Souris
Caractérisation des composés pro addictogènes dans la nourriture
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers pour 100 d'entre elles et modérés pour 70. Elles sont soumises pendant deux à trois mois à un régime gras et sucré pour induire l'obésité, puis à des croquettes contenant une substance opioïde destinée à provoquer un comportement addictif, avant des tests de comportement motivationnel. Le porteur reconnaît que ces croquettes peuvent générer un état de stress ou de manque et revendique un "besoin de stratégies innovantes" contre les troubles métaboliques. Il conclut au recours aux souris car les invertébrés n'ont pas les structures cérébrales équivalentes aux mammifères, et toutes les souris sont tuées pour prélever des tissus.
Objectifs
Ce projet fait partie d’un groupe de projets qui visent à identifier, si et comment certains composés alimentaires agissent directement ou indirectement sur le système de récompense pour modifier le plaisir associé à l’alimentation mais aussi les troubles compulsifs et addictifs qui leur sont associés.
Bénéfices attendus
Les dernières estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela représente également un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés et largement étudiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes des maladaptations physiopathologiques. Malgré les progrès et les efforts, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. Des recherches approfondies sur l'obésité et la prise excessive de certains aliments, décrivent l’existence, dans un nombre important des cas, d’un composant de type addictif qui pourrait partager des mécanismes neurobiologiques communs. Ce travail permettra d’identifier formellement si une ou plusieurs composés alimentaires sont responsable de la mise en place de consommation compulsive.
Procédures
Les animaux ne subiront aucune procédure invasive, ils seront soumis à un régime riche en gras et sucre (2-3 mois) pour induire l’obésité et des régimes spécifiques (1-2 semaines) pour induire un comportement addictif. Ils seront aussi soumis à des tests de comportement motivationnel (1-2 semaines).
Impact sur les animaux
L’exposition à des croquettes contenant une drogue pour induire le comportement addictif peut générer des situations de stress chez les rongeurs ou une situation de manque. Nous surveillerons de près tous les jours le comportement de chaque souris pour détecter des signes de détresse ou une perte de poids importante( >15% du poids d'une souris contrôle). Le cas échéant, nous arrêterons le traitement et nous écarterons la souris qui montre un état de santé dégradé, pour qu’elle récupère. Basée sur notre expertise et sur la littérature nous prédisons que l’exposition relativement courte aux substances opioïdes devrait augmenter l’appétence pour la nourriture mais ne devrait pas créer de situation de manque trop rapide ni trop aigue.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et du comportement.
Réduction
Les groupes expérimentaux et le nombre d'animaux ont été déterminés par une approche statistique en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Selon les dessins expérimentaux et les nombres de variables (groupes; temps; régimes; comportements) nous utiliserons des tests paramétriques et si nécessaire des tests non paramétriques.
Raffinement
Les soins apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs ont pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, bâtons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé : notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.
Choix des espèces
Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris. Toutes les souris seront utilisées à l’âge adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux soient stables.
Rôle de l’enzyme PCSK9 dans le système nerveux périphérique chez la souris
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par exsanguination sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent du tamoxifène, subissent des tests sensoriels et moteurs sur animal vigile, une mesure de la conduction nerveuse par électromyographie sous anesthésie et une hyperglycémie provoquée après six heures de jeûne. L'objectif est de comprendre le rôle de l'enzyme PCSK9 dans les nerfs périphériques et d'évaluer un risque possible des traitements anti-cholestérol qui la bloquent. Le porteur qualifie d'"indispensable" le recours aux animaux vivants et d'"inestimable" le système génétique employé, la neuropathie étant selon lui impossible à reproduire in vitro.
Objectifs
Le projet a pour objectif principal de comprendre le rôle de PCSK9 dans le système nerveux périphérique. PCSK9 est une enzyme fortement exprimée dans le foie où elle joue un rôle clé dans le métabolisme lipidique. PCSK9 est un inhibiteur naturel du récepteur au LDL-cholestérol, LDLR. Des cibles thérapeutiques pour PCSK9 ont été développées récemment et sont actuellement utilisées en clinique pour traiter des patients atteints de dyslipidémie, dont des patients diabétiques. L'utilisation d'inhibiteurs de PCSK9 chez l'homme permet de bloquer sa fonction et de diminuer les taux de LDL-cholestérol plasmatique suite à l'augmentation du nombre de récepteurs au LDL-cholestérol au niveau du foie. Nos précédents travaux ont pu mettre en évidence que PCSK9 est également exprimé dans le système nerveux périphérique au niveau des nerfs où son role reste pour l'instant totalement inconnu. Suite à cette observation, il est essentiel de déterminer la fonction de PCSK9 dans cette structure afin d'évaluer le risque potentiel de l'utilisation des thérapies bloquant son activité sur les fonctions sensorielles et motrices des patients traités. Afin d’étudier la fonction de PCSK9 dans les nerfs périphériques, nous utiliserons plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées permettant d'éliminer spécifiquement son expression dans différents tissus. Nous évaluerons les fonctions sensorielles et motrices des animaux en réalisant des tests comportementaux. Nous évaluerons également le bon fonctionnement des nerfs sensoriels en faisant des mesures de la vitesse de conduction par la technique de l'électromyographie.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera de nouvelles données sur la fonction de PCSK9 dans les nerfs périphériques. PCSK9 est un inhibiteur naturel du récepteur au LDL-cholestérol, LDLR. Des cibles thérapeutiques pour PCSK9 ont été développées récemment et sont actuellement utilisées en clinique pour traiter les patients atteints de dyslipidémie, dont des patients diabétiques de type 2. L'utilisation d'inhibiteurs de PCSK9 chez l'homme permet de bloquer sa fonction et de diminuer les taux de LDL-cholestérol plasmatique suite à l'augmentation du nombre de récepteurs au LDL-cholestérol au niveau du foie. Suite à la mise en évidence de l'expression de PCSK9 dans les nerfs périphériques, il est essentiel de déterminer sa fonction dans cette structure afin d'évaluer le risque potentiel de l'utilisation des inhibiteurs de PCSK9 sur les fonctions sensorielles et motrices chez les patients traités. Ce projet permettra de déterminer le rôle de PCSK9 dans les nerfs périphériques et de déterminer si son inhibition en clinique peut avoir un impact sur le développement de neuropathie chez les patients traités.
Procédures
Le prélèvement de tissus pour le génotypage des souris et la mise en place d’une bague d’oreille numérotée sera réalisé sous anesthésie générale sur l’ensemble des animaux et la technique sera d’une durée de 5min par animal. Les tests comportementaux seront réalisés sur animaux vigiles sur l’ensemble des animaux et le geste technique sera d’une durée de 20min par animal. La vitesse de conduction nerveuse sera effectuée sous anestéshie générale et sur l’ensemble des animaux pour une durée de 20 min par animal. L’hyperglycémie provoquée se fera sur animaux vigiles et sur l’ensemble des animaux pour une durée de 120 min par animal avec des prélèvements à différents temps. L’exsanguination sera effectuée sur l’ensemble des animaux du projet qui seront mis sous anesthésie générale et la procédure durera 5min par animal.
Impact sur les animaux
Concernant les nuisances ou effets indésirables possibles sur les animaux, nous avons identifié certaines manipulations qui pourraient entrainer des nuisances ou des effets indésirables sur les animaux. L’injection de tamoxifène sur animal non anesthésié peut entrainer un certain niveau de stress. Afin de limiter le stress, les animaux seront manipulés par des expérimentateurs formés à la préhension et à la contention des animaux de laboratoire. Le tamoxifène est un anti-estrogène administré dans le cancer du sein de la femme. Même si quelques effets secondaires peuvent être observés tels qu'une mortaité embryonnaire, une infertilité temporaire ou un blocage intestinal, en recherche, elle est couramment utilisée chez la souris pour activer la recombinase Cre dans des lignées de souris génétiquement modifiées. Au vu des doses utilisées et de la période d’injection (5 jours), nous ne nous attendons pas à des effets indésirables sévères. Concernant les tests sensoriels et moteurs, l’isolement des animaux pour effectuer les tests peut entrainer un certain niveau de stress. Afin de limiter ces effets, les animaux seront habitués à la salle de test, à son environnement et au matériel pendant 3 jours consécutifs (30 minutes par jours). Pour l'hyperglycémie provoquée, la mise à jeun de l’animal pendant 6 heures peut entrainer des effets indésirables. Afin de limiter le stress, la mise à jeun se fera pendant la journée afin que les expérimentateurs puissent surveiller le comportement des animaux pendant cette période.
Devenir
L'ensemble des animaux est maintenu en vie au cours des procédures 1 à 7. A la fin de la procédure, l'ensemble des animaux subiront une exsanguination suite à une ponction cardiaque après anhestésie à l’isoflurane.
Remplacement
Les objectifs de cette étude sont de déterminer le rôle de PCSK9 de manière spécifique dans le système nerveux périphérique. Elle nécessite donc l’utilisation de lignées de souris transgéniques dans le but de supprimer l’expression de la protéine PCSK9 dans différents types cellulaires composant le nerf. Par ailleurs, le recours à l’expérimentation sur des animaux vivant est indispensable car la neuropathie est impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés (ex : culture cellulaire), de même que les tests de phénotypage sensoriel et moteur. De plus, le système Cre-loxP est un système inestimable pour le contrôle de la délétion de différents gènes au niveau du système nerveux chez la souris et est très fréquemment utilisé chez les modèles de souris transgéniques. Les études seront systématiquement optimisées d’après la littérature et/ou les observations réalisées au laboratoire.
