Souris

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une maladie osseuse pédiatrique rare, elles subissent des radiographies sous anesthésie tous les quinze jours, jusqu'à six injections de fluorochromes et une ponction cardiaque terminale, pour décrire l'apparition d'un granulome dans les mâchoires. Le porteur affirme que cette cinétique ne peut s'observer chez les patients, diagnostiqués trop tard, et qu'elle requiert un "organisme entier". Les tests de thérapies sont présentés comme une étape ultérieure.

Objectifs

La maladie osseuse pédiatrique rare qui nous intéresse est caractérisée par le remplacement de l’os des mâchoires par un tissu mou fibreux appelé granulome. Cette pathologie se met en place vers 3 à 5 ans et est d’origine génétique. Les lésions spécifiques de la maladie sont toujours symétriques et bilatérales et peuvent ne concerner que des zones restreintes de la mandibule ou au contraire toutes les mâchoires jusqu’au plancher de l’orbite. Le principal traitement proposé aux patients pour le moment consiste principalement en chirurgies itératives et souvent iatrogènes et quelques rares molécules pour les formes très sévères. Ce qui définit la localisation anatomique et la période d’apparition de cette pathologie ne sont pas connues. Avoir accès et comprendre l’apparition du granulome permettrait de proposer des traitements plus précoces et efficaces aux patients. L’objectif de ce projet est donc de définir la cinétique d’apparition du granulome spécifique de cette pathologie dans un modèle murin, cinétique à laquelle nous ne pouvons avoir accès chez les patients. La description de cette cinétique nous permettra d’avoir une progression claire du granulome et dans un second temps de définir plusieurs fenêtres de traitement.

Bénéfices attendus

La description de la cinétique d’apparition du granulome n’est pas possible chez les patients. En effet, les patients sont diagnostiqués quand le granulome est déjà installé voire agressif. La description de cette apparition est la première étape qui permettra de mettre en place des tests de thérapies efficaces (avec un effet évaluable facilement) qui manquent encore pour le traitement des patients.

Procédures

Le phénotype osseux des souris est exploré par un examen radiographique tous les 15 jours qui nécessite une anesthésie et qui dure 5 minutes, un seul recueil d’urines en cage métabolique (durée maximale 2h) pour l’analyse des marqueurs osseux urinaires, l’injection de 2 fluorochromes pour analyser la formation dynamique de l’os (2 minutes par injection) et enfin, le prélèvement sanguin intracardiaque (réalisée sous anesthésie profonde - 5 minutes maximum) pour l’analyse des marqueurs osseux sanguins.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis au maximum 6 injections intrapéritonéales (anesthésies et injections de fluorochromes), 1h de cage métabolique et une ponction cardiaque terminale. Aucun autre dommage que d’être manipulé pour l’injection et isolé pendant 1h n’est observé dans le cadre de la caractérisation du phénotype osseux. Aucun autre dommage que d’être manipulé pour pratiquer les injections, lesquelles peuvent éventuellement provoquer une gêne très passagère qui ne nécessite pas de médication particulière.

Devenir

Les animaux concernés par cette procédure sont mis à mort pour réaliser des prélèvements post-mortem des os et des caecum qui permettront de caractériser le phénotype osseux et l’apparition du granulome du chérubisme.

Remplacement

La mutation d’un gène est responsable du développement du chérubisme. La culture de cellules mutées in vitro a déjà fourni des informations sur les voies de signalisation impliquées dans le développement du chérubisme mais toutes ces études préalables in vitro sont menées sur des cellules provenant de granulomes de patients diagnostiqués, quand le granulome est déjà installé voire agressif. La cinétique d’apparition du granulome pathognomonique du chérubisme ne peut être étudié que grâce à l’utilisation d’un modèle animal. Les interactions entre l’os (les cellules osseuses mutées), le ligament parodontale (et ses cellules mutées) et la moelle osseuses (et ses cellules mutées) et leurs implications dans l’apparition du granulome ne pouvant être observées qu’au sein d’un organisme entier. Le granulome pathognomonique du chérubisme n’apparait que lorsque le gène concerné est muté, rendant le modèle animal que nous voudrions utiliser approprié pour cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (168) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires à l’établissement de la cinétique d’apparition du granulome de chérubisme. L’analyse préalablement publiée du modèle à 10 semaines permet d’estimer la puissance statistique de nos analyses et l’échantillonnage nécessaire pour caractériser les effets biologiques souhaités.

