Souris

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection dans le sinus veineux situé derrière l'œil sous anesthésie, puis subit jusqu'à neuf prélèvements de sang par la joue sur deux à trois semaines, pour comparer des anticorps produits à partir de microalgues à des anticorps classiques. Le porteur présente l'enjeu comme économique, réduire le coût de production des anticorps, et annonce le bénéfice pour les patients à terme. Il affirme qu'après vérification in vitro il était "nécessaire" d'étudier ces anticorps dans un organisme au système immunitaire mature.

Objectifs

L’industrie pharmaceutique mise de plus en plus sur les anticorps thérapeutiques pour satisfaire les besoins de santé, encore nombreux. Cependant, l’industrie française a pris du retard dans ce domaine. Malgré une consommation importante de médicaments par la population française, seuls trois anticorps thérapeutiques sont produits en France (omalizumab, canakinumab, sécukinumab). Avec la prévalence croissante des maladies chroniques comme les cancers, les maladies autoimmunes et infectieuses telles que la COVID-19, le besoin en médicaments de type anticorps s’accroit considérablement. Ces médicaments sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Le coût de production de ces anticorps est très élevé. En conséquence, il devient indispensable de développer des systèmes alternatifs de production d’anticorps qui permettent de décroître leurs coûts de production et ainsi de les rendre plus accessibles. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels dirigés contre des virus comme le virus de l’Hépatite B ou le virus de Marburg. Nous produisons actuellement des bio-similaires d’anticorps anti-cancéreux. L'objectif du projet est donc de comparer la pharmacocinétique de ces anticorps produits à partir de microalgues par rapport aux anticorps génériques.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude, si ils valident le système alternatif de production d'Ac à partir de microalgues va permettre de diminuer considérablement leur coût de production et ainsi les rendre plus accessibles.

Procédures

Chaque souris recevra à J0 une injection intraveineuse unique via le sinus rétro-orbitale de 5 mg/kg d’anticorps dans un volume total de 200µl de PBS. Cette injection sera pratiquée sous anesthésie générale. Chaque souris aura des prélèvements sanguins, un total de 9 sur 2 à 3 semaines. Prélèvements de sang via les veines submandibulaires. L’ensemble des prélèvements sera effectué sous anesthésie générale à l’isoflurane 2.5% après une induction à l’isoflurane 5% dans l’air. Le volume de chaque prélèvement sera de 50µl récupéré dans des capillaires calibrés. Après chaque ponction une pommade antiseptique cicatrisante sera appliquée (Biseptine Cica gel).

Impact sur les animaux

Les gestes expérimentaux sur les animaux se limitent à une injection intraveineuse et des prélèvements sanguins qui ne devraient pas induire de nuisances ou effets indésirables particuliers compte tenu des mesures préventives prises et des précautions apportées à leur mise en oeuvre.

Devenir

Tous les animaux de l'étude seront mis à mort.

Remplacement

Les anticorps sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels, malgré une structure protéique identique certaines modifications post-traductionnelles peuvent intervenir et par conséquent modifier l'affinité des parties constantes pour les différents récepteurs aux FcGamma ou son immunogénicité. Après vérification in-vitro de ces différentes interactions anticorps récepteurs il était nécessaire d’étudier leur comportement dans un organisme vivant avec un système immunitaire mature et fonctionnel.

Réduction

Au-delà de l’utilisation du nombre minimum d’animaux pour obtenir une modélisation correcte de la pharmacocinétique de chaque anticorps, cette étude à terme permettra de remplacer les milieux de culture riches en sérum de veaux foetal par de l’eau de mer pour la production de ces anticorps. Le problème éthique majeur du sérum de veau foetal vient du fait qu’il provient du sang de foetus de vache, prélevé au moment de l'abattage de vaches gestantes. Le foetus est retiré du ventre de sa mère, et la totalité de son sang est prélevé par ponction cardiaque, le plus souvent sans anesthésie afin de garantir la qualité de l’échantillon. Ce nouveau mode de production permettra donc à court et à long terme moins d’utilisation de sérum de veaux foetal et donc d’animaux donneurs.

Raffinement

L’injection intraveineuse ainsi que les différents prélèvements seront pratiqués sous anesthésie générale à l’isoflurane. Afin de limiter le nombre de prélèvement sur chaque souris tout en garantissant un suivi sérologique optimal pour l’étude pharmacocinétique, les 16 souris seront divisées en 4 groupe de 4. De cette façon le nombre de prélèvements par individu sera divisé par 4, de plus les prélèvements seront alternés coté droit et gauche de la mandibule. L’innocuité de ces anticorps devant être totale, des points limites extrêmement précoces basés sur le mouse grimace scale et le poids seront appliqués :

Choix des espèces

La souris est un très bon modèle qui permet d'évaluer après modélisation le profil pharmacocinétique d'un anticorps monoclonal. La demi vie d'un anticorps et sa bio distribution au sein des différents tissus d'un organisme vivant sont dûs à un récepteur aux Fc des immunoglobulines G, le FcRn. Chez la souris il est totalement fonctionnel pour les IgG humaines ce qui permet d'évaluer la demi vie et la courbe de distribution par dosage cinétique des concentrations résiduelles dans le sang (volume périphérique) d'un anticorps choisi. Ces anticorps sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels, malgré une structure protéique identique certaines modifications post-traductionnelles peuvent intervenir et par conséquent modifier l'affinité des parties constantes pour les différents récepteurs aux FcGamma. Cette étude chez la souris permettra donc d'évaluer ces modifications potentielles. Les souris seront utilisées à l’âge de 7 semaines pour que leur système immunitaire soit mature. Elles arriveront dans notre animalerie à l’âge de 6 semaines et seront acclimatées pendant 7 jours période nécessaire au développement d'un microbiote dépendant de notre animalerie.

6 098 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, des injections dans le ventre, des médicaments par gavage et des prélèvements de sang, pour tester huit inhibiteurs de la protéine eIF4A censés lever la résistance des mélanomes et cancers du poumon aux thérapies ciblées. Le porteur situe l'essai clinique et le bénéfice pour les patients dans un temps ultérieur, l'objectif immédiat restant de mesurer l'effet des composés sur la tumeur. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'est assez robuste et que le recours à un modèle animal "comparable au corps humain" est "indispensable".

