Souris

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le virus de la vaccine ou de la grippe par voie cutanée ou nasale sous anesthésie, puis reçoivent des injections et des prélèvements sanguins, pour étudier le rôle d'une protéine dans la mise en place des lymphocytes T mémoires de la peau et du poumon. Le porteur qualifie les atteintes de légères et affirme que ces infections ne génèrent pas de signes cliniques, les souris étant tuées pour prélever leurs organes. Il présente ce travail de recherche fondamentale comme visant à comprendre les mécanismes de défense, et juge l'étude in vivo "nécessaire" faute de pouvoir reproduire la réponse immunitaire in vitro.

Objectifs

Lors d’une infection virale, les lymphocytes T prolifèrent et acquièrent la capacité d' éliminer les cellules infectées. En parallèle, un petit nombre de lymphocytes T mémoires se développent, qui sont capables de réagir de manière plus rapide et plus efficace en cas de nouvelle rencontre avec le même virus. Il existe différentes sous-populations de lymphocytes T CD8 mémoires. L'une d'entres elles est capable de résider sur le long terme dans le tissu préalablement infecté. Il s'agit des Lymphocytes T mémoires résidents des tissus et ils représentent l'une des premières barrières de défense immune dans les tissus. Une protéine a été identifiée comme étant impliquée dans la mise en place de ces lymphocytes T résidents, dans la peau et le poumon, après infection virale. Ce projet vise à présent à étudier plus en détail le rôle de cette protéine, dans la mise en place d'un compartiment mémoire résident, dans la peau et le poumon. Pour cela, nous utiliserons des modèles murins d'infections virales (par le virus de la vaccine et le virus de la grippe), de la peau et du poumon.

Bénéfices attendus

Les lymphocytes T mémoires qui résident dans les tissus non lymphoïdes représentent la première ligne de défense contre des infections virales. Ce projet permettra de comprendre le rôle spécifique d'une protéine récemment identifiée, dans la mise en place de ce compartiment tissulaire et dans sa capacité à remplir ses fonctions de défense anti-virale.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal concerné – durée 30 secondes par narine - Infection cutanée (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal concerné – durée 2 mn ; - Injection Intraveineuse (sous brève anesthésie gazeuse) – 1 fois par animal – durée de l'anesthésie: 30 secondes; Injection intrapéritonéale pour anesthésie profonde: 1 fois par animal – durée de l'anesthésie: 30 mn; Prélèvements sanguins (sous anesthésie gazeuse)- 1 fois par animal – durée 30 secondes;

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont : i) une légère douleur générée par les injections intra-péritonéales; ii) une légère douleur générée par les injections intra-veineuses et une légère irritation à l'oeil; iii) le stress généré par l’anesthésie et/ou la procédure d’inoculation du virus par voie intranasale ; iv) une légère abrasion de la peau suite à l'infection par voie cutanée; ; v) une légère douleur et le stress généré par les prélèvements de sang. Les infections virales par voie cutanée ou intranasale sont des procédures bien établies dans la communauté scientifique et dont les conséquences ne génèrent pas de signes cliniques sur les animaux.

Devenir

Des prélèvements d'organes seront réalisés sur les animaux mis à mort, afin d'effectuer des analyses cellulaires et morphologiques sur les lymphocytes T.

Remplacement

Les mécanismes de défense d'un organisme face à une infection virale sont basés sur la capacité des cellules immunes à circuler dans l'organisme : ainsi, une infection au niveau de la peau ou du poumon déclenche une cascade d'évènements qui conduit notamment au recrutement de lymphocytes T circulants, qui acquièrent la capacité de pénétrer dans le tissu infecté. Une fois le virus éliminé, une partie de ces lymphocytes persistent dans le tissus réparé. Ainsi, la réponse immunitaire est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro. L’utilisation de modèles murins est donc nécessaire pour comprendre la complexité des mécanismes qui prennent place lors de la réponse immunitaires face à une infection

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris au maximum, nous utiliserons par exemple qu’un seul groupe control pour toutes nos approches expérimentales afin de réduire par 2 le nombre de ces animaux. Nous avons aussi calculé par des approches statistiques le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir interpréter les variations expérimentales que nous attendons et nous assurer que nos travaux seront interprétables et ne devrons pas être répétés inutilement sur des animaux complémentaires.