Réduction
L’utilisation des animaux sera réduite au maximum et les expériences seront planifiées et réalisées les unes après les autres afin d’éviter des pertes inutiles. L’application de cette politique de réduction mise en place permettra d’optimiser au mieux chaque expérimentation afin de retirer un maximum d’information d’un minimum d’animaux. Le nombre d'animaux minimum a été déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Les protocoles ont été établis afin de réduire la douleur et la détresse de l’animal. Les animaux seront sous la surveillance de personnes habilitées et la diffusion par ces personnes de leur savoir-faire permettra de réaliser nos expérimentations dans le respect du bien-être animal et des conditions optimales du suivi des règles d’hygiène et de sécurité. Pour les tests sensoriels et moteurs, les souris bénéficieront d'une acclimatation à la salle de test (30 minutes/jour pendant 3 jours) afin d’éviter le stress de l’animal. Les tests seront effectués sur plusieurs jours dans le but de limiter le nombre de stimulations (mécaniques, nociceptives et motrices). Si lors d'une procédure des signes de douleur ou de détresse sont observés alors l'animal se verra administré une dose d'analgésique (buprénorphine) à 0,01 mg/kg en sous-cutané. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne des zootechniciens et expérimentateurs afin de s’assurer de leur bien-être et de détecter tout signe éventuel de douleur (prostration, isolement, passivité, pelage, respiration, vocalisations)
Choix des espèces
La souris représente une espèce validée dans l’étude des neuropathies. Elle permet l’évaluation des déficits sensoriels et moteurs par la possibilité d’effectuer des tests sensoriels et moteurs non invasifs établis de longue date chez ce modèle animal et récapitulant les tests sensoriels réalisés chez l’homme. Nous utilisons des souris car elles sont déjà à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris transgéniques permettant l’étude de protéines d’intérêt impliquées dans les neuropathies. Nous utiliserons des souris âgées de 10 semaines. Nous avons choisi ce stade de développement car le système somatosensoriel est mature et fonctionnel à partir de 8-10 semaines.
Identification des gènes bactériens essentiels à la colonisation du tractus digestif
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent un antibiotique dans l'eau de boisson pendant deux jours, puis un gavage unique avec une banque de mutants d'Escherichia coli multirésistants, avant que leurs fèces soient séquencées pour repérer les gènes utiles à la colonisation intestinale. Le porteur affirme ne pas s'attendre à une gêne pour les animaux et prévoit leur mise à mort dès une perte de poids supérieure à 10 %. Il conclut que cette question "ne peut être réalisée que sur un modèle animal", sans détailler d'alternative testée.
Objectifs
Les bactéries Escherichia coli sont des bactéries retrouvées naturellement au sein du microbiote intestinal, c’està-dire les microorganismes hébergés dans notre intestin. La grande majorité des E. coli sont non pathogènes. Cependant, ces bactéries ont une grande capacité d’échange de matériel génétique et peuvent au fil de leur évolution acquérir de nombreux gènes. Parmi ceux-ci, les gènes responsables de la résistance aux antibiotiques sont ceux qui attirent le plus l’attention de la communauté hospitalière. En effet, de plus en plus d’E. coli résistent à plusieurs antibiotiques (on parle alors de souches multi-résistantes) les rendant extrêmement difficiles à traiter et pouvant conduire à des infections fatales chez les patients notamment immunodéprimés. Au sein des E. coli multi-résistants, un clade (un regroupement de plusieurs souches ayant une organisation génomique et une origine commune) est particulièrement scruté car sa fréquence est en constante augmentation aussi bien chez les Hommes que chez les animaux, suggérant une très forte capacité à coloniser le tractus digestif. Le but de notre étude est de comprendre les mécanismes adaptatifs qu’ont développés ces souches de manière à coloniser si efficacement le tractus digestif. Pour cela, nous disposons de souches multi-résistantes présentes chez l’Homme et retrouvées en clinique depuis plusieurs années, ainsi que des souches multi-résistantes apparues récemment chez l’Homme et dont la fréquence de détection et donc le portage augmentent rapidement. Nous disposons pour chacune des souches d’une banque de mutants. Une banque de mutants correspond à plusieurs dizaines de milliers de clones de la bactérie initiale dans lesquelles, à l’aide d’une approche moléculaire, un élément mobile appelé transposon a été inséré aléatoirement dans le chromosome bactérien. Le transposon en s’intégrant de façon aléatoire dans le génome bactérien va inactiver le gène dans lequel il s’est intégré. Nous gaverons de souris avec les banques de mutants puis par séquençage, des bactéries présentes dans les fèces, nous déterminerons pour chaque souche les gènes importants pour l’implantation intestinale. La découverte de protéines cruciales pour l’implantation intestinale des E. coli multi-résistants pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques visant à limiter la colonisation intestinale de ces souches.
Bénéfices attendus
Le projet permettra du point de vue scientifique une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeux pour faciliter la colonisation intestinale des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques. Nous espérons mettreen lumière des protéines clefs impliquées dans la colonisation bactérienne et ainsi proposer de nouvelles stratégies permettant de limiter cette colonisation intestinale.
Procédures
Les animaux recevront via l'eau de boisson un antibiotique pendant 2 jours. C'est une procédure classique qui n'induit aucun stress/douleur chez l'animal. Les animaux seront ensuite gavés avec un volume de 200μl (1 seul gavage). Le gavage se fera sur animal vigile par du personnel expérimenté habitué à cet acte qui hormis la contention n'induit aucune douleur à l'animal (le temps moyen de l'acte entre la prise de l'animal dans sa cage, la contention, le gavage ne dépasse jamais les 20 secondes).
Impact sur les animaux
Nous ne pensons pas que les manipulations proposées induisent une quelconque gène chez l’animal étant donné que les souches utilisées ne sont pas pathogènes et les animaux immunocompétents. Cependant, un suivi quotidien des animaux sera réalisé de manière à repérer toute détresse animale. Si un animal présente un des critères suivant : perte de poids supérieure à 10%, un dos vouté, le poil dru, ou une démarche traduisant une souffrance, il sera immédiatement mis à mort. Pour faciliter le suivi des animaux, un système de score intégrant différents paramètres (apparence, comportement, signes cliniques…) sera utilisé de manière à nous assurer qu’aucun animal n’est en souffrance.
Devenir
Les animaux auront été traités avec des antibiotiques et gavés par des bactéries rendant leur réutilisation dans un autre protocole impossible.
Remplacement
Le but du travail est comprendre comment les bactéries multi-résistantes aux antibiotiques colonisent le tractus digestif. Ceci ne peut être réalisé que sur un modèle animal.
Réduction
Des expériences préliminaires menées au laboratoire nous ont permis grâce au séquençage du génome de nombreuses souches d'intérêt, de sélectionner les clones les plus représentés chez les patients. Ainsi nous réduirons le nombre d'animaux en limitant le nombre de souches et en ne testant que les plus relevantes (c'est-à-dire les plus fréquentes chez les patients).
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans une salle climatisée (22 ± 2°C) avec un cycle 12/12h (jour/nuit, 7h00 à 19h00) et un taux d'humidité maintenu à 55%. Les animaux auront libre accès à la boisson et à la nourriture. Le milieu sera enrichit à l’aide de maisons en carton. Un suivi quotidien des animaux sera effectué de manière à repérer toute détresse animale. Le poids des souris sera également suivi avec attention (pesées 2 fois par semaine) car c’est un très bon marqueur de l’inflammation intestinale et de la sévérité d’une diarrhée. Une perte de plus de 10% du poids avant le gavage constituera un critère d’arrêt et l’animal en question sera mis à mort. De plus, nous utilisons un système de score (présenté en annexe) dont les paramètres sont : l'apparence, le comportement naturel, l'hydratation, les signes cliniques, et le comportement provoqué.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront des souris de fond génétique C57BL/6 wild-type. Ces dernières sont particulièrement utilisées dans les expériences de colonisation du tractus digestif par des bactéries notamment les E. coli. Les animaux utilisés seront tous des jeunes adultes (6 à 8 semaines) au début de la procédure expérimentale. Au sein de la communauté scientifique, c'est à cet âge là que les expériences de colonisation intestinale se font.
Troubles endocriniens et métaboliques : diabète et obésité
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rats : 1100
Jusqu'à huit prises de sang en quatre à huit heures, un jeûne pouvant atteindre 16 heures, un isolement jusqu'à 24 heures pour recueillir urines et fèces : 1 100 souris et 1 100 rats, soit 2 200 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chez une partie d'entre eux, l'équipe provoque des troubles métaboliques par l'administration unique d'un réactif que le résumé ne nomme pas, par un régime riche en graisse ou par les deux. Les rongeurs reçoivent des substances par la bouche, en injection ou en perfusion veineuse de plusieurs heures, pendant des jours ou des semaines, pour tester des candidats médicaments contre le diabète et l'obésité, ou les effets d'autres molécules sur le système hormonal. Le porteur écrit que l'impact de ces substances sur le métabolisme des rongeurs "est prédictif de leur efficacité et/ou sécurité en clinique". Le champ structuré du devenir ne déclare aucun rongeur réutilisé, alors que le texte prévoit de réutiliser, après accord vétérinaire, ceux qui sortent de procédures légères ou modérées, et de tuer ceux dont les organes sont prélevés.
