d’exposition de la tête sur certaines fonctions cognitives et sur le système vestibulaire situé dans l’oreille interne et qui contribue à la sensation de mouvement et d’orientation dans l’espace, ainsi qu’au maintien de l’équilibre.
Bénéfices attendus
Notre projet vise une première caractérisation des effets sur le système nerveux central de l’exposition chronique à des champs magnétiques intenses, en particulier sur certaines fonctions cognitives et sur le système vestibulaire qui intervient dans la coordination motrice et le maintien de l’équilibre. Les résultats de cette étude viendront compléter ceux déjà présentés dans une étude récente avec des expositions à 10,5 T et 16,4 T, et contribueront, à apporter de nouvelles preuves scientifiques sur les impacts potentiels des champs magnétiques statiques sur la santé. En effet, l’intensité du champ magnétique utilisé pour réaliser des études d’IRM sur le cerveau humain est un paramètre essentiel, car plus le champ magnétique est intense, plus le signal disponible pour acquérir une image est important, ce qui permet d’atteindre des résolutions spatiales et temporelles plus élevées. L’émergence de nouveaux scanners IRM cliniques à très hauts champs magnétiques nécessite de compléter les études sur les effets potentiels sur la santé humaine (aigus et à long terme) de l’exposition unique ou répétée à des champs magnétiques intenses.
Procédures
Les souris seront soumises : - À une exposition chronique à un champ magnétique statique intense (20h d’exposition réparties en 2 sessions de 2h par semaine pendant 5 semaines) - Des tests comportementaux pour quantifier les effets de cette exposition chronique sur la coordination motrice, l’équilibre et la locomotion volontaire (de 30mn à 1h selon le test allant de 4 à 7 sessions) Les tests comportementaux seront réalisés avant l’exposition (pour caractériser le comportement de base), à différents temps pendant les expositions (pour caractériser les effets de l’exposition chronique), puis 2 semaines après la dernière exposition (pour caractériser des effets persistants).
Impact sur les animaux
Les tests de comportement utilisés pourraient induire un stress chez l’animal. Une phase d’entraînement sera réalisée avant le début des expériences afin que les animaux s’habituent aux expérimentateurs et aux dispositifs de tests comportementaux. La présence d’effets indésirables chez les animaux liés à l’exposition chronique à un champ magnétique, et notamment la potentielle perturbation du système vestibulaire (perturbation de la coordination motrice et de l’équilibre), sera déterminée d’après une série d’indicateurs comportementaux : réduction de la mobilité, dos voûté, pilo-érection, tressautements du corps, perte de poids importante (plus de 20%).
Devenir
En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux prélevés afin de réaliser des analyses histologiques, qui permettront d’étudier au niveau cellulaire les potentielles modifications du système nerveux central induites par l’exposition chronique à des champs magnétiques intenses.
Remplacement
Quelques études in vitro menées sur des cultures de cellules souches neurales ou de neurones immatures ont mis en évidence des effets biologiques induits par l’exposition chronique à des champs magnétiques statiques. Néanmoins, il est indispensable de confirmer ces effets sur des organismes vivants car l’auto-renouvèlement, la migration et la différenciation des cellules souches neurales sont des processus finement régulés par leur microenvironnement. Notre projet nécessite d’avoir recours à des animaux à des fins scientifiques car l’objectif de cette étude est de déterminer clairement l’existence ou non d’effets du champ magnétique statique sur le système nerveux central dans son ensemble, mais surtout sur certaines fonctions cognitives et le système vestibulaire, en utilisant des tests comportementaux dédiés.
Réduction
En se basant sur les résultats présentés dans une étude récente qui a montré certains changements comportementaux chez des souris exposées de façon chronique à haut champ magnétique, il apparaît qu’un nombre de 24 animaux par groupe est nécessaire pour mettre en évidence des effets significatifs lors de l’analyse statistique des résultats des tests comportementaux choisis. Cependant, l’ensemble du projet sera réalisé de manière séquentielle : les expériences seront réalisées avec des lots de 8 animaux et ainsi, si des effets significatifs sont observés sur la santé et le bien-être des animaux dès le premier lot ou après l’utilisation du deuxième lot, les expériences seront arrêtées.
Raffinement
Les animaux, une fois obtenus auprès d’élevages agréés, seront hébergés en groupe dans des cages munies de modules d’enrichissement (accessoires de jeu, fabrication de nids), avec un accès illimité à l’eau et la nourriture. Leur état de santé sera étroitement suivi tout au long de l’étude, afin d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance et d’appliquer les critères d’arrêt en cas d’événement inattendu qui compromettrait le bien-être d’un animal. Les tests de comportement qui suivront les expositions au champ magnétique ne sont pas stressants et sont basés sur la curiosité naturelle des rongeurs pour la nouveauté. Une phase d’entraînement sera réalisée avant le début des expériences afin que les animaux s’habituent aux expérimentateurs et aux dispositifs de tests comportementaux
Choix des espèces
La souris est une espèce couramment utilisée dans le domaine des neurosciences car l’organisation anatomique et fonctionnelle des structures cérébrales est relativement proche de celles de l’Homme. De plus, l’espèce souris a été choisie pour cette étude car les tests comportementaux qui seront réalisés ont déjà été réalisés chez cette souche de souris dans de très nombreuses études comportementales, ce qui nous permettra de nous référer à des données connues de la littérature. Des souris de 8-9 semaines environ, mâles et femelles, seront utilisées car ce stade de développement correspond à l’âge adulte pour cette espèce. Pour les expériences de cette étude, le choix d’animaux adultes jeunes se justifie par la nécessite de limiter le risque d’apparition de pathologies liées à l’âge pouvant biaiser certains résultats comportementaux, et par la nécessité de pouvoir comparer les résultats obtenus avec ceux de la littérature.
Rôle de la minipuberté dans la différentiation sexuelle du système nerveux femelle chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
160 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections hormonales dès la période néonatale, la moitié subissant à l'âge adulte l'ablation des ovaires et la pose d'implants hormonaux, avant des tests comportementaux. Le porteur prévoit la mise à mort pour prélever le cerveau et étudier le rôle de la minipuberté dans la différenciation sexuelle. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'étudier ce réseau neuronal dans l'"organisme entier" et retient la souris pour les outils disponibles.
Objectifs
Ce projet vise à identifier le rôle de la minipuberté dans l'organisation permanente des structures nerveuses impliquées dans la reproduction femelle. La minipuberté est une période postnatale pendant laquelle l'axe gonadotrope, qui régit la reproduction, s'active. Or, jusqu'à présent le rôle et les conséquences de cette activation précoce et transitoire, qui existe également chez l'espèce humaine et qui précède de loin l'initiation de la puberté, sont encore mal connus. Il s'agira donc d’abolir pendant cette période la production ovarienne en hormones en utilisant un modèle de souris transgénique et de mesurer les conséquences de cette perturbation, ainsi que de la supplémentation d'hormones ovariennes sur les fonctions neuroendocrines et comportementales liés à la reproduction chez la souris femelle.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à comprendre les mécanismes cérébraux qui régissent l’organisation de la fertilité chez les femmes. Alors que cette question a été largement étudiée chez le mâle, les données sur les femelles manquent Ce projet qui se concentre sur la compréhension des mécanismes cérébraux chez la femelle permettra d’approfondir les connaissances scientifiques sur la reproduction féminine, en particulier sur le rôle des hormones ovarienne sur son organisation au cours du développement. Cela est d’autant plus important qu’une avancée de l’âge de la puberté a été observée ces dernières années chez les filles, associée à des problèmes sociaux et psychologiques. La perturbation hormonale au cours de la minipuberté peut avoir un impact indirect sur les réponses neuroendocrines et comportementales liées à la reproduction, par le biais des altérations de l'axe gonadotrope à l'âge adulte. Elle peut également affecter directement l'organisation précoce et l'expression des voies de signalisation neurales clés qui régulent ces réponses. Cette étude évaluera les effets des hormones ovariennes produites pendant la minipuberté sur les composants clés des comportements sexuels et maternels. Ce projet permettra ainsi une meilleure compréhension des voies de signalisation sous-tendant l’organisation cérébrale des fonctions de reproduction par les hormones ovariennes.