Raffinement

Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, l'ensemble des gestes techniques seront réalisés sous anesthésie profonde ou gazeuse. Concernant les anesthésiers profondes, les animaux seront placés sur un tapis chauffant durant toute la durée de l'anesthésie, pour limiter les risques d'hypothermie, et du gel oculaire sera appliqué sur les yeux des souris, afin d'éviter la sécheresse oculaire. De plus, nous maintiendrons les animaux en groupes sociaux au sein de chaque cagée (en moyenne 5 animaux par cagée). Enfin, nous assurerons une surveillance adaptée à chacune des procédures ou étape au sein d'une procédure, et des points limites définis pour chaque procédure ont été établis afin d'anticiper toutes souffrances et tout mal être des animaux. de plus, les animaux sur lesquels nous identifierions des signes de douleur seront immédiatement mis à mort pour éviter toute souffrance inutile

Choix des espèces

Le modèle souris a été choisi car il permet de réaliser des expériences dans des animaux génétiquement modifiés et d'étudier les conséquences d'un gène invalidé ou muté, sur la génération et la maintenance d'un compartiment mémoire dans le tissu cutané. Ce type d'expériences est nécessaire pour comprendre la mise en place d'une compartiment résident des tissus, au cours des réponses immunes. De plus, des souris adultes (entre 6 et 12 semaines) seront utilisées: le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant au moment de l’infection et certains animaux seront gardés jusque 45 jours après infection.

440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit un dispositif implanté dans l'abdomen par chirurgie, l'autre des injections locales, et toutes subissent l'application répétée de pommades irritantes provoquant psoriasis, eczéma ou dermatite, pour tester le potentiel thérapeutique de la cytokine IL-34. Le porteur décrit un épaississement de la peau accompagné de démangeaisons ou de douleur locale, et prévoit la mise à mort pour prélever peau et organes immunitaires. Il affirme que la structure et l'immunité de la peau rendent l'analyse in vivo "indispensable", les retombées pour des maladies humaines fréquentes restant annoncées à terme.

Objectifs

La cytokine IL-34, découverte en 2008, a été principalement décrite pour son implication dans la survie et la différenciation de certaines cellules immunitaires présentes dans le sang et les tissus. Plus récemment, il a également été montré qu’elle est impliquée dans la fonction de cellules régulatrices, aboutissant à une tolérance dans le contexte de la transplantation. Cette protéine a donc un grand potentiel thérapeutique dans la maitrise du rejet de greffe, mais également dans d’autres maladies autoimmunes ou inflammatoires. Celle-ci pourrait en effet offrir une alternative aux traitements donnés à ces patients pour limiter l'action du système immunitaire, dont les effets secondaires sont importants. En parallèle, il a été décrit que les cellules de Langerhans, cellules résidentes de la peau, sont dépendantes de la présence d’IL-34. Cela rend l’étude du rôle de l’IL-34 dans le compartiment cutané très intéressant, au niveau des cellules de Langerhans mais aussi d'autres cellules résidentes du derme. L’objectif principal est donc d’étudier le potentiel thérapeutique de l’IL-34 dans le traitement de pathologies inflammatoires de la peau comme le psoriasis ou l'eczéma par exemple.