Objectifs
La prévalence mondiale du diabète et de l’obésité n’a cessé d’augmenter au cours de ces dernières décennies et a atteint des proportions pandémiques (463 millions de personnes atteintes en 2019). Ces troubles métaboliques exposent les personnes atteintes à un risque de pathologie bien plus grave, en effet une glycémie constamment élevée provoque des lésions vasculaires généralisées affectant le cœur, les yeux, les reins et les nerfs. Elle expose les personnes atteintes à une incidence accrue de maladies athérosclérotiques cardiovasculaires. A l’heure actuelle, toutes les thérapies disponibles traitent les conséquences du diabète de type 2 en se focalisant principalement sur la régulation glycémique, mais ne ciblent pas le mécanisme biologique sous-jacent qui cause la maladie. Par ailleurs, certaines molécules médicamenteuses en cours de développement peuvent avoir des effets secondaires sur le système endocrinien et favoriser l’apparition d’hyperglycémie et de diabète. Ainsi le présent projet aura pour objectif d’une part d'évaluer l’efficacité préclinique de nouvelles substances susceptibles de lutter contre les troubles métaboliques et endocriniens (diabète, obésité, syndrome métabolique), d’autre part, de déterminer si de nouvelles substances en développement peuvent avoir une répercussion sur le système endocrinien. Quel que soit le contexte de l’étude, l’effet des substances pharmacologiques est évalué sur des modèles biologiques suffisamment sensibles et prédictifs, capables de mimer la physiologie endocrinienne humaine et sa complexité, afin de garantir la pertinence et la validité des résultats expérimentaux obtenus.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'évaluer l’activité pharmacologique de substances en développement sur le métabolisme glucidique et lipidique. Ce projet permettra également d’étudier les effets secondaires possibles d’autres substances bioactives sur le système endocrinien.
Procédures
Les troubles métaboliques sont induits par une administration unique d'un réactif (durée d'environ 1 minute), ou par un régime riche en graisse, ou la combinaison des deux. Les substances-test peuvent être administrées par bolus (voie orale, intraveineuse, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire), durée de quelques secondes ou par perfusion lente (intraveineuse) de quelques minutes à quelques heures. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours (le plus souvent) ou plusieurs semaines, et cela en fonction de l’objectif de l’étude. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline nécessitent une administration unique (durée d’environ 1 minute) suivie de prélèvements d'une goutte de sang (durée de quelques secondes, 8 maximum, sur 4 ou 8h de test). Par ailleurs, des prélèvements de sang (8 maximum, sur 4 ou 8h) peuvent être réalisés, chaque prélèvement durant quelques secondes à 3 minutes. Enfin, un hébergement individuel (durée max 24 h) peut être réalisé au cours de l'étude pour prélèvement d'urines ou de fèces.
Impact sur les animaux
Bien qu’un certain nombre de procédures appliquées dans ce projet n’induisent pas de nuisance ou d’effets indésirables sur les animaux, quelques procédures peuvent induire un stress lié à un isolement (
Devenir
Pour les procédures légères et modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Pour procédures nécessitant des prélèvement d’organes les animaux sont euthanasiés.
Remplacement
Dans le cadre du développement des médicaments testés de nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) ont déjà eux lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substance à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne reflètent pas la complexité de l’environnement biologique et du système endocrinien chez l’Homme. De même, il n'est pas possible de prédire les effets secondaires des substances utilisées. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Quand le protocole d'étude le permet, un groupe traité est utilisé comme son propre contrôle négatif permettant ainsi d’utiliser un nombre d’animaux réduit. Par ailleurs et dans la mesure du possible (en fonction de la durée d'action de la substance-test), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal et à des jours différents, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Nos données historiques ainsi que celles de la littérature indiquent qu’un effectif 8-10 animaux ( rats et souris) en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. L' analyse statistique prévue repose sur des tests paramétriques. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude. Dans le but de réduire le nombre d’animaux, certains animaux issus des procédures réalisées sur l’animal éveillé sont également réutilisés aux strictes conditions qu’ils n’aient pas subi de procédure sévère et après accord du vétérinaire.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant l'euthanasie précoce de tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le métabolisme de rongeurs (rats, souris), est prédictif de leur efficacité et/ou sécurité en clinique. En effet, le rongeur s'est avéré être un modèle fiable pour découvrir et valider de nouveaux traitements du diabète, il presente une physiologie proche de celle de l'Homme. Les études sont principalement menées sur des jeunes rongeurs adultes sains dont l'âge est compris entre minimum 4 semaines (correspond à la fin du sevrage des animaux) et maximum 20 semaines (correspond à l'apparition du processus de sénescence).
Etude du mode d’action et de l’efficacité du Fitusiran dans des modèles murins d’hémophilie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
467 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Rendues déficientes en facteurs de coagulation pour reproduire l'hémophilie humaine, elles reçoivent une à trois injections de Fitusiran, deux prélèvements sanguins dont un terminal, et pour une partie un test de saignement où une veine de la queue ou de la cuisse est blessée sous anesthésie et la perte de sang mesurée pendant trente minutes. Le porteur indique que ces pertes de sang importantes empêchent toute réutilisation et justifie le recours aux souris par le fait que les tests sans animaux ne reproduisent pas l'intégralité de la coagulation. Le projet vise à préciser le mode d'action et les risques thrombotiques d'un traitement déjà en essai clinique.
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare affectant principalement les hommes. Il en existe deux types : l’hémophilie A (1 naissance de garçons sur 5000) et l’hémophilie B (1 naissance de garçons sur 30000). Une troisième maladie hémorragique apparentée est la maladie de Stuart-Prower (1 cas sur 1 million). Ces trois maladies surviennent lorsqu'il y a un déficit en protéines importantes pour assurer la coagulation sanguine. Pour l'hémophilie A, il manque le facteur VIII. Pour l'hémophilie B, il manque le facteur IX et pour la maladie de Stuart-Prower, il manque le facteur X. La coagulation sanguine est le processus qui permet l'arrêt du saignement lors d'une blessure. Sans traitement, l'espérance de vie des patients hémophiles est d'environ une quinzaine d'années. Il existe un traitement standard de l'hémophilie qui consiste à donner aux patients la protéine qui leur manque. Par contre, ce traitement est assez lourd car il ne s'agit pas d'un comprimé à avaler mais d'injections par voie intraveineuse, injections qui doivent être faites plusieurs fois/semaine. Actuellement de nouveaux traitements cherchent à faciliter la prise en charge de ces maladies en diminuant la fréquence des injections. L'un de ces traitements est très original puisqu'il ne cherche pas à redonner aux patients la protéine qui leur manque mais il vise à bloquer une autre protéine, l'antithrombine, dont le rôle normal est de réduire le processus de coagulation. Lors des essais cliniques chez les patients hémophiles, cette thérapie, appelée Fitusiran semble être efficace mais des questions demeurent d'une part sur son mode d'action précis et d'autre part sur les risques potentiels associés à son utilisation. En effet, de nombreux professionnels de santé sont réticents à l'idée d'utiliser ce traitement qui pourrait potentiellement induire un effet pro-thrombotique, c'est-à-dire induire une coagulation sanguine indésirable qui interviendrait même en absence de blessure. L'objectif de notre projet est donc de mieux comprendre le mécanisme d'action du Fitusiran ainsi que l'évaluation des risques associés dans des modèles de souris déficientes en Facteur VIII (hémophiles A), en Facteur IX (hémophiles B) ou en Facteur X.
Bénéfices attendus
A court-terme, les résultats de cette étude permettront 1) d'établir un effet dose-réponse du Fitusiran pour corriger les saignements incontrôlés chez des souris reproduisant des maladies hémorragiques humaines 2) de surveiller le risque thrombotique associé. A plus long terme, le projet contribuera à mieux établir le profil de sécurité du Fitusiran afin de favoriser son déploiement à plus grande échelle dans la population hémophile.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure impliquant plusieurs gestes sur une période de 21 jours maximum. Selon les groupes, les souris recevront 1, 2 ou 3 injections de Fitusiran à raison d'une injection/semaine. Deux prélèvements sanguins seront effectués au maximum par souris, l'un avant le traitement et le second à différents temps après le traitement. Pour certaines souris, ce second prélèvement sanguin sera terminal puisque toutes les mesures seront ensuite effectuées sur le sang recueilli. Ces prélèvements sanguins se feront sur souris anesthésiées. Pour un autre groupe de souris, un test de saignement sera réalisé le lendemain du second prélèvement sanguin Dans ce test, les souris seront anesthésiées et une blessure sera induite sur une veine de la queue ou de la cuisse et la quantité de sang perdu sera mesurée pendant une durée de 30 minutes. Au terme des 30 minutes, les animaux toujours sous anesthésie seront euthanasiés par les méthodes réglementaires.
