Souris

900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 720 tuées à l'issue et 180 expédiées vers des laboratoires clients. Ce prestataire induit à la demande des tumeurs mammaires par injection de cellules cancéreuses, avec un suivi par imagerie, des traitements répétés et des prélèvements sanguins, puis la mise à mort pour analyses. Le porteur décrit une offre de modèles tumoraux facturée à des chercheurs extérieurs, justifiée par 400 animaux déjà utilisés lors d'une autorisation précédente. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace "l'animal entier" pour étudier la biodistribution d'un composé.

Objectifs

Ce projet a pour but de mettre en œuvre, à la demande de chercheur extérieurs à notre laboratoire, des modèles de cancer mammaire et de les étudier par imagerie in vivo, à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou pour l'évaluation de nouveaux médicaments.

Bénéfices attendus

Le projet représente un ensemble d’études types qui pourront viser à comprendre des mécanismes impliqués dans la progression tumorale ou à évaluer l'efficacité thérapeutique de nouveaux traitements.

Procédures

Induction de cancer mammaire : 1 seule injection par animal, cellules injectées sous anesthésie gazeuse dans le coussinet mammaire des souris. Cette procédure dure moins de 5 minutes. Suivi par imagerie : au maximum 2 examens non invasifs par semaine pendant 9 semaines sous anesthésie générale soit 18 examens d’imagerie au maximum par animal dans une étude. Pour les techniques d’imagerie les plus longues, le temps est de 20 minutes maximum par examen. Traitements : au maximum 5 traitements par semaine pendant 6 semaines par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse sur animal vigile. Il faut 30 secondes au maximum pour administrer un traitement. Au cours d’une étude, un animal recevra au maximum 30 traitements. Prélèvement de sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire volume maximal de 130μL(en 3 fois sur 24h ou en 1fois/jour sur 5 jours) pour une souris de 25g en alternant les joues gauche et droite .Il faut environs 30 secondes pour effectuer ce type de prélèvement et appliqué un point de pression avec un crayon hémostatique au point de collecte pour arrêter le saignement. On estime qu’un animal aura au maximum 9 prélèvements de sang sur 9 semaines d’étude.

Impact sur les animaux

Les dommages attendus sont liés au développement d'une tumeur mammaire et éventuellement à l'apparition de foyers tumoraux secondaires (dans les ganglions lymphatiques, le sang, le foie, les poumons, le cerveau, et les os). Néanmoins, ces foyers, qui peuvent être détecé par imagerie de bioluminescence.apparaissent lorsque la tumeur primaire est déjà proche de l’atteinte d’un point limite (>2cm3 ou apparition de nécrose). Les dommages attendus sont donc essentiellement liés à la tumeur primaire. Nous mettrons en place un suivi ainsi que des points limites pertinents permettant d’anticiper toute douleur ou stress qui pourrait être provoqué chez l’animal. La douleur infligée par l’injection des cellules et réactifs pour l'imagerie et les traitements, correspond à celle d’une piqûre d’aiguille. On s’assurera auprès du client que les molécules sont déjà connues pour leur non toxicité. Les molécules nouvelles seront testées au préalable selon un projet spécifique pour vérifier la tolérance avant de débuter ce type d’études en modèle cancéreux. De plus, les souris seront suivies grâce à nos grilles de scoring pour surveiller l’apparition d’effet secondaire tels que la perte de poids, modification de la physiologie ou du comportement.

Devenir

Les animaux de 3 études (180 animaux) seront uniquement induits pour des tumeurs, hébergés dans nos locaux pendant 1 semaine minimum, le temps de leur récupération complète. Il n'y aura aucun acte d'imagerie. Ils pourront ensuite être fournis à des clients demandeurs de ce modèle pour des travaux expérimentaux réalisés dans leurs locaux. Nous leur fournirons la grille de scoring des animaux de la semaine précédent l'envoi dans leurs EU. Les animaux de 12 études ( 60 x 12 =720 animaux) seront mis à mort à l'issue de la procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour une autre étude.

Remplacement

Aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable. Avant de débuter les études chez l’animal, des tests d’efficacité in vitro seront effectués par nos clients sur des cellules de cancer mammaires en culture. Ainsi, les molécules qui ne présentent pas d’effet in vitro ne seront pas testées in vivo. De plus nous justifions l’utilisation de 900 animaux sur 5 ans puisque lors des 3 dernières années dans une DAP similaire à présent expirée, nous avons utilisé 400 animaux pour des études clients qui ont d’ores et déjà prévu de tester des candidats médicaments très prochainement.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous mettons en œuvre des techniques d’imagerie (bioluminescence, échographie, scanner, photoacoustique, imagerie radioisotopique, imagerie par résonnance magnétique, imagerie de fluorescence) qui permettent de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris.