Procédures
L’ensemble des animaux sera soumis à une injection unique intra-péritonéale d'hormones en période postnatale. Ces injections sont très rapides (1 minute). Après les injections, les souris retournent dans leurs cages habituelles avec leurs mères respectives jusqu’au sevrage. A l’âge adulte, 80 animaux seront soumis à une procédure chirurgicale rapide (ovariectomie et pose d’implants hormonaux). Cette procédure est d’une durée maximale de 10 minutes sur animaux anesthésiés ayant reçu une injection d’analgésique 20 minutes au préalable.
Impact sur les animaux
Les souris femelles seront soumises à des injections intrapéritonéales et sous-cutanées au cours du développement. Les produits administrés n’ont pas d’effet douloureux connus, les animaux auront le seul inconfort de la contention et de l’injection. Les femelles de la première cohorte seront ensuite, à l’âge adulte, ovariectomisées et supplémentées en hormones afin de mimer la séquence naturelle de réceptivité de la souris en s'affranchissant des variations hormonales des femelles et en assurant des niveaux d'imprégnation hormonale identiques. Après la récupération post-opératoire, l’ovariectomie et la supplémentation n’entrainent pas d’inconfort des animaux. Les paramètres de leur comportement de reproduction, de leur activité locomotrice et leur niveau d’anxiété spontané seront ensuite analysés. Les femelles de la deuxième cohorte ne subiront pas de procédure chirurgicale. Après les traitements postnataux, elles seront testées pour leur comportement maternel et leur capacité à apporter des soins aux petits. Les tests comportementaux se font pendant la phase obscure, respectant la phase d'activité des souris, et sont filmés en lumière rouge afin d'interférer le moins possible avec leur activité quotidienne. Ces analyses comportementales consistent à observer des comportements spontanés : cela n’engendre pas d’inconfort des animaux.
Devenir
L'ensemble des 160 souris sera euthanasié à l’issue de chaque procédure afin de prélever le cerveau des animaux. Les analyses immunohistochimiques et moléculaires de ces cerveaux nous permettrons de mieux comprendre les voies de signalisation sous-tendant l’organisation cérébrale des fonctions de reproduction femelle, et tout particulièrement le rôle de la période de minipuberté dans ces processus.
Remplacement
L'étude du rôle de la minipuberté dans la mise en place des structures nerveuses impliquées dans la reproduction nécessite des modèles animaux pour pouvoir étudier le réseau neuronal complexe au sein de l’organisme entier. Des animaux vivants seront donc nécessaires pour ce projet. Ce projet comporte des analyses comportementales et neuroendocrines. Il n'est donc pas possible de le développer par des méthodes alternatives et/ou substitutives.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans cette étude est de 160. Il a été calculé au plus juste pour garantir la puissance statistique de l'étude. Afin de réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons les mêmes cohortes d'animaux pour les analyses comportementales et moléculaires. Par ailleurs, plusieurs zones du cerveau (cortex, bulbe olfactif, striatum...) seront collectées et stockées pour des études futures, les autres organes (hypophyse, ovaire, squelette, dents...) seront proposés aux collaborateurs de l'équipe.
Raffinement
Les animaux seront hébergés sous la supervision de soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L'hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE en termes d'espace et d'environnement. Les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l'enrichissement, un nid sera placé dans la cage. Les résultats du phénotypage reproductif antérieur de la lignée de souris utilisée n'a pas révélé de phénotypes présentant une souffrance inhérente. Avant chaque procédure chirurgicale, une analgésie sera effectuée par l’injection d’un analgésique 20 minutes avant la procédure. Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s'assurer que toute souris présentant un ou plusieurs points limites sera euthanasiée. Les points suivants sont considérés comme points limites ; - tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible de se nourrir ou de boire - toute modification comportementale caractéristique d’une douleur intense, d’une détresse ou d’une souffrance (absence de locomotion, prostration, dos vouté, pelage hérissé et/ou terne, affection cutanée…) - perte de poids supérieure à 20% du poids initial. Toutes les euthanasies des animaux seront effectuées sous anesthésie générale. forts. La mort de l’animal est avérée par l’arrêt des battements cardiaques. Le prélèvement du cerveau ne laisse aucun doute sur la mort de l'animal.
Choix des espèces
La souris est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et comportementales grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...), et de données dans la littérature permettant d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Les souris femelles seront injectées au 7ème jour postnatal afin de perturber la production hormonale qui a lieu pendant la période de minipuberté, et qui est peut-être responsable de la différenciation sexuelle du cerveau femelle. Les femelles seront soumises aux procédures décrites seulement à partir de l'âge adulte (8 semaines d'âge). En effet, le but de ce projet est d'analyser les effets de la perturbation de la minipuberté sur la différenciation sexuelle du cerveau et donc des effets à long-terme qui peuvent interférer avec l'expression à l'âge adulte des comportements de reproduction.
Etude du long ARN non codant LENOX comme cible thérapeutique dans le traitement des mélanomes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte des cellules de mélanome humain sous la peau ou dans le sang, puis on les traite par des oligonucléotides et un gavage quotidien jusqu'à une tumeur de deux centimètres cubes. Le porteur prévoit la mise à mort dès ce point limite ou à la fin, puis des analyses moléculaires. Il présente le projet comme une preuve de concept ouvrant une collaboration avec l'industrie pharmaceutique et écarte les cultures cellulaires, jugées insuffisantes pour reproduire la tumorigenèse.
Objectifs
Ce projet vise à démontrer que l'inhibition de longs ARNs non codants in vivo altère la formation de mélanome et la progression des métastases, en association avec les traitements déjà existants. Ce projet est destiné à prouver que certains longs ARNs non codants sont de potentielles cibles thérapeutiques Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour développer des inhibiteurs spécifiques pouvant être testés dans des essais précliniques
Bénéfices attendus
Cette expérimentation doit permettre de caractériser les changements dans la formation et la croissance tumorales suite à l'inhibition d'un ARN longs non codant associée ou non à un traitement complémentaire déjà utilisé et ceci dans un contexte physiologique que ne permettent pas les cultures cellulaires in vitro. Ce projet devrait permettre la validation d'une nouvelle cible thérapeutique pour le mélanome cutané. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique afin d’étudier l’effet de notre approche d'inhibition des ARNs longs non codants, dans l'objectif final d'identifier de nouveaux traitements pour le mélanome cutané.
Procédures
Toutes les souris seront injectées une fois avec des cellules tumorales humaines (200 microlitres). Les injections de cellules par voie sous-cutanée ou intraveineuse rétroorbitale sont réalisées sous anesthésie gazeuse et durent une dizaine de secondes. Les injections sous-cutanée d'ASO (ASO : "Anti-Sense Oligonucleotides" : petites molécules d'ADN simple brin) (tous les deux jours, 100 microlitres) ou intrapéritonéales de luciférine (une fois par semaine, 100 microlitres) sont faites sur animal vigile et durent quelques secondes. Le gavage oral sera quotidien à raison de 100 microlitres, est réalisé sur animaux vigiles et dure une dizaine de secondes. Les traitements durent au maximum trois semaines.
Impact sur les animaux
L'injection de cellules tumorales par voie sous-cutanée va provoquer la croissance d'une tumeur primaire à l'endroit de l'injection et/ou la formation de métastases distantes, notamment dans les poumons. La tumeur primaire pourra générer un inconfort physique lors des déplacements des souris. Cette tumeur primaire devrait apparaitre à partir de 5 jours suivant l'injection et croitre assez rapidement. La durée totale de l'expérimentation sera de trois semaines. Les souris seront sacrifiées en cas d'atteinte du point limite du volume tumoral de 2cm3. Les métastases ne seront pas visibles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés. Lors des expériences précédentes d'injection de cellules tumorales dans le laboratoire, les souris ont dû être sacrifiées du fait de la taille de la tumeur primaire et non d'effets dus aux métastases. Les cellules tumorales injectées par voie intraveineuse devraient se fixer sur les organes de préférence métastatique, à savoir les poumons en premier. Les métastases ne seront pas visibles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés. Le suivi des cellules du fait de leur luminescence permettra de suivre la croissance tumorale pour les deux voies d'injection. Les traitements subséquents devraient réduire la formation et la croissance des tumeurs.
Devenir
Il est prévu de mettre à mort tous les animaux pendant ou à la fin du projet : l'injection de cellules tumorales devant conduire à la formation de tumeurs voire de métastases chez les souris, les animaux seront mis à mort pendant le projet si la taille de(s) tumeur(s) atteint les points limites, en cas de signes de souffrance ou à la fin du projet. Après euthanasie, des prélèvements seront effectués pour des analyses moléculaires.