Impact sur les animaux
Douleur légère lors des injections sous-cutanées et après les prélèvements sanguins. Stress lors de la préhension des animaux
Devenir
En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. En effet, lors des tests de saignement, les souris peuvent perdre beaucoup de sang, ce qui provoquerait un impact trop important sur une ré-utilisation potentielle.
Remplacement
La coagulation sanguine est un processus complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, que ce soit les cellules sanguines, les protéines qui circulent dans le sang mais aussi la paroi des vaisseaux sanguins. Actuellement les tests disponibles qui ne font pas appel aux animaux, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus.
Réduction
Afin de déterminer le nombre d’animaux approprié pour le projet, nous avons réalisé une analyse de puissance. Les hypothèses sous-jacentes à nos calculs sont basées sur la littérature existante et sur notre expérience des modèles expérimentaux et de la variabilité qui leur est associée. Les doses de Fitusiran que nous avons choisies de tester ont déjà été suggérées dans la publication scientifique décrivant cette approche, ce qui nous permet de ne pas partir en aveugle et de limiter les doses à étudier.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et la procédure aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet. Les points limites susceptibles d'entraîner l'euthanasie immédiate de l'animal seront les suivants: Hyperalgésie après les injections et les prélèvements, visible par une agitation importante de la souris ou manifestation hémorragique qui serait visible par un écoulement de sang au niveau oculaire/nasal. Pendant les 14 jours de la procédure, observation quotidienne des animaux (1 fois pendant le week-end): Décision d'euthanasie si un des critères suivants est noté: 1) perte de 20% du poids par rapport à la veille, 2) poils hérissés ou 3) état apathique.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à des modèles murins déjà développés qui reproduisent les pathologies étudiées (hémophilie et maladie de Stuart-Prower). Il s'agit de souris déficientes en Facteur VIII (modèle d'hémophilie A) en Facteur IX (modèle d'hémophilie B) et en Facteur X (modèle de maladie de Stuart-Prower). Ces modèles ont d’ores et déjà montré leur pertinence en tant que modèles de ces pathologies humaines. Pour l'intégralité des procédures, des souris adultes (8-16 semaines environ) des deux sexes seront utilisées.
Efficacité d’un nouvel antibiotique contre Mycobactérium avium
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers pour 30 d'entre elles et sévères pour 180. Elles sont infectées par Mycobacterium avium au moyen d'un aérosol de deux heures, puis reçoivent des antibiotiques par gavage et par injection dans le ventre cinq jours par semaine pendant un à quatre mois. Le porteur reconnaît que les gavages réalisés par des personnes novices peuvent provoquer des saignements, une inhalation ou la mort, et prévoit un entraînement préalable sur une fausse souris. Il affirme qu'il n'existe à ce jour aucune solution alternative satisfaisante et met à mort tous les animaux en fin de traitement pour mettre leurs poumons en culture.
Objectifs
L'objectif principal du projet est de déterminer l'efficacité d'un nouvel antibiotique, contre les infections respiratoires à Mycobacterium avium, une bactérie particulièrement difficile à traiter. Les objectifs secondaires sont de déterminer les meilleures combinaisons de traitements avec cet antibiotiques et de décrire la réaction des tissus de l'organisme sous ce(s) traitement(s).
Bénéfices attendus
Cet antibiotique a déjà montré une efficacité in vitro (en laboratoire) sur Mycobacterium avium, mais l'efficacité in vivo (chez l'être vivant) reste à démontrer. Si notre hypothèse de travail est correcte, notre projet permettra de mettre en évidence l'efficacité de ce nouvel antibiotique seule et en combinaison avec d'autres antibiotiques spécifiques. Cette efficacité permettra d'informer à court terme d'autres études expérimentales sur des combinaisons à tester et leur durée de traitement, mais également à moyen terme les essais cliniques thérapeutiques pour des patients en grand besoin de traitements plus efficaces et mieux tolérés dans cette indication.
Procédures
Il n'est pas prévu de prélèvement sanguin ou d'intervention chirurgicale. En revanche les souris seront infectées par des aérosols de mycobactérie (durée 120mn) et seront par la suite traitée par différents antibiotiques afin de déterminer leur efficacité. Si l'infection par aérosol est indolore, l'administration des antibiotiques se fait par voie orale (à la seringue) et/ou par voie injectable (dans le ventre). Ces administrations sont répétés tous les jours (durée 5 à 10 secondes), cinq jours par semaine pendant 1 mois, 2, 3 ou 4 mois pour certaines souris.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale du gavage et de l'injection, bien qu'en soit peu délétère, est répétée quotidiennement, pouvant provoquer un stress sur les animaux. C'est pourquoi il est prévu un rapport écrit de la surveillance quotidienne avec évaluation a posteriori du projet. Des points limites spécifiques ont été établis pour la surveillance. Les effets indésirables attendus, surviennet essentiellement lorsque les gavages sont faits par des novices. Ce sont : des saignements, un stress, une inhalation, le décès. Lors des injections, ce sont des douleurs, des hématomes, des troubles cutanés. Toutefois, le personnel novice sera dans un premier temps entraîné sur une souris d'entrainement fictive (Mimicky mouse, Dorset, UK) jusqu'à ce qu'ils acquièrent la dextérité et l'aisance nécessaire pour ne pas faire subir d'effet indésirable inutile aux souris.
Devenir
Afin de pouvoir tester l'efficacité des antibiotiques les animaux doivent être infectés puis traités. Après la durée de traitement prévue dans le protocole il est nécessaire de mettre en culture les poumons afin de mesurer l'efficacité des antibiotiques. Tous les animaux sont donc mis à mort à la fin de la durée de traitement.
Remplacement
La procédure de préhension et de gavage sera apprise sur une souris fictive jusqu'à ce que les personnes formées soient à l'aise avec ces procédure. Des analyses in vitro ont été réalisées en amont pour sélectionner les candidats, mais à ce jour, il n'existe pas de solution alternative satisfaisante pour remplacer les animaux dans cette indication.
Réduction
Le nombre de souris est calculé au plus proche de ce qui est nécessaire pour voir une différence significative entre les groupes de traitement.
Raffinement
Les mesures de raffinement suivantes seront prises pour diminuer la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux. Les souris seront suivies quotidiennement. Dans la cas où une douleur serait observée, les souris auront une injection d'analgésique une fois par jour jusqu'à normalisation de l'échelle de la douleur. Dans le cas d'une aggravation des signes de douleur, les souris concernées seront euthanasiées. Nous avons défini des points limites spécifiques au gavage. Les souris seront gardées dans des cages collectives (en respectant la limite de souris par cage) et enrichies (litières foisonnantes et absorbantes, tunnels, …). Nourriture et boisson seront ad libitum.
Choix des espèces
Dans notre étude précédente la souris BALB/c était le modèle animal répondant le mieux à l’antibiothérapie semblant le plus se rapprocher des données humaines. Il n'est pas justifié d'utiliser des modèles de souris immunodéprimées (ou d'autres espèces animales) moins semblables aux données cliniques
Etudier l’effet de xénobiotique en pharmacologie (Travaux pratiques BUT2 Parcours BMB)
- Enseignement supérieur
415 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 165 proposées à l'adoption et le reste tué. Elles reçoivent une à deux injections hebdomadaires de psychotropes, dont le diazépam et la chlorpromazine, puis servent à quatre tests comportementaux réalisés par des étudiants, dans le cadre de travaux pratiques de pharmacologie en BUT. Une partie est ensuite tuée pour fournir des cadavres aux travaux pratiques d'anatomie de première année. Le porteur affirme qu'acquérir des compétences en expérimentation "nécessite" l'animal vivant, et complète ces séances par des vidéos et des exercices in silico.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de répondre à l’une des attentes du Programme National des IUTs en vue de l’obtention du Bachelor Universitaire de Technologie (BUT), Spécialité Génie Biologique, Parcours Biologie Médicale et Biotechnologie de 2ème année. Les étudiants doivent en effet réaliser une Situation d’Apprentissage et d’Evaluation (SAé) au cours du semestre 4 de la 2ème année intitulée « Etudier l’effet de xénobiotiques en Pharmacologie » dans un contexte de développement de médicament lors de l’étude préclinique. Ce projet permettra ainsi aux étudiants d'appréhender de nouveau les méthodes faiblement invasives (maniement, contention, injection, etc. ; cf DAP n°38855) notamment utilisées en pharmacologie mais aussi d’acquérir de nouvelles compétences comme celle portant sur la caractérisation du mode de fonctionnement et des effets d’un xénobiotique sur un organisme vivant. Dans ce contexte, l’utilisation de l’animal semble nécessaire pour répondre à cet objectif. Les étudiants pourront ainsi au moyen de 4 tests comportementaux étudier les effets bénéfiques et/ou délétères de molécules médicamenteuses, à savoir des psychotropes (diazépam et chlorpromazine). Ces TPs seront également complétés i) par des recherches bibliographiques sur les tests comportementaux employés et les molécules testées, ii) par le visionnage de vidéos montrant d'autres tests comportementaux avec des souris ayant également reçu soit du diazepam soit de la chlorpromazine comme par exemple le test de l'escalier et iiI) par des TPs in silico et in vitro en Ressources afin d’étudier les effets bénéfiques et/ou délétères d’autres médicaments.
