Souris

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections d'un anticorps thérapeutique et subissent huit prélèvements de sang sur 42 jours, avant une mise à mort pour prélèvements terminaux. Le porteur cherche à vérifier si son anticorps déclenche une réaction immunitaire, une étape qu'il présente comme imposée par la réglementation avant un passage en clinique. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" non animale pour reproduire ces mécanismes physiologiques.

Objectifs

Le potentiel thérapeutique des anticorps médicaments ne cesse de croître avec d’indiscutables succès. Mais le bénéfice clinique de leur utilisation peut être compromis par l’induction d'une production d’anticorps anti-médicaments par l'organisme lui-même. Cette réaction, de production d’anticorps anti-médicaments, est appellée communément "réponse de type ADA", elle altère l’efficacité des anticorps médicaments ainsi que leur devenir dans l'organisme, ce qui peut aboutir à leurs éliminations. La réglementation, concernant le développement préclinique de molécules médicaments, impose de rechercher dans des modèles animaux une éventuelle production d'anticorps anti-médicaments. Nous souhaitons dans cette étude savoir si des injections répétées d'un anticorps médicaments développé pour le traitement d'une maladie auto-immune, le lupus, induit une réponse de type ADA chez la souris. La voie d’injection étant un paramètre non négligeable dans l'apparation des ADA, trois voies d'inoculation seront comparées : la voie intraveineuse, la voie sous-cutanée et la voie intrapéritonéale (cette dernière étant la plus immunogène).

Bénéfices attendus

A court terme, la réalisation de ce projet permettra de recueillir des données in vivo et vérifier si notre anticorps thérapeutique induit ou pas une réponse de type ADA chez la souris. A long terme, ce projet va permettre la poursuite du développement de notre anticorps en clinique humaine.

Procédures

Les souris seront soumises à 5 injections d'anticorps d'une durée de 1 à 5 minutes maximum sur animal anesthésié ou vigile. 8 prélèvements sanguins sur animal vigile seront réalisés sur une durée de 42 jours (soit une moyenne d'un prélèvement tous les 6 jours).

Impact sur les animaux

Du stress sera engendré lors des pesées, 5 pesées de moins de 30 secondes au total pour chaque animal et lors des 5 anesthésies gazeuses d'une durée de 5 minutes réalisées pour les injections sous-cutanées ou intraveineuses. Une douleur légère sera engendrée par les injections intrapéritonéale d'anticorps, un total de 5 injections de moins de 30 secondes par animal espacée de 3 à 4 jours. Du stress lors des prélèvements sanguins sera engendré lors de la manipulation des souris qui seront positionnées dans un tube à contention prévu à cet usage (durée de 2 minutes maximum) ainsi qu'une douleur légère liée à la piqûre de l'aiguille dans une des veines saphènes (8 piqûres par animal espacées d'une semaine) pour collecter le sang (durée de moins de 30 secondes). Une douleur légère sera également engendrée lors de l'injection intrapéritonéale d’un mélange anesthésique/antalgique réalisée avant la mise à mort de l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure pour réaliser des prélèvements terminaux de tissus et de sang.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animales pour réaliser ce projet car les études de pharmacocinétique font intervenir des mécanismes physiologiques complexes qui ne peuvent être reproduits en dehors d’un être animal. Nous avons besoin de réaliser des prélèvements de sang pour évaluer si la souris produit des anticorps contre notre anticorps thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par lot est calculé pour obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Si tous les prélèvements de sang étaient réalisés sur un même animal, l'état d’anémie serait certain et leurs fréquences auraient également un impact sur la tolérance aux futurs prélèvements et surtout aux interférences avec les résultats. Ce projet ayant une approche longitudinale, nous avons fait le choix de doubler chacun des groupes afin d'alterner les prélevements sanguins, ce qui nous permet d'une part d'éviter de déstabiliser l'homéostasie de la souris et nous permet d'intégrer des points pour gagner en puissance. Les volumes de prélèvements de sang seront limités pour obtenir la quantité nécessaire afin de réaliser les analyses voulues. Dans le principe de la réduction, nous avons un seul groupe contrôle, celui avec l'anticorps contrôle injecté par voie intrapéritonéale, cette voie d'injection est la plus immunogène si cette réponse est visible, elle le sera dans ce groupe. Ceci nous permet de réduire le nombre d'animaux de 20 souris.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Une anesthésie sera mise en place pour réaliser les injections sous-cutanées et intraveineuses.