Objectifs

Le mélanome est la première cause de décès par cancer des jeunes adultes. Les thérapies ciblées actuelles augmentent la durée de vie des patients porteurs d’une mutation sur le gène BRAF mais n’empêchent pas l’apparition d’un phénomène de résistance au traitement dans la grande majorité des cas. Nos récentes études ont montré que l’inhibition de la protéine eIF4A impliquée dans la traduction de l’ARN en protéine entraine une levée de cette résistance in-vitro. Ces découvertes encourageantes ont initié l’étude de l’utilisation d’inhibiteurs de la protéine eIF4A en combinaison avec les thérapies ciblées usuelles. Actuellement plusieurs dizaines de candidats sont en cours de caractérisation in-vitro afin de sélectionner les 8 inhibiteurs les plus prometteurs qu’il est indispensable de tester in vivo. L’objectif de ce projet est de démontrer l'efficacité in vivo de 8 inhibiteurs eIF4A, dans différents modèles de mélanome et de cancer du poumon qui est également très répandu. Ces modèles ont été choisis parce qu’ils modélisent plusieurs types de thérapies ciblées usuellement utilisées en cancérologie et qu’ils présentent différents degrés de sensibilité à celles-ci nous permettant ainsi de mimer différentes situations cliniques. Les souris recevront une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses, permettant d’obtenir un modèle rapide et reproductible, avec une mesure de la croissance tumorale directe et des métastases rares.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle aucun inhibiteur eIF4A n’a reçu d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) pour le traitement des mélanomes et du cancer du poumon. Cela serait une avancée considérable dans la prise en charge des patients avec le recul du risque de rechute qui est malheureusement prévisible dans la plus grande majorité des cas. Les expériences in-vitro réalisées sur ces inhibiteurs présentent des conclusions très prometteuses lors de la combinaison avec une thérapie ciblée sur le phénomène de résistance. L’objectif par la suite sera de mettre en place un essai clinique dès qu’un inhibiteur eIF4A aura fait ses preuves dans le modèle animal afin de permettre aux patients d’en bénéficier dès que possible.

Procédures

Greffes de tumeurs en sous-cutanée sous anesthésie générale (durée 15 minutes). Injections en intrapéritonéale (durée 10 minutes). Administration de médicaments par gavage (durée 1 minute). Prélèvements de sang sous anesthésie générale, durée 2 minutes.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à la présence de tumeurs unique sur le flanc en sous-cutanée.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements post-mortems d'organes et de tissus aux fins d'analyses.

Remplacement

Il n'existe, à ce jour, pas de modèle in vitro modélisant suffisamment robuste pour tester ces synergies ni les interactions entre tumeur et système immunitaire. La variété et la complexité des cancers, ainsi que leur incidence élevée, rendent l’utilisation de modèles animaux cruciale pour comprendre comment le cancer se développe et pour améliorer les stratégies préventives, de diagnostiques et thérapeutiques. L'utilisation de modèles animaux comparables par de nombreux aspects au corps humain est donc indispensable pour l'évaluation des nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Des études préliminaires sur cultures cellulaires ont permis d’affiner les tests d’optimisation et de cibler les analyses à effectuer et ainsi réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats statistiques significatifs. Ainsi, le nombre d’animaux a été défini pour utiliser l’effectif minimal d’animaux possible. Des études antérieures conduites dans les mêmes modèles d'étude et avec des cibles thérapeutiques différentes ont montré que 10 animaux par groupe sont nécessaires et suffisants pour obtenir des effets significatifs sur la croissance tumorale par rapport à des souris contrôle non traitées (procédures 3 et 4). De plus, les résultats de la procédure 3 nous permettront de réduire le nombre d'inhibiteurs à tester aux 5 les plus efficaces dans les modèles immunodéficients. La procédure 1 étant une étape préliminaire pour vérifier l’absence de toxicité in vivo, 3 animaux par groupe seront suffisants. La procédure 2 étant une étape d’optimisation, elle nécessitera également un nombre réduit de souris à savoir 3 animaux par groupe pour déterminer la dose et l’intervalle optimaux. Le nombre d'animaux indiqué est un nombre maximal qui pourra être réduit si le nombre de composés à tester diminue pour des raisons de toxicité ou autre raison.

Raffinement

Les animaux seront surveillés tous les jours lors des procédures qui sont raffinées par l’établissement de points limites précoces, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. De plus, des médications appropriées (anesthésiques et analgésiques) seront utilisées lors des greffes pour réduire la douleur et le stress de l’animal. La présence de souffrance sera recherchée en utilisant les critères habituels (état général, sous-alimentation, état du pelage, prostration). Les souris seront également surveillées quotidiennement afin de déceler le plus rapidement possible l’apparition de points limites précoces. Trois fois par semaine, les animaux seront pesés et les tumeurs mesurées.

Choix des espèces

Le génome de la souris a été séquencé et de nombreux outils ont été développés pour étudier ce modèle. De plus, on observe une croissance tumorale rapide chez ce modèle et son poids permet d’utiliser des doses de produits moins importantes. La souris est donc le modèle de choix pour l'étude des cancers. Le projet nécessite des souris adultes (5-8 semaines) sans plus de contraintes sur l’âge. Ceci se justifie par l’âge de la population humaine touchée par le mélanome et le cancer du poumon et ciblée par les éventuels traitements.

980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un régime gras et sucré, une chirurgie du cerveau sous anesthésie, des injections sous-cutanées, dans le ventre et directement dans le cerveau, des prélèvements sanguins sur animal éveillé et des jeûnes de 6 à 16 heures, pour étudier le rôle d'un récepteur dans la régulation du poids. Le porteur renvoie au long terme les retombées annoncées, de nouveaux traitements contre l'obésité et le diabète. Il affirme qu'il est "nécessaire" d'étudier un "organisme vivant intègre" que ni les cultures cellulaires ni aucun modèle informatique ne pourraient remplacer.

Objectifs

Le système endocannabinoïde représente une cible thérapeutique potentielle pour combattre l’obésité et le diabète de par sa capacité à réguler la balance énergétique et le métabolisme glucidique. Le récepteur aux cannabinoïdes CB1, qui fait partie de ce système, est présent dans plusieurs organes impliqués dans le métabolisme énergétique et glucidique. Il est notamment présent dans certains neurones du cerveau et dans certaines cellules pancréatiques. Ce récepteur a différentes localisations subcellulaires (à la surface ou à l'intérieur de la cellule). Ces cellules sont aussi très sensibles aux changements d’alimentation et participent activement à la régulation du métabolisme pour maintenir à terme un poids et une glycémie stable. Une étude récente suggère un rôle d'un sous-type de récepteur CB1 dans la modulation de la fonction des neurones et des cellules pancréatiques. Notre objectif général est de comprendre le rôle de ce récepteur CB1 dans la balance énergétique et le métabolisme glucidique. Nous combinerons des approches pharmacologiques, comportementales, métaboliques, moléculaires et neuro-anatomiques.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir des informations sur comment l'organisme répond à la surcharge calorique, ainsi que de trouver de potentielles cibles thérapeutiques. Les bénéfices attendus à long-terme sont de permettre l'élaboration de nouveaux traitements pour l’obésité et le diabète.

Procédures

- Changement de régime alimentaire : le nouveau régime est plus gras et plus sucré. Il est palatable pour les animaux mais induit une obésité à long-terme. La consommation de ce régime durera entre une et 12 semaines. - Tests métaboliques avec prélèvements sanguins sur animaux vigiles : le suivi de la glycémie implique que les animaux soient non anesthésiés. - Chirurgie stéréotaxique (= cérébrale) et vasculaire, sous anesthésie générale, avec protocole d'analgésie post-chirurgicale. - Injections sous-cutanées, intra-péritonéales et intra-cérébro-ventriculaires : cela nécessite de prendre les animaux en contention pendant quelques secondes. - Jeune de 6h ou 16h

Impact sur les animaux

1. Stress induit par l’isolement en cage individuelle : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la prise alimentaire individuelle est nécessaire. 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce test nécessite de placer l’animal dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras HFD. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeun (6h ou 16h). La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10 à 15% du poids mesuré le jour précédent. 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. La peau du scalp et le périoste devant être incisés, une douleur post-opératoire est attendue. La perte de poids ne devrait pas durer plus de 3 jours (basée sur nos études antérieures).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour faire des analyses moléculaires.