Bénéfices attendus
Ce projet correspondant à une Situation d’Apprentissages et d’Evaluation (SAé) permettra aux étudiants d'acquérir la compétence " Mener des études à l'échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé" exigées dans le cadre de cette formation. L'acquisition de cette compétence nécessite pour l'étudiant de maitriser un certain nombre d'apprentissages critiques (AC) qui sont, pour cette compétence et pour ce niveau de formation, : i) Mener des études sur les dysfonctionnements cellulaires, tissulaires et physiologiques et ii) Expérimenter dans le cadre d’études pré-cliniques en évaluant l’effet de xénobiotiques en pharmacologie notamment sur l’animal de laboratoire. Le contenu de ce projet comportant 4 expérimentations répond ainsi à ces apprentissages critiques et entre donc dans le processus d'acquisition de cette compétence en complément des autres enseignements théoriques et pratiques telles que les Ressources intitulées « Etude des dysfonctionnements cellulaires et physiopathologiques » et « Pharmacologie ». Pour résumé, au travers des enseignements théoriques et pratiques (entre autres par ce projet), les étudiants auront ainsi une vision d'ensemble sur ce qu'implique l’étude de l’effet d’un xénobiotique en pharmacologie en utilisant l’animal de laboratoire : réglementation en vigueur, éthique, bien-être, gestes de base, dispositif expérimental, points limites, rendre compte des résultats de manière appropriée...
Procédures
Ces animaux seront soumis uniquement à 1 voire 2 injections par semaine de liquide physiologique et/ou de psychotropes (diazépam, chlorpromazine, imipramine) en intrapéritonéale. Seules les souris témoin des 2 premiers TP seront soumises à 2 injections par semaine car elles serviront pour le 3ème groupe de TP permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux.
Impact sur les animaux
Durant ce projet, les animaux seront confrontés à différentes nuisances : 1) le maniement par des personnes inconnues. Neanmoins, ce point sera amoindri au cours du temps car nous essaierons qu'ils aient les mêmes souris à chaque TP ; 2) l'utilisation dans 4 expérimentations différentes mais cela permet de réduire le nombre d'animaux utilisés ; 3) injections de substances thérapeutiques à dose active (diazepam, chlorpromazine, imipramine) mais ces substances ont une durée de vie courte dans l'organisme donc les effets s'estomptent quelques heures voire quelques jours après l'injection. Pour palier à cela, les souris ne recevront qu'une seule dose par semaine de substances thérapeutiques à dose active.
Devenir
Pour le bien-être animal, l'adoption est à privilégier. Cependant, pour la ressource « Biologie Animale » en BUT 1 parcours BMB, il nous faut des souris mortes pour les TPs d’anatomie. C’est pourquoi 50 des 83 souris seront mises à mort pour ces TPs. Ce nombre a été décidé car nous avons la possibilité d’avoir entre 45 et 50 étudiants en parcours BMB 1ère année. Le reste de souris sera bien évidemment proposé à l’adoption. Il est à noter que lors des adoptions, un sachet de granulés ainsi qu'un peu de litière de leur cage d'origine seront donnés aux adoptants pour l'acclimatation de l'animal dans son nouvel environnement et des recommandations telles que l'introduction progressive de la nouvelle alimentation seront données. Pour finir, les étudiants comme les associations permettant la réhabilitation des animaux de laboratoire, recevront le certificat sanitaire de notre vétérinaire référent et l'autorisation triennale de la DDPP.
Remplacement
Il est difficile d'acquérir des compétences en expérimentation animale sans l'utilisation de l'animal in vivo c'est pourquoi un remplacement total n'est pas possible mais un remplacement partiel l'est. En complément de ces expérimentations in vivo et dans un objectif de remplacement, des vidéos seront mises à disposition des étudiants pour qu'ils puissent en plus des enseignements théoriques et pratiques, préparer au mieux leurs interventions / expérimentations avec les animaux.
Réduction
Le nombre de souris utilisé est réduit au minimum. Chaque année, 83 souris seront utilisées et seront subdivisées 9 cages de 8 souris et 1 cage de 9 souris. D'autre part, nous avons choisi de faire travailler les étudiants par groupe de 3 ou 4 étudiants réduisant ainsi le nombre de groupe d'étudiants à 4 par TP. D'autre part, ces 83 souris serviront à 4 expérimentations. Les résultats des différents groupes de TP seront poolés et exploités lors de TPs de statistique.
Raffinement
Durant tout leur séjour au sein de notre établissement, les souris auront à disposition et sans restriction de la nourriture et de l'eau. Elles seront également visitées tous les jours par la personne habilitée au sein de l'établissement et seront également observées et manipulées par les étudiants pendant les TPs. Selon la corpulence des souris, elles pourront être répartie dans un nombre plus important de cages. Au cours de ces visites, les animaux seront observés pour détecter tout comportement de souffrance, d'anxiété, etc... De plus, notre établissement a acquis des objets d'enrichissement tels que des tubes/ tunnel en PVC qui seront préalablement désinfectés, ruban de carton, etc. De la même façon, les étudiants pourront eux-mêmes apporter des objets d'enrichissement. Comme mentionné lors de la justification du choix du sexe des animaux, nous utiliserons uniquement des femelles car elles sont plus faciles à héberger sur le long terme (risque de conflits dus à un stress éventuel ou une hiérarchie instable moindre comparé aux mâles). Enfin le comportement à adopter face aux animaux sera rappelé aux étudiants i.e être calme, manipuler les animaux (handling) avec douceur et patience de façon à les habituer à être manipulés.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle d'étude pour ce projet pour plusieurs raisons : 1- c'est l'un des modèles les plus utilisés en recherches bio-médicales et pharmacologiques (75%) 2- c'est un modèle (globalement) représentatif de la physiologie humaine (proximité phylogénétique entre les espèces). 3- leur comportement face à la manipulation, aux injections de molécules est bien documenté et des dispositifs expérimentaux sont disponibles pour le mesurer. 4- c'est une espèce facile à maintenir en captivité Les animaux utilisés auront au moins 2 mois. Il s'agira donc d'adultes car ils possèdent, théoriquement à ce stade, toutes les capacités exploratrices, psychiques et locomotrices.
Hébergement de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Conservation des espèces
- Enquêtes médicolégales
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 25000
250000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie expédiée aux scientifiques qui les ont commandés et le reste tué. Ce projet d'élevage industriel de lignées génétiquement modifiées prévoit identification, jusqu'à quatre biopsies à l'oreille ou à la queue et des prélèvements sanguins par animal, certaines lignées exprimant un phénotype dommageable comme un diabète, une hémophilie ou une immunodéficience. Le porteur indique que les animaux "appartiennent au scientifique" et ne peuvent être replacés. Il présente l'élevage sur mesure de rongeurs "à fournir aux scientifiques" comme un service rendu à la communauté de recherche.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la création, caractérisation et/ou l’élevage de lignée transgéniques à phénotypes dommageables ainsi que la réalisation d'une biopsie par méthode invasive séparément du geste d'identification sur des lignées transgéniques dans le but d'héberger ou de maintenir des lignées de rongeurs génétiquement modifiés pour le compte de la communauté scientifique. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique comme par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées transgéniques, si la présence d’un phénotype dommageable n’a pas été analysée, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre la gestion optimale des possibles expressions cliniques du phénotype dommageable, leur prévention ou leur traitement adéquat. Lorsque le phénotype dommageable est avéré et connu, la gestion de cette lignée sera adaptée à ce dernier par la définition / surveillance des possibles signes cliniques associés à l'expression de ce phénotype ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée transgénique hébergée/élevée, il est important de connaitre le génotype des animaux, ainsi, en plus de l’identification, une biopsie avec une méthode invasive sera réalisée. Le but de cette biopsie est donc d’analyser le génotype de chaque animal afin de sélectionner celui d'intérêt. En 2022, sur 505 projets transgéniques au total (225 000 animaux), seulement 95 lignées étaient signalées avec un phénotype dommageable (19%, soit 43 000 animaux). Parmi ces 19%, moins de 1% ont réellement exprimé un phénotype dommageable. Ces phénotypes peuvent être catégorisés en tant qu’immunodéficient ; hémophile ; maladie métabolique ; trouble neurologique ; pathologie musculaire et articulaire ou cancer, mais nous ne pouvons prévoir précisément le nombre de lignées par catégories, cela dépend des sujets de recherche des scientifiques. Pour ce projet, nous comptons 250 000 animaux (ajout de 10% en prévision de la hausse d’activité) répartis entre 500 et 600 projets d’élevage de lignées transgéniques différentes. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes dommageables.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux transgéniques (avec un statut génétique et sanitaire connu) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production et de la qualité génétique, sanitaire et zootechnique des animaux génétiquement altérés à fournir aux scientifiques pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : A une identification unique, acte d’une durée maximale de 20 secondes, à maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute, à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute. Un hébergement isolé peut être nécessaire en cas d’animal fragile ou d’animal agressif. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Expression possible d’un phénotype dommageable due à la mutation génétique (immunodépression, arthrite, diabète, hémophilie, …). Chaque effet indésirable est notifié si connu à l’arrivée des animaux ou estimé lors de l’hébergement. Un suivi adapté et des mesures de raffinement spécifiques sur avis vétérinaire sont mis en place en fonction de l’impact observé / attendu chez l’animal. Sur la base du suivi rapproché effectué sur ces souches et des raffinements mis en place, la nuisance sur l’animal est légère à modérée. Stress suite à la contention pour identification Douleur et stress dus aux biopsies (nombre maximum de 4) si besoin d’identifier le génotype d’intérêt. La biopsie à l’oreille est privilégiée (environ 3mm x 3mm ou languette de 5mm de large maximum, plusieurs biopsies peuvent être faite si nécessaire et justification, âge minimum : 7 jours). Compte tenu de la taille de la biopsie et de la zone (oreille peu sensible), la nuisance sur l’animal est légère. Les biopsies à la queue sont possibles sur justification scientifique (biopsies de queue de 5mm maximum, une 2eme biopsie peut être réalisée sous justification du scientifique, âge minimum : 7 jours). Compte tenu de la taille de la biopsie et de la zone, la nuisance sur l’animal est légère pour les animaux de moins de 3 semaines (queue peu sensible) et modérée pour les animaux de plus de 3 semaines. Douleur et stress dus aux prélèvements de sang (volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur et les bonnes pratiques et raffinements internes). Une anesthésie pourra être appliquée en fonction du lieu du prélèvement. Hébergement isolé la période de récupération post opératoire pour les femelles réimplantées ou en cas d’agressivité au sein du groupe social afin de limiter la douleur et le stress liés à cette agressivité. Mise en place d’enrichissements supplémentaires et adaptés en cas d’hébergement isolé.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet (par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction), ou d’éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels).