Remplacement
Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’effet du traitement par des oligonucléotides antisens (ASO) sur la croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis.
Réduction
Le nombre total de souris expérimentales sera de 180 réparti comme suit : 1 cohorte de 30 animaux injectés par voie intraveineuse (IV) rétroorbitale avec 1 lignée de cellules tumorales puis traités ou non avec les ASOs, 1 cohorte de 30 animaux injectés par voie sous-cutanée (SC) avec 1 lignée de cellules tumorales puis traités ou non avec les ASOs, 2 cohortes de 60 animaux injectés par voie sous-cutanée (SC) avec 2 lignées cellulaires différentes, puis traités ou non avec les ASOs en présence ou en absence d'une thérapie ciblée complémentaire. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Le paramètre étudié sera la taille de la tumeur (mesurée avec un pied à coulisse) ainsi que sa vitesse de croissance pour les souris injectées par SC et le développement des métastases pulmonaires pour les souris injectées par IV. Les mélanomes humains sont des tumeurs hétérogènes et leur étude n'a pas permis d'isoler une lignée cellulaire modèle unique, il est donc nécessaire de tester plusieurs lignées cellulaires dans les deux voies d'injection. Pour l'analyse statistique, nous utiliserons le logiciel GraphPad Prism. Pour comparer deux groupes, un test t de Fisher à deux intervalles sera appliqué. Pour plus de deux groupes, une analyse de la variance à sens unique (ANOVA) sera suivie d'une analyse post hoc de Tukey pour comparer les moyennes entre deux groupes.
Raffinement
Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale, ce qui confortera le résultat des expériences. Les femelles et les mâles répondent de la même manière aux traitements, il ne devrait donc pas y avoir de biais expérimental du au sexe. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur primaire trois fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 2 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des lignées cellulaires utilisées. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. La migration des cellules métastatiques sera suivie par l'utilisation du système d'imagerie in vivo (IVIS) une fois par semaine. En plus du suivi de la taille de la tumeur primaire, la "painscore sheet" servira à l'évaluation de la douleur des animaux. Ce suivi permettra la mise en place d'une éventuelle analgésie (niveau 2) qui pourra être suivie de l'euthanasie si le score de douleur augmente encore (niveau 3).
Choix des espèces
In vitro, nous avons validé nos techniques expérimentales et obtenu des premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques environnementales de la tumorigenèse in vivo et ne peuvent donc fournir le niveau d'information requis. L'utilisation du modèle de xénogreffe chez la souris ne peut être remplacée par d'autres méthodes expérimentales, il est fiable et facile à manipuler et déjà largement utilisé. De plus, les données que nous produirons à partir de nos tumeurs (cinétique tumorale, séquençage d'ARN, quantifications de protéines) seront comparées à celles collectées par notre laboratoire et nos collaborateurs dans des modèles similaires pour d'autres études. Nous utiliserons des souris ayant atteint le stade adulte (6 semaines) qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc ou intraveineuse rétroorbitale.
L’utilisation rituelle des sécrétions de la grenouille Phyllomedusa bicolor (kambo) a-t-elle un effet antileucémique dans un modèle murin ?
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 198 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie subit des brûlures superficielles au bois incandescent, des greffes de cellules leucémiques et des administrations des sécrétions de la grenouille kambo, pour tester un effet antileucémique. Le projet part de l'observation d'un seul patient guéri d'une leucémie après un rituel chamanique, que le porteur veut étayer expérimentalement. Il affirme que le kambo ne se dissout pas en culture et qu'un modèle immunocompétent est "indispensable", puis retient trois modèles murins de leucémie.
Objectifs
Ce projet fait suite à l’observation clinique d’un patient porteur d’une leucémie aiguë myéloïde (LAM), un cancer agressif des cellules hématopoïétiques dont le pronostic est extrêmement sombre. Ce patient a refusé le traitement conventionnel par chimiothérapie, mais a été guéri par un rituel chamanique amazonien appelé kambo, qui consiste à appliquer sur une brûlure superficielle de la peau des sécrétions cutanées de la grenouille Phyllomedusa bicolor. Le kambo est pratiqué en Amazonie mais depuis une vingtaine d'années, l’usage s’est répandu dans le monde entier, pour une variété de conditions médicales dans lesquelles les effets du kambo n’ont jamais été rigoureusement évalués. On estime qu’ environ 100 000 personnes reçoivent du kambo chaque année. En pratique, les patients sont brûlés au deuxième degré avec une baguette de bout de bois incandescente sur 5- à 10 points de 5-10 mm de diamètre. Les sécrétions de kambo forment une pâte qui est appliquée sur les brûlures. Après 1 heure, les effets s’estompent et les patients décrivent une sensation de bien-être intense. Les séances sont habituellement répétées plusieurs fois (5-10) tous les 3-7 jours. Les sécrétions contiennent de nombreux peptides bio-actifs, certains ayant des actions antitumorales. Il est donc possible que le kambo ait un intérêt thérapeutique dans la LAM. Sur les conseils de l'Agence nationale de sécurité du médicament, ce projet vise à trois conditions pour initier un essai clinique : 1/ apporter des arguments expérimentaux renforçant l'observation clinique; 2/ démontrer la bonne tolérance du traitement (étude anthropologique) ; et 3/ mettre au point un approvisionnement en kambo. La principale hypothèse pour expliquer les effets antileucémiques du kambo est que cette procédure permettrait au système immunitaire de reconnaître et éradiquer les cellules cancéreuses par l'induction d'une mort immunogène. De ce fait, un modèle murin immunocompétent est indispensable pour tester cette hypothèse. Trois modèles de LAM seront évalués compte tenu de l'hétérogénéité moléculaire des LAM, de l'agressivité différentielle des modèles et de la compétences des cellules immunitaires. Il est possible que l'administration transdermique après brûlure (méthode traditionnelle) contribue aux effets car il a été décrit que les brûlures activent les cellules de l'immunité. Une comparaison avec d'autres voies d'administration moins invasives sera évaluée afin de limiter au maximum la souffrance animale.
Bénéfices attendus
Trois bénéfices majeurs sont attendus : 1/ L’observation d’une guérison de leucémie aiguë myéloïde, pathologie agressive pour laquelle il n’y a jamais de guérison spontanée, chez un patient après réalisation de quelques séances de kambo suggère qu’il pourrait s’agir d’une nouvelle approche thérapeutique pour les patients atteints de LAM. Il s’agit là d’un enjeu clinique majeur, dans une maladie au pronostic particulièrement sombre (survie globale
Procédures
1) Des prélèvements sanguins hebdomadaires sur souris vigiles seront réalisés dans l’ensemble des procédures (288 animaux). Les prélèvements sanguins seront réalisés par ponction veineuse en submandibulaire à l’aide d’une lancette. Un volume maximal de 50µL sera récolté à chaque prélèvement. Ce volume n'excédera pas 280µL sur 15 jours, volume maximal recommandé pour une souris de 20 grammes. Ces prélèvements débuteront chez des souris âgées de 8 semaines et chaque procédure n'excèdera pas une durée supérieure à 6 mois (24 semaines). 2) Injections par voie sous cutanée de l’analgésique. Pour les interventions de brûlures superficielles, il sera administrée 30 minutes avant la procédure puis 8 heures et 24 heures après la procédure (72 animaux). Lors des transplantations, il sera administrée 30 minutes avant la procédure (222 animaux). En terme de durée, son administration est rapide (moins de 10 secondes). 3) Induction de point de brûlure superficielle au niveau cutané : Les animaux de la procédure 2 (condition brûlure et brûlure + kambo : 72 animaux). La brûlure superficielle sera pratiquée niveau dorsal (très faible superficie 0,0016 cm2,
Impact sur les animaux
1. Nuisances modérées liées aux injections intra-péritonéales de l’agent myélo-ablatif. Le temps requis pour effectuer les injections est de l’ordre de quelques secondes. La greffe de cellules 24 heures après l’administration de busulfan permet d’éviter un état d’aplasie médullaire. 2. Nuisances modérées liées aux prélèvements sanguins hebdomadaires. Un volume faible de 50µL de sang sera ponctionné par prélèvement submandibulaire avec lancette, technique recommandée pour générer le moins de souffrance chez l’animal. Le temps requis pour effectuer cette procédure est de l’ordre de quelques secondes. Le volume sanguin ponctionné n'excédera pas 280µL sur 2 semaines comme recommandé. 3. Nuisances sévères liées à la réalisation de points de brûlure superficielle. Elles vont être réduites par l’administration répétée en 4 fois sur 48h d’analgésique (buprénorphine). Cet acte sera réalisé sous anesthésie générale. Les points seront suivis 5 jours par semaine afin de surveiller tout risque d’infection (jusqu’à cicatrisation de la plaie). A noter que chez l’humain, la surinfection des points d’application n’a jamais été rapportée, peut-être du fait de la présence de nombreux peptides antibactériens dans les sécrétions de Phyllomedusa bicolor. Nos essais préliminaires chez la souris montrent une cicatrisation complète à 5 jours, sans surinfection. 4. Nuisances modérées liées à la greffe intra-fémorale. Cette procédure permet de se substituer à l’injection de cellules leucémiques en intra-orbitaire et éviter le risque de développement de tumeur orbitaire. Ces nuisances seront limitées au maximum grâce à une procédure stricte couplant un analgésique (buprénorphine) et un anesthésiant (isoflurane). 5. Effets indésirables liés à l’infiltration leucémique et indiquant une souffrance modérée (réduction de l’activité, prostration, poil hérissé, yeux plissés ou bridés). Ces effets vont être prévenus par une analyse du taux d’infiltration leucémique (
Devenir
L'ensemble des procédures requiert une mise à mort des animaux du fait que les analyses seront réalisées sur différents tissus (moelle osseuse, rate, ganglions).