Remplacement

Le but de notre activité de recherche est de comprendre les bases biologiques de la régulation de la balance énergétique et les mécanismes physiopathologiques menant à l’obésité. Lors d’un déséquilibre énergétique, plusieurs structures cérébrales entrent en jeu et communiquent, non seulement entre elles, mais aussi avec les organes périphériques. Il est donc nécessaire d’étudier un organisme vivant intègre, qui ne peut être remplacé par des techniques in vitro. Toutefois, nous réaliserons des tests pharmacologiques in vitro sur îlots pancréatiques en culture, ce qui limitera le nombre d’animaux. Cependant, le niveau de complexité dans une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que de nombreux mécanismes biologiques contrôlant la balance énergétique restent inconnus. Enfin, les modèles génétiques dont nous avons besoin pour tester notre hypothèse sont largement développés chez la souris.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement (le calcul est détaillé en 3.4.10). Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil à résonnance magnétique nucléaire, qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec l’aide d’un test t de Student (2 groupes) ou par analyse de variance (ANOVA) à 2 facteurs, suivie si nécessaire d’un test post-hoc de Tukey (plus de 2 groupes). Dans le cas des mesures répétées (évaluation de la prise alimentaire, du poids corporel dans le temps), des ANOVAs à mesures répétées suivies des tests post-hoc adéquats seront utilisés

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 ou 7 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, un tunnel en carton pour se cacher et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

Le comportement alimentaire, la balance énergétique et les métabolismes glucidique et lipidique sont depuis longtemps évalués chez la souris, qui représente donc une espèce adéquate pour ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités sont développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité du génome murin et humain fait de la souris un bon modèle prédictif lors d’études d’inactivation de gènes. Toutes les souris arriveront dans notre animalerie expérimentale à l’âge de 3 semaines. Les procédures expérimentales débuteront après au minimum 1 semaine d’habituation. Etant donné l’impact significatif de l’âge sur le métabolisme énergétique et glucidique, ces expériences seront réalisées sur des souris jeunes (4 semaines) ou plus âgées (24 semaines).

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une fibrose et des tumeurs du foie par injections répétées de deux produits chimiques, le DEN dès l'âge de quinze jours et le tétrachlorure de carbone deux fois par semaine pendant dix-huit semaines, avant d'administrer des inhibiteurs de l'inflammation seuls ou combinés à un anticancéreux. Le porteur affirme que l'évolution du cancer reste silencieuse et sans effet indésirable notable pour les souris, et qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer cette étude jugée trop complexe. Toutes les souris sont tuées pour prélever le sang et le foie.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique de molécules dans le cancer du foie. Pour cela, nous induirons chez la souris une fibrose et des tumeurs dans le foie pour reproduire la maladie humaine en leur administrant deux produits chimiques, le N-nitrosodiéthylamine (DEN, administré aux souris âgées de 15 jours), et le tétrachlorure de carbone (CCl4, administré aux souris 2 fois par semaine à partir de l’âge de 8 semaines pendant 18 semaines). A partir de la semaine 15 et pendant 4 semaines, les souris seront traitées avec deux molécules capables de soit diminuer les effets (antagoniste IL-1b) ou la production (un inhibiteur de l'inflammasomme NLRP3) d’une molécule de l’inflammation (IL-1b) pour étudier si elles sont capables de réduire le cancer du foie. Ces molécules ont donné des résultats prometteurs dans des modèles cellulaires au laboratoire. Elles seront administrées seule ou en combinaison avec le Sorafenib qui est médicament administré chez les patients atteints de cancer du foie à un stade tardif.

Bénéfices attendus

Les études proposées dans ce projet permettront de déterminer si des molécules permettant de diminuer les effets ou la production d’une molécule de l’inflammation (IL-1b) ont la capacité de réduire la progression du cancer du foie.

Procédures

Les souris seront soumises à : une injection d’un génotoxique ou son diluant en injection intrapéritonéale 15 jours après la naissance pour induire le développement de tumeurs ; deux injections par semaine d’une molécule favorisant le développement de la fibrose hépatique ou son diluant en injection intrapéritonéale à partir de l'âge de 8 semaines pour une durée de 18 semaines ; une administration de molécules ciblant une voie de l’inflammation ou leurs diluants en injection intrapéritonéale 2 fois par semaine les 4 dernières semaines (elles seront combinés pour réduire la fréquence des injections) ; une administration d’un traitement antitumoral ou son diluant en injection intrapéritonéale cinq fois par semaine. Les injections intrapéritonéales ont une durée de 15 secondes par souris. Au moment du sacrifice, il sera réalisé un prélèvement de sang à la veine cave inférieure.

Impact sur les animaux

Ce modèle favorise le développement de tumeurs hépatiques (induites par le DEN) sur un foie avec une fibrose (induite par le CCl4) ce qui permet de se rapprocher de la physiopathologie du carcinome hépatocellulaire chez l’homme car la cirrhose représente un stade de la maladie qui précède l'apparition d'un cancer du foie. A ce stade, l'évolution du cancer est silencieuse (comme chez l'homme), les souris n'ont pas d'effets indésirables notables.

Devenir

Les animaix seront euthanasiés à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie.

Remplacement

Les méthodes alternatives consisteraient à réaliser des études in vitro. Cependant, celles-ci ne permettraient pas de répondre à la question posée. En effet, ce projet vise à étudier l'effet de deux molécules pharmacologiques ciblant la réponse inflammatoire seul ou en combinaison avec une molécule pharmacologique ciblant les cellules tumorales. Les effets des molécules ciblant la réponse inflammatoire vont avoir des répercussions sur de nombreux types cellulaires immunitaires et tumorales. Il n’est donc pas possible de trouver un modèle in vitro permettant de remplacer une telle étude dans laquelle la réponse physiopathologique étudiée est très complexe car elle met en jeu plusieurs types cellulaires (cellules tumorales et plusieurs types de cellules immunitaires). Nous avons recours à des animaux car il n’y a pas de méthodes alternatives.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats.

Raffinement

Nous effectuerons un suivi quotidien des souris tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait son euthanasie anticipée. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en présence de papier kraft et de carrées de coton pour faire le nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose.

Choix des espèces

La souris est le modèle couramment utilisé pour étudier les effets de molécules pharmacologiques dans la progression du carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, ce modèle permettant le développement de tumeurs hépatiques sur un foie avec une fibrose, et qui permet de se rapprocher de la physiopathologie du carcinome hépatocellulaire chez l’homme a été développé en 2014 chez la souris et est bien caractérisé dans cette espèce (Uehara T et al.Curr Protoc Pharmacol 2014). Le N-nitrosodiéthylamine (DEN) est un produit chimique qui induit des cancers du foie s’il est administré chez le souriceau de 15 jours car à ce stade les cellules hépatiques sont en forte prolifération ce qui rend plus facile l’induction d’un cancer du foie.