Bénéfices attendus

Plusieurs bénéfices, à court et long terme sont attendus avec ce projet. Dans le cadre du projet, l’association des résultats obtenus in vitro et in vivo permettra l’amélioration des connaissances sur les mécanismes d’action de l’IL-34, et de l’impact sur les différentes cellules cibles présentes dans le derme et l’épiderme. Mais l’objectif est surtout la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques pour la molécule IL-34, ici dans des modèles de pathologies cutanées. Ces résultats permettront de proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques pour ces pathologies très fréquentes chez l’homme. De manière plus générale, la cytokine IL-34 pourrait avoir un potentiel thérapeutique dans plusieurs maladies autoimmunes ou inflammatoires. Celle-ci pourrait en effet offrir une alternative aux traitements immunosuppresseurs dont les effets secondaires sont importants chez les patients, et dont l’efficacité peut être insuffisante.

Procédures

Deux voies d’administration de la molécule thérapeutique seront comparées. 50% des animaux seront traités à l’aide de dispositifs implantables permettant une diffusion continue de la molécule thérapeutique. Le traitement via l’utilisation de ces dispositifs implique une seule chirurgie (environ 30 min) pour leur implantation au niveau de la cavité abdominale. Toutes les précautions sont prises pour limiter le stress, l’inconfort et la douleur induite par la chirurgie, avec une procédure réalisée sous anesthésie gazeuse, une analgésie pré- et post-opératoire, une prévention de l’hypothermie avec placement des animaux sur tapis chauffants, ainsi que la prévention de l’hypotension avec l’injection d’une solution saline. Les animaux sont suivis de manière journalière dans les jours suivant la chirurgie. 50% des animaux recevront le traitement sous forme d’injections locales au niveau des zones lésées de la peau, l’objectif étant d’évaluer l’efficacité locale et de limiter les potentiels effets secondaires. Ces injections seront également réalisées sous anesthésie afin de limiter le stress et garantir la sécurité des animaux, ainsi que la qualité de l’injection thérapeutique. Dans les différents protocoles, l’induction des pathologies se font par application cutanée de pommades ayant un effet irritant localement. Le protocole de psoriasis a une durée de 5 jours avec une application locale journalière. Le protocole de dermatite allergique de contact a une durée de 10 jours avec un total de 2 applications locales. Le protocole d’eczéma a une durée de 20 jours, avec un total de 12 applications locales. Toutes ces applications se feront sous anesthésie générale de courte durée afin de limiter la contention et le stress des animaux.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables modérés et de courte durée sont attendus dans les procédures décrites dans cette saisine. Ces effets sont décrits ci-dessous et seront tous pris en compte afin de limiter leur intensité et leur durée. En plus des soins pré- et post-opératoires ainsi que des traitements analgésiques prévus suite à la chirurgie, les animaux sont suivis de manière journalière dans les jours suivant la chirurgie, bien qu’aucune réduction de mobilité ou inconfort n’est attendue. La réalisation des injections au niveau de la peau ne doit pas être responsable de douleurs au niveau local, mais sera également réalisée sous anesthésie. Dans les différents modèles de pathologies cutanées décrits ici, l’induction des pathologies se font par application cutanée de pommades, ayant un effet irritant localement et spécifiques pour chaque modèle (psoriasis, dermatite allergique de contact, dermatite atopique/eczéma). Ces pommades sont appliquées de manière répétée sur une petite zone de la peau des animaux, soit au niveau d’une zone de l’abdomen, soit au niveau de l’oreille. Les effets attendus sont un épaississement de la peau de l’oreille, associé au non à des démangeaisons ou une douleur locale. Telles que décrits dans la littérature, les effets attendus sont légers avec peu d’impact sur le bien-être et le comportement des animaux traités. Une grille de suivi clinique et un suivi de poids seront réalisés afin de pouvoir repérer une éventuelle aggravation de l’état clinique des animaux.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Le but est d'obtenir le maximum d'informations sur les mécanismes d'actions et cellules cibles de la molécule thérapeutique, pour chaque animal traité, et en comparaison avec les animaux non traités. Un prélèvement de sang sera réalisé avant euthanasie afin d'analyser les cellules immunitaires et cytokines circulantes du sang. Des prélèvements d'organes seront réalisés en post-mortem afin d'analyser effets de la molécule thérapeutique sur les différents organes immunitaires (ganglions, rate) mais également au niveau de la peau traitée ou non traitée.