Remplacement
Dans ce projet, il est difficile de s’orienter vers des alternatives in vitro car le kambo n’est pas soluble dans du milieu aqueux (formation d’une pâte non dissoute ni dans du milieu de culture ni dans d’autres solvants). De plus, l’activité pharmacodynamique et la pharmacocinétique des peptides contenus dans les sécrétions de grenouille peut agir de manière indirecte sur les cellules leucémiques (activation des cellules de l’immunité innée et adaptative, cellules stromales) : il est donc nécessaire de préserver le micro-environnement médullaire ce qui ne peut être fait in vitro avec des lignées cellulaires. Au total, comme pour toutes les immunothérapies testées en oncologie, il est indispensable d’avoir recours à des modèles animaux immunocompétents.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation nous allons: - mutualiser au sein de l’équipe les ressources cellulaires post-mortem afin qu’un même échantillon puisse être exploité pour différents projets et ainsi éviter l'utilisation itérative de souris (tri des cellules GMP). - effectuer une étude statistique descriptive qui déterminera les différences qualitatives et quantitatives entre les groupes des souris. Cela permettra d’éviter la répétition de l’expérience et de réduire au minimum l’utilisation des animaux - optimiser le matériel issu pour production multiple (cellules en DMSO, acides nucléiques (ADN,ARN), lysats protéiques pour analyses rétrospectives et éviter la répétition de l’expérience). Nous utiliserons dans chaque expérience un nombre minimal mais suffisant d’animaux pour permettre une étude statistique exploitable.
Raffinement
Les souris auront un temps d’acclimatation de 7 jours minimum avant d’être incluses dans une procédure. Pour réduire au maximum la douleur associée au développement de la leucémie, des points limites prédictifs seront mis en place pour limiter les souffrances et le stress. La mise à mort sera pratiquée lorsque le taux de cellules leucémiques dans le sang sera de 80%, taux d’infiltration qui peut commencer à impacter le bien-être animal (BEA). Si des signes cliniques se déclarent avant (prostration, poil hérissé, perte d’activité, ataxie), l’animal sera mis à mort. Ces signes seront surveillés par un suivi régulier (5 jours par semaine du lundi au vendredi). Nous veillerons à optimiser et enrichir l’hébergement (blocs de cotons pour les besoins ludiques, maintien des groupes sociaux pour éviter le stress et l’isolement, portoirs ventilés adaptées, séparation des mâles et des femelles). Pour réduire la souffrance liée à la réalisation de gestes pouvant induire une douleur, les souris bénéficieront d’une anesthésie générale et de la mise en place d’un protocole analgésique puissant. Concernant les points de brûlure superficielle, ils seront suivis 5 jours après le geste pour mettre en évidence des signes d’infection cutanée (temps nécessaire pour la cicatrisation complète selon nos premiers résultats). Si nous mettons en évidence une infection cutanée, la plaie sera désinfectée 2 fois par jour jusqu’à disparition des signes d’infection. Si l’infection cutanée ne se résout pas par traitement au bout de 5 jours, les souris seront mises à mort. Le suivi des animaux permettra de visualiser la présence de signes de stress et de souffrance. A noter que nos résultats préliminaires n’ont pas mis en évidence ce type d’incident.
Choix des espèces
Ce projet s'intéresse aux leucémies aiguës myéloïdes (LAM). Au cours des dernières années, la communauté scientifique a généré des lignées murines génétiquement modifiées qui développent soit spontanément soit de manière inductible des LAM. Ces animaux sont donc des modèles de choix pour évaluer l’efficacité d’un traitement visant à éradiquer les cellules leucémiques. De plus, les mécanismes de leucémogenèse impliquent non seulement les cellules leucémiques mais aussi les cellules du microenvironnement (cellules stromales, cellules immunitaires). Les cellules immunitaires ayant un rôle déterminant dans l’effet antileucémique des traitements, il est indispensable d’avoir recours à des animaux immunocompétents pour tester des stratégies faisant intervenir le système immunitaire, comme c’est très probablement le cas avec le kambo. C’est pour cela que les modèles murins sont pertinents dans ce contexte d’étude.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises pendant cinq à quinze semaines à une alimentation riche en graisses et en sucre, avec des prélèvements de sang à la queue, des injections de glucose et d'insuline et une échocardiographie sous anesthésie. Le porteur décrit une obésité et un prédiabète induits, puis la mise à mort pour prélever le cœur et le foie et constituer une biobanque. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe pour ce projet de physiologie intégrée et retient des souris de cinq mois pour majorer l'atteinte cardiaque.
Objectifs
Le diabète entraine très souvent des complications cardiaques avec notamment l’apparition d’un mauvais fonctionnement du cœur, appelé cardiopathie diabétique, et pouvant mener à l’insuffisance cardiaque. Or, le diabète est en pleine expansion dans notre société, ce qui confirme la nécessité de constantes recherches pour mieux cibler les solutions thérapeutiques. Le projet consiste à analyser un modèle de cardiomyopathie diabétique chez la souris induit par une alimentation riche en graisse et en sucre, afin d’en comprendre les mécanismes et d’identifier de nouvelles potentielles pistes thérapeutiques. Plus particulièrement, cette étude vise à : 1) étudier l’impact de l’âge et du sexe sur la communication du signal calcium entre le réticulum, réservoir de calcium, et la mitochondrie, source d’énergie de la cellule, dans le développement du diabète au niveau du foie et du cœur et 2/ identifier les acteurs au niveau moléculaire en réalisant une analyse comparative entre 6 laboratoires européens pour identifier l’impact des conditions d’élevage dans les laboratoires.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de préciser les altérations de la communication entre réticulum et mitochondries au cours du diabète de type 2 et de la cardiopathie diabétique selon l’âge et le sexe, afin d’établir son rôle comme cible thérapeutique pour tous les patients ou seulement des sous-groupes, en vue d’une médecine personnalisée. Ce projet permettra également d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques spécifiques de la cardiomyopathie diabétique car indépendantes des conditions d’élevage ou du technicage des échantillons, dans le cadre d’un projet multi-établissements et via des analyses comparatives à large échelle des mécanismes moléculaires. A plus long terme, nos résultats permettront d’envisager de nouveaux traitements pour les patients
Procédures
Les souris recevront une alimentation riche en lipides et en sucrose pendant 5 ou 15 semaines qui va induire une prise de poids sans altérer leur mobilité sur la durée de l’étude. Une fois par mois et lors des test métaboliques, les souris sont mises à jeun 6 heures et soumises à des prélèvements sanguins de petits volumes au niveau de la queue pour les mesures de glycémie sous analgésie. Ces prélèvements sont au nombre maximum de 15 répartis sur 15 semaines, selon les durées de régime et leur durée n’excèdera pas 30 secondes chaque fois. Lors de chaque test métabolique, les souris sont soumises à une injection (glucose ou insuline) au niveau de l’abdomen (
Impact sur les animaux
Suite à l’alimentation riche en lipides, les souris vont développer une obésité et un prédiabète associé à une hyperglycémie modérée. Nos études préalables démontrent que leur prise de poids ne les empêche pas de se mouvoir dans la cage et d’accéder à la mangeoire et que leur prédiabète ne modifie pas de manière majeure leur prise hydrique ni leur besoin d’uriner. Au cours du test de tolérance au glucose, une hyperglycémie transitoire est induite. Ces variations de glycémie sont des réponses physiologiques transitoires qui n’affectent pas l’état général des souris. L’hyperglycémie provoquée lors du test de tolérance au glucose revient à la normale au bout de 90 minutes. Au cours du test de tolérance à l’insuline, certaines souris sont susceptibles de présenter une hypoglycémie transitoire qui revient à la normale lorsqu’on redonne accès à la nourriture aux souris. Les injections intrapéritonéales associées à ces différents tests peuvent entrainer, de même que les prélèvements sanguins, une douleur transitoire, prise en charge par ailleurs.