Raffinement

Les animaux seront observés scrupuleusement et des points limites prédictifs (perte de poids >20%, nécrose de la tumeur, volume tumoral >2cm3, aspect général, physiologie clinique, locomotion) nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance au cours de l’expérimentation. De plus, durant les examens d'imagerie et l'induction du modèle tumoral dont la douleur est similaire a une piqure d’aiguille, les souris seront anesthésiées. Les symptômes potentiels liés au traitements sont principalement une légère perte de poids. Enfin, les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé, ce qui empêchera l’expression du phénotype dommageable des souris immunodéficientes, enrichies avec du celluron (Les souris utilisent chaque semaine ce petit cylindre de coton pour la fabrication d’un nid). Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

Certains types de tumeurs mammaires utilisées sont injectés à des modèles immunodéficients ce que l’on ne retrouve pas chez toutes les espèces mais quasiment uniquement chez la souris. Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses humaines et murines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 - 6 semaines, stade où les bourgeons mammaires ne sont pas complètement développés et où les conditions hormonales de la souris sont adéquates pour la croissance tumorale.

225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire le syndrome de Dravet, elles présentent des crises d'épilepsie spontanées entraînant une mort subite chez 35 % d'entre elles, subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes corticales et des tests comportementaux dont 44 immersions forcées dans l'eau sur vingt jours. Elles sont tuées en fin de procédure, aucune ne pouvant être réutilisée après un mois de traitement. Le porteur affirme, en citant le NC3Rs, que les crises ne seraient pas ressenties comme douloureuses, et juge le modèle murin "indispensable".

Objectifs

Le syndrome de Dravet est une épilepsie d'origine génétique qui apparaît avant l'âge de 1 an. Les crises épileptiques sont le plus souvent associées à des difficultés d'apprentissage et de coordination motrice ainsi qu'à des troubles de type autistique ou encore anxieux. Ce syndrome est dû, dans 80% des cas, à une mutation qui affecte le fonctionnement d'un canal sodique localisé majoritairement dans la membrane de neurones inhibiteurs et qui joue un rôle primordial dans la régulation de leur excitabilité. Plusieurs équipes, incluant la nôtre, ont montré que les mutations de ces canaux d'intérêt entraînaient une baisse de l'excitabilité des neurones inhibiteurs à l'origine des crises d'épilepsie. Notre projet de recherche a pour objectif d'évaluer l'efficacité d'un nouveau traitement chronique précoce sur le développement des différents symptômes dans un modèle murin du syndrome de Dravet. En effet, un grand nombre de patients atteints du syndrome de Dravet n'ont pas d'amélioration de la fréquence et de la sévérité de leurs crises épileptiques avec les traitements pharmacologiques actuels. De plus, les effets de ces traitements sur les troubles associés ont très rarement été évalués. Nous disposons d'un modèle de souris déficientes pour les canaux d'intérêt dont le phénotype récapitule les symptômes observés chez les patients atteints du syndrome de Dravet. Le traitement chronique est un peptide de synthèse résistant à la dégradation et qui se fixe sur les récepteurs d'un neuropeptide abondant dans un type de neurones inhibiteurs et qui est capable d'augmenter l'excitabilité des autres neurones inhibiteurs. Notre stratégie est de potentialiser l'effet des neurones inhibiteurs contenant le neuropeptide en administrant ce traitement et ainsi s'opposer à la baisse de l'excitabilité des autres neurones inhibiteurs, mécanisme central dans le syndrome de Dravet.

Bénéfices attendus

C'est une nouvelle piste thérapeutique qui pourrait permettre d'améliorer la pharmacorésistance observée chez les patients atteints du syndrome de Dravet. En effet, il existe un grand nombre de patients atteints du syndrome de Dravet dont la fréquence et la sévérité des crises épileptiques ne diminuent pas avec les traitements pharmacologiques actuels, y compris les traitements en cours d'essais cliniques. De plus, les effets de ces traitements sur les troubles associés (anxiété, autisme, troubles moteurs...) ont très rarement été évalués alors qu'ils constituent une part importante des symptômes.

Procédures

Deux groupes de 14 souris mutantes subiront une chirurgie sous anesthésie générale afin d'implanter à la surface du cortex des électrodes permettant l'enregistrement de l'activité électrique et donc de détecter les crises épileptiques. Cette chirugie dure moins d'1h. La majorité des tests comportementaux qui seront utilisés sont basés sur la tendance naturelle des rongeurs à explorer un nouvel environnement et se feront en une seule session (5 à 30 min). Trois tests d'apprentissage (moteur, environnement spatial ou conditionnement) seront réalisés en 1 à 3 sessions sur 2 ou 5 jours. L'un des test d'apprentissage spatial se déroulera sur 20 jours (dont 5 jours sans manipulation) et impliquera d'immerger les animaux dans une eau à 23°c (pour 1 min maximum par essai. (4 essais quotidiens x5)+2 immersions, protocole répété une fois = 44 immersions sur 20 jours). Le test comportemental réalisé en dernier (mesure continue de l'activité spontanée de l'animal sur la durée du cycle circadien) requiert que les souris soient placées en cage individuelle pendant 3 jours.