Choix des espèces

Pour ce projet nous avons choisi d’employer des souris BALB/c qui sont couramment utilisées dans des études de pharmacocinétique et de bio-distribution des anticorps thérapeutiques. Les animaux utilisés seront âgés de 7-8 semaines, c’est-à-dire un stade adulte pour que leur système immunitaire soit à maturité et la réponse métabolique optimale.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des implants sous la peau du dos, du crâne et du genou sous anesthésie, avec un risque annoncé de douleur, d'infection et de développement de tumeurs liées aux cellules souches humaines implantées. Le porteur vise des implants de comblement osseux pour l'arthrose, une application renvoyée au long terme. Il affirme que la complexité de l'environnement sous-cutané est impossible à reproduire in vitro et que la réglementation rend l'étude du cancer "nécessaire" sur animal vivant.

Objectifs

Dans le but de développer de nouveaux types d’implants synthétiques contenant des composés actifs sur le plan biologique et d’étudier leur efficacité dans le comblement osseux, nous envisageons tout d’abord de tester leur biocompatibilité et leur tumorigénicité en sous-cutané chez la souris, en vue de leur utilisation en préclinique. Les implants seront constitués d’une matrice fonctionnalisée ou non avec des molécules et/ou des cellules souches mésenchymateuses humaines. Trois sites d’implantation ont été choisis sous la peau du dos, du crâne et du genou. Les implants actifs seront fonctionnalisés avec des molécules et/ou des cellules souches, les implants inactifs sans cellules serviront de témoins. Notre objectif est donc d’optimiser le non-rejet des implants ainsi que l’absence de développement de tumeurs après une intervention chirurgicale en développant des implants contenant des molécules présentant des activités biologiques et/ou des cellules souches humaines (implants vivants de troisième génération). Après des études in vitro, notre projet consistera à étudier in vivo sur modèle animal les performances des implants en termes de biocompatibilité, de toxicité et d’efficacité. Nous devrons également optimiser des dispositifs approuvés par la FDA (Food and Drug Administration) qui est l’agence américaine des produits alimentaires et médicamenteux. Ce projet consiste donc à valider sur des modèles animaux des implants pouvant se résorber dans l’organisme.

Bénéfices attendus

Nous espérons valider de nouveaux implants osseux pour les tester dans certaines pathologies comme l’arthrose. A terme, ces implants pourraient être utilisés dans le traitement régénératif de lésions articulaires (arthrose) ou osseuse.

Procédures

La procédure chirurgicale sous-cutanée est réalisée sous anesthésie générale et couverture antalgique et dure au maximum 30 minutes.

Impact sur les animaux

Nuisances prévisibles : douleur liée à la chirurgie, inflammation, infection au niveau du site d’implantation, gêne dans la locomotion, développement de tumeurs dues aux cellules souches humaines.

Devenir

A l’issue de la procédure tous les animaux implantés seront mis à mort pour la récupération des implants et des tissus (peau) pour des analyses complémentaires approfondies.

Remplacement

Après des études in vitro validant l'efficacité des implants comme la minéralisation, la survie des cellules, la différenciation…, il est nécessaire de passer à des études in vivo étant donnée la complexité de l'environnement physiologique sous-cutané, impossible à reproduire in vitro (vascularisation, cellules du système immunitaire, molécules inflammatoires…). Seuls les implants efficaces in vitro seront testés sur les animaux. Selon la règlementation, l’étude d’un éventuel développement de cancer par des implants est nécessaire sur animal vivant.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux a été évalué sur la base du nombre d’analyses nécessaires (études histologiques, immunohistologiques…) afin d’obtenir des résultats fiables. De plus, uniquement les implants validés in vitro seront testés en implantation sous-cutanée. Il n’y aura pas de tests statistiques, nous effectuerons des observations directes de type présence/absence. Par exemple, pour la biocompatibilité, nous regarderons en priorité le recrutement et l’infiltration éventuel de cellules inflammatoires.

Raffinement

Le raffinement prend en compte le bien-être des animaux. Tous les actes chirurgicaux seront réalisés stérilement sous anesthésie générale avec une analgésie locale pour réduire la douleur post-opératoire au site implanté. Le réveil complet des animaux sera activement surveille le jour de l’intervention et le suivi journalier de leur bien-être sera ensuite mis en place. Les souris immunodéficientes seront hébergées dans des portoirs ventilés séparées des autres souris et l’aliment, l’eau de boisson et la litière seront autoclavés. Pour l’ensemble des animaux un enrichissement du milieu (tunnels, bâtonnets, nids, coton…) sera ajouté dans les cages. Des points limites adaptés ont été établis afin de pouvoir soustraire l’animal à la douleur.