245 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisées ensuite ou tuées puis conservées pour des dissections d'enseignement. Déjà issues d'expérimentations classées "légères", elles sont manipulées par des étudiants qui les saisissent, les pèsent, les contiennent et leur injectent de l'eau physiologique, puis en deuxième année de l'éthanol jusqu'à 1,8 g/kg pour observer un effet comportemental. Le porteur revendique la "nécessité" d'une première expérience pratique sur animal vigile, non remplaçable selon lui par de la simulation, pour des étudiants qui se destinent à l'expérimentation animale. Il indique qu'aucun animal n'est commandé pour ce projet et que des données d'archives peuvent suppléer un effectif réduit.

Objectifs

Ce projet se justifie par la nécessité pour les étudiants engagés en formation à l'IUT (Institut Universitaire de Technologie) d'avoir une première expérience pratique avec des modèles animaux habituellement utilisés à des fins scientifiques. Ces étudiants se destinant à des métiers de type technicien voire d'ingénieur de laboratoire, un nombre significatif d'entre eux sera concerné par l'expérimentation animale. Bien que leur formation contienne des enseignements théoriques sur les réglementations, l'intérêt et les contraintes des protocoles animaux, il est nécessaire de leur proposer après ces premiers enseignements théoriques, une première approche concrète pratique avec des animaux vigiles comme les rongeurs (souris et/ou rats) qui sont très fréquemment utilisés en biologie-médecine. Parmi tous les étudiants inscrits notamment en 1ère année (6 groupes de TP de 14 étudiants au maximum), seuls ceux qui choisissent le parcours Biologie Médicale et Biotechnologie (BMB, soit 4 groupes de TP de 14 étudiants maximum) seront concernés par ce projet. Les autres étudiants de la même promotion suivent un parcours "Diététique". L'objectif principal de ce projet est de proposer la réalisation de protocoles simples de préhension, pesée, contention courte, injection intrapéritonéale, tests comportementaux d'observation, prise de données, en binômes sous accompagnement/surveillance d'un enseignant titulaire du Diplôme Universitaire d'expérimentation niveau concepteur. Afin de respecter au mieux l'éthique animale, il est proposé de n'utiliser dans le projet que des animaux souris ou rats provenant de précédentes expérimentations classées "légères", et de n'utiliser qu'un nombre limité d'animaux. D'ailleurs, les nombres qui sont indiqués dans ce projet sont des nombres "idéaux et maximums" calculés avec le nombre d'étudiants théoriques par groupe. Mais puisque nous considérons des animaux de réutilisation, nous prévoyons de réaliser les séances d'enseignement même avec un nombre réduit d'animaux. Dans ce cas uniquement des démonstrations avec les quelques animaux disponibles seront réalisés et des données chiffrées d'archives serviront aux étudiants. Aucun animal ne sera commandé de façon spécifique pour ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet expérimental constitue un apprentissage par la pratique pour les étudiants de leurs cours théoriques en matière d'expérimentation animale utilisés à des fins scientifiques. Il leur permettra aussi un premier contact avec des rongeurs fréquemment utilisés dans les laboratoires de recherche dans lesquels les étudiants diplômés pourront postuler. De plus, ce projet propose une continuité scientifique avec théorisation de l'expérimentation en amont (hypothèse de travail), manipulation des animaux, prise de données expérimentales par rapport à une hypothèse de travail, traitement des données recueillies, analyse statistique (non rigoureuse vu la diversité des animaux, mais "à titre d'exemple") et conclusion par rapport à l'hypothèse initiale. De cette façon, les étudiants ainsi initiés via ce projet seront opérationnels plus rapidement dans les postes adéquats et cela permettra de sécuriser leur utilisation future d’animaux au cours de leur futurs postes professionnels.

Procédures

Lors de la procédure proposé en 1ème année, les animaux seront manipulés selon deux phases. La première dure environ 5 minutes (souvent moins) pour la préhension (contrôlé par un titulaire du DU niveau 1), la pesée sur balance électronique, puis la contension et injection d'eau physiologique. La deuxième phase dure également 5 minutes lorsque chaque animal est déposé dans le disositif et est laissé libre de ses mouvements (observation comportementale). Entre les deux phases, les animaux sont remis dans leur boîte d'élevage, et après la deuxième procédure, ils y retournent pour être surveillés (points limites). Lors de la procédure proposé en 2ème année, les mêmes types et phases de maniulations qu'en 1ère années seront réalisées et avec les mêmes temps. Cette fois ci, l'injection sera de l'éthanol dilué dans le l'eau physiologique, et une dose modérée sera choisie selon la littérature scientifique (au maximum 1,8g/kg). Ceci pour (1) tout de même générer un effet comportemental notable mais ne pas générer trop d'inconfort aux animaux (trop grande ébriété ou effet toxique par exemple) et permettre une élimination relativement rapide (2 à 3 heures).

Impact sur les animaux

Très peu d'effets sont attendus car ce projet se veut minimaliste en terme de manipulation sur les animaux. Les seuls effets qui pourraient être notables sont une élévation du stress des animaux manipulés par les étudiants et l'inconfort ponctuel au moment de l'injection intra-péritonéale. Cependant, les moments de manipulation seront brefs (quelques dizaines de secondes à chaque fois, voire une à deux minutes au maximum). Lors de la procédure proposée en 2ème année avec injection d'éthanol, une dose modérée sera choisie selon la littérature scientifique et au maximum 1,8g/kg. Ceci pour (1) tout de même générer un effet comportemental notable mais ne pas générer trop d'inconfort aux animaux (trop grande ébriété ou effet hépatotoxique par exemple) et permettre une élimination relativement rapide (2 à 3 heures).

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront soit proposés pour une réutilisation dans un autre projet, soit mis à mort pour fin de projet et cryo-conservés pour être utilisés en enseignement de physiologie (dissection)

Remplacement

Le programme national du BUT exige un enseignement pratique minimal portant sur la manipulation concrète d'animaux vigiles, qu’il n'est donc pas possible de remplacer par de la simulation pour l’apprentissage, par les étudiants ayant un projet professionnel orienté vers recherche biomédicale, des gestes techniques de base sur les animaux. A noter tout de même que dans le même module d'enseignement que le présent projet, les étudiants auront vu précédemment toutes les notions théoriques correspondant à l'expérimentation animale parmi lesquels la présentation de la réglementation, initiation à la genèse de projets scientifiques, le traitement de données expérimentales, etc...