Impact sur les animaux

La lignée de souris génétiquement modifiée que nous utiliserons présente des crises d'épilepsie tonico-cloniques spontanées à partir d'environ 3 semaines après la naissance. Les souris sont particulièrement vulnérables à ces crises au cours de cette période du développement jusqu'à environ 40 jours après la naissance, ce qui, dans 35% des animaux, conduit à une mort subite (SUDEP) sans souffrance. Cette mortalité est également constatée chez les enfants atteints du syndrome de Dravet. Les crises d'épilepsie dans le syndrome de Dravet sont des crises généralisées (ç-à-d impliquant l’ensemble du cerveau), et, sont, par définition, associées à une perte de conscience. Cette perte de conscience explique pourquoi les crises tonico-cloniques ne sont pas ressenties comme douloureuses chez les patients et c’est très vraisemblablement le cas dans les modèles animaux, comme cela est expliqué dans un article sur les modèles d’épilepsie du National Centre for Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs). Les crises tonico-cloniques sont de courte durée (entre 20 et 30 s) et les animaux récupèrent rapidement (2 à 5 min). En d’autres termes, les souris sortent progressivement de leur état d’inconscience et se mettent à bouger petit à petit sans qu’il y ait de signes évidents de souffrance (pas de posture, cri ou expression faciale de douleur). La fréquence des crises spontanées dans ce modèle murin est d'1crise tous les 2 jours.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés pour ce projet seront euthanasiés en fin de procédure. En effet, nous ne pouvons pas réutiliser des animaux ayant reçu un traitement chronique pendant 1 mois ou plus. De plus, pour les études comportementales, les animaux (contrôles ou traités) doivent être naifs pour chacun des tests utilisés.

Remplacement

Afin de répondre au principe de remplacement, nous réaliserons, parallèlement aux expérimentations in vivo, des études in vitro sur cultures cellulaires permettant de caractériser l'interaction entre nos canaux d'intérêt et le système neuropeptidergique ciblé par le traitement. L’utilisation d'un modèle animal in vivo reproduisant le phénotype clinique décrit chez les patients atteints du syndrome de Dravet est cependant indispensable à l'objectif de notre projet, à savoir évaluer l'efficacité d'un nouveau traitement pharmacologique sur l'ensemble des symptômes (épileptiques et non épileptiques) observés dans ce syndrome.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux nécessaires dans chacune des 2 procédures tout en s'assurant d'avoir le nombre suffisant pour interpréter nos expériences sur le plan statistique (analyse a priori via le logiciel Gpower). Dans toutes les procédures, nous comparerons les résultats obtenus chez les souris mutantes à ceux obtenus chez les souris contrôles issues des mêmes portées. Dans une des procédures, nous utiliserons aussi bien les femelles que les mâles d'une même portée car il n'a pas été constaté de différences entre les sexes concernant les troubles épileptiques chez ces souris. Dans l'autre procédure, seuls des mâles seront utilisés pour les tests comportementaux et les femelles produites seront utilisées pour les expériences in vitro.

Raffinement

Toutes les mesures de raffinement appropriées seront prises pour éviter toute souffrance ou inconfort à l’animal. Ainsi, toutes les souris seront élevées dans un environnement enrichi (social et physique) et une manipulation régulière des animaux sera réalisée afin de réduire leur stress. Concernant les animaux soumis à la procédure chirurgicale, ils seront réchauffés grâce à un tapis chauffant avant, pendant et après l’intervention afin d’éviter la perte de température corporelle due à l’anesthésie. Un anti-inflammatoire sera administré dans l'eau de boisson pendant la période post-opératoire et un suivi journalier permettra d’évaluer leur état de santé et ainsi d’intervenir rapidement par rapport aux points limites définis (voir champ 4, procédure 1). Enfin, compte tenu du fait que les souris mutantes présentent des crises tonico-cloniques spontanées, une attention particulière sera portée aux critères de poids, de stress et d’hyper-réactivité comme recommandé par le NC3Rs pour les modèles d’épilepsie avec crises spontanées.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris déficientes en nos canaux d'intérêt avec un fond génétique 100% C57Bl/6J. Cette lignée sera issue du croisement de 2 lignées parentales ne présentant pas les symptômes caractéristiques du syndrome de Dravet. La souris C57Bl/6 est une espèce très largement utilisée pour les études in vivo. Nos études s'appuieront donc sur des protocoles déjà décrits dans la littérature. L'évaluation du potentiel thérapeutique du peptide de synthèse sur les troubles épileptiques et non épileptiques débutera avant l'apparition des crises d'épilepsie chez les souris mutantes. Le traitement chronique débutera par conséquent à 17jours après la naissance (P17) et se terminera à l'âge adulte (vers P60-70) à la fin des procédures.