Choix des espèces

La souris est un modèle validé et utilisé classiquement dans ce type d’études, et qui permettra de comparer nos résultats avec les travaux similaires. Pour tester la biocompatibilité nous utiliserons des souris contrôles pour des implants sans cellules ainsi que des souris immunodéficientes pour des implants contenant des molécules actives et/ou des cellules humaines et pour l’étude de la tumorigénicité de ces implants. Les animaux utilisés à l’âge adulte (après 8 semaines minimum) pour présenter des systèmes physiologiques (notamment immunitaire) matures.

76 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 12 d'entre elles réutilisées ensuite pour la reproduction et les autres tuées. Des femelles gestantes reçoivent des composés déclenchant une inflammation, par gavage ou injection, puis passent une IRM sous sédation avant que leur descendance ne soit euthanasiée pour examen du cerveau. Le porteur cherche à reproduire un phénotype "de type autistique" chez les souriceaux et décrit les troubles obtenus comme légers. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne peut mimer l'interaction entre le foetus et la mère et retient la souris pour sa placentation proche de l'humaine.

Objectifs

Les facteurs environnementaux, comme le stress maternel, les carences nutritionnelles et les infections pré- ou périnatales, sont désormais reconnus comme des agents facilitant l'apparition de maladies neurologiques. De nombreuses études épidémiologiques ont confirmé que les infections pendant la grossesse (virus, bactéries, parasites protozoaires) sont corrélées avec le risque accru de développer des troubles neurodéveloppementaux (schizophrénie, épilepsie, troubles du spectre autistique) ainsi que des maladies neurodégénératives. Dans le cerveau, les cellules microgliales sont particulièrement sensibles aux infections. Elles nettoient des agents pathogènes, aident à assembler les connexions neuronales et régulent de nombreux processus. Le dysfonctionnement microglial a été associé à certains troubles neurodéveloppementaux (spectre autistique et schizophrénie). Le premier objectif de cette étude est de vérifier si l’élimination transitoire de la microglie (sans présence d’une infection avec toute la complexité des mécanismes moléculaires associés) peut causer, elle-même, des troubles neurodéveloppementaux à l’âge adulte. Un aspect majeur lié aux infections pendant la grossesse est l'inflammation : 12 % des grossesses à terme ont des infections intra-utérines, qui exposent les mères à un niveau élevé d'inflammation tout au long de la grossesse. Les infections intra-utérines, donnent souvent naissance à des bébés avec une connectivité cérébrale anormale qui devient évidente à l'âge adulte. Le deuxième objectif de notre étude est de vérifier si l’inflammation, sans présence d’une infection, peut, elle-même, modifier le câblage cérébral précoce et causer des troubles neurodéveloppementaux à l’âge adulte. Les rongeurs sont de bons modèles animaux pour imiter cette condition pathologique car ils partagent certaines caractéristiques particulières de la grossesse humaine. Nous proposons d'étudier la connectivité cérébrale structurelle et fonctionnelle avec des enregistrements IRM et IRMf chez des souris ayant subi soit une déplétion de la microglie soit une inflammation transitoire avant la naissance, pour mieux comprendre les mécanismes de base à l’origine de trouble cognitifs, indépendamment du type d’infection pendant la grossesse. Ces modèles murins ont déjà été étudiés et n’ont pas montrés de signes cliniques important au niveau du comportement, uniquement des troubles légers de sociabilité, ne nécessitant pas d’études comportementales spécifiques.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre comment les infections causées par différents agents pathogènes pendant la grossesse, sont corrélées avec le risque accru de développer des troubles neurodéveloppementaux est crucial pour un diagnostic précoce chez les bébés, qui, à l'avenir, permettra d'identifier les nourrissons qui ont effectivement besoin d'une intervention précoce, afin de profiter de la période de plasticité cérébrale la plus élevée pour empêcher l'installation de la pathologie. De plus, les résultats de nos études précliniques ouvriront la possibilité de traiter ces enfants pendant la période fœtale, en bloquant l’inflammation, avec un impact tangible sur le chemin clinique. L'identification des paramètres diagnostiques associés à un risque élevé de développer des dysfonctionnements neurologiques chez le nouveau-né apportera une contribution facilement traduisible en clinique néonatale, permettant l'établissement de nouveaux biomarqueurs pour ces cas. L'établissement de nouveaux biomarqueurs est crucial pour favoriser les études sur de nouveaux médicaments visant à résoudre les anomalies cérébrales. Nous analyserons la connectivité cérébrale fonctionnelle, qui s'est avérée extrêmement efficace pour suivre les changements cérébraux, même subtils, chez des jeunes souris qui ont reçu des traitements mimant certains aspects spécifiques des conséquences des infections. Cela nous permettra de séparer et d'évaluer l'importance des différents mécanismes impliqués dans la réponse physiologique aux infections. De plus, comme les enregistrements IRM sont aussi réalisables chez l'homme, la traduction clinique de cette étude sera aisée.