Devenir
A la fin des procédures, toutes les souris seront mises à mort pour le prélèvement des organes d’intérêt. Ces prélèvements d’organes sont nécessaires pour constituer une biobanque et analyser les mécanismes moléculaires à l’origine du développement de la pathologie. Pour accroitre notre compréhension de ces mécanismes et tirer le plus d’information de ce modèle, nous allons réaliser des analyses à large échelle sur plusieurs organes afin de mieux comprendre l’influence du métabolisme à l’échelle de différents organes sur la cardiomyopathie.
Remplacement
Il s’agit d’un projet de physiologie intégrée où aucune alternative non animale n’est disponible. D’autre part, on veut également déterminer si la cardiomyopathie diabétique induite par une alimentation obésogène est dépendante ou pas du sexe, et ce paramètre n’est pas analysable autrement que sur animal.
Réduction
Le nombre d’animaux par procédure a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques afin de déterminer le plus précisément possible le nombre minimal d'animaux permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables tout en mutualisant les prélèvements des différents organes, soit 160 animaux sur 2 ans.
Raffinement
L’alimentation hypercalorique va induire une prise de poids qui ne gêne pas la motricité des souris qui peuvent toujours accéder à la mangeoire. Le nombre d’animaux par cage est donc réduit par rapport aux conditions standard d’hébergement pour que chacune ait suffisamment de place. Les animaux sont suivis quotidiennement et la mise en place de points limites pertinents permet d'intervenir au plus tôt en cas de difficulté. Le temps de jeûne pour les mesures de glycémie et les tests métabolique est réduit au minimum nécessaire (6 heures) et est mis en place dans le début de la phase diurne, soit en période de faible activité des souris. Pour les mesures de glycémie et les tests métaboliques, les souris sont mises à jeun pendant 6 heures, puis une crème analgésiante est appliquée à l’extrémité de la queue 30 minutes avant de réaliser une incision fine à l’aide d’un scalpel pour prélever une goutte de sang (5µl). Pour les mesures successives lors des tests, la queue n’est pas retaillée mais le coagulum est ôté par un léger frottement avec une compresse stérile, qui provoque à nouveau le saignement de la queue. Une hyperglycémie transitoire est attendue lors du test de tolérance au glucose qui devrait se restaurer au bout de 90 minutes. De même une hypoglycémie transitoire est attendue lors du test de tolérance à l’insuline. Après les examens échographiques réalisés sous anesthésie générale, les souris sont placées dans une couveuse à 37°C pendant 30 minutes pour éviter toute hypothermie et leur permettre de récupérer plus facilement.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car leur physiologie est « proche » de l’homme en termes de contrôle de la glycémie et le fonctionnement cardiaque. Nous utiliserons des souris à l’âge adulte (âgées de 5 mois), âge auquel le développement cardiaque est terminé. Cet âge « avancé » permet de majorer les atteintes cardiaques induite par l’alimentation et de reproduire la pathologie de cardiomyopathie diabétique chez l’Homme (intervenant généralement chez le sujet adulte).
Etude de la colonisation intestinale de Staphylocoques dans un modèle néonatal murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
250 souris nouveau-nées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès l'âge de deux jours, les souriceaux sont gavés deux fois par jour pendant sept jours avec des staphylocoques, ce qui peut provoquer une inflammation digestive, des diarrhées, une infection généralisée avec fièvre et déshydratation. Le porteur prévoit la mise à mort par décapitation dès une perte de poids supérieure à 15 %, puis une analyse bactériologique des tissus. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité de l'animal et retient le modèle néonatal parce que les infections humaines visées surviennent dans les premiers jours de vie.
Objectifs
Les bactériémies à Staphylocoques chez les nouveaux-nés peuvent-être médiées par le portage digestif. Lors d'une étude préliminaire, nous avons pu montrer une forte présence de Staphylocoques dans les selles des patients atteints de bactériémie. Nos travaux in-vitro se sont donc portés sur la colonisation de différentes espèces de Staphylocoque (aureus, capitis, haemolyticus) au niveau digestif. Nous avons réussi à déterminer que ces pathogènes parvenaient à passer à travers la barrière intestinale en utlisant des cellules appelées entérocytes et cellules M. Pour confirmer nos observations, un modèle in-vivo de souris néonatal nous permettra de (i) confirmer le passage intestinale de ces souches à travers l'épithélium intestinal. Nous pourrons également vérifier (ii) qu'une souche microbiotique (L. lactis) peut avoir un effet protecteur quant à l'implantation de souches pathogènes.
Bénéfices attendus
Nos résulats in-vitro valident nos hypothèses sur un modèle simple. Un modèle animal complexe permettrait de résoudre le mystère de la physiopathologie des Staphylocoques dans l'intestin.
Procédures
Les interventions seront des gavages répétés 2x/jour (20 secondes par gavage, donc 40 secondes par jour de gavage) pendant 7 jours chez des souriceaux âgés entre 2j et 9j. La pesée et le test du pli de la peau du dos prendront environ 30 secondes par jour. Au total, les souriceaux seront exposés à environ 1 minute de procédure par jour pendant 7 jours.
Impact sur les animaux
Le gavage sur souris adulte est une technique maitrisé dans le laboratoire, il faudra cependant adapter notre protocole à des souriceaux. Il est possible que la sonde de gavage puisse provoquer une légère irritation dans la gorge de l'animal. L'induction d'une forte charge bactérienne peut provoquer une inflammation du système digestif avec une apparition de diarrhées. La survenue d'une bactériemie peut provoquer un état infectieux général incluant de la fièvre et de la déshydratation.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour une analyse bactériologique et inflammatoire des tissus.
Remplacement
Nous sommes limités par notre modèle simple in-vitro. Un modèle de récupération de cellules primaires de patients est envisagé mais restera circonscris à un modèle in-vitro. Il est impossible d'envisager de travailler sur un modèle in-vitro reproduisant la complexité d'un animal.
Réduction
Nous n'aurons pas besoin d'effectuer des génotypages et des sélections de génotypes puisque nous travaillerons sur des souris au génotype "sauvage" issus d'éleveurs agréés. Afin de minimiser le nombre d'individus nécessaires, un test statistique ANOVA a permis de défnir le nombre d'animaux nécessaire pour une puissance statistique significative.
Raffinement
Toutes les expérimentations sont réalisées dans une animalerie certifiée. Les souris seront manipulées une fois tous les jours pour être habituées à la présence et à l'odeur de l'expérimentateur. Cela évitera également que la mère délaisse ces petits après les manipulations de l'expérimentateur. Les petits resteront avec leur mère (il ne pourra donc n'y avoir qu'une condition par cage) pour éviter toute souffrance des bébés. Les bébés seront pesés 1 fois par jour avec une balance de précision pour détecter une perte de poids correspondant à l'installation de la maladie. Une perte de poids supérieure à 15% conduira au sacrifice de l'animal par décapitation. Les petits ne seront utilisés qu'à partir de l'âge de 2 jours, les recommandations demandent de laisser généralement la femelle et ses petits tranquilles pendant les premières 24h de vie. Les gants seront changés entre chaque cage, avec un frottage préalable avec de la litière avant de manipuler les petits. Les souriceaux seront manipulés sur une table chauffante (préalablement frottée avec de la litière de la cage) ou dans le creux des mains pour éviter une hypothermie. Les mères seront alimentées avec une nourriture enrichie pour reproducteurs. Les cages seront enrichis (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). L'eau et la nourriture pour les individus adultes seront mis à disposition "ad libitum". Chaque animal bénéficie d'une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d'assurer un bien-être optimal tout au long de l'étude. Les gavages seront effectués via une sonde flexible spécialement adapté aux souriceaux.