11520 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à deux chirurgies cérébrales pour induire une maladie à alpha-synucléine puis recevoir une thérapie génique, avec un suivi comportemental locomoteur, avant la mise à mort et l'étude histologique du cerveau. Le porteur indique que ces modèles neurodégénératifs n'entraînent "pas de symptôme marqué", les atteintes étant surtout moléculaires. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le développement des synucléinopathies et espère restaurer le "nettoyage" des neurones contre Parkinson.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (MP) ou l’atrophie multisystématisée (AMS) sont caractérisées par l’agrégation d'une protéine mutée dans différents types cellulaires. Ces agrégats, toxiques pour les cellules, provoquent après accumulation des symptômes moteurs tels qu’une rigidité musculaire, une difficulté/incapacité à initier le mouvement , mais aussi des symptômes non-moteurs comme un état dépressif ou des troubles digestifs. Actuellement, ces maladies neurodégénératives ne possèdent pas de traitement curatif, mais seulement des traitements symptomatiques ayant un effet limité, accompagné d’effets indésirables. Le but de ce projet est de développer un outil thérapeutique visant à restaurer la voie de nettoyage des neurones en permettant ainsi de dégrader les agrégats protéiques.

Bénéfices attendus

La maladie de Parkinson touche plus de 100.000 personnes en France, dont 80% sont âgées de plus de 65 ans. Au cours des années à venir nous allons observer une augmentation importante du nombre de cas en raison du vieillissement de la population et de l'amélioration de l'espérance de vie. De ce fait la découverte d’un traitement curatif (et non symptomatique) est un des grands axes de la recherche. Ce projet novateur ayant pour but de développer un traitement curatif a certains types de maladies neurodégénératives, grâce à des outils permettant de rétablir le fonctionnement des voies de dégradation de protéines agrégées de façon anormales par les neurones. Nous espérons, grâce à notre traitement rétablir l’activité de dégradation et de "nettoyage" dans les neurones et donc éviter la neurodégénérescence chez des modèles animaux de maladies neurodégénératives.

Procédures

Les animaux subissent deux intervention chirurgicales au maximum, avec une durée de 30 minutes, qui correspondent à la création des modèles et le traitement. Une étude de comportement simple locomoteur, non invasif et non contraignant sera réalisée pendant ce projet, afin d'avoir un suivi de l'évolution du modèle et de l'impact du traitement.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent au maximum deux chirurgies d'une durée de 30 minutes maximum chacune, correspondant à l'induction du modèle et au traitement. Les nuisances peuvent être liées à la chirurgie : récupération post-anesthésie, hypothermie, déshydratation, infection de la plaie, mais sont bien encadrés par une analgésie et une anesthésie controlées et par un suivi des animaux postopératoire sur 3 jours minimum. De plus ces modèles neurodégénératifs n'entrainent pas de symptome marqué, en effet les désordres sont plutôt visibles à l'échelle moléculaire.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser une étude histologique détaillée du cerveau et ainsi de déterminer l'éfficacité du traitement.

Remplacement

Dans le respect du R de remplacer, dans l’état actuel des connaissances, nous ne pouvons pas nous passer d’animaux vivants, car il n’est pas possible de mimer le développement spatiotemporel des synucléinopathies dans des modèles in vitro. L’impact bénéfique potentiel sur l’accumulation d’α-synucléine et donc sur le fonctionnement cérébral et la survie neuronale ne peuvent être évalués que chez l’animal.

Réduction

Des études pilotes ont été effectuées au préalable pour confirmer l’activation des lysosomes après injection de plasmide TFEB, et pour confirmer l’absence de toxicité chez l'animal. Tests statistiques : toutes nos études sont réalisées avec un nombre d’animaux minimum mais suffisant pour pouvoir obtenir des résultats qui sont statistiquement représentatifs, et ainsi limiter la répétition des d’études.