Raffinement
Les observations par le personnel permettent d’évaluer le stress, la douleur et la souffrance et d’y répondre au plus vite en contactant les techniciens qualifiés, compétents et le vétérinaire. Si un point limite est atteint, le technicien met en place des soins particuliers, un enrichissement adapté, un isolement et/ou si besoin la mise à mort de l’animal. En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place et géré par des techniciens qualifiés, compétents au suivi vétérinaire des animaux. Les lignées connues pour pouvoir présenter un phénotype dommageable peuvent être observées et vérifiées de manière plus fréquente et plus spécifique avec des points limites et des raffinements précis. Ceci est évalué lors de la caractérisation du phénotype de la lignée ou en lien avec le scientifique en charge de cette lignée et le vétérinaire lorsque le phénotype attendu est connu. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype dommageable, une mise en place de points limites non terminaux est adoptée afin de réaliser un suivi plus précis et plus optimum et la mise en place de soins adaptés (soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, …). Si des animaux présentent des signes cliniques qui peuvent être atténués ou guéris à l’aide d’un traitement, avec accord du scientifique, ce traitement est mis en place. Les animaux déclarant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final afin qu’il puisse gérer selon les règles éthiques et de bien-être animal leur réception et utilisation. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la « Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l'animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s'assurer de sa récupération immédiate.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont les plus développées, les mieux maitrisées et pour lesquelles les données scientifiques sont nombreuses. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables. Ce sont les espèces qui permettent à la communauté scientifique de réaliser un certain nombre d’études en recherche et développement grâce aux données historiques et à leur connaissance de ces modèles animaux. Lors de la caractérisation des lignées, l’observation détaillée et l’analyse de la présence du phénotype dommageable sont réalisées à la naissance, au sevrage et 8 semaines d'âge. Il est également possible de prolonger sur l'âge adulte si les animaux sont conservés plus longtemps. - Hébergement des lignées à phénotypes dommageables fait à tout âge. -Biopsies réalisées le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une recoupe à l’âge adulte peut être demandé par le client. - Prélèvement de sang dans la plupart des cas fait en submandibulaire après 4 semaines d’âge minimum (adulte).
Effet d’anticorps monoclonaux sur la biologie du facteur Willebrand dans un modèle de souris humanisées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
473 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modifiées pour exprimer le facteur Willebrand humain, elles reçoivent l'injection d'un anticorps puis, selon les groupes, des prélèvements sanguins, un test de saignement consistant à couper les trois derniers millimètres de la queue, ou l'observation de la formation de caillots, les gestes les plus invasifs se faisant sous anesthésie sans réveil. Elles sont tuées à l'issue, le porteur jugeant les tests incompatibles avec une réutilisation. Il affirme que les tests sans animaux ne reproduisent pas l'intégralité de la coagulation et vise des anticorps utilisables ensuite chez l'humain.
Objectifs
Le facteur Willebrand est une protéine qui circule dans le sang et qui a un rôle important dans l'arrêt du saignement après une blessure. Lorsqu'il est absent, le caillot sanguin ne se forme pas correctement et par conséquent, les saignements se prolongent. Il existe d'ailleurs une maladie, appelée maladie de Willebrand, dans laquelle les patients n'ont pas de facteur Willebrand ou alors un facteur Willebrand anormal. Dans les deux cas, les patients ont alors une maladie hémorragique qui peut être très sévère. Par contre, à l'opposé, si des personnes ont trop de facteur Willebrand, ils ont un risque augmenté de développer des pathologies thrombotiques telles que les accidents vasculaires cérébraux ou les infarctus du myocarde. De par son rôle important dans cet équilibre entre saignement et thrombose, le facteur Willebrand est une cible intéressante pour essayer de traiter ces conditions pathologiques. On peut effectivement envisager de développer des outils pour réduire la quantité de facteur Willebrand chez les personnes qui ont un taux trop élevé ou au contraire, l'augmenter chez les personnes qui n'en n'ont pas assez. L'objectif du projet réside dans cette dualité et nous avons à notre disposition des molécules (anticorps) qui sont susceptibles de moduler la quantité et la fonction du facteur Willebrand. Nous souhaitons donc tester leur effet dans un modèle murin spécialement développé à cet effet. Nous espérons ainsi identifier certains outils avec la capacité d'augmenter ou de diminuer la quantité de facteur Willebrand ou encore de corriger le défaut de fonction de cette protéine.
Bénéfices attendus
A court-terme, les résultats de cette étude permettront 1) de valoriser un modèle permettant de tester des agents ciblant le facteur Willebrand dans un modèle murin et 2) d'identifier potentiellement des outils biologiques permettant de moduler la fonction et la concentration du facteur Willebrand. A plus long terme, le projet a le potentiel d'identifier des pistes thérapeutiques avec un intérêt soit comme traitement de la maladie de Willebrand, soit comme anti-thrombotiques.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure impliquant plusieurs gestes sur une période de 17 jours maximum. Le premier geste consistera en une prise de sang de petit volume (sous anesthésie), suivi 24H plus tard d'une injection unique de la molécule (anticorps) à tester. Ensuite les souris seront divisées en 3 groupes: Un groupe subira un second prélèvement sanguin à différents temps. Selon les animaux, ce prélèvement interviendra entre 24H et 14 jours après l'injection de l'anticorps. Chaque souris ne sera prélevée que 2 fois en tout. Les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie et les souris seront euthanasiées à l'issue du second prélèvement. Pour un second groupe de souris, 1 heure après l'injection de l'anticorps, le temps de saignement des souris sera mesuré. Ce test réalisé sous anesthésie consiste à couper les 3 derniers millimètres de la queue de la souris et à mesurer la quantité de sang perdu en 30 minutes. A l'issue du test, les souris toujours sous anesthésie seront euthanasiées par les méthodes réglementaires. Pour le troisième groupe de souris, 1 heure après l'injection de l'anticorps nous regarderons comment des caillots sanguins peuvent se former dans les vaisseaux au niveau de l'abdomen pendant une durée de 60 minutes. Au terme des 60 minutes, les souris toujours sous anesthésie seront euthanasiées par les méthodes réglementaires.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent expérimenter une légère douleur transitoire pendant et après les injections. Au moment des prélèvements de sang, les souris seront sous anesthésie. Enfin, les derniers gestes qui sont les plus invasifs (tels que le test de saignement) se feront entièrement sous anesthésie et seront sans réveil puisque les souris anesthésiées seront directement euthanasiées.
Devenir
Les tests pratiqués ne sont pas compatibles avec une ré-utilisation potentielle des animaux.
Remplacement
La coagulation est un processus complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, que ce soit les cellules sanguines, les protéines qui circulent dans le sang mais aussi la paroi des vaisseaux sanguins. Actuellement les tests disponibles qui ne font pas appel aux animaux, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus.
Réduction
Afin de déterminer le nombre d’animaux approprié pour le projet, nous avons réalisé une analyse de puissance. Les hypothèses sous-jacentes à nos calculs sont basées sur la littérature existante et sur notre expérience des modèles expérimentaux et de la variabilité qui leur est associée. Le nombre d'anticorps monoclonaux qui sera testé a été limité à 10. Nous avons sélectionné les anticorps les plus intéressants sur la cinquantaine d'anticorps dont nous disposons. Cette pré-sélection a été réalisée grâce à des tests in vitro
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et la procédure aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet. Les points limites susceptibles d'entraîner l'euthanasie immédiate de l'animal seront les suivants: Hyperalgésie après les injections et les prélèvements, visible par une agitation importante de la souris ou manifestation hémorragique qui serait visible par un écoulement de sang au niveau oculaire/nasal. Pendant le reste de la procédure (3-17 jours), observation quotidienne des animaux (1 fois pendant le week-end): Décision d'euthanasie si un des critères suivants est noté: 1) perte de 20% du poids par rapport à la veille, 2) poils hérissés ou 3) état apathique.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à un modèle murin exclusif, récemment développé et qui exprime le facteur Willebrand humain dans la souris. A l'exception de modèles de primates non humains, il s'agit du seul modèle qui permette d'utiliser des anticorps contre le facteur Willebrand humain in vivo, outils qui pourraient ensuite être utilisés chez l'homme. Des souris des deux sexes, allant d'un âge entre 4 et 16 semaines seront utilisées.