Choix des espèces
La souris est à l'heure actuelle l'animal le mieux adapté pour la modélisation de la colonisation intestinale à Staphylocoques. Il se trouve que cet animal peut-être naturellement colonisé par S. aureus. L'expérimentation sur des animaux de petites tailles permet d'apporter des élements dans un contexte physipathologique impossible à atteindre in-vtro ou en clinique humaine. Les animaux seront utilisés à H+48 par rapport à leur naissance. En effet, les bactériémies observées chez les nouveaux-nés humains se produisent dans les 5 jours suivant la naissance. Il est donc nécessaire de développer un modèle murin néonatal. Les souris adultes ne pourront pas être infectées par le gavage de leurs petits. En effet, les trois espèces bactériennes utilisées sont : - S. capitis pour lequel le risque d’infection est impossible pour une souris adulte en bonne santé (C’est avant tout un germe opportuniste qui profite de l’axenie des nouveau-nés pour s’implanter) - L. lactis qui est une souche commensale sans pouvoir pathogène - S. aureus pour lequel il pourrait exister une faible chance pour les souris adultes d’être inféctées. L’inoculum étant principalement localisé dans les souriceaux, un transfert suffisamment important de l’inoculum des souriceaux à la souris adulte est impossible. Une quantité très importante est généralement nécessaire pour induire un effet direct sur la souris adulte (en gavage direct ou sur une plaie profonde et maintenue induite par l’expérimentateur). Il est impossible que cette dose se retrouve par accident au contact des souris adultes.
Optimisation de l’expression d’un transgène sur modèle murin par modulation du sérotype, du vecteur therapeutique et du site d’injection en vue d’une application en thérapie génique pour les maladies neurodégéneratives.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection du produit dans le cerveau ou la moelle épinière, par voie intracrânienne, intrathécale ou intraveineuse, puis sont mises à mort au plus tard soixante jours après pour prélever leurs tissus. Le porteur indique des douleurs post-opératoires possibles, un saignement lors de la descente de l'aiguille, une perte de poids ou un décès sous anesthésie, et décrit un protocole d'analgésie. Il conclut à l'irremplaçabilité de la souris, aucune culture cellulaire ne reproduisant selon lui la complexité du cerveau, pour optimiser une thérapie génique visant les maladies neurodégénératives.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. De nouvelles stratégies sont essentielles pour progresser dans la prise en charge des patients. Parmi ces nouvelles approches se trouve la thérapie génique. Elle utilise la génétique pour soigner ou prévenir la maladie. L’objectif est de délivrer aux cellules malades un gène à action thérapeutique (transgène) qui permet de remplacer la protéine défectueuse à l’origine de la maladie. Ce gène médicament est transporté dans les cellules grâce à un virus modifié (vecteur viral) dont les caractéristiques peuvent permettre de cibler plus ou moins spécifiquement les cellules malades. Le projet « Optimisation de l’expression d’un transgène sur modèle murin par modulation du sérotype du vecteur thérapeutique et du site d’injection en vue d’une application en thérapie génique pour les maladies neurodégénérative » a pour but de déterminer les conditions optimales d’administration (site d’injection et spécificité du vecteur médicament) pour permettre d’augmenter l’efficacité du traitement de thérapie génique en vue d’une application à l’homme. Nous testerons différents vecteurs médicaments ainsi que différents sites d’injection et testerons leur efficacité. Cette optimisation permettra d’ajuster au mieux la thérapie aux patients en ciblant de manière plus spécifique les cellules malades et en déterminant la meilleure voie. Les deux approches combinées (ciblage des cellules malades et choix de la voie d’administration) permettront d’améliorer considérablement l’efficacité de la thérapie tout en réduisant de manière significative les risques liés à l’utilisation de virus en diminuant la dose utilisée.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de : - déterminer la meilleure voie d'administration pour le traitement de maladie neurodégénérative, - déterminer la dose de virus utile pour un traitement avec pour objectif de réduire cette dose au maximum, - déterminer une stratégie thérapeutique qui réduirait le délai pour envisager une application à l’homme.
Procédures
Pour l’ensemble de ce projet aucun prélèvement ne sera effectué sur animal vigile. Deux interventions seront effectuées sur chaque animal, l’une au moment de l’injection (IC - Intra cranienne, injection dans le cerveau), ICM - Intra Cisterna Magna, injection dans la grande citerne, cavité à l'arrière de la tête entre le crâne et la première vertèbre, IT - Intrathécale, injection au niveau de la moelle épinière par injection entre les vertèbres, ICV - IntraCérébroVentriculaire, injection dans les ventricules du cerveau, IV - Intraveineuse, injection dans le système veineux), l’autre au moment de l’euthanasie au maximum 60j post-injection. Pour les injections IC, ICM, IT, ICV une intervention inférieure à 30 minutes animal endormi, avec prise en charge analgésique 30 minutes avant la chirurgie sera effectuée. Afin d’éviter la douleur, post-chirurgie, les animaux reçoivent l’administration d’analgésique dans les 48 heures suivant la chirurgie. Pour l’injection IV une intervention de moins de 5 minutes par animal sera réalisée (5 minutes pour anesthésie et injection avec un temps d’injection de 20 secondes maximum). Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir prélever les tissus pour analyses.
Impact sur les animaux
Cette étude ne devrait pas engendrer de nuisance ou d’effet indésirable pour les animaux (surexpression modérée des différentes protéines et un temps d’expression suffisamment court pour ne pas engendrer de toxicité à long terme). L'utilisation d'antalgique (buprénorphine) permettra de minorer les éventuelles douleurs post opératoire liées : (1) à la manipulation des animaux (placement sur appareil de stéréotaxie), (2) à l’injection (réalisation de trepan pour l'Intra Cranienne et l'Intra Cérébroventriculaire, chirurgie pour injection dans la Cisterna Magna et en Intra Thécale), (3) à un saignement suite à une lésion d’une artère ou d’une veine lors de la descente de l’aiguille au site d’injection, (4) à une perte de poids liée à l’intervention et/ou chirurgie ou un décès dû à l'anesthésie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin procédure expérimentale pour les prélèvements et leurs analyses afin de pouvoir répondre a la question scientifique de ce projet.
Remplacement
Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles.
Réduction
Des résultats précédents nous ont permis d’estimer la puissance statistique de nos analyses et l’échantillonnage nécessaire pour caractériser les effets biologiques souhaités. Le nombre d’animaux utilisés est donc optimisé pour obtenir des résultats statistiques. La composition des groupes d’étude a été faite pour utiliser un nombre minimal d’animaux (6 animaux, un seul sexe étudié car aucune variabilité liée au sexe n’est attendue permettant ainsi de ne pas injecter d’animaux supplémentaires pour homogénéiser le ratio sexe F/M). Leur nombre (338) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. Un groupe contrôle de 12 animaux servira pour l’ensemble de l’expérience. En cas de problème pour l’un des groupes injectés (tel qu’un décès lors de l’anesthésie par exemple), un animal du groupe contrôle sera utilisé en remplacement, ainsi aucun animal supplémentaire ne devrait être ajouté à celui indiqué précedemment pour finaliser le projet. Le design expérimental a pour but d’obtenir un maximum d’informations en utilisant un minimum d’animaux. Un plan statistique complet a été rédigé et validé. L’analyse statistique sera réalisé à l’aide du logiciel statistique informatique.