Raffinement

Acclimatation : une période de deux semaines permet une bonne acclimatation des animaux à leur nouvel environnement. Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers ou les expérimentateurs afin de détecter tout inconfort ou souffrance en observant l’aspect physique, l’état du poil, la vigueur, la nutrition, l’hydratation et le comportement social des animaux. Chirurgie : une attention particulière est apportée pour un maintien de l'asepsie pendant la période opératoire. Les animaux sont anesthésiés (Isoflurane, induction 4% 1,5l d’air/min et maintien à 1% 0,4l d’air/min) pendant la chirurgie, ils animaux reçoivent un couverture analgésique une demi-heure avant l’intervention et après l’intervention ainsi que le lendemain . Un suivi post-opératoire est dans tous les cas réalisé grâce à une fiche de scorage qui évalue la perte de poids, la mobilité, les interactions avec les congénères, aspect du poil (0 mauvais, 1 moyen, 2 bon). Les points limites adaptés sont pour les deux espèces : une mobilité réduite voir difficile suite à la chirurgie, une attitude de repli, une allure du poil terne et mal nettoyé, difficulté à récupérer le poids initial, dans les jours suivant la chirurgie. Les animaux sont pesés de manière hebdomadaire pendant toute la durée de l’étude. Si malgré les soins concernant la chirurgie (plaie), les scores restent mauvais durant deux jours consécutifs, si une lésion cutanée s’étend et s’infecte, une décision d’euthanasie est prise par l'expérimentateur en accord avec le personnel zootechnique. Si un constat de stéréotypie est fait, des éléments d’enrichissement comme des roues sont proposés à l’animal. Si cela n’améliore pas son état au bout de 48h, il sera mis à mort selon la règlementation en fonction de l'espèce. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal.

Choix des espèces

La souris permet de travailler les modèles de type pathologies humaines, une fois ces modèles bien établis , ils sont transposables au rat, espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle moléculaire. Cela rend les enseignements tirés de l'étude des tissus du rat largement transférables à l'homme. De plus, cette espèce permet d’utiliser des animaux modifiés génétiquement. Pour toutes les cohortes, les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 6 semaines pour les rats et 8 semines pour les souris)

1840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cocaïne pendant cinq jours et l'implantation chirurgicale d'une pompe osmotique, puis subissent des mesures d'activité locomotrice et des tests d'anxiété, de dépression et d'anhédonie après sevrage, avant d'être tuées pour prélever le sang et le cerveau. Le porteur induit ainsi une dépendance à la cocaïne pour tester des agents pharmacologiques censés bloquer la sensibilisation comportementale. Il indique privilégier des traitements déjà sur le marché pour un "transfert rapide à la clinique".

Objectifs

A la suite d’une injection répétée de drogue comme la cocaïne, on observe une sensibilisation comportementale qui se traduit chez la souris par une augmentation progressive de l’activité locomotrice après chaque exposition à la drogue. Cette sensibilisation comportementale persiste après plusieurs semaines de sevrage et impliquent des changements neurobiologiques qui ont lieu dans des structures cérébrales responsables de l’addiction. C’est la raison pour laquelle ce modèle est fréquemment utilisé dans l’étude des addictions chez l’animal et aussi parce qu’il est simple à mettre en place. Alors qu’il n’existe aucun traitement spécifique de l’addiction à la cocaïne, le projet propose d’étudier la capacité de plusieurs agents pharmacologiques à bloquer la sensibilisation comportementale induite par la cocaïne. Les molécules les plus efficaces seront ensuite utilisées pour mesurer leur effet à réduire d’autres conséquences d’une exposition répétées à la cocaïne comme l’anxiété, l’anhédonie (incapacité à éprouver du plaisir) et l’état dépressif.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de pouvoir proposer un traitement qui soit à la fois capable de réduire voire de bloquer la sensibilisation comportementale induite par la cocaïne mais aussi de réduire les effets secondaires induits par le sevrage à cette drogue. Le choix de traitements existants sur le marché permettra un transfert rapide à la clinique. En effet, ce projet fait partie d’un projet plus large consistant à tester de nouvelles pistes thérapeutiques chez les patient(e)s dépendant à la cocaïne.

Procédures

Tous les animaux verront leur activité locomotrice mesurée (pendant 1h30 dans un actimètre) avant (pednant 3 jours) puis pendant le traitement à la cocaïne. Tous subiront des injections de cocaïne pendant 5 jours et une implantation d'une pompe osmotique sous anesthésie générale (intervention de 10 min maximum). Une mesure de l’activité locomotrice suite à une injection de cocaïne sera réalisée deux fois (après 13 et 27 jours de sevrage à la cocaïne) chez une partie des animaux. Chez une autre partie des animaux des tests comportementaux (anxiété, dépression, anhédonie) seront réalisés une fois (après 13 et 27 jours de sevrage à la cocaïne). Ces tests durent 5 à 6 min hormis pour l’anhédonie, les animaux devront être placés dans l’actimètre pendant 6 heures.

Impact sur les animaux

Les procédures qui seront réalisées le sont déjà dans des projets antérieurs. Le traitement à la cocaïne entraine une dépendance chez les animaux, qui peut se manifester lors de l’arrêt du traitement par des modifications émotionnelles qui sont les paramètres que nous suivrons dans l’étude pour mettre en évidence l’intérêt des traitements de substitution. Néanmoins ces modifications comportementales restent modérées. Les nuisances attendues sont essentiellement liées à la procédure chirurgicale. L’administration d’antalgiques est prévue en pré et post opératoire. L’injection intrapéritonéale provoque une douleur légère et de courte durée.