Remplacement

La majorité des résultats obtenus sont issus d'études sur la structure et la fonction de l’IL-34, réalisées in vitro sur cellules de souris et humaines, et ont permis de mettre en évidence les propriétés immunorégulatrices de l’IL-34. Malgré cela, ces résultats sont limités par l’absence de contexte physiologique et par la complexité du système immunitaire qui ne peut être mimé in vitro. L’utilisation de modèles pré-cliniques est donc nécessaire pour approfondir les mécanismes d’action et cibles thérapeutiques potentielles de l’IL-34, notamment dans les pathologies cutanées ayant une composante immunitaire. La peau possède une structure et une immunologie très spécifique, qui rend l’analyse in vivo indispensable.

Réduction

Un nombre total maximum de 440 animaux est prévu dans ce projet, dont la répartition est décrite ci-après. Le nombre d'animaux a été déterminé de façon à être interprétable statistiquement. Chaque protocole contient 4 groupes de 10 souris maximum, soit 40 souris par modèle. Quatre modèles seront développés, à savoir un modèle de psoriasis, un modèle de dermatite allergique de contact, avec deux agents différents, et un modèle d'eczéma (dermatite atopique). Pour chaque modèle, 2 voies d’administration seront comparées, une administration systémique par l’utilisation de dispositifs implantables permettant une diffusion continue, ou une administration via une injection locale au niveau de la zone lésée de la peau. De plus, l'efficacité du traitement en préventif et en curatif sera comparée. Pour chaque modèle, des expériences préliminaires seront d’abord effectuées sur un petit nombre d’animaux; si les effets observés ne sont pas suffisamment visibles in vivo lors de premiers tests (groupe de 3 à 4 souris par expérience), les expériences ne seront pas reproduites et la totalité des 10 souris ne sera donc pas utilisée. Dans le modèle de dermatite de contact par exemple, un seul agent sera testé en premier lieu, et si le modèle est satisfaisant, le deuxième agent ne sera pas testé. De la même manière, si une voie d’administration donne des résultats bien supérieurs à l’autre, une seule voie d’administration sera conservée afin de diminuer le nombre total d’animaux utilisés. Le traitement curatif (après apparition des premiers symptômes) ne sera testé qu'avec la voie d'administration choisie dans la première phase, et seulement si les résultats préliminaires sont encourageants en préventif.

Raffinement

Des mesures sont mises en place lors de la chirurgie d’implantation des dispositifs, avec une analgésie pré- et post-opératoire et une anesthésie générale. Les souris sont placées sur un tapis chauffant pendant la chirurgie jusqu’au réveil total. Elles recevront une injection de solution saline, un baume ophtalmique sera appliqué sur leurs yeux. Une analgésie locale sera également ajoutée au moment de la chirurgie. En post-opératoire, les animaux seront suivis quotidiennement pour vérifier l’absence de perte de poids et l’état général, avec suivi quotidien de la cicatrisation. Les injections locales cutanées ainsi que les prélèvements sanguins avant euthanasie seront également effectués sous anesthésie générale. Bien qu’une atteinte de l’état général ne soit pas attendue dans ces différents protocoles, un suivi journalier du poids et de l’apparition de signes cliniques (comportement/mouvement, aspect général, évaluation du poids) sera effectué. Un tableau de score a été mis en place, afin d’agir rapidement en cas de détérioration de l’état clinique, avec mise en place d’une analgésie si besoin, ou sortie du protocole avec euthanasie le cas échéant. Dans ce cas, les animaux concernés seront euthanasiés après anesthésie générale. Les animaux provenant d'élevages agréés sont acclimatés pendant au moins une semaine avant de débuter une procédure. Les souris sont hébergées dans des cages ouvertes par groupe de 5 animaux maximum, et ont des formes d’enrichissements à leur disposition (tube, block, frisottis) afin de réduire leur stress.