Raffinement
Les animaux seront regroupés par groupes de 6. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Un suivi quotidien des animaux sera effectué certifiant un contrôle régulier du bien-être des animaux. En cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance inutile. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’injection de lidocaïne (anesthésique local) et par protocole analgésique ratifié par le vétérinaire du service pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Toute manipulation de vecteurs thérapeutiques se fait dans les conditions optimales. Les animaux seront hébergés en zone confinée du moment de l’injection des vecteurs thérapeutiques jusqu’à leur euthanasie. Un environnement enrichi sera garanti aux animaux, : carré de coton ou des lamelles de kraft pour la nidification. Un igloo sera ajouté dans chaque cage. Tout au long de la vie des animaux un suivi rigoureux sera réalisé pour s’assurer de leur bien-être en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi pour ce projet est la souris. Notre étude a pour but d’étudier la biodistribution, un modèle « complet » animal est donc indispensable. Le modèle murin est le modèle de référence pour des études préliminaires. Les animaux utilisés seront injectés à P50 et mis à mort 2 mois après injection. Ce projet a pour objectif de déterminer la voie d’administration optimale en fonction du sérotype et du transgène choisi. Il servira de référence en vue d’une application de cette stratégie sur l’humain adulte. Des animaux adultes sont donc utilisés. L’expression de nos vecteurs est optimale 4 à 6 semaines post injection, nous avons choisi de conserver les animaux 8 semaines post injection pour que chacun des animaux injectés exprime la protéine d’intérêt de manière optimale.
Validation préclinique d’un nouveau radiopharmaceutique pour l’imagerie de l’Hypoxie par Tomographie d’Emission de Positons dans le cancer du poumon en vue d’un essai clinique de phase 0/1.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. On leur implante des cellules de cancer du poumon sous la peau ou dans le poumon, puis on répète deux fois des séances d'imagerie TEP et IRM sous anesthésie pour évaluer un nouveau radiotraceur de l'hypoxie. Le porteur indique que le modèle intra-pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires et un essoufflement. Les retombées annoncées, un premier essai clinique de phase 0/1, restent formulées comme une perspective, l'objectif immédiat étant de valider le radiotraceur.
Objectifs
Le cancer du poumon représente un problème de santé publique majeur, en étant le 2ème cancer le plus fréquent chez l’homme et le 3ème chez la femme. Il est aussi le plus meurtrier en représentant à lui seul 20% des décès par cancer. Le pronostic vital est directement corrélé au stade de la maladie ainsi qu’à la rapidité de la prise en charge diagnostique et thérapeutique. L’imagerie TEP (Tomographie par Emission de Positons) de l’hypoxie est considérée comme pouvant être un outil pertinent pour cartographier avec précision et une grande sensibilité les cellules cancéreuse. Elle est particulièrement recherchée pour, outre le diagnostic précoce, la détection des récidives et le suivi des traitements afin de mieux les adapter et les optimiser, en particulier dans le cadre de programmes de radiothérapie. Cependant, les radiopharmaceutiques usuels ciblant l’hypoxie, tels que le [18F]FMISO qui a déjà fait l’objet de plusieurs essais cliniques chez des patients atteints de cancers du poumon, conduisent à des images avec des très faibles contrastes et les délais d’acquisition sont très longs. Le projet consiste en l’évaluation d’un nouveau radiotraceur pour l’imagerie TEP de l’hypoxie, le [18F]FLUSONIM, dans des modèles précliniques de cancer du poumon, dans la perspective d’un futur transfert clinique. Notre équipe de recherche travaille depuis de nombreuses années au développement de nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie TEP. Les études antérieures de développement du [18F]FLUSONIM ont montré des performances encore inégalées pour l’imagerie de l’hypoxie en termes de contrastes (1,5 à 9 fois plus élevés que ceux obtenus avec le [18F]FMISO) et de délais d’acquisition (20-60 min versus 2,5-3,5 h pour le [18F]FMISO) dans plusieurs modèles animaux de cancers hypoxiques (rhabdomyosarcome, glioblastomes et mélanome) par rapport aux animaux sains. Cette demande d’autorisation de projet inclut deux modèles précliniques avec implantation des cellules cancéreuses LLC (Lewis Lung Carcinoma) en sous-cutané ou en intra-pulmonaire chez la souris. Le caractère hypoxique de ces deux modèles est bien attesté. Le modèle sous-cutané est un modèle classique et largement utilisé en recherche préclinique. Le modèle intra-pulmonaire se rapproche de la pathologie humaine et il n’a jamais été utilisé en TEP.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus concernent la validation du radiotraceur pour l’imagerie TEP de l’hypoxie spécifique et performante dans les deux modèles de cancer du poumon dans le but d’un premier essai clinique en phase 0/1.
Procédures
L'ensemble des interventions qui suivent sont réalisées sous anesthésie générale: 1) Implantation de cellules tumorales en sous cutané ou en intra-pulmonaire (environs 5 min par animal). 2) Pour le modèle intra-pulmonaire uniquement, suivi de la croissance tumorale tous les 2 à 3 jours par IRM (environ 10 min). 3) Injection intraveineuse d'un radiotraceur suivi d'une imagerie TEP (durée de 75 min) puis d'une série d'acquisitions IRM (environ 20 min). Chaque animal est soumis à ce protocole deux fois à environs une semaine d'intervalle.
Impact sur les animaux
Le modèle sous-cutané est de classe légère. Les effets indésirables attendus sont faibles: stress à l’induction de l’anesthésie et au réveil, éventuelle douleur au point d’injection (mais encore jamais observée jusqu’à aujourd’hui dans nos expériences antérieures). Le modèle intra-pulmonaire est de classe modéré car l'implantation est plus complexe à réaliser et à suivre. Les nuisances peuvent être des difficultés respiratoires et un essoufflement excessif nécessitant une surveillance accrue durant la croissance tumorale et pendant l’anesthésie.
Devenir
Les animaux sont porteurs d'une tumeur, il est donc impossible de laisser en vie ou de les réutiliser à l'issu des procédures expérimentales.
Remplacement
L’imagerie TEP préclinique in vivo utilisée en mode dynamique est la seule technique qui permet d’accéder à l’ensemble des données pharmacocinétiques des radiopharmaceutiques, avec une grande fiabilité. Aucune étude in vitro ne peut être utilisée en remplacement.
Réduction
L’imagerie TEP dynamique est un outil puissant pour évaluer un nouveau radiotraceur avec un nombre limité et minimisé d’animaux. Le protocole étant peu invasif, un même animal peut être réutilisé pour plusieurs sessions d'imagerie, réduisant ainsi le nombre total d'animaux nécessaire. Le projet est organisé de façon à optimiser le nombre d'animaux par groupe. Le nombre d’animaux prévu par condition expérimentale est restreint (au moins 8, maximum 10 par lot, sachant qu’un seul lot peut être suffisant) et reste suffisant pour les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations interindividuelles.
Raffinement
Tous les animaux seront hébergés en animalerie conventionnelle respectant leurs besoins physiologiques et comportementaux. Ils ont accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Les cages sont enrichies par la présence d’un dôme de cellulose et de lanière de papier kraft permettant de réaliser des abris. Les imageurs TEP/IRM ainsi que l'ensemble de l'environnement technique, sont adaptés aux rongeurs. Afin de limiter leurs mouvements durant l'imagerie et de maintenir des conditions physiologiques correctes, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse avec un monitoring de température et un suivi de la fréquence respiratoire. Les injections se feront sans recours à la chirurgie, et aucune douleur n'est attendue. Les animaux seront surveillés durant les 24 heures suivant les expériences d’imagerie afin de contrôler l'absence de signes visibles de douleur (prostration, perte de poids, état anormal du poil ou des yeux) ou de problème au niveau du point d'injection (démangeaisons, état anormal de la peau). En cas d’apparition de ces signes, il est prévu un traitement antidouleur pendant 2 jours. La non-résolution de cette douleur est considérée comme un point limite et entrainera une mise à mort de l'animal. Nous n’avons jamais eu besoin de recourir à des antidouleurs dans les protocoles d’imagerie TEP réalisés jusqu’à ce jour.
Choix des espèces
Les cellules LLC sont syngéniques des souris C57Bl/6 qui sont donc choisies comme espèce animale. Les cellules LLC étant issues de souris mâles, les animaux utilisés seront tous de sexe masculin. Le laboratoire dispose de l’infrastructure nécessaire pour les expérimentations chez les rongeurs. L’imageur TEP préclinique est adapté pour l’imagerie corps entier de la souris permettant d’accéder aux données de biodistribution générale du nouveau radiotraceur. Le modèle tumoral, qu’il soit sous-cutanée ou intra-pulmonaire, est bien maitrisé, reproductible, tout en étant de classe légère, et surtout pertinent vis-à-vis de la pathologie cancer du poumon et des propriétés hypoxiques. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (à partir de 8 semaines), de tailles et poids raisonnables et compatibles avec le volume du berceau de l’imageur.