Procédures

Les souris gestantes reçoivent des médicaments induisant une inflammation, soit sous forme de complément alimentaire, soit par injection (moins d'1mn). La principale source de stress pour les souris pendant ces injections est due à la nécessité de les manipuler et de les tenir pendant l'injection. Les souris seront ensuite scannées par IRM pendant maximum 3 heures et maximum 2 fois (la deuxième séance seulement en cas de mauvais qualité des données de la première séance). L’imagerie IRM nécessite que la souris soit immobile sous sédation. Comparée à l'anesthésie, la sédation est beaucoup plus douce en termes de temps de récupération. Cependant, nous laisserons les souris se reposer pendant au moins deux semaines, dans leur cage, après la séance d'IRM. L’étude nécessite des examens du cerveau ex vivo. Les animaux sont donc euthanasiés en fin d’étude. Cette procédure est réalisée sous anesthésie profonde et dure environ 20 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris basé sur notre traitement cause un phénotype de type autistique, léger, dans les descendants, comme l’hyperactivité et des déficits d’interactions sociales. Le modèle de souris est un modèle qui mime « une des causes potentielles du spectre autistique », à savoir les troubles du développement des neurones liés à l’état inflammatoire de la mère, lié ou non à une infection pendant la gestation. Le spectre autistique est très large en terme de phénotype chez l’humain et essentiellement diagnostiqué par des tests psychologiques, chez le très jeune enfant. Modifier l’état inflammatoire pendant la gestation chez la souris permettrait d’obtenir des souriceaux avec potentiellement des troubles du développement. Ce modèle murin est déjà décrit comme ne présentant que de légers troubles moteurs et sociétaux, n’empêchant en rien la vie en groupe. Ni souffrance ni perte de poids ne sont attendus. Les effets indésirables prévisibles sont liés à la sédation de longue durée, entrainant potentiellement un ralentissement de la respiration, laquelle est monitorée durant toute la session d’IRM. La pose du cathéter se fait sous antalgique et anesthésique et ne devrait pas causer d’inconfort. Cependant, une lésion cutanée peut perdurer au point d’implantation après l’imagerie. La température des animaux peut également chuter en fin de session IRM et les animaux peuvent être isolés en cage chauffée, le temps de récupérer et au maximum jusqu’à 24h.

Devenir

Les souris gestantes utilisées pour générer les souris imitant les malformations prématurées, après l'accouchement, seront utilisées pour produire d'autres souris nécessaires à d'autres projets de recherche dans l’établissement de recherche. En l'absence de besoin, elles seront euthanasiées. Toutes les souris subissant les enregistrements IRM fonctionnelle seront euthanasiées pour récupérer leur cerveau.

Remplacement

Afin d'étudier l'effet de l'infection, ou la réponse inflammatoire, pendant la période de gestation, il est nécessaire d'utiliser des animaux. Cette recherche examine l'interaction entre l'embryon/le fœtus et la femelle gestante suite à une réponse inflammatoire ; aucune approche in vitro ou in silico ne pourrait mimer cette condition physiopathologique. Aux fins de l'étude, il est également essentiel de mener des expériences sur des animaux qui ont une placentation de type humain. Cette caractéristique du modèle animal sélectionné nous permettra d'étendre les résultats obtenus dans cette recherche à l'homme. La souris constitue donc l'espèce animale au développement neurologique le plus utile à l'étude décrite.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à cette étude a été calculé avec des statistiques basées sur des études antérieures. Pour induire le phénotype désiré en prénatal, il faudra utiliser un certain nombre de souris pour former les couples : ces souris, une fois devenues inutiles pour ce projet, seront mises à la disposition d'autres études nécessitant de tels animaux dans l’établissement. Nous réduirons davantage le nombre de souris nécessaires en imageant deux fois la même souris en cas de problème lors de l'acquisition de données IRM, au lieu d'utiliser une autre souris.