Devenir

A l'issue des 3 procédures, les animaux sont mis à mort pour prélèvement de sang et du cerveau.

Remplacement

Ce projet ayant pour but d’étudier des phénomènes psychiatriques et des processus pathologiques, les méthodes alternatives actuelles (e.g., modélisation, études in vitro) sont insuffisantes. Ce projet a également pour but d’étudier des modifications cérébrales complexes et des modifications comportementales qui s’inscrivent dans le cadre d’une étude intégrée, et nécessite donc d’être réalisé sur des animaux.

Réduction

Pour réduire au minimum le nombre de souris utilisées, nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace grâce aux données obtenues lors de projets précédents en prenant l’hypothèse d’. Chaque groupe de traitement sera constitué de 20 souris pour révéler les différences comportementales.

Raffinement

L’angoisse des animaux sera minimisée par au moins une semaine d’habituation aux conditions d’hébergement avant le début des expériences. Les animaux seront hébergés dans des conditions normales (4 souris / cage) avec enrichissement du milieu (nids végétaux). Tous les groupes auront un accès libre à l’eau et à la nourriture. L’implantation des pompes osmotiques sous anesthésie gazeuse sera réalisée par une personne compétente ayant suivie la formation réglementaire de chirurgie. Les animaux auront accès à un anti-inflammatoire dans l'eau de boisson 24h avant la chirurgie. En fin de chirurgie, qui dure au maximum 10 min, la phase d’éveil se fait en cage individuelle disposée sur une couverture chauffante pour éviter toute hypothermie. Les souris sont très régulièrement surveillées jusqu’à leur réveil complet. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés juqu’à la date prévue de mise à mort. Ces observations permettent de graduer les points limites pour l'apparence et la perte de poids. En fonction du degré de gravité, les animaux seront isolés et surveillés plus attentivement ou mis à mort en cas de gravité plus importante.

Choix des espèces

L’investigation d’une pathologie telle que l’addiction nécessite d’étudier une espèce animale phylogénétiquement voisine de l’être humain pour pouvoir reproduire la maladie. La souris est un modèle de référence dans le domaine des addictions. En effet, elle est moins avancée dans le processus d‘évolution des espèces que le primate non-humain mais en tant que mammifère, elle possède une organisation anatomique et structurelle du cerveau comparable à celle de l’être humain. La souris est capable d’apprendre des tâches complexes et peut réaliser des comportements élaborés. Les animaux que nous utiliserons seront de jeunes adultes. Ils arriveront au laboratoire âgées de 8 semaines et ne seront pas testés avant leur 9ème semaine, ce qui correspond à une phase où ils sont sexuellement mâtures, et où ils ont aussi un système nerveux mâture. Il est important de réaliser les expériences chez l’animal adulte pour éviter des biais dus à l’âge et le manque de maturité des systèmes physiologiques.

100 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses pour développer une carcinose du péritoine, un suivi tumoral par bioluminescence sous anesthésie, puis trois tests comportementaux que le porteur ne détaille pas, censés mesurer une "dépression". Elles sont tuées à J14 ou J28 pour analyses, un point limite de mise à mort étant fixé à 20 % de perte de poids. Le porteur affirme que le modèle murin ne peut être remplacé et espère qu'un antidépresseur pourrait freiner le développement des carcinoses chez les patients.

Objectifs

Un patient porteur d’un cancer va exprimer des troubles psychologiques. Le fait de se savoir malade d’une pathologie mortelle à court terme, d’y associer une possible prédisposition familiale, ou une exposition à des toxiques, va aussi affecter la thymie (siège des passions et de l’humeur) des patients. Une des manifestations est la dépression. Pour les cancers qui sont métastatiques au péritoine, nommés carcinose, la dépression est fréquente, 30% des carcinoses coliques et 70% des carcinoses ovariennes selon certaines publications. L’objectif de notre étude est d’évaluer cette dépression chez la souris développant une carcinose péritonéale et d’évaluer l’effet des traitements antidépresseurs ou/et chimiothérapie sur le développement de la carcinose et de la dépression.

Bénéfices attendus

Si l'utilisation d'un antidépresseur diminue la dépression des animaux et le développement de la carcinose péritonéale, nous pourrions mettre en évidence un nouveau type de traitement non invasif qui diminuerait le développement des carcinoses chez les patients. Aujourd’hui les patients qui reçoivent un traitement antidépresseur lors de leur soins, le reçoive souvent à l’initiative de leur médecin généraliste et non de l’oncologue et cela comme un traitement visant à améliorer leur qualité de vie et non la durée de leur survie.