Modèles d’ACLF associant Thioacétamide, éthanol et divers évènements précipitants. Application à l’évaluation de l’efficacité de molécules.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 5268
5 268 souris et 5 268 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance jusqu'à sévère. Ils reçoivent pendant sept à neuf semaines un agent toxique pour le foie deux fois par semaine, puis un agent déclencheur dont des administrations massives d'alcool, avant des prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur décrit des effets invalidants, ataxie, détresse respiratoire, vocalises et incapacité à se retourner, pour reproduire l'insuffisance hépatique aiguë sur cirrhose et tester des molécules. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la défaillance simultanée de plusieurs organes et conclut à la nécessité du rat et de la souris.
Objectifs
La décompensation aiguë de la cirrhose hépatique est une évolution majeure dans le développement de la cirrhose hépatique. Celle-ci se subdivise en deux catégories, la décompensation traditionnelle dont le pronostic vital à court terme n’est pas engagé et l’ACLF (Acute on chronic liver failure) avec une défaillance multi-organes, beaucoup plus complexe et où le pronostic vital est clairement défavorable. Il n’existe pas de traitement à ce jour afin de permettre de bloquer l’évolution fatidique de la pathologie et permettre d’orienter le patient vers une greffe de foie. La transplantation hépatique restant la seule thérapie pour l'ACLF une fois que les fonctions vitales sont préservées mais l'allocation adéquate des organes représente un défi croissant Notre projet consiste à reproduire dans un modèle expérimental chez le rat et la souris, le processus de décompensation aigue observé chez les patients cirrhotiques. Ce processus entraine la perte de capacités d’un ou plusieurs organes ou de fonction : foie, rein, cerveau, coagulation, … La cirrhose hépatique est caractérisée par la présence de tissus cicatriciels au niveau du foie en réponse à une agression répétée de l’organe (alcoolisme, hépatite virale, NASH, …). Ce tissu de réparation est non fonctionnel et n’a pour but que de combler les zones détériorées. La mise en place de la défaillance hépatique et l’épisode aigue de décompensation peuvent avoir différentes origines. L’une des premières causes de défaillance hépatique est l’alcoolisme chronique. Le précipitant le plus courant est l’infection bactérienne qui ouvre la voie à une décompensation hépatique aiguë se manifestant par l'ACLF. La cirrhose est un facteur de risque d'infection avec une prévalence de 30 % chez les patients hospitalisés contre 5 à 7 % chez les patients hospitalisés sans cirrhose. IL existe d’autres précipitants courants dont les saignements gastro-intestinaux, les lésions hépatiques d'origine médicamenteuse et la thrombose aiguë de la veine porte. En dehors de ces précipitants, une forte consommation d'alcool répétée est à l’origine de plus de 22 % des cas d'ACLF.
Bénéfices attendus
La prévalence de la cirrhose est d’environ 2000 à 3500 cas par million d’habitants, soit en France 700 000 cas avec 10 à 15 000 décès par an. Le passage d’une cirrhose compensée vers une cirrhose décompensée est associé à une diminution de la survie à court terme (3-5 ans). L’ACLF est associée à une forte mortalité à court terme (mortalité à 28 jours après l’admission à l’hôpital) de l’ordre de 20–25 % chez les patients ayant une défaillance d’organe à plus de 75 % chez les patients présentant trois défaillances d’organe et de fonction ou plus. L’ACLF est présent chez 26 % des patients cirrhotiques hospitalisés et 8 % le développent au cours de leur hospitalisation. Ce projet vise donc à bloquer et reverser le processus qui conduit au décès prématuré du patient ou à une dégradation majeure de ses fonctions vitales, et de lui permettre d’avoir accès à une transplantation hépatique (seul recours actuel à la décompensation hépatique).
Procédures
Au cours des procédures décrites dans ce dossier d'autorisation, les animaux recevront, deux administrations hebdomadaires d’un agent hépatotoxique (durée 9 semaines pour les rats et 7 semaines pour les souris-durée d’une administration : 15 secondes). Après une semaine sans traitement l’agent déclenchant, sera administré selon la procédure soit une seule fois, soit pendant 3 jours (3 injections par jour). Chaque administration dure 15 secondes. Au cours de la dernière semaine de la procédure, les animaux subiront un prélèvement de sang (durée 30 secondes) sous anesthésie à l’isoflurane (durée 3 minutes). Les composés à tester seront administrés (chaque administration dure 15 secondes) pendant une période de 1 à 7 jours max . Un prélèvement de sang sous anesthésie à l’isoflurane sera réalisé au moment de la mise à mort des animaux.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont produites par les administrations par voie orale qui ne sont pas douloureuses mais stressantes, elles sont classées légères. La période d’administration est longue et une sorte d’habituation au geste estompe rapidement ce stress. L’induction de la fibrose n’induit pas de douleur elle-même, la pathologie est silencieuse (pas de douleur perceptible par le foie qui n’a pas de nocicepteurs) . L’administration des agents précipitants de la défaillance hépatique comme les administrations massives d’alcool produisent les effets d’une ivresse importante (perte d’équilibre, ataxie). Ces effets sont invalidant (trouble de la mobilité, perte de repères, ou altération des interactions sociales). L’administration unique ou répétée des agents inflammatoires ont des effets notoires sur les animaux dans les heures qui suivent les inductions. On note une baisse d’activité, une diminution de la vigilance, des déperditions thermiques et une détresse respiratoire. Dans les phases aigues, des signes plus marqués peuvent apparaitre tels que des vocalises spontanées, des difficultés respiratoires (dyspnée), une incapacité à se retourner, une absence de réflexe pupillaire, une ptose palpébrale avec larmoiements et une pâleur prononcée. Ces troubles connus et déjà observés sont monitorés. Leur fréquence et intensité de leur apparition permet selon le cas de les apprécier au niveau de gravité modéré ou sévère.
Devenir
L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et poumons) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux
Remplacement
Les modèles développés et décrits dans ce projet tente de reproduire une cascade d’événements conduisant à la défaillance successive de plusieurs organes comme cela se produit chez le patient cirrhotique en phase de décompensation aigue. Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire la globalité ni la chronologie de la progression de la rupture multi organe. Les premières étapes du programme de recherche seront réalisées dans des tests in vitro pour évaluer les activités intéressantes sur des paramètres connus ayant un rôle dans l’évolution de la pathologie étudiée (par exemple l’inflammation, le stress oxydatif, ou la prolifération ou mort cellulaire etc )
Réduction
Le nombre d’animaux estimé pour chaque procédure tient en compte de l’hétérogénéité associée aux modèles d’induction de la défaillance hépatique. Cette estimation s’appuie sur nos expériences antérieures durant de nombreuses années des modèles murin et sur la connaissance de la variabilité des paramètres d’efficacité que nous mesurons. ( paramètres sanguins qui sont assez labiles) A l’aide de ces données, un calcul de puissance et la déduction par le calcul théorique des effectifs est possible. Le test de Welsh permet de définir cet effectif théorique permettant d’atteindre la significativité recherchée. Cette approche statistique permet d’affiner les plans d’expérience pour lesquelles une étude pilote préalable par exemple a permis d’approcher un résultat très proche de la significativité.
Raffinement
L’ACLF est une pathologie sévère, qui chez l’humain entraîne le décès à 28 jours de 20 à 70% des patients hospitalisés. Le modèle expérimental s’avère donc lui aussi sévère sur la phase finale de la procédure (administration de l’agent précipitant). Nous avons établi une liste de signes cliniques de manière à ne pas conserver des animaux ayant atteint ces points limites. La liste de ces points limites pourra être réajustée après les procédures de caractérisation des modèles et afin d’éviter toute souffrance non nécessaire à l’établissement des résultats. Les procédures se feront avec un hébergement adapté au bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, tunnel ou igloo et éléments de nidification). Au cours des procédures, nous appliquerons pendant les périodes qui suivent les prélèvements sanguins, un apport d’aliment gélifié enrichi qui favorise la récupération des animaux suite à l’anesthésie. Etant une pathologie multi-organe, l’étude de la maladie requiert l’utilisation d’animaux et ne peut être remplacée par des expérience in vitro
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie ou celles qui lui sont associées. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce souris a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. De jeunes adultes offrent une meilleure homogénéité et une meilleure réponse aux inductions de la pathologie, leur système immunitaire étant mâture. Nous utiliserons de jeunes adultes, à savoir 7 à 8 semaines (20-25g) pour les souris et 6 à 7 semaines (250 à 300 g) pour les rats à l'arrivée.