Raffinement

Les embryons de souris connaîtront soit un état inflammatoire, soit l'épuisement des cellules cérébrales anti-inflammatoires pendant un temps limité. Il est connu que cela ne cause aucune douleur. Les séances d'IRM seront sous sédation, avec un protocole déjà testé et publié par des équipes de recherche du monde entier. Avec la sédation, nous évitons le stress causé par la configuration contrainte du berceau d’IRM, tout en utilisant peu d'anesthésiques. Dans les cages, aucune restriction d'eau ou de nourriture n'est requise et des enrichissements, tels que des tubes en plastique et des roulettes pour courir seront fournis. Une inspection quotidienne plus précise que l’inspection habituellement faite en regardant les souris à l'intérieur de la cage, sera immédiatement commencée en cas de blessure, de maladie ou des signes de douleur. Dans ce cas, un score de santé a été défini, avec des points limites qui, s’ils sont atteints pour une souris, déclencheront automatiquement l'euthanasie. Seul le personnel formé à la manipulation des animaux réalisera les expériences et les souris seront inspectées par un vétérinaire en cas de besoin.

Choix des espèces

Pour les besoins de l'étude, il est essentiel de mener des expériences sur des animaux qui ont une placentation très proche celle de la femme. La présence d'une placentation « humaine » chez l'animal modèle sélectionné nous permettra d'étendre les résultats obtenus dans cette recherche, selon une approche translationnelle, à l'homme également. La souris constitue donc l'espèce animale au développement neurologique convenant le plus à l'étude décrite. Nous voulons évaluer l'effet de l'inflammation aiguë prénatale après le développement des animaux (souris de plus de 2 mois de ce fait).

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux interventions chirurgicales cérébrales sous anesthésie, une restriction alimentaire de sept jours et des injections pendant cinq jours, avant une tâche d'apprentissage récompensée par de la nourriture. Le porteur étudie la consolidation de la mémoire dans une zone du cerveau qu'il relie à des maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives, des retombées présentées comme lointaines. Il affirme avoir "besoin" d'un modèle intact et génétiquement modifiable et conclut que seule la souris convient.

Objectifs

L’objectif global de notre projet est de contribuer à la compréhension des processus d’encodage et de stockage des mémoires chez les mammifères. Plus spécifiquement, nous souhaitons étudier les mécanismes sous-jacents la formation de la mémoire à long terme dans une zone spécifique du cerveau. Cette zone de cerveau a été impliquée dans plusieurs maladies humaines. Une meilleure compréhension de son fonctionnement en conditions normales est nécessaire afin d’identifier et de comprendre les altérations, qui se manifestent en conditions ‘anormales’, telles queles maladies neuro-développementales ou neuro-dégénératives.

Bénéfices attendus

La zone de cerveau ciblé par notre étude a été impliquée à plusieurs maladies humaines. Une meilleure compréhension de son fonctionnement en conditions normales est nécessaire afin d'identifier et de comprendre les altérations, qui se manifestent en conditions 'anormales', telles que les maladies touchant le système nerveux central. Les connaissances obtenues grâce à ce travail nous permettront de renseigner d'autres projets en cours dans l'équipe, explorant le rôle de cette région du cerveau dans les altérations pathophysiologiques présentent, par exemple, lors des maladies neuro-développementales ou neuro-dégénératives. La réorganisation structurelle des circuits neuronaux est également un domaine de recherche largement négligé par les études préclinique et notre travail apportera des nouvelles connaissance dans le domaine des mécanismes de plasticité.