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux, ce projet réutilisera des animaux issus de précédentes expérimentations légères réalisées dans les animaleries fournisseurs du site universitaire, et disponibles au moment des créneaux d'enseignement. De plus, les créneaux d’enseignement seront planifiés pour permettre, selon l'effectif d'étudiants (56 en 1ère année et en 2ème année) de n'utiliser que 49 animaux au maximum par année d'enseignement, car seules des manipulations légères étant prévues, les mêmes animaux pourront être réutilisés 3 à 4 fois dans la même semaine d'enseignement.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les animaleries partenaires selon les conditions standards au sein d'animaleries conventionnées. Un enrichissement avec des buchettes, maisonnettes cartonnées ou papier absorbant sera proposé aux animaux et une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée. Leur transport sur le site d’enseignement (sur une centaine de mètres) sera assuré en sacs isothermes et charriot dédié. Les animaux seront maintenus dans leur cage d'élevage tout au long de leur prise en charge (une semaine maximum, correspondant à un TP par rpomotion d'étudiants). Pendant les procédures mais également après celles-ci, les points limites seront surveillés. Les signes principaux seront, les changements brusques de comportement, les vocalises, l'accélération exagérée du rythme respiratoire, le freezing éventuel qui correspond à une raideur immobilisatrice brutale en réponse à un stress aigu. Le poids des animaux étant un paramètre mesuré par les étudiants, il servira également de référence pendant la semaine de TP; une perte de poids de 10% sur 3 jours sera considérée comme limite.

Choix des espèces

Souris ou rats sont les espèces les plus utilisées en biologie/médecine dans les projets scientifiques et la plupart des étudiants concernés ici seront amenés à postuler pour participer à ce type de projets (stage, métiers) animaux adultes mâles ou femelles âgés de 2 à 12 mois selon les disponibilités en animalerie partenaire.

768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucune ne restant vivante à la fin. Génétiquement modifiées, elles subissent un prélèvement de queue au sevrage, une injection déclenchant un lupus, puis des prélèvements sanguins mensuels, la maladie provoquant une inflammation pulmonaire, une perte de poids, une alopécie et des atteintes articulaires handicapantes. Le porteur indique que 90 animaux sont d'abord utilisés comme reproducteurs pendant un an avant d'être tués, les autres étant tués en fin de procédure pour prélever poumons, rate et reins. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un "organisme entier", ce qui justifierait selon lui le recours aux souris.

Objectifs

Le lupus systémique est le prototype de la maladie auto-immune non spécifique d’organes. Elle est parmi les plus fréquentes des maladies rares avec une prévalence variant en fonction des pays entre 15 à 50 cas pour 100000 habitants. Les manifestations cliniques sont nombreuses incluant fréquemment des atteintes cutanées, articulaires, hématologiques ou rénales. De plus, bien que souvent sous-évaluées, les manifestations pulmonaires sont retrouvées dans 30 à 50% des cas suivant les études. Certaines formes de ces atteintes pulmonaires comme l’hémorragie intra-alvéolaire se grèvent d’une mortalité supérieure à 50% incitant à mieux comprendre la physiopathologie, étant donné l’urgence thérapeutique qu’elle constitue. D’autres atteintes notamment rénales peuvent se compliquer dans 25 % des cas d’une insuffisance rénale terminale. La pathologie est caractérisée par la présence d’auto-anticorps anti-ADN. Ces complexes anticorps/ADN forment des agrégats qui participent au développement et au maintien d’une inflammation chronique qui engendre des dégâts tissulaires. Le rôle du récepteur Fc néonatal (FcRn), dans la physiopathologie des maladies auto-immunes est étudié depuis de nombreuses années. Les principales fonctions du FcRn sont associées à la biologie des IgG et de l’albumine. Le FcRn est un récepteur de recyclage et de transfert des IgG et de l’albumine, permettant leur maintien dans la circulation sanguine mais aussi leur transport au travers des barrières épithéliales. Le rôle de FcRn dans le routage des complexes immuns a permis de suggérer son implication dans la physiopathologie de différents types de maladies auto-immunes dont le lupus. Par ailleurs, l’inflammation déclenchée par ces complexes immuns entraine une activation des cellules immunitaires et notamment de certaines populations de lymphocytes T spécialisées dans la production rapide de cytokines comme les lymphocytes T innés (e.g. les cellules NKT et les cellules MAIT). Ces cellules sont ainsi impliquées dans différentes maladies auto-immunes et notamment dans le lupus systémique. Par exemple, plusieurs études ont montré un défaut de NKT chez des patients lupiques ou dans des modèles expérimentaux. L’objectif de ce projet de recherche est de caractériser l’implication de la protéine FcRn et des lymphocytes T innés, dans la physiopathologie du lupus afin de permettre de développer de nouveaux axes de traitements ciblant ces cellules.

Bénéfices attendus

Les stratégies de recherches visant à identifier des cibles thérapeutiques de l’immunité adaptative tout particulièrement humorale ont montré une certaine efficacité dans l’amélioration de la prise en charge des malades lupiques. Cependant leurs indications restent limitées pour l’instant, les formes les plus graves de la maladie comme les atteintes neurologiques, pulmonaires et rénales reposant toujours sur des thérapeutiques non ciblées exposant à des effets secondaires non négligeables. Explorer de manière plus poussée le rôle de l’immunité innée, notamment des lymphocytes T innés pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques s’intégrant aux stratégies actuelles de manières non exclusives. Avec ce projet il s’agira 1) de comprendre l’homéostasie de ces cellules en situation physiologique et pathologique 2) d’identifier les interactions entre ces cellules et les cellules clés de la physiopathologie du lupus comme le lymphocyte B 3) d’analyser la nature de leur participation au cours des différentes atteintes d’organes et 4) d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques pouvant permettre de moduler leur action.

Procédures

Toutes les hypothèses, issues de la littérature, seront évaluées, au préalable, sur des modèles in vitro (culture cellulaire) et ex vivo (cellules issues de donneurs de sang humains et de patients atteints de lupus). Seuls les paramètres d’intérêts seront sélectionnés afin d’être testés in vivo chez la souris. En effet, il n’existe pas de modèles in vitro ou ex vivo capables de reproduire la complexité d’une réponse immunitaire d’un organisme vivant. Les animaux transgéniques devront être génotypés au moment du sevrage (3 semaines après la naissance). Pour cela un prélèvement d’un 1 mm de queue sera réalisé sous anesthésie générale (anesthésie gazeuze). Ce protocole dure moins de 3 minutes en tenant compte du temps d’anesthésie, du prélèvement (instantané) et du réveil de l’animal et ne sera pas renouvellé. Afin de reproduire le développement d’un lupus chez l’Homme, les souris adultes (8 semaines minimum) recevront 1 injection unique de 500µL par voie intrapéritonéale. Ce protocole dure moins de 1 minute en tenant compte de la contention de l’animal et de l’injection et une seule injection par animal sera réalisée. Des prélèvements sanguins seront réalisés 1 fois par mois à partir de J15 après l’injection (donc les animaux auront entre 1 et 7 prélèvements sanguins (pour les animaux conservés jusqu’à J180) afin de suivre les paramètres inflammatoires et l’apparitions des anticorps auto-immuns marquant le développement de la pathologie. 100 µL de sang seront prélevés en prélèvement submandibulaire en utilisant des lancettes et le sang sera collecté dans des tubes héparinés. Cette procédure dure quelques secondes. Les souris seront toujours anesthésiées avant de procéder au prélèvement sanguin. Tout au long des expériences, les souris seront soigneusement surveillées quotidiennement pour détecter les changements physiques ou comportementaux. Ainsi, le poids et les comportements, seront relevés de façon journalière les 1ers jours après l’injection puis 3 fois par semaine entre 15 jours et 180 jours après l’injection.