Raffinement

Les mesures de densité minérale osseuse, seront effectuées sous anesthésie avec analgésie. Le temps de radiographie sera très cours, environ 5 minutes par animal. Il sera surveillé jusqu’à son réveil. L’appareil étant à température ambiante, un maintien de la température à 37°de l’animal ne sera pas nécessaire pour une intervention si courte. Le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs assureront une surveillance quotidienne. Nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux aux différents temps de la procédure car aucun autre dommage que de courtes anesthésies, espacées de 15 jours, des injections (6 maximum) et un isolement de 2h au plus pour le recueil d’urine ne sont envisagés dans le cadre de la caractérisation du phénotype osseux. Cependant, dans l’éventualité d’une perte de poids ou encore d’un comportement anormal, une surveillance plus fréquente et un apport de nourriture gélifiée seront mis en place. Les animaux seront hébergés sous conditions standards - température 20/24°, cycle jour/nuit 12h/12h, hygrométrie entre 50/55%. L’enrichissement du milieu sera assuré par la mise à disposition de tunnel en carton, de nids en papier kraft, de maisonnettes rouge et de bâtonnets à ronger. L’acte final, une ponction cardiaque, nécessaire pour évaluer les marqueurs osseux sanguins, sera faite sous anesthésie avec antalgique. L’assurance d’une anesthésie profonde sera vérifiée avant par un test de l’abolition du réflexe des extrémités.

Choix des espèces

Un modèle murin de la pathologie osseuse rare pédiatrique qui nous intéresse a été précédemment généré. La culture de cellules mutées in vitro a déjà fourni des informations sur les voies de signalisation impliquées dans le développement du chérubisme. Cependant, les interactions entre l’os (les cellules osseuses mutées), le ligament parodontale (et ses cellules mutées) et la moelle osseuses (et ses cellules mutées) et leurs implications dans l’apparition du granulome ne peuvent être observées qu’au sein d’un organisme entier. Le granulome spécifique de la pathologie osseuse rare pédiatrique qui nous intéresse apparait dans le modèle murin, rendant ce modèle approprié pour cette étude. A 10 semaines le granulome est mis en place (comme décrit précédemment). Nous voulons décrire son apparition entre 4 et 10 semaines, 4 semaines correspondant au sevrage des animaux et qui correspond au stade d’apparition du granulome chez les patients.

850 souris et 850 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont mis à jeun jusqu'à 24 heures, reçoivent un candidat médicament et un traceur alimentaire, subissent des prélèvements sanguins puis une euthanasie avec prélèvement d'organes, pour évaluer l'effet d'une molécule sur le transit gastro-intestinal. Le porteur présente l'animal comme un passage obligatoire avant toute administration à l'humain. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne suffit à évaluer ces effets sur le transit.

Objectifs

Les effets secondaires gastro-intestinaux liés aux médicaments peuvent causer beaucoup d'inconfort et de douleur. Ces effets secondaires comprennent la constipation, l'irritation gastro-intestinale, la constriction abdominale ou la diarrhée. Le projet vise à évaluer l'effet d'un candidat médicament sur le transit gastrointestinal et sur la vidange de l'estomac. La fonction gastro-intestinal est évaluée par la mesure de la progression d’un traceur alimentaire administré par voie orale.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Les animaux auront une ou plusieurs administrations de candidat médicament (moins de 30 secondes pour chaque administration) ainsi qu'une administration d'un traceur alimentaire (moins de 30 secondes) après mise à jeûn (sur grille pour une durée de 24h maximum et isolement pour les souris) et éventuellement des prélèvements de sang (2 minutes) sur animal vigile, ensuite d'une anesthésie suivi éventuellement un prélèvement sanguin terminal suivi d'une euthanasie pour effectuer des prélèvements d'organes (pas de réveil après prélèvement).