Procédures

Les animaux sont nourris avec un régime alimentaire modifié. Ils subissent deux brèves interventions chirurgicales (< 45 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Ils sont soumis à une tâche comportementale nécessitant une motivation appétitive pour laquelle ils reçoivent une récompense nutritive. Cette tâche nécessite que la quantité de nourriture disponible soit limitée pendant 7 jours. Ils reçoivent également des injections pendant 5 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent deux brèves interventions chirurgicales sous anesthésie. Cependant, l'utilisation appropriée d'analgésiques, l'utilisation d'outils et de matériels stériles, ainsi qu'une surveillance et des soins post-chirurgicaux optimaux nous permettent de limiter les conséquences indésirables subies par les animaux. Une période de récupération (4-7 jours) est prévue avant toute nouvelle manipulation. Les animaux sont soumis à une restriction alimentaire. Celle-ci peut être stressante pour les souris car elle ne leur permet pas d'exprimer certains de leurs comportements naturels tels que cacher de la nourriture dans la cage. Pour compenser ce stress, nous manipulons les souris au préalable et nous nous efforçons de les nourrir à la même heure de la journée afin qu'elles apprennent à associer la présence de l'expérimentateur à la fourniture de nourriture. En adaptant le programme d'entraînement, nous maintenons la période de restriction alimentaire aussi courte que possible (maximum 7 jours consécutifs). Le paradigme de la restriction alimentaire nous oblige également à héberger les souris individuellement, afin d'éviter la compétition pour la nourriture et l'agression entre congénères. Pour pallier cette contrainte, nous maintenons les souris en hébergement collectif le plus longtemps possible avant cette étape. Nous augmentons la quantité de matériaux disponibles pour la construction de nids et augmentons l'enrichissement en manipulant les souris avant l'expérimentation. Tout au long des expériences, à l'exception des deux jours précédant le « retrieval 1 », les souris sont nourries avec un régime contenant une très faible concentration d'antibiotique. Pour compléter la dose d'antibiotique pendant la période de restriction alimentaire, nous sommes obligés d'administrer cette molecule par injection intra peritonéale. Pour pallier les conséquences de cette injection répétée, nous utilisons une aiguille de très petite taille, ce qui minimise l'inconfort pour l'animall. La solution d'antibiotique est de faible concentration et l’injection est sans conséquences négatives pour l'animal. Toutes les manipulations sont effectuées par des expérimentateurs formés et habilités, ayant plus de 8 ans d'expérience dans la manipulation des animaux.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.

Remplacement

Le projet porte sur l'étude des mécanismes qui sous-tendent la formation et le stockage de la mémoire dans le néocortex. Pour mener à bien notre étude, nous aurions besoin d'un modèle : i) complexe et intact, ii) adapté à la réalisation de tests cognitif, iii) pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique, iv) qui se prête facilement à la modification de son génome, v) possédant un néocortex, vi) adapté aux approches expérimentales invasives. Conformément à la directive européenne et au principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer des approches alternatives lorsque cela était possible. A notre connaissance, seuls les modèles de mammifères, notamment les souris, répondent à l'ensemble de ces critères. Bien que des tests comportementaux simples soient possibles chez des espèces moins sensibles, ces animaux ne possèdent pas la structure cérébrale ciblée et ne sont donc pas adaptés à l'objectif de notre étude. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre question scientifique car des tests invasifs sont nécessaires pour détecter et analyser les neurones associés au stockage de la mémoire et les analyses de connectivité possibles au niveau clinique n'ont pas la résolution nécessaire pour répondre à la question scientifique posée. Les modèles in silico actuellement disponibles ne permettent pas de modéliser le cerveau entier. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, l'utilisation d'animaux est malheureusement nécessaire.

Réduction

Afin de ne pas utiliser plus que le nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Nous sommes très attentifs à l’objectif de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour cette raison nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce de nos données au fur et à mesure (c.à.d. les expériences réalisées au fur et à mesure sur de petits lots de 4-6 animaux). Cela nous permettra de modifier la taille de l'échantillon si nécessaire selon les premiers résultats obtenus. L'utilisation de ces petits groupes permettra également de repérer rapidement les problèmes potentiels de la procédure et de modifier notre approche si nécessaire pour le lot suivant. Approche statistique : selon les caractéristiques de nos données nous appliquons les tests statistiques appropriés à notre question scientifique et à nos données.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal (avant et après chaque manipulation/étape) selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Intervention immédiate et appropriée (en cas de besoin) - mesures conservatoires à privilégier. iv) Raffinement des procédures chirurgicales pour réduire le risque de douleur ou de souffrance : utilisation d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques (pré- et post-op) pour chaque procédure chirurgicale v) Application de soins préventifs après la chirurgie; stratégie de nursing si nécessaire vi) Manipulation quotidienne des animaux avant les sessions comportementales pour réduire le niveau de stress lié à l'interaction avec l'expérimentateur vii) Optimisation de notre tâche comportementale pour minimiser la durée de la restriction alimentaire viii) Entraînement progressif de l'animal (séances d'habituation) intégré à la tâche afin de minimiser le stresse ix) Utilisation d’aiguilles de petite taille pour minimiser l'inconfort associé à l'injection i.p. x) Utilisation, dans la mesure du possible, de méthodes non invasives (par exemple, l'administration dans la nourriture) pour l'administration des médicaments afin d'éviter les contraintes associées aux autres méthodes d'administration. xi) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs proposants les méthodes de raffinement. xii) Adaptation des conditions d’hébergement : animaux maintenus le plus longtemps possible dans des cages collectives.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris car nous voudrions exploiter certains modèles transgéniques impliquants, par exemple, le marquage permanent des cellules activées lors de l’apprentissage, ou l'expression d'un sonde calcique. À ce jour, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, d'une manière routine, de modifier la génome et pour laquelle les modèles crés ont été caracterisés au niveau comportemental et moléculaire. Le choix d'utiliser la souris est également motivé par nos données précédentes et la disponibilité de paradigmes expérimentaux déjà élaborés qui garantissent le succès de notre étude.