Etude de l’impact d’un traitement à l’érythropoïétine sur la réponse immunitaire anti-cancéreuse chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
400 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'érythropoïétine, pour une partie une greffe de cellules de cancer mammaire triple négatif et des injections rétro-orbitaires, ainsi que des prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour prélever un maximum d'organes. L'objet du projet est de comprendre comment l'érythropoïétine, donnée aux patients cancéreux anémiques, altère la réponse immunitaire anti-tumorale. Le porteur affirme qu'aucun système ne reflète la complexité des interactions entre cellules immunitaires et tumorales.
Objectifs
Chez les patients atteints de cancer et traités ou non par chimiothérapie, une anémie peut se développer. Afin de pallier cet effet secondaire, les patients reçoivent de l'érythropoïétine (EPO) améliorant ainsi leur qualité de vie. Cependant, plusieurs méta-analyses récentes ont montré qu’à la suite du traitement à l’EPO, certains patients pouvaient présenter une réduction de survie globale indépendamment du type de cancer ou du protocole de chimiothérapie. Nous savons maintenant qu’en plus de l’augmentation de la production de globules rouges, l’EPO agit sur de nombreuses autres cellules et notamment les cellules immunitaires. L’EPO affecte négativement la réponse immunitaire de souris greffées avec des cellules de carcinome mammaire triple négative, les plus difficiles à traiter et a notamment un effet systémique sur les lymphocytes T qui ont un role central dans la réponse immunitaire anti-cancéreuse. Nous souhaitons maintenant caractériser, dans ce modèle murin, les altérations induites par le traitement à l’EPO sur un autre type de cellules immunitaires importantes dans la réponse anti-tumorale : les cellules Natural Killer.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de caractériser l’impact de l’EPO sur les cellules NK. Cela nous permettra de mieux comprendre les effets secondaires indésirables que certains patients atteints de cancer peuvent développer suite au traitement de leur anémie par l’EPO et par la suite donc de traiter seulement les patients qui ne développeront pas ces effets indésirables.
Procédures
pro40 femelles C57BL/6J subiront tous les deux jours une injection sous cutanée pendant 14 jours (moins de 20 secondes) et 1 prélèvement sanguin caudal (J13) (moins d'une minute). 200 femelles C57BL/6J subiront trois fois par semaine (lundi mercredi et vendredi) une injection sous cutanée pendant 14 jours (moins de 20 secondes), une injection intrapéritonéale d'un adjuvant (J13) (moins de 20 secondes) et 1 prélèvement sanguin caudal (J13) (environ 30 secondes). 80 femelles C57BL/6J subiront une injection sous cutanée trois fois par semaine pendant 15 jours (moins de 20 secondes), une injection intrapéritonéale d'un adjuvant (J13) (moins de 20 secondes), 1 prélèvement sanguin caudal (J13) (environ 30 secondes) et une injection rétro-orbitaire de cellules cibles sous anesthésie gazeuse (J14) (environ 3 min). 80 femelles C57BL/6J subiront une injection sous cutanée trois fois par semaine pendant 35 (moins de 20 secondes), une injection de cellules tumorales (J14) (moins de 20 secondes) et deux prélèvements sanguins (J13 et J34) (environ 30 secondes)
Impact sur les animaux
Lors des premières injections, les souris peuvent être légèrement stressées au moment de la contention. Les injections sous cutanées, intrapéritonéales et intradermiques engendrent une douleur légère et de très courte durée. L’injection rétro-orbitaire s’effectuant sur animal anesthésié, la douleur après réveil due à ce geste est légère et de courte durée. La croissance tumorale peut être dans certains cas, gênante mais nous n’avons jamais observé chez ces souris de douleurs importantes. Les prélèvements sanguins au niveau de la veine caudale induisent une douleur légère et de très courte durée.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever le maximum d'organes pour l'étude des cellules natural Killer qui représentent une population minoritaire.
Remplacement
Notre projet vise à évaluer l’effet de l’Erythropoïétine sur la réponse immunitaire anti-tumorale. A ce jour, il n’existe pas de modèle et de système permettant de refléter la complexité des interactions entre les cellules immunitaires et les cellules tumorales. L’expérimentation animale s’avère donc nécessaire.
Réduction
Dans notre étude, chaque souris sera utilisée pour analyser un maximum de tissus. Le premier type d'expérimentation qui s’effectue dans un contexte non pathologique, nous permettra dans un premier d’étudier l’effet de l’Erythropoïétine sur le développement des cellules Natural Killer dans la moelle osseuse mais également dans les organes lymphoïdes secondaires (ganglions lymphatiques et rate) et dans le sang. Dans un deuxième temps, nous analyserons l’effet de l’Erythropoïétine sur leurs fonctionalités grâce à des tests in vitro d’activation en présence d’anticorps activateurs ou de cellules cibles. La rate et le sang seront prélevés afin d’obtenir le maximum de cellules Natural Killer qui représentent une population cellulaire minoritaire. Enfin, nous analyserons l’impact de l’Erythropoïétine sur leurs fonctionalités in vivo grâce à des tests de réjection de cellules cibles obtenues à partir de souris non hébergées dans notre animalerie. Lors de la mise à mort des souris, la rate et le sang seront prélevés également afin de mesurer l’activation des cellules Natural Killer dans ce test in vivo. Nous analyserons ensuite dans un contexte tumoral, l'impact de l'Erythropoïétine sur le développement des cellules Natural Killer dans la moelle osseuse, ainsi que les fonctionalités des ces cellules matures dans les organes lymphoïdes secondaires, dans le sang et dans les tumeurs. Ces analyses multiparamétriques nous permettront de réduire le nombre d’animaux employés tout en conservant une validité statistique appropriée. Etant donné que nous travaillons sur des populations cellulaires minoritaires (les cellules NK représentent environ 3% des cellules présentes dans la rate des souris et 5% des globules blancs du sang), et que certaines souris sont réfractaires au traitement à l’EPO ou à la pousse tumorale (environ 20%), ces études nécessitent 20 souris par groupe et par type d'expérimentation. Ce nombre d’animaux a été calculé selon notre expérience acquise en tenant compte de la variabilité interindividuelle et afin d’obtenir des résultats statistiquement représentatifs.
Raffinement
Toutes les souris du projet bénéficient des conditions d’hébergement, conformes à la réglementation et contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. L’expérience acquise sur ce type d’expérience nous a permis d’établir que l’injection d’EPO n’induit pas de phénotype dommageable chez la souris. De plus nous avons mis en place une grille de points limites adaptée afin d’évaluer le bien être de l’animal et de limiter sa souffrance.
Choix des espèces
La souris Mus musculus est l’espèce la plus utilisée en expérimentation pour étudier l’immunité anti-cancéreuse. De nombreuses bases de données sont disponibles dans la littérature et nos propres résultats servent de base expérimentale pour nos protocoles. Les souris adultes que nous utilisons sont âgées de 7 à 12 semaines, âge auquel le système immuntaire est mature.
Caractérisation cellulaire de l’horloge circadienne chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une injection dans le cerveau profond, sous anesthésie, pour éteindre l'activité de populations de cellules de l'horloge biologique, puis un hébergement isolé de trois semaines avec roue d'activité, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour vérifier le site d'injection. L'objet du projet est de comprendre l'horloge circadienne, en lien avec les troubles liés au travail de nuit. Le porteur reconnaît que le déphasage provoqué peut entraîner fatigue et troubles du sommeil, et renvoie à d'éventuels traitements futurs.
Objectifs
En France, environ 15% de la population active est concernée par le travail de nuit. Ce mode d'organisation du travail augmente les risques de troubles du sommeil et du métabolisme, de cancer ou de problèmes cardiovasculaires et psychiques. Pour répondre à cet enjeu de santé publique, il convient de mieux connaitre l'horloge interne qui régule nos rythmes biologiques en adéquation avec le cycle jour-nuit de 24 heures. Cette horloge circadienne (= "autour du jour") est localisée dans une petite structure du cerveau profond, appelée les noyaux suprachiasmatiques (NSC). Les NSC contiennent environ 10000 cellules nerveuses, douées d'une rythmicité circadienne autonome reposant sur un petit ensemble de gènes, appelés gènes de l'horloge. Alors que les interactions entre ces gènes de l'horloge sont maintenant bien connues et définissent les rouages moléculaires de l'horloge, le rôle des différentes cellules des NSC reste mal connu. Pour répondre à cette question, notre approche expérimentale vise à éteindre l'activité électrique ou à inactiver le mécanisme de l'horloge moléculaire dans des populations cellulaires spécifiques des NSC chez des souris génétiquement modifiées. Notre objectif sera de cibler une dizaine de populations cellulaires différentes et d'identifier lesquelles participent au rythme de locomotion circadienne, mesurée à l'aide d'une roue d'activité dans la cage des animaux.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra d'identifier les cellules régulant les rythmes circadiens, et selon quelle modalité (phase, amplitude, période?). Cette dissection cellulaire de l'horloge circadienne des Mammifères est une étape essentielle pour comprendre le fonctionnement physiologique de l'horloge et son dérèglement pathologique dans le cadre de notre société moderne, active 7 jours sur 7, 24 heures sur 24. A terme, les cellules ainsi identifiées pourraient constituer la cible de traitements adaptés pour accompagner les travailleurs de nuit et les voyageurs souffrant de jetlag. Un autre bénéfice attendu consiste dans l'obtention de nouvelles données sur le rôle du canal NALCN que nous ciblerons pour éteindre l'activité électrique des cellules des NSC. Ce canal ionique est associé à des maladies génétiques rares. Les enfants touchés par ces maladies développent très souvent des troubles du rythme veille-sommeil. Comprendre le rôle précis de NALCN dans l'horloge circadienne serait une avancée majeure pour alléger les conditions de vie de ces jeunes patients et de leur famille, déjà confrontés à des situations très sévères.