Impact sur les animaux

Les animaux seront mis à jeun sur une période de maximum 24h avant l'administration du candidat médicament. Et ils subiront plusieurs injections afin d'administrer le candidat médicament, le traceur alimentaire et l'anesthésique. Des prélèvements de sang pourront aussi être réalisés. Par ailleurs, les effets potentiellement indésirables des candidats médicaments font l'objet d'échange avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d'observations des animaux afin d'anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organes ne permettant pas la survie de l’animal.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le transit intestinal. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat et la souris sont les espèce qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d'animaux par groupe est utilisé afin d'exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Ce nombre (en général n=10/groupe) est calculé pour pouvoir réaliser une analyse statistique robuste sans avoir besoin de répéter les expériences (et donc d'utiliser un nombre d'animaux encore supérieur). L’analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : -La mise au point de procédures rigoureuses, -la formation du personnel à ces dernières, - un suivi quotidien de l'état de santé des animaux, -le suivi d'éventuels signes cliniques, -la détermination des points limites, -le recours aux procédures d'euthanasie dès que nécessaire, -la réduction du volume sanguin prélevé grâce à l'amélioration de la sensibilité des méthodes d'analyse, -un protocole analgésique adapté au modèle, -la familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont deux des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un nouveau médicament sur le transit gastro intestinal. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement .

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant quatre à six semaines une alimentation à la cuprizone reproduisant une sclérose en plaques, qui peut provoquer crises d'épilepsie induites, perte de poids et difficultés locomotrices, avant euthanasie pour études post mortem de l'hippocampe. Le porteur fixe des points limites, dont une perte de poids de 20 % et l'apparition de crises spontanées, déclenchant la mise à mort. Les pistes thérapeutiques pour les patients épileptiques atteints de sclérose en plaques sont renvoyées au long terme.

Objectifs

L’épilepsie chez les personnes atteintes de sclérose en plaque est un véritable enjeu de santé publique, comprendre ses mécanismes neurophysiologiques aiderait à mieux traiter cette pathologie. Ce projet durerait 3 ans.

Bénéfices attendus

La sclérose en plaques est une maladie auto-immune très invalidante qui atteint généralement de jeunes adultes (20 à 40 ans). Elle se caractérise par la destruction progressive, par les cellules du système immunitaire, de la gaine de myéline des axones, ce qui aboutit à une dégénérescence neuronale provoquant des perturbations à la fois motrices, sensitives et cognitives. Les patients atteints de sclérose en plaques ont 3 à 6 fois plus de risque de développer de l’épilepsie. Le lien entre sclérose en plaques et épilepsie n’ayant été que peu étudié, l’épilepsie en cas de sclérose en plaques n’a pas de traitement de premier choix clairement établi et son pronostic est souvent défavorable. L’objectif de cette étude à court terme est de définir les mécanismes neuronaux sous-jacents à cette propension à l’épilepsie en cas de sclérose en plaques. L’objectif à long terme de ce projet est d’obtenir des pistes de traitements thérapeutiques de l’épilepsie chez les personnes atteintes de sclérose en plaques.

Procédures

Pour reproduire la sclérose en plaques, un régime alimentaire à la cuprizone sera donné aux animaux pendant 4 à 6 semaines. Les animaux seront pesés une fois par semaine. Le cerveau des animaux est utilisé après leur euthanasie pour des études post mortem.