Impact sur les animaux

Notre modèle de lupus est induit par une injection intrapéritonéale ce qui provoque un stress et une douleur au point d’injection (piqûre). Quelques semaines après l’injection, l’inflammation pulmonaire peut entrainer des dégâts pulmonaires qui peuvent fragiliser l’animal et provoquer des troubles respiratoires, une perte de poids et une réduction de l’activité. A plus long terme (plusieurs mois) les souris développent des symptômes inflammatoires variés pouvant prendre différentes formes. Les plus courantes étant une alopécie derrière la tête et sur le dos et l’apparition de problèmes articulaires, notamment au niveau des extrémités (pattes), pouvant être handicapant pour l’animal. Une diminution de l’activité des souris peut ainsi être observée.

Devenir

Les animaux utilisés pour l’entretien des lignées transgéniques seront réutilisés, en tant qu’animal reproducteur, pendant 1 an. Ces animaux seront ensuite euthanasiés et d’autres animaux plus jeunes seront mis en accouplement. Tous les autres animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de collecter les poumons, la rate et les reins pour analyser les réponses immunitaires se développant dans ces organes. Il ne restera donc pas d’animaux vivants en fin de procédure.

Remplacement

Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme entier pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Cependant, nous utilisons au laboratoire, des systèmes de culture in vitro (hybridomes de cellules immunitaires), pour étudier certains paramètres avant de réaliser des expériences in vivo. De plus, nous avons développé des modèles d’analyses des cellules humaines issues de donneurs sains ou de patients atteints par de lupus systémique. En effet en parallèle de cette étude réalisée chez l’animal, nous avons développé une étude clinique dont l’objectif est de caractériser les lymphocytes T innés de patients atteints de lupus et hospitalisés dans le service de Médecine interne du CHU. Ces modèles nous permettent d’analyser et d’affiner certaines hypothèses avant de les tester in vivo chez la souris. Ils permettent également de confirmer chez l’Homme, les résultats obtenus chez la souris.

Réduction

Tout d’abord, nous tenons à souligner que les expériences in vitro et ex vivo avec des cellules humaines, limiteront le nombre d’hypothèses et donc le nombre de souris à utiliser. De plus, les expériences sont conçues pour utiliser un nombre minimum d’animaux, mais suffisant pour pouvoir réaliser les tests statistiques adaptés. Lors de nos expérimentations, nous comparerons les souris traitées aux souris non traitées, en utilisant des tests statistiques. Nous souhaitons une puissance de test de 90% de détecter une différence à un niveau de significativité de 5%. Pour chaque condition, 12 souris ayant reçu l’injection induisant le lupus et 12 souris ayant reçu l’injection d’huile minérale seront nécessaires. Pour réduire le nombre de souris, un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène, …). L’objectif initial est de tester 4 lignées de souris transgéniques comparées à 2 lignées consanguines contrôles. Le nombre total de souris est ainsi estimé à 768 pour l’ensemble de ce projet d’équipe planifié sur 5 ans. Cet objectif sera évalué au cours de l’avancement des expériences et de la validation des hypothèses et pourra être revu à baisse. En effet, si certains génotypes s’avèrent ne pas être pertinents in vitro et/ou ex vivo par rapport à la maladie lupique, alors les expériences in vivo ne seront pas réalisées. Ainsi, nous avons actuellement une étude clinique analysant la fréquence et les fonctions des cellules MAIT chez des patients atteint de lupus. Si aucun impact de la pathologie sur les cellules MAIT n’est observé alors les expériences sur les souris CAST et CAST-MR1-/- ne seront pas réalisées. De plus, les analyses en cinétique seront réalisées au fur et à mesure des résultats. Ainsi, les expériences des temps les plus précoces (J15 et J30) seront réalisés dans un premiers temps et si nous n’observons pas de différences entre les différentes lignées de souris alors les temps tardifs (J90 et J180) ne seront pas réalisés.

Raffinement

Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de l’état clinique des animaux sera réalisée par toujours les mêmes expérimentateurs afin d’habituer les animaux et de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. De plus, une pesée régulière des animaux sera effectuée. Afin d’identifier la souffrance et la douleur, nous avons établi des points limites et les animaux présentant un de ces critères seront euthanasiées.

Choix des espèces

Lors de ce projet, nous utiliserons des souris consanguines. Nous avons choisi la souris, car elle offre les avantages suivants : - La souris est l’espèce la mieux caractérisée pour les réponses immunitaires pulmonaires limitant de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. - Il existe de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris pour décrire et comprendre les acteurs de sa réponse inflammatoire et immunologique. - Notre laboratoire dispose de différentes lignées de souris transgéniques adaptées à l’analyse du rôle du FcRn et des lymphocytes T innés. De plus, l’utilisation de souris consanguines permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats significativement interprétables. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8 à 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant. Les animaux utilisés pour le maintien des lignées seront mis en reproduction à partir de l’âge de 7 semaines et jusqu’à 1 an.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit du tamoxifène puis des injections de vecteurs viraux dans le cerveau par chirurgie stéréotaxique, avec pose d'une plaque métallique et d'une fenêtre crânienne, avant des séances d'imagerie tête immobilisée, et 70 d'entre elles sont élevées dans l'obscurité depuis la naissance. Le porteur reconnaît que l'immobilisation de la tête et le port de la plaque peuvent stresser les animaux et limiter leur comportement habituel. Il affirme n'avoir pas d'alternative pour étudier les circuits corticaux intacts tout en développant un modèle numérique complémentaire, et toutes les souris sont tuées pour analyse anatomique.

Objectifs

Dans le cerveau des Mammifères, le cortex cérébral est responsable de fonctions cognitives complexes, notamment d'une représentation cohérente du monde extérieur qui est cruciale pour une interaction efficace avec l’environnement. En revanche, la perception sensorielle est fortement influencée par le contexte ainsi que par l'environnement qui entoure les stimuli sensoriels. Cependant, les mécanismes impliqués dans les traitement de l’information sensorielle par le cerveau ne sont toujours pas clairs. Dans le système visuel, le traitement de l'information est largement conditionné par l'état comportemental de l'animal, ses intentions et ses attentes ainsi que la présence d'autres modalités sensorielles. L'intégration d'informations contextuelles (état comportemental) avec des signaux sensoriels (signaux visuelles) se produit déjà aux premiers stades du traitement cortical. Ces signaux contextuels sont transmis aux zones sensorielles corticales par de multiples voies, dont les projections thalamiques et intra-corticales qui innervent fortement la couche 1, la couche la plus superficielle du néocortex. Ainsi, en intégrant les entrées sensorielles et contextuelles, la couche 1 est une structure centrale, clé, qui sous-tend le codage des informations sensorielles. Pourtant, l'architecture fonctionnelle des circuits de la couche 1 est encore mal définie. Malgré les travaux récents étudiant la fonction des interneurones (INs) de la couche 1, la connaissance des mécanismes cellulaires impliqués dans l'activation de ces interneurones et leurs impacts sur le traitement des informations sensorielles est encore limitée. Au cours de ce projet, nous étudierons les propriétés des microcircuits de la couche 1 due cortex et sont role dans le traitement de l'information visuelle.