1 090 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'ablation d'une phalange pour identification et biopsie, des administrations de substances, une hémicastration sous anesthésie puis une perfusion létale de fixateur, pour étudier la stabilité des ARN au cours de la spermatogenèse. Le porteur affirme que la phalangectomie avant dix jours cause une douleur minime car les fibres nerveuses ne sont pas encore myélinisées. Les retombées sur le cancer, le VIH et la stérilité sont renvoyées au long terme.

Objectifs

L’ADN (acide désoxyribonucléique) est constitué de gènes servant à la fabrication des protéines qui sont nécessaire au fonctionnement des cellules. L’information contenue dans ces gènes est dans un premier temps recopié sous forme d’une molécule transitoire appelée ARN (acide ribonucléique). Une fois que l’ARN à fabriqué les protéines il est dégradé afin d’arrêter leurs productions. Ceci permet de réguler la quantité de protéine dans la cellule. L’étape de dégradation de l’ARN est contrôlée par un complexe de régulation qui détermine la stabilité de l’ARN. Notre projet consiste à étudier les mécanismes intervenant dans la stabilité des ARN. Nous utiliserons un modèle présentant une défaillance de ce complexe de régulation, qui se traduit par la stérilité chez le mâle.

Bénéfices attendus

Notre projet fournira une nouvelle compréhension de la fonction du complexe de régulation qui détermine la stabilité de l’ARN et de son implication dans la spermatogenèse (processus aboutissant à la production de spermatozoïdes). A plus long terme, notre projet va induire une meilleure compréhension des maladies telles que le cancer, l'infection par le VIH, les maladies génétiques rares et la stérilité, qui sont liées à l’altération de ce complexe. Ceci va permettre de développer des thérapies.

Procédures

Toutes les interventions décrites ci-dessous nécessitent d’immobiliser les souris avec la main (contention non traumatisante de 20 à 30 secondes). - Phalangectomie (avant l’age de 10 jours) sur animaux vigiles pour identifier les animaux et prélever la biopsie. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration de substance (à 3 jours) pour synchroniser la spermatogenèse. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’une molécule (à 8-10 semaines) pour suivre l’évolution d’une cellule (traceur). Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’analgésique (15 minutes avant l’hémicastration). Réalisée 1 fois dans leur vie. - Hémicastration (2 heures après l’administration de traceur). Anesthésie gazeuse de l’animal dans une boîte à induction en plexiglas puis sous un masque (narcose en 2 à 3 minutes). La chirurgie (incision/prélèvement/suture) prend 10 minutes. Reprise de l’activité normale généralement observée en 15 minutes. -. Administration d’anesthésique/analgésique (à partir de l’age de 8 jours) en dose létale pour perfuser un fixateur histologique. Etape finale réalisée 9 ou 18 jours après l’hémicastration. Les souris sous anesthésie générale profonde en moins de 5 minutes. La perfusion (10 minutes) résulte en la mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Nous allons générer des souris porteuses de mutation dans un type de cellule du testicule, ce qui entraîne une stérilité des mâles mais ne génère aucune douleur. Les procédures expérimentales tel que l’ablation de phalanges, l’administration de substances et l’hémicastration mises en œuvre engendrent une douleur minime aux animaux. La phalangectomie réalisée avant l’âge de 10 jours entraine une douleur minime du fait qu’à cet âge les fibres nerveuses sont encore non myélinisées. L’administration de substance induit une douleur identique à celle de l’introduction d’une aiguille sous la peau L’hémicastration est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie mais elle peut entrainer une perte hydrique, une sécheresse oculaire, une perte de poids, une hypothermie et une douleur au niveau de la plaie. Dans ce cas, les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne et le vétérinaire sera prévenu si nécessaire et des mesures appropriées seront prises pour soulager l’animal.