Procédures

Les souris vigiles seront soumis à une injection de cellules cancéreuses en intrapéritonéale (1 fois 30 secondes) qui sera associée associé à une chimiothérapie (3 à 4 fois 30 secondes) ou à un anti-dépresseur (dilué dans l’eau de boisson pendant la durée de l’expérience). Puis sous anesthésie, ils auront un suivi non invasif par bioluminescence pour suivre l'évolution tumorale (3 fois 20 minutes pour les bal/c; 4 fois 20 minutes pour les C57BL/6) après une injection de luciférine (3 x pour les Balb/c (4X pour les C57BL/6) 0,1ml pour 10g, poids des souris). A J14 pour les Balb/c et à J28 pour les C57BL/6, les souris suivront 3 tests comportementaux (3 x 15 min par souris répétées deux fois donc 6 x 15 min). Ces tests comportementaux ont pour objectif la mesure de la dépression des animaux.

Impact sur les animaux

Les souris vont développer une carcinose péritonéale et nous observerons si le traitement par un antidépresseur va diminuer le développement tumoral au même titre que la chimiothérapie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J14 ou à J28 post-injection des cellules cancéreuses pour des analyses post mortem.

Remplacement

Nous ne pouvons remplacer le modèle murin car un comportement dépressif corrélé à un développement de la carcinose péritonéale ainsi qu’une réponse du comportement à un anti-dépresseur et/ou une chimiothérapie ne peut être évalué in vitro.

Réduction

En dessous de 7 animaux par groupe, du fait des variations de nos modèles, en nombre de nodules ou vitesse de propagation de la maladie il y a trop peu de données pour avoir un résultat solide. Compte tenu de notre expérience sur le modèle et de la variabilité observée, un nombre minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire. En cas de groupe contrôle régulier nous nous autorisons à diminuer le nombre à 5 en acceptant pour faire les analyses scientifiques de pooler deux groupes contrôles. Ce sont des règles de bonne pratique pour toutes expériences en oncologie sur l’animal, utilisant des xenogreffes. Aussi, le suivi par bioluminescence d'un même animal tout au long de l'expérience permet de diminuer le nombre d'animaux. Nous réaliserons des tests Student et Anova en comparant le groupe CTRL avec les groupes traités par la chimiothérapie ou l'antidépresseur.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement. Lors du suivi de la croissance tumorale par bioluminescence, les animaux seront sous anesthésie générale gazeuse et avant l'intervention finale (ponction cardiaque) les animaux recevront une injection d'analgésie et seront ensuite sous anesthésie générale Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids (>20%), la déshydratation, le comportement (yeux fermés, dos voûté, isolement), l’apparence physique (automutilation, plaies) et la gêne pour se déplacer qui seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux 2 fois par semaine. De plus, le suivi par bioluminescence nous permet d’arrêter l’expérience avant que la progression tumorale soit trop importante (signal de bioluminescence étendu à tout l’abdomen) mais surtout de confirmer le développement de la carcinose et ne pas inclure des animaux non malades dans l’expérience.. Les cellules utilisées exprimant la luciférase, la bioluminescence correspond à l’émission de lumière à partir du substrat injecté en intrapéritonéale des souris, la luciférine, lue par un luminomètre. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard classique) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements. En cas d’atteinte des points limites, ils seront alors exclus de l'expérience dans les 24heures.

Choix des espèces

Il s’agit de souris femelles immunocompétentes (BALB/c ou C57BL6). Ces types de souris sont utilisés largement dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. Les CT26 correspondent à une lignée de cellules cancéreuses du côlon murin qui est issue des Balb/C alors que les ID8 correspondent à un lignée de cellules cancéreuses ovarienne murines qui est issue des C57BL/6. Les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines pour ne pas interagir avec les processus de vieillissement.

225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent l'injection d'un agent bactérien pro-inflammatoire, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le projet se limite à valider des souris dites "humanisées", porteuses d'un gène humain à la place du gène murin, étape préalable à des études ultérieures faisant l'objet d'une demande séparée. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative in vivo" et renvoie au conditionnel et au long terme les retombées annoncées pour le développement de médicaments chez l'humain.