Bénéfices attendus

Les maladies du cerveau ont des répercussions majeures sur la santé des individus, leur autonomie, leur éducation, leur emploi, leur mobilité et leurs relations personnelles, ce qui représente un lourd fardeau social et économique. Il est d'une importance fondamentale de comprendre les propriétés de base qui régissent la force, le dynamisme, l'étendue spatiale, la localisation anatomique et les composants moléculaires des connexions synaptiques entre des types de neurones spécifiques formant un réseau neuronal dans des états normaux et pathologiques. Plus précisément, nous pensons que le dysfonctionnement du néocortex est à l'origine de déficiences cognitives et de troubles tels que la schizophrénie, l'autisme, la dépression, ou encore de symptômes de douleur chronique. Cependant, nous ne comprenons pas encore comment les circuits du cortex fonctionnent normalement ni comment ils se dérèglent dans ces troubles. Nos objectifs sont de caractériser les motifs normaux et anormaux d'activité des circuits qui peuvent se produire dans le cortex visuel et contribuer aux symptômes de ces troubles. Nous espérons que ces études nous permettront d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour certaines maladies du cerveau.

Procédures

Au total nos utiliserons 260 souris. A partir de ce total, 140 souris seront d'abord injectées avec du tamoxifène par voie intrapéritonéale (IP) au stade adulte (3 minutes par animal) pendant 3-5 jours e après l’insertion de gènes dans ces souris adultes sera réalisée en utilisant des vecteurs viraux injectés par stéréotaxie sous anesthésie générale (1 chirurgie/animal, 40-60 minutes par animal). 70 souris seront hébergées classiquement tandis que 70 autres seront placés dans l'obscurité dès la naissance. Pour cela, les animaux seront placés dans des cages identiques à celles utilisées pour les souris sauvages, mais teintées en rouge. Les humains peuvent voir à travers, mais la longueur d'onde de la lumière ambiante à laquelle les souris sont sensibles sera filtrée par la cage. Dans un autre group, 120 souris transgéniques, seront d'abord injectées avec du tamoxifène par voie intrapéritonéale (IP) au stade adulte (3 minutes par animal) pendant 3 jours. Ces 120 souris transgéniques au stade adulte recevront aprés sous anesthésie générale, l’insertion de gènes en utilisant des vecteurs viraux injectés par stéréotaxie, le scellement d’une plaque métallique sur le crâne et la pose d’une petite fenêtre crânienne avec une lamelle de verre (1 chirurgie par animal, 30-90 minutes par animal). Les souris seront ensuite utilisées pour l'imagerie intravitale à biphotons 2 semaines après la chirurgie. Les souris seront d'abord habituées à la fixation de la tête pendant 5 jours, en commençant par des périodes de petite durée (premier jour 15 min) jusqu'au dernier jour d'habituation qui peut durer 1 heure:30. La période d'habituation peut être prolongée d'une semaine si, au cours de cette période, on observe que l'animal lutte contre la fixation de la tête et n'est pas à l'aise dans le dispositif expérimental. Après cette période de familiarisation, les animaux seront imagés pendant 5 jours consécutifs à raison de 1h30 par session. Cinq jours consécutifs d'imagerie seront toujours suivis d'au moins une semaine de période sans imagerie pour permettre aux animaux de récupérer. Ces sessions d'imagerie et de non-imagerie peuvent être répétées jusqu'à un maximum de 3 mois après la chirurgie initale.

Impact sur les animaux

Le traitement par tamoxifène peut induire du stress, de l'inactivité et une perte de poids. De plus, le traitement au tamoxifène nécessite la manipulation des animaux et des injections intrapéritonéales. L'implantation d'une plaque métallique sur la tête des animaux pour l'imagerie biphotonique nécessite une procédure chirurgicale. Une telle procédure implique une anesthésie générale avec des risques de douleur et/ou de développement d'infections chez les animaux. De plus, après l'implantation dela plaque métallique, l'animal devra vivre dans la cage avec une plaque métallique sur la tête, ce qui peut limiter son comportement habituel. Afin d'imager l'animal sous un éclairage à deux photons, les animaux seront éveillés mais la tête sera immobilisée, ce qui limitera les mouvements de la tête qui peuvent être stressants pour les animaux.

Devenir

À la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés . Dans un cas les tranches de cerveau vont être utilisées pour réaliser des expériences. Por les experiences d’ imagerie in vivo biphotonique nécessitent des analyses anatomiques post-mortem (localisation anatomique des implants, injection de virus, expression de différents gènes).

Remplacement

Il n’y a malheureusement pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car des modèles adéquats du circuit cortical contenant le nombre, les types et la localisation appropriés des récepteurs dans les réseaux excitateurs et inhibiteurs ne sont pas disponibles. L'objectif de nos expériences est de découvrir l’action des gènes, des neuromodulateurs et des médicaments sur les circuits neuronaux dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie neuronale des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, ces expériences ne seraient pas possibles en culture cellulaire. Il est important de noter que notre projet scientifique globale comporte une composante alternative à l’expérimentation animale: l’analyse de modèles in silico. Nous utiliserons l’expertise théorique du laboratoire pour générer un modèle numérique du circuit neuronal étudié incluant les résultats de notre caractérisation expérimentale. Ce modèle sera diffusé publiquement et constituera une alternative à l’expérimentation animale pour l’étude du rôle fonctionnelle des interneurones de la couche 1 pour nos futurs travaux ainsi que pour ceux d’autres équipes.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (n = 260) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux recevront des injections virales et l’imagerie simultanément afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur le même animal. Nos compétences chirurgicales permettront également de réduire le nombre de complications chez les animaux et de minimiser les dommages durables. Toutefois, les avantages de la réutilisation des animaux seront mis en balance avec les effets négatifs sur leur bien-être, en tenant compte de l'expérience de toute une vie de l'animal. En outre, notre expertise dans l'entraînement des souris à être fixées par la tête dans l'installation d'imagerie réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon, et donc la signification statistique, dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Des tests paramétriques et non-paramétriques seront utilisés en fonction de la distribution normale ou non-normale des données. Il est également important de noter que le projet comporte un plan de partage de données. Les données expérimentales seront disponibles en libre accès sur un plateforme en ligne ce qui permettra à d’autres équipes de profiter de ces données, leur évitant ainsi de reproduire ces expériences, et réduira donc le nombre d’animaux utilisés à terme.