Choix des espèces

Les études fonctionnelles réalisées in vitro à partir de cellules humaines mettent en évidence les propriétés immunorégulatrices de l’IL-34 mais sont limitées par l’absence de contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire qui ne peut-être mimé in vitro. L’utilisation de modèles pré-cliniques est donc nécessaire pour valider ces résultats, pour approfondir les connaissances sur les cellules cibles et mécanismes d’action, et pour obtenir des informations sur le potentiel thérapeutique de l’IL-34. De plus, le compartiment cutané possède une structure et une immunologie très spécifiques, qui rend l’analyse in vivo indispensable. Plusieurs modèles de souris sont utilisés pour différentes pathologies cutanées, et les mécanismes immunitaires sont bien mis en évidence dans la littérature, ce qui permet à ce projet de s’appuyer sur des publications déjà existantes représentant de manière fiable les pathologies humaines. Les fonctions de l’IL-34 de souris sont également bien décrites et sont représentatives des effets observés sur cellules humaines. La souris est donc l’espère la plus pertinente pour faire la preuve de concept sur le potentiel thérapeutique de l’IL-34 dans des pathologies cutanées. Pour ce projet, les animaux utilisés seront des souris jeunes adultes de 10 à 12 semaines, afin d’éviter la phase de croissance et d’avoir un poids stabilisé au démarrage de l’expérimentation, permettant un meilleur suivi clinique, mais aussi un poids suffisant pour limiter le risque de complications chirurgicales liées à l’implantation des dispositifs au niveau de la cavité abdominale.

2 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'injection d'un virus dans le cerveau, la pose d'une fenêtre crânienne et un contrôle de leur consommation d'eau et de nourriture, pour étudier la mobilité de récepteurs synaptiques et son rôle dans la mémoire. Le porteur annonce comme bénéfice une meilleure compréhension du fonctionnement des synapses, sans application médicale précise. Il affirme que la souris est "l'espèce de choix" et qu'une approche in vivo est "nécessaire" pour observer le cerveau en fonctionnement.

Objectifs

Le but de ce projet est d’étudier le rôle de la mobilité et de la nano-organisation des récepteurs à glutamate hétérotétramère formé de quatre sous-unités dans la physiologie des synapses, les fonction cérébrales et le comportement. Dans ce but nous utiliserons des outils moléculaires et génétiques qui permettent d'induire l'immobilisation de récepteurs à glutamate contenant les sous-unités A2 ou A1 . Précédemment, nous avons démontré que la diffusion de surface de ces recepteurs est impliquée dans la régulation de la potentialisation synaptique à long terme et de la mémoire dépendante de l'hippocampe. Nous voulons étudier ce phénomène plus précisément et premièrement, examiner l'implication de la diffusion latérale des AMPAR dans différentes formes de plasticité synaptique comprenant non seulement la plasticité synaptique à long terme mais aussi la plasticité synaptique à court terme, dans différentes régions du cerveau. Deuxièmement, nous voulons également identifier d’autres acteurs moléculaires, répertoriés comme protéines auxiliaires de ces récepteurs, impliqués dans la régulation de leurs mobilités et pouvant modifier la plasticité synaptique. Troisièmement, nous voulons étudier les processus physiologiques qui agissent sur la mobilité de ces derniers pour réguler la plasticité synaptique. Enfin, nous voulons rechercher des paradigmes comportementaux qui sont régulés par la mobilité des recpetuerus à glutamate in vivo.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons découvrir le rôle et la régulation de la mobilité de surface des AMPAR dans la plasticité synaptique et la fonction cérébrale, ce qui contribuera à une meilleure compréhension de la manière dont la transmission synaptique est régulée dans le cerveau. Grâce à l'approche expérimentale conçue, nous voulons découvrir comment les effets de la mobilité de la surface des AMPAR sur la plasticité synaptique sont régulés dans le tissu cérébral intact et in vivo. De manière générale, cela nous permettra de mieux comprendre la fonction des synapses dans le cerveau.