Objectifs

Le but de ce projet est de valider des modèles génétiques de souris où un gène de souris est remplacé par un gène humain. Si le modèle fonctionne, la protéine humaine sera ensuite exprimée dans les cellules et les tissus où la protéine de souris était auparavant exprimée. Dans ce projet, la validation de l’expression des gènes humains chez la souris nécessite un challenge avec une injection d’un agent bactérien. Cette injection induira une réponse inflammatoire nécessaire à l’expression des gènes d’intérêt dans les organes de la souris. Pour chaque modèle génétique analysé, nous prévoyons de comparer des groupes de 5 animaux pour chaque génotype soit 15 animaux par modèle étudié. Durant la durée de ce projet, nous anticipons 5 études par année, soit un total de 15 animaux * 5 projets * 3 ans, soit 225 souris au maximum. Chaque étude se focalisera sur un gène d'intérêt disposant d'éléments de la littérature justifiant la création du modèle. Les gènes humains étudiés sont de potentielles cibles pour les thérapies dans les domaines de l’oncologie, la neurologie, les troubles cardiaques et métaboliques. Cette étape de validation de modèle est nécessaire pour étudier plus tard sur une plus large cohorte l’effet sur les fonctions biologiques de l’expression de ces gènes humains chez la souris. Cette étape préliminaire est donc requise avant d’étudier les processus biologiques humains in vivo qui sont associés aux gènes exprimés. Cette étude future nécessitera une demande éthique à part.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider des modèles de souris exprimant des gènes humains. Il nous apportera plus de connaissances sur le fonctionnement de ces gènes humains dans un organisme entier comme la souris. Les données générées nous permettront plus tard d'étudier l'effet de l'expression de ces gènes sur les fonctions biologiques. Ces modèles permettront de modéliser des maladies humaines où ces gènes sont impliqués. Plus tard, cela permettra d'envisager des pistes thérapeutiques potentielles qui seront utilisées pour le développement de nouveaux candidats médicaments dans le cadre des pathologies neurologiques, cardiaques, métaboliques ou encore les cancers. A plus long terme, ces données pourront permettre le développement de médicaments chez l'Homme.

Procédures

Une injection de produit pro-inflammatoire : durée moins d'une minute. Un prélèvement sanguin sera effectué. Ce prélèvement dure quelques minutes.

Impact sur les animaux

Durant ce projet les animaux subiront une injection de produit pro-inflammatoire qui entraine une réponse inflammatoire dans l'organisme et une faible réduction de l’activité locomotrice. Un prélèvement sanguin sous anesthésie avant d’être euthanasiés.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les organes d'intérêt afin d'évaluer le niveau d'expression du gène d'intérêt.

Remplacement

Ce projet vise à valider des modifications génétiques chez la souris de gènes humains impliqués dans les systèmes : nerveux, métabolique, cardiaque et les pathologies associées. Aujourd’hui il n’existe pas d’alternative in-vivo aux modèles animaux pour étudier les systèmes biologiques humains sans mettre les individus en danger. Les souris dites « humanisées » s'avèrent être très utiles pour les tests précliniques et pour l'étude de nombreux processus biologiques humains. Le génome de la souris étant bien caractérisé et son organisme présentant de similitudes avec celui de l’Homme, en fait un modèle d’intérêt.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 5 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous analyserons l’expression des gènes dans les organes d'intérêt de la souris entre les groupes de différent génotype grâce à un test statistique non paramétrique.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mises en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Durant l'ensemble de la procédure, des points limites spécifiques ont été mis en place afin de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions éthiquement acceptables et d'une réponse appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être. Le cas échéant, une couverture pharmacologique pourra être employée et adaptée en accord avec notre vétérinaire (analgésie, antiseptiques...)

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée. Nous avons donc décidé de valider la présence de gènes humains dans ce modèle. Ce mammifère permet de fournir de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte soit à partir de 8 semaines, âge où le système immunitaire est mature.

1000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la majorité expédiés vers d'autres laboratoires après l'opération et les autres tués. Chaque animal subit l'ablation de la rate sous anesthésie, une chirurgie que le porteur associe à des risques de douleur, de saignement, de mauvaise cicatrisation et d'infection. Ce prestataire produit ainsi 100 rats et 100 souris par an sans rate, destinés aux projets de ses clients. Il reconnaît qu'"aucune approche statistique" n'a fixé les effectifs et présente l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'humain.

Objectifs

Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent les modèles animaux de choix dans les domaines tels que les maladies cardiovasculaires et l'immunologie. Ce projet a pour but de fournir des rongeurs sans la rate donc déficient pour la production de globules rouges, la cicatrisation, la coagulation et dans l’immunité en vue de leur utilisation dans les études expérimentales de nos clients. Plusieurs sessions sont réalisées chaque année pour nos clients sur nos animaux : 100 rats et 100 souris par an.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Chaque animal subira une ablation de la rate sous anesthésie d'une durée maximale de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie et celle en post-opératoire, le risque de saignement continu, de mauvaise cicatrisation et un risque infectieux (baisse du système immunitaire).

Devenir

La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche. Les animaux aptes au transport après évaluation clinique seront expédiés. Les autres animaux seront mis à mort (pas de possibilité de continuer le projet ou d’être réutilisé).

Remplacement

Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans les études expérimentales.

Réduction

Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique n'a été réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres système métabolique proche de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connu ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce entre rat et souris est conditionné par les besoins de nos partenaires suivant les éléments cibles de l'organisme. Le projet commencera avec des animaux à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum). L'âge exact est déterminé par la demande de notre partenaire en fonction de son axe de recherche. Le choix du stade de développement des animaux est donc justifié dans sa demande de projet. Puis, 5-6 jours après l'opération, les animaux lui seront envoyés après un examen vérifiant la bonne récupération des animaux de la chirurgie.