Impact sur les animaux

Nous nourrirons les souris à la cuprizone pendant moins de 7 semaines. La souris peut développer des crises d’épilepsie induites et non spontanées si la durée du régime à la cuprizone est inférieure à 7 semaines ce qui est le cas dans notre étude. Ces crises induites sont des crises tonico-cloniques se caractérisant par une perte des réflexes de redressement. Le régime alimentaire à la cuprizone peut entraîner une perte de poids. Les souris nourries à la cuprizone sont moins sujettes à la douleur que des souris exposées à un régime normal. Cependant, elles peuvent développer des difficultés locomotrices et de l’anxiété.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour des études post mortem.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant la compréhension des mécanismes complexes mis en jeu dans cette pathologie humaine invalidante. En effet, les organoïdes présentent de nombreuses limites telles que : - le manque d'une haute fidélité pour chaque type cellulaire, alors que dans ce projet nous voulons étudier des neurones avec des caractéristiques spécifiques très prononcées - une maturation limitée, alors que dans ce projet nous voulons étudier une pathologie qui se déclare quand le cerveau est mature - une physiologie atypique et des problèmes de développement d'aires neuronales adéquates, alors que dans ce projet nous voulons étudier une partie cérébrale spécifique, l'hippocampe, dont la structure neuronale est extrêmement organisée.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux au maximum, différentes expériences seront effectuées à partir de tranches d’hippocampe provenant d’une même souris. Le nombre estimé de souris nécessaires à cette étude en fonction des conditions expérimentales et des tests statistiques est de 120 souris dont la moitié nourrie à la cuprizone. Les souris mâles et femelles présentant le même degré de dégradation cérébrale à la suite d’un régime à la cuprizone, nous utiliserons des mâles et des femelles indifféremment ce qui nous permettra de réduire le nombre d’animaux (pas de tri négatif dans les portées). Les données seront traitées avec des tests statistiques non paramétriques afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. 20 neurones par condition seront nécessaires. Nous prévoyons 4 conditions expérimentales (a,b, c, d) à tester pour 2 temps de nourriture (4 et 6 semaines) avec et sans cuprizone. Chaque condition expérimentale nécessitera 15 souris pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Afin de réduire le nombre d’animaux, 2 conditions expérimentales seront testées sur le même animal. Seront ainsi nécessaires : expériences a/b ; 15 souris cuprizone-4sem + 15 souris cuprizone-6sem + 15 souris contrôle-4sem + 15 souris contrôle-6sem = 60 ; expériences c/d ; 15 souris cuprizone-4sem + 15 souris cuprizone-6sem + 15 souris contrôle-4sem + 15 souris contrôle-6sem =60. Total 120 souris.

Raffinement

Nous nourrirons les souris à la cuprizone pendant moins de 7 semaines afin d’éviter que les animaux ne développent des crises d’épilepsie spontanées. Un examen quotidien permettra de suivre la progression des signes cliniques. La présence de crises d’épilepsie spontanées constitue un point limite : tout animal développant des crises d’épilepsie spontanées sera euthanasié. Ces souris peuvent développer des crises d’épilepsie induites et non spontanées. Il faudra donc impérativement veiller à un silence environnant, à manipuler les souris le moins possible à partir du début du régime à la cuprizone et, au contraire, les manipuler le plus souvent possible avant le début du régime pour qu’une certaine habituation de la manipulation par le même expérimentateur puisse être établie. Un deuxième point limite déterminé est le poids : ce régime alimentaire peut entraîner une perte de poids. Une pesée hebdomadaire sera effectuée. Les animaux présentant une perte de poids supérieure à 20% de leurs poids initiaux seront euthanasiés. Il est possible que certains animaux développent des crises d’épilepsie lors de cette manipulation. Si cette crise tonico-clonique (avec une perte des réflexes de redressement) dure plus de 15 secondes, l’animal sera euthanasié. Les souris nourries à la cuprizone sont moins sujettes à la douleur que des souris exposées à un régime normal. Cependant, elles peuvent développer des difficultés locomotrices et de l’anxiété. Nous surveillerons donc les souris tous les jours. Si elles sont prostrées et que leur score de « mouse grimace scale » du NC3R est de 2, nous les euthanasierons. Les euthanasies se feront par décapitation après anesthésie à l'isoflurane 5% pendant 5 minutes.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus utilisé actuellement dans la littérature pour l’étude des mécanismes neuronaux en cas de sclérose en plaques. L’objectif de l’étude est de déterminer le rôle d’interneurones de l’hippocampe dans l’épilepsie de modèles de sclérose en plaques. L’induction de la sclérose en plaques se fera via un régime de croquettes contenant de la cuprizone. Présentant une propension au développement des crises d’épilepsie, ce modèle constitue un sujet d’étude concordant. Intéressés par les mécanismes cérébraux expliquant le développement futur de crises, nous avons choisi d’utilisé ce modèle avant le développement de crises d’épilepsie spontanées afin d’éviter une souffrance animale. Ce modèle a déjà été détaillé dans la littérature antérieure ce qui nous a permis de cibler des fenêtres de temps d’étude précises en fonction du taux de dégradation de l’hippocampe caractérisées par différentes études. Le laboratoire UNIS a acquis depuis plusieurs années une grande expertise dans le domaine de l’électrophysiologie neuronale, en particulier chez les souris au travers des différents projets. De plus, cette équipe de recherche a l’habitude, depuis quelques années, de travailler sur des modèles épileptiques telles que les souris KO Lgi1. Des souris de 8 semaines seront nourries pendant 4 ou 6 semaines à la cuprizone (0.3%). Les animaux présentent à ces stades une dégradation partielle et totale de l’hippocampe selon des études antérieures.