Procédures

Procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 10 et 20 min - procédure chirurgicale avec implantation fenêtre crânienne : entre 1 et 2H- régime avec contrôle de la consommation hydrique et alimentaire.

Impact sur les animaux

Les procédures postopératoires et l'analgésie se feront sans douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte.

Devenir

Tous les animaux seront mises à mort à l'issue de chaque procédure

Remplacement

La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Le concept de l’importance de la mobilité des récepteurs dans les phénomènes de plasticité synaptique a été identifié par notre équipe avec des approches in vitro de culture de neurones de souris de type sauvage comme de neurones de nos lignées transgéniques. Pour vérifier ce concept dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement.

Réduction

La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique.

Raffinement

A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimenter a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du systéme nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de P0 semaines à 3 mois. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.

314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un vecteur viral sous anesthésie, cinq prélèvements de sang et cinq séries de tests comportementaux sur douze mois, pour évaluer une thérapie génique contre une maladie neuromusculaire mortelle chez l'humain. Ce dossier constitue le deuxième volet d'une série de trois autorisations pour le même programme. Le porteur mentionne des tests moteurs et sensoriels sans les nommer et juge la souris "essentielle" pour prouver l'efficacité de l'approche.

Objectifs

Ce projet concerne le développement d’une thérapie génique pouvant constituer un traitement curatif pour une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle, il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie génique consiste donc à compenser le gène défectueux en important une copie du gène fonctionnelle dans l’organisme grâce à un vecteur viral. Précédemment, nous avons développé un modèle animal (souris) qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. Notre premier objectif est d’optimiser les conditions de notre protocole (choix du meilleur promoteur, doses à utiliser) en analysant les effets sur le comportement et l’organisme de nos souris (prélèvements sanguins, analyses moléculaires). Ensuite, notre deuxième objectif est d’évaluer les bénéfices de ce protocole thérapie génique grâce à un essai pré-clinique dans notre modèle sur une durée de 12 mois. Nous évaluerons ces bénéfices en évaluant le comportement et l’effet sur l’organisme de ces souris.

Bénéfices attendus

La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices de notre thérapie génique chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique. De plus, lors des analyses sanguines, nous aimerions pouvoir mettre en évidences des marqueurs sanguins de cette maladie. Ces marqueurs pourraient être utilisés également dans le cadre du diagnostic d’autres maladies neurodégénératives.

Procédures

Les souris recevront le vecteur viral (durée : 5mn) sous anesthésie générale. Les souris auront 5 prélèvements sanguins (durée : 5mn). Les souris réaliseront 5 fois la série de tests comportementaux (5 tests comportementaux, durée : entre 30s et 15mn) entre 1 mois et 12 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique.

Impact sur les animaux

L’administration du vecteur viral, les prises de sang pourront induire un stress faible chez les animaux. Les tests comportementaux pourront induire un stress variable chez les animaux allant de faible à modérer. Aucun autre effet indésirable n’est attendu à l’issu de ces éléments.

Devenir

Ce projet compte 2 procédures. La première permettra de valider le protocole de thérapie génique sur les souris par des analyses comportementales et tissulaires, nécessitant leur mise à mort afin d’étudier le phénotype tissulaire (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses). La deuxième permettra d’évaluer les bénéfices de la thérapie au niveau comportemental et tissulaire nécessitant la mise à mort des souris (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses.

Remplacement

Le projet a pour but de valider un premier essai pré-clinique de thérapie génique pour une maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Les modèles in vitro (cellules immortelles et neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaire de cette approche. Elle nécessite à présenter être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyses nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet.