Raffinement

Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire au maximum l'impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton et maison) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. Toutes les interventions chirurgicales seront effectuées sous anesthésie et des analegésiques seront administrés avant et après les intervention pour limiter la douleur. Les animaux auront à manger et à boire à volonté. Des croquettes adaptées à la gestation/allaitement seront mise à disposition pour les animaux en accouplement. Les animaux qui subissent une intervention chirurgicale seront mis sous surveillance étroite, au moins deux fois par jour pendant les trois premiers jours suivant la chirurgie. Nous définirons des points limites qui, s'ils sont atteints, nous conduiront immédiatement à l'euthanasie de l'animal afin de réduire les souffrances inutiles. Nous prévoyons également d'utiliser des gels et de la nourriture molle pour les animaux qui se récupèrent d'une intervention chirurgicale

Choix des espèces

Les propriétés de base des microcircuits neuronaux chez la souris sont similaires à celles d’autres mammifères. Actuellement, seuls les modèles murins nous permettent de visualiser les types d’interneurones que nous étudions. Les approches expérimentales multiples réalisées chez la souris permettent une analyse complète allant du comportement jusqu’à l’activité d’un seul neurone. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. De plus, chez la souris, la période de gestation est courte et les portées sont importantes, permettant de produire suffisamment d’animaux pour plusieurs expériences à partir de peu de fondateurs. Le développement du cerveau est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Nous maîtrisons suffisamment les techniques proposées dans ce projet pour réduire le nombre d’animaux nécessaires aux expériences. Les lignées que nous utiliserons ne présentent pas de phénotype dommageable. Des animaux adultes (>P40) seront utilisés pour toutes les procédures (50% males et 50 % femelles). Toutes les procédures nécessitent des interventions chirurgicales qui ne peuvent être pratiquées que sur des animaux adultes. En outre, toutes les expériences seront réalisées chez des souris adultes, lorsque les circuits corticaux ont atteint un stade de maturation final.

3 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont colonisées par gavage avec des souches d'Escherichia coli, soumises à un régime gras pendant plusieurs semaines à plusieurs mois et à des tests répétés de tolérance au glucose, certaines souches pathogènes pouvant entraîner une perte de poids déclenchant leur mise à mort. Le porteur qualifie le recours à l'animal d'"irremplaçable" pour ces bactéries et reconnaît ne pas avoir prévu d'analyse statistique préalable du nombre d'animaux. Toutes les souris sont tuées pour disséquer leurs tissus, un effectif de 3 360 justifié par la recherche d'un "seuil statistiquement valable".

Objectifs

Comprendre : i) les altérations du métabolisme du glucose et du microbiote intestinal induites par les infections à E. coli; ii) le rôle de l'inflammation intestinale dans les phénomene du point i); iii) comoprendre les mécanismes moléculaires selon lesquels les maladies métaboliques type obésité et diabète de type 2 predisposent aux infections.

Bénéfices attendus

Amélioration de la prise en charge des patients métaboliques et qui souffrent des maladies infectieuses à E. coli

Procédures

9 procédures : voir point 4. Durée de la procédure 1 de colonisation ~5 seconds, le temps du gavage; pour la procédure 2 high-fat diet courte durée, 4 semaines; pour la procédure 3 high-fat diet longue durée, ~3 mois; pour la procédure 4 IPITT 1 heure; pour la procédure 5 IPGTT 2 heures; pour la procédure 6 OGTT 2 heures; pour la procédure 7 IPPTT 2 heures; pour la procédure 8 injection de MCC950, ~5 seconds, le temps de l'injection; pour la procédure 9 de la NFS, durée de ~15 seconds, le temps du prélevement du sang.

Impact sur les animaux

Les expérimentations décrites ne sont pas censées induire de douleur et sont bien tolérées par les souris adultes. Pour les souches pathogènes, une perte de poids supérieure à 20 % du poids initial nous conduira à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Eventuels états de prostration (pas prévus) et/ou isolement et poil hérissé seront aussi considérés comme points limites.

Devenir

Les souris resterons en vie à la fin de chaque procédure. Les souris seront mises à mort à la fin de chaque protocole complet indiqué en 3.4.10. La mise a mort est nécessaire afin de permettre la dissection des tissus pour réaliser les analyses moléculaires et identifier les facteurs moléculaires à la base des phénotypes observés.

Remplacement

Pas adaptable dans ce cas car si les études avec des cellules ont permis d’identifier et caractériser les dommages à l'ADN provoqués par les génotoxines, le recours à l’animal est irremplaçable pour ce type d'étude avec des souches bactériennnes. En effet, aucun modèle cellulaire ne permet de récapituler les processus de la colonisation intestinale bactérienne, de la translocation, c’est-à-dire la diffusion des bactéries vers les autres organes, ni d’évaluer, au niveau de l’individu, le rôle de la colonisation par des bactéries produisant des génotoxines sur la santé.

Réduction

Le chiffre de 3360 souris nous permettra d’atteindre un seuil statistiquement valable et donc de pouvoir interpréter les résultats obtenus. Cela permettra donc de ne pas répéter les expérimentations tout en respectant la réduction du nombre d’animaux employés (règle de 3 R). En ce qui concerne les points limites (critères d'interruption) pour le raffinement des protocoles, l’inhibition pharmacologique de l’inflammasome intestinal NLRP3 et les procédures de colonisation n’ont pas été rapportées pour induire de douleur chez l’animal et sont bien tolérées sauf avec certaines souches pathogènes. Pour ces souches spécifiquement, le temps d’expérimentation sera réduit afin de minimiser la mortalité. Une perte (non attendue) du poids initial supérieure à 20% ainsi que des éventuels états de prostration ou isolement nous conduiront à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Nous envisageons d’utiliser de souris mâles, dont la littérature montre une vaste gamme de données sur le microbiote intestinal.

Raffinement

Les expérimentations décrites ne sont pas censées induire de douleur et sont bien tolérées par les souris adultes. Pour les souches pathogènes, une perte de poids supérieure à 20 % du poids initial nous conduira à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Eventuels états de prostration (pas prévus) et/ou isolement et poil hérissé seront aussi considérés comme points limites. Nous ne prévoyons pas une étude statistique à l’avance (analyse de puissance) car nous n’avons pas un pourcentage précis de modulation de variables que l’on va analyser.

Choix des espèces

Le microbiote intestinal chez la souris est désormais bien connu et sa structure ressemble à celle du microbiote intestinal chez l’homme. Pour cela, la translation des résultats obtenus chez la souris vers l’homme pourrait être faite rapidement (Serino et al., Acta Diabetol. 2013). Nous utiliserons des souris de 12 semaines d’âge au moment de la colonisation avec les souches bactériennes d’intérêt. Cette âge tient compte du temps d’acclimatation des souris en zootechnie (2 semaines), de l’éventuel protocole antibiotique (2 semaines) avant colonisation et du traitement par régime gras 60%HFD (4 semaines ou 3 mois, selon le protocole). Dans ce dernier cas les souris arriveront à l’âge de 6 semaines. Cette âge permet une réponse optimale des souris au régime gras diabétogène/obésogène pour l’induction des maladies métaboliques. Dans les autres cas sans régime gras les souris arriveront en zootechnie à l’âge de 10 semaines.