660 souris et 60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de tumeur colique sous anesthésie, des traitements par voies multiples, parfois une irradiation, et des mesures répétées de tumeur, la croissance tumorale pouvant provoquer occlusion, ascite et perte de poids. Le porteur, prestataire de services en recherche préclinique, propose ces modèles à des clients pour sélectionner des molécules anticancéreuses avant essais chez l'humain. Sur le remplacement, il affirme que les méthodes alternatives ne prédisent pas l'efficacité in vivo et que la reconstruction 3D de tumeurs reste marginale.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer colorectal est le deuxième plus mortels (plus de 900 000 décès en 2020 pour environ 1,93 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer coliques déjà mis en place dans notre établissement ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs viscérales coliques chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer, spécifiquement les cancers colorectaux. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Identification des animaux par implantation d’un transpondeur ou clips aux oreilles ou tatouage, sous anesthésie (1 fois, moins de 1 minute). Induction tumorale : sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieur à 30 min). Des méthodes d’imagerie non invasives peuvent être réalisée (sous anethésie pour une durée maximale d’1 heure. Les animaux sont traités sous anesthésie générale par voie : - intra-veineuse -intrapéritonéale -sous cutanée -intra-musculaire ou intra-dermique avec analgésie Les animaux sont traités vigile par voie : - per os faite sous contention La palpation et la mesure au pied à coulisse des tumeurs nécessite la contention des animaux (inférieur à 30 secondes) Des prélèvements de sang pourront être réalisés (1 minute) sur animaux vigiles sous contention si nécessaire ou si possible sous anesthésie. Des prélèvements d’urine peuvent être réalisés en hébergeant individuellement les animaux moins d’une heure ou par légère pression sur le ventre sous contention.

Impact sur les animaux

La greffe tumorale pourra engendrer une douleur et un stress modérés sur 1-2j. L’évolution de la tumeur pourra entraîner une douleur, une gêne, une occlusion intestinale, un envahissement de la cavité abdominale ou pelvienne, de l’ascite et une perte de poids. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2j. Les animaux recevront des traitements par voie intra-musculaire, intradermique, sous cutané, intra-veineuse, orale, per os ou intra-péritonéale et / ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère. Dans le cas des rayons ionisants, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’irradiation. Cela pourra entrainer un stress léger.

Devenir

Les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament, pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global, ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individuelles. Il est estimé que 9 études seront réalisées sur 5 ans. Le nombre d’animaux par groupe est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus (en général 6 à 10 animaux) afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude.