Raffinement

Le phénotype de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (12 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’administration du vecteur viral est réalisée sous anesthésie générale avec un réveil post-anesthésie dans une cage chauffée, du gel ophtalmique est appliqué post-injection et mise en place d’une analgésie si besoin. Les prises de sang sont effectuées sous anesthésie générale avec réveil post-anesthésie dans une cage chauffée et mise en place d’une analgésie si besoin. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voir 2 jours entiers est prévue afin de limiter au maximum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude réalisée sur notre modèle a montré qu’il reproduit pour la première fois les symptômes moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients, justifiant son utilisation valider notre approche de thérapie génique. Notre projet utilisera le stade juvénile (1 mois) et le stade adulte (2 à 12 mois). Notre modèle murin présente des défauts moteurs et sensoriels à partir de 3 mois ; il est donc nécessaire de débuter la stratégie à un stade précoce. La validation du protocole et l’évaluation des bénéfices au niveau comportemental et histologique doivent être évaluées au stade adulte pour évaluer les effets de la thérapie à moyen- et long-terme.

314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un vecteur viral sous anesthésie, cinq prélèvements de sang et cinq séries de tests comportementaux entre un et douze mois, pour évaluer une thérapie génique contre une maladie neuromusculaire mortelle chez l'humain. Le porteur mentionne des tests moteurs et sensoriels sans en préciser la nature. Il affirme qu'il est "essentiel" de prouver l'efficacité de l'approche chez la souris, présentée comme ayant "98 % d'identité protéique" avec l'humain.

Objectifs

Ce projet concerne le développement d’une thérapie génique pouvant constituer un traitement curatif pour une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle, il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie génique consiste donc à compenser le gène défectueux en important une copie du gène fonctionnelle dans l’organisme grâce à un vecteur viral. Précédemment, nous avons développé un modèle animal (souris) qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. Notre premier objectif est d’optimiser les conditions de notre protocole (choix du meilleur promoteur, doses à utiliser) en analysant les effets sur le comportement et l’organisme de nos souris (prélèvements sanguins, analyses moléculaires). Ensuite, notre deuxième objectif est d’évaluer les bénéfices de ce protocole thérapie génique grâce à un essai pré-clinique dans notre modèle sur une durée de 12 mois. Nous évaluerons ces bénéfices en évaluant le comportement et l’effet sur l’organisme de ces souris.

Bénéfices attendus

La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices de notre thérapie génique chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique. De plus, lors des analyses sanguines, nous aimerions pouvoir mettre en évidences des marqueurs sanguins de cette maladie. Ces marqueurs pourraient être utilisés également dans le cadre du diagnostic d’autres maladies neurodégénératives.

Procédures

Les souris recevront le vecteur viral (durée : 5mn) sous anesthésie générale. Les souris auront 5 prélèvements sanguins (durée : 5mn). Les souris réaliseront 5 fois la série de tests comportementaux (5 tests comportementaux, durée : entre 30s et 15mn) entre 1 mois et 12 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique.

Impact sur les animaux

L’administration du vecteur viral, les prises de sang pourront induire un stress faible chez les animaux. Les tests comportementaux pourront induire un stress variable chez les animaux allant de faible à modérer. Aucun autre effet indésirable n’est attendu à l’issu de ces éléments.

Devenir

Ce projet compte 2 procédures. La première permettra de valider le protocole de thérapie génique sur les souris par des analyses comportementales et tissulaires, nécessitant leur mise à mort afin d’étudier le phénotype tissulaire (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses). La deuxième permettra d’évaluer les bénéfices de la thérapie au niveau comportemental et tissulaire nécessitant la mise à mort des souris (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses.

Remplacement

Le projet a pour but de valider un premier essai pré-clinique de thérapie génique pour une maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Les modèles in vitro (cellules immortelles et neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaire de cette approche. Elle nécessite à présenter être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyses nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet.