Procédures
1. Injection intra-cérébrale sous anesthésie générale : 30-60 minutes. 2. Hébergement en cage individuelle (avec contact visuel avec des congénères) pour mesure du rythme de locomotion volontaire dans une roue d'activité : 3 semaines.
Impact sur les animaux
L'effet attendu des manipulations réalisées est une perturbation de l'horloge circadienne : diminution ou perte totale de la rythmicité circadienne, ou déphasage entre le rythme interne et le cycle jour-nuit extérieur. La perte de rythme n'est a priori pas dommageable sur la durée du protocole. Le déphasage peut provoquer une fatigue liée à des troubles du sommeil. Sur le long terme, le développement d'un syndrome métabolique (diabète, obésité) ou au contraire un amaigrissement est possible, ainsi qu'un risque accru de cancer est possible. Cependant, ces effets extrêmes ne sont pas envisageables en quelques semaines. La nuisance potentiellement causée par la procédure chirurgicale d'injection stéréotaxique sera traitée par anesthésie/analgésie et surveillance des animaux
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour réaliser une vérification histologique du site d'injection.
Remplacement
Le fonctionnement moléculaire de l'horloge a déjà été largement étudié in vitro. Mais comprendre l'impact de ce mécanisme dans des cellules spécifiques au sein d'un organisme nécessite le recours aux modèles animaux. Ici, nous regarderons comment une manipulation cellulaire dans le cerveau profond modifie le rythme repos-activité chez la souris. Les résultats expérimentaux que nous obtiendrons révéleront la complexité fonctionnelle de l'horloge circadienne. Ces données pourront servir de base pour une modélisation réaliste de ce système.
Réduction
Pour chaque groupe expérimental, la quantité totale d'activé sera mesurée en condition d'éclairage jour-nuit, puis d'obscurité constante. Les paramètres du rythme d'activité locomotrice, directement liés à l'horloge, seront évalués sous ces conditions d'obscurité constante (= conditions de libre cours) : 1. Analyse qualitative : le rythme circadien d'activité est-il préservé ou aboli? 2. Analyse quantitative : si une rythmicité est préservée, la période du rythme en conditions de libre cours sera le paramètre limitant. Nous avons réalisé une étude statistique pour estimer la taille nécessaire de nos groupes expérimentaux.
Raffinement
L'injection stéréotaxique de petits volumes (1 µl) dans les NSC est largement documentée, et maitrisée dans notre équipe. Cette opération est conduite sous anesthésie générale de l'animal, et est suivie d'une observation accrue pendant la phase de réveil, avec utilisation d'analgésiques et per- et post-opératoire. La mesure de l'activité locomotrice implique l'hébergement en cage individuelle, équipée d'une roue d'activité. Pour limiter l'isolement social, les animaux garderons un contact visuel avec leurs congénères. D'autre part, l'accès à la roue constitue un enrichissement des conditions d'hébergement très apprécié. Les animaux seront observés visuellement de façon quotidienne. En plus des signes de souffrance couramment recherchés (prostration, poil hérissé, amaigrissement), nous utiliserons la mesure d'activité locomotrice comme point limite spécifique à la procédure mise en œuvre : toute souris parcourant une distance inférieure de 50% à celle parcourue par des souris contrôles sera pesée et observée plus en détail. En fonction des signes cliniques observés, la souris aura accès à une nourriture hydratée et/ou un analgésique adapté. Nous ne nous attendons pas à un degré de souffrance justifiant la mise à mort des animaux, mais si une souris devait atteindre un poids inférieur de 15% au poids avant l'opération, alors elle sera euthanasiée par dislocation cervicale.
Choix des espèces
La souris est un modèle mammifère de choix, donnant accès à un grand nombre de lignées génétiquement modifiées. Ici les lignées Bmal1-flox et Nalcn-flox sont uniques et particulièrement adaptée pour répondre à la question posée. D'autre part, la mesure de l'activité locomotrice volontaire dans des cages à roue est un outil très largement utilisé en chronobiologie pour évaluer le fonctionnement de l'horloge circadienne des rongeurs. Souris jeunes adultes (7-8 semaines), lorsque la croissance est terminée pour des coordonnées stéréotaxiques fiables.
Etude de l’efficacité de la Méfloquine et de ses enanthiomères contre M. avium sur un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
110 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont une partie atteint un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par aérosol avec la mycobactérie M. avium puis gavées d'antibiotiques cinq jours par semaine pendant un à quatre mois, la répétition quotidienne des gavages justifiant à elle seule la gravité sévère. Elles sont tuées à la fin du traitement pour mettre leurs poumons en culture et mesurer l'efficacité des molécules. Le porteur affirme n'avoir pas observé de nuisance liée à l'infection et juge qu'il n'existe "pas de solution alternative satisfaisante".
Objectifs
L'objectif principal du projet est de déterminer l'efficacité de la méfloquine et de ses énanthiomères contre les infections respiratoires à Mycobacterium avium (M. avium). Les objectifs secondaires sont de déterminer les meilleures combinaisons de traitements avec l'omadacycline et de décrire l'anatomie pathologique sous ce(s) traitement(s).
Bénéfices attendus
La méfloquine et ses dérivés ont déjà montré une efficacité in vivo sur M. avium, mais l'efficacité en combinaison avec les antimycobactériens de références reste à démontrer. Si notre hypothèse de travail est correcte, notre projet permettra de mettre en évidence une combinaison plus efficace que le traitement de référence, ce qui permettra d'informer à court terme d'autres études expérimentales sur des combinaisons à tester et leur durée de traitement, mais également à moyen terme les essais cliniques thérapeutiques pour des patients en grand besoin de traitements plus efficaces et mieux tolérés dans cette indication.
Procédures
Il n'est pas prévu de prélèvement sanguin ou d'intervention chirurgicale. En revanche les souris seront infectées par des aérosols de mycobactérie (durée 120mn) et seront par la suite traitée par différents antibiotiques afin de déterminer leur efficacité. Si l'infection par aérosol est indolore, l'administration des antibiotiques se fait par voie orale (à la seringue). Ces administrations sont répétés tous les jours (durée 5 à 10 secondes), cinq jours par semaine pendant 1 mois, 2, 3 ou 4 mois pour certaines souris.
Impact sur les animaux
Les gavages et injections étant répétés quotidiennement amènent la procédure à être classée sévère. Lors de nos précédentes expérimentations, nous n'avons pas observé de nuisance dûe à l'exposition à M. avium. Des points limites spécifiques sont mis en place en fonction de nos précédentes observations sur ce type de protocole.
Devenir
Afin de pouvoir tester l'efficacité des antibiotiques les animaux doivent être infectés puis traités. Après la durée de traitement prévue dans le protocole il est nécessaire de mettre en culture les poumons afin de mesurer l'efficacité des antibiotiques. Tous les animaux sont donc mis à mort à la fin de la durée de traitement.
Remplacement
La procédure de préhension et de gavage sera apprise sur une souris fictive jusqu'à ce que les personnes formées soient à l'aise avec ces procédure. Des analyses in vitro ont été réalisées en amont pour sélectionner les candidats, mais à ce jour, il n'existe pas de solution alternative satisfaisante pour remplacer les animaux dans cette indication.
Réduction
Le nombre de souris est calculé au plus proche de ce qui est nécessaire pour voir une différence significative entre les groupes de traitement.
Raffinement
Les mesures de raffinement suivantes seront prises pour diminuer la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux. Les souris seront suivies quotidiennement. Dans la cas où une douleur serait observée, les souris auront une injection d'analgésique une fois par jour jusqu'à normalisation de l'échelle de la douleur. Dans le cas d'une aggravation des signes de douleur, les souris concernées seront euthanasiées. Nous avons défini des points limites spécifiques au gavage. Les souris seront gardées dans des cages collectives (en respectant la limite de souris par cage) et enrichies (litières foisonnantes et absorbantes, tunnels, …). Nourriture et boisson seront ad libitum.
Choix des espèces
Dans notre étude précédente la souris BALB/c était le modèle animal répondant le mieux à l’antibiothérapie semblant le plus se rapprocher des données humaines. Il n'est pas justifié d'utiliser des modèles de souris immunodéprimées (ou d'autres espèces animales) moins semblables aux données cliniques.