Raffinement

Les animaux sont pesés minimum 2 fois par semaine. Le volume tumoral est estimé, minimum 2 fois par semaine par palpation. Ces fréquences seront adaptées en fonction de l’état général des animaux. Un gel nutritif sera placé au fond de toutes les cages dès que la perte de poids supérieur à 10% sera observée. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages. La greffe de tumeur est réalisée sous anesthésie générale gazeuse avec administration préalable d’un analgésique opiacé. L’implantation de la greffe nécessite l’incision de la peau, la chirurgie est réalisée de façon aseptique et les animaux reçoivent une injection d’anti inflammatoire non stéroïdien en préopératoire ainsi que le lendemain, des soins opératoires (maintien de la température), surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Toutes les procédures invasives et la plupart des procédures peu invasives, sont réalisées sous anesthésie générale par des techniciens formés dont les compétences ont été validées. Les administrations/prélèvements sont réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les administrations douloureuses (intramusculaire et intradermique) sont réalisées avec analgésie préalable (opiacés). Ces administrations/prélèvements sont effectués en suivant les recommandations vétérinaires et du comité d’éthique. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation et un traitement est si possible mis en place. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’induction tumorale. Les animaux adultes pourront mieux supporter le développement tumoral ainsi que les éventuels effets secondaires des composés testés.

2 000 souris et 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués pour prélever organes et sang, 250 pouvant être gardés vivants et réutilisés. Les composés sont administrés par de nombreuses voies, dont intracérébrale, intravésicale et intrapéritonéale, avec mises à jeun jusqu'à 16 heures et une phase in vivo pouvant durer douze mois. Le porteur présente ce travail comme une étape de biodistribution préalable à des études d'efficacité, dans un contexte de cancer colorectal. Sur le remplacement, il affirme que les tests in vitro ne suffisent pas à prédire la biodistribution réelle et qu'il faut la vérifier chez le rongeur.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer colorectal est le deuxième plus mortels (plus de 900 000 décès en 2020 pour environ 1,93 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer coliques déjà mis en place dans notre établissement ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs viscérales coliques chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.

Procédures

Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon). Des administrations intravésicales (par cathéterisation de l’urètre) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Pour les administrations orales où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h. Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vie sur avis du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle, nous attendons n’attendons pas d’effets indésirables particuliers chez les animaux. Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité, ce qui sera surveillée.

Devenir

Dans une grande partie des cas, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer la cinétique et la biodistribution des composés testés. Les animaux ayant reçu une administration unique de composé et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible sélectionnées au préalable dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes, etc.) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex. collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de criblage de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement et une de l’alimentation et de l’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. • Entre 10 et 15% du poids : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA et le comité d’éthique (document de référence) sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les administrations intracérébrales, intrathécales ou intravésicales seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire (analgésique opioïde et alpha2 agoniste au préalable). Les administrations intramusculaire et intradermique seront réalisées après administration d’un analgésique (analgésique opioïde et alpha2 agoniste).

Choix des espèces

Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. Les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.

Une injection de lentivirus dans le cerveau, par chirurgie stéréotaxique de trente à quarante minutes, provoque chez chaque souris une tumeur cérébrale de type glioblastome. 460 souris femelles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de la tumeur dans leur cerveau. Elles reçoivent ensuite des séries d'injections renouvelées toutes les deux semaines, drogues sénolytiques ou anticorps bloquants, pendant que la tumeur peut entraîner fonte musculaire, prostration, déshydratation et lésions cutanées. Le porteur indique que ces tumeurs se développent de façon similaire chez les mâles et les femelles, et retient les femelles parce qu'elles sont "moins agressives et donc plus faciles à manipuler".

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l'effet de drogues dites sénolytiques (drogues qui éliminent les cellules sénescentes) seules ou en combinaison avec d'autres traitements, dans un nouveau modèle immunocompétent de tumeur cérébrale de type glial appelée glioblastome. Le modèle de glioblastome de type mésenchymateux proposé dans le projet récapitule au mieux les altérations moléculaires identifées