Raffinement

Le phénotype de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (12 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’administration du vecteur viral est réalisée sous anesthésie générale avec un réveil post-anesthésie dans une cage chauffée, du gel ophtalmique est appliqué post-injection et mise en place d’une analgésie si besoin. Les prises de sang sont effectuées sous anesthésie générale avec réveil post-anesthésie dans une cage chauffée et mise en place d’une analgésie si besoin. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voir 2 jours entiers est prévue afin de limiter au maximum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude réalisée sur notre modèle a montré qu’il reproduit pour la première fois les symptômes moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients, justifiant son utilisation valider notre approche de thérapie génique. Notre projet utilisera le stade juvénile (1 mois) et le stade adulte (2 à 12 mois). Notre modèle murin présente des défauts moteurs et sensoriels à partir de 3 mois ; il est donc nécessaire de débuter la stratégie à un stade précoce. La validation du protocole et l’évaluation des bénéfices au niveau comportemental et histologique doivent être évaluées au stade adulte pour évaluer les effets de la thérapie à moyen- et long-terme.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du crâne avec pose d'un cathéter et ouverture de la boîte crânienne sous anesthésie pendant soixante-dix minutes, puis une IRM sous anesthésie, pour provoquer un accident vasculaire cérébral et étudier l'effet d'un thrombolytique sur l'inflammation. Le porteur n'annonce que de simples "pistes" thérapeutiques comme retombée. Sa rubrique de réduction avance deux nombres différents, 120 souris puis 60, sans lever la contradiction.

Objectifs

Cette étude vise à comprendre l'implication de l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) dans les processus inflammatoires qui surviennent lors d'un accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, et notamment sur l'infiltration des neutrophiles du compartiment vasculaire vers le tissu cérébral. Des études précédentes montrent que l'utilisation de rtPA (Actilyse) pour induire une reperfusion du tissu cérébral peut moduler en parralèle l'infiltration des neutrophiles dans le tissu cérébrale. La contribution du rtPA dans ces mécanismes inflammatoires reste à déterminer. L'objectif de notre projet est de comprendre les effets du rtPA sur l'inflammation cérébrale à la suite d'un AVC ischémique. Afin de représenter les différentes situations qui se produisent en clinique, nous étudierons les effets de la thrombolyse par rtPA sur deux modèles murins d'AVC ischémique : un modèle thromembolique où l'injection i.v. de rtPA permet la reperfusion du tissu cérébrale et un modèle thrombotique où l'injection de rtPA est inefficace sur la reperfusion. De plus nous allons étudier l'impact de la thrombolyse par le rtPA sur la réponse inflammatoire dans le contexte d'une thrombolyse précose et tardive afin de mimer les differents contextes possibles en clinique.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'apporter de nouvelles connaissances l'impact du rtPA sur l'inflammation cérébrale et ainsi nous permettra de proposer de nouvelles pistes pour de potentielles stratégies thérapeutiques en combinaison de la thrombolyse par rtPA.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie permettant une pose de cathéter caudal et l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 70 minutes par animal. Les animaux seront également soumis à des acquisitions par imagerie par résonnance magnétique (IRM) à 24h après l’induction de l’AVC, sous anesthésie générale pour une durée totale de 34 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Afin de limiter toutes douleur occasionnée par la chirurgie, nous utiliserons un analgesique lors du protocol chirurgical. Lors de projets précédents utilisant des procédures identiques ou similaires, nous n’avons pas observés de signe de douleur ni souffrance des animaux à la suite de la chirurgie. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de souffrance sont le suivi strict et rapproché des animaux, l’hébergement en petits groupes sociaux stables (n = 5) avec un enrichissement minimum (un rouleau cartonné + une feuille de papier essuie-tout), et la manipulation uniquement par des personnels expérimentés. Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, dans un environnement stabilisé en température (21°), hygrométrie (55%), luminosité (100 lux), et durée du cycle de lumière (12h/12h).

Devenir

Tous les animaux utilisés au cours de ce projet (120 animaux) seront mis à mort. Les tissus récupérés seront necessaires pour les futures analyses immunohistochimiques et en biologie moléculaire.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 120 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrale et l’inflammation cérébrale permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux total : 60) a été évalué via un test d’analyse de puissance (α=0.05 ; β=0.8).

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce de référence comme d’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la thrombolyse, la neuroprotection et la réponse inflammatoire suite à un AVC ischémique. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour notre étude.