Devenir

Pour des analyses histologiques et moléculaires, une mise à mort est nécessaire en fin de procédure pour tous les animaux décrits dans ce projet, et ceci en respectant les points limites.

Remplacement

Notre étude vise à comprendre les effets de la dégradation de l’ARN dans un système physiologique (la spermatogenèse). Etant donné que la spermatogenèse est un processus complexe qui fait intervenir plusieurs types cellulaires du testicule, seule une approche expérimentale avec des animaux permet d’atteindre notre objectif. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.

Réduction

Le nombre d’animaux requis est calculé au plus juste pour satisfaire aux exigences en matière de réduction du nombre d’animaux utilisés tout en assurant la qualité des résultats obtenus et la robustesse de leur validité statistique en utilisant des tests statistiques adaptés. A chaque stade nous analyserons 3 mâles contrôles et 3 mâles mutants pour les analyses morphologiques et 10 mâles contrôles et 10 mâles mutants pour les analyses moléculaires. La stratégie des accouplements permet d’obtenir la moitié des animaux contrôles et l’autre moitié des animaux seront mutants. Cependant, étant donné que notre travail porte sur l’étude de la spermatogenèse, seuls les males (statistiquement la moitié des naissances) serviront pour l’expérimentation. La réduction du nombre d’animaux (2e R de la règle des 3R) est donc appliquée dans notre projet.

Raffinement

Tout est mis en œuvre pour le bien-être des animaux, la surveillance de l’état de santé et des actions appropriées sont réalisées à l’animalerie si nécessaires (soins, analgésie, …). Le bien-être est surveillé en permanence et toute altération du comportement des animaux (souffrance, angoisse) sera immédiatement discutée avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour prendre les mesures correctives nécessaires. Les animaux générés ne souffrent pas car le phénotype attendu se limite à la stérilité des mâles. La douleur résultant de la phalangectomie est minimisée en prélevant la phalange avant l’âge de 10 jours, âge en dessous duquel les fibres nerveuses sont non myélinisées. Pour les animaux, dont les traitements doivent être administrés à l’âge de 3 jours, la phalangectomie sera réalisée à l’âge de 1 jour (afin de traiter que des animaux de génotype intéressant). Pour les autres animaux expérimentaux, la phalangectomie sera réalisée entre 7 à 10 jours après la naissance, quand les doigts des souriceaux sont écartés. Nous prenons soin de n’amputer que la phalange distale en utilisant des outils fins et après un entrainement sur des cadavres. Les traitements seront réalisés par un expérimentateur qualifié ayant suivi une formation à la manipulation des rongeurs afin de minimiser les nuisances sur les animaux. La douleur de l’hémicastration sera minimisée en administrant un Anti-Inflammatoire Non Stéroïdien (AINS) avant l’opération. Pour diminuer le stress de l’animal et faciliter sa thermorégulation la phase de réveil est surveillée sur plaque chauffante et un nid de coton ou un nid végétal est ajouté dans chaque cage. Pour faciliter sa réhydratation une injection de sérum physiologique sera réalisée à la fin de la chirurgie et de la nourriture sous forme de gel sera mise à disposition au fond de la cage. Le raffinement (3e R de la règle des 3R) est donc appliqué dans notre projet.

Choix des espèces

De par ses nombreuses ressemblances génétiques et physiologiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, la souris est un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. De plus, il s’agit d’une espèce simple à élever et proléfique. Dans notre projet, nous utilisons la spermatogenèse comme modèle d’étude. C’est un processus qui se met en place depuis la naissance jusqu’à l’âge adulte et qui évolue quand la souris vieillit. Nous allons analyser différents stades dans la spermatogenèse. Les études débuteront peu de temps après la naissance (à l’âge de 1 semaine) pour étudier la mise en place de la spermatogenèse. Des souris adultes (à l’âge de 8 à 10 semaines) serviront à étudier le maintien de la spermatogenèse. Les plus vieilles souris (à l’âge de 1 an) permettront d’étudier le vieillissement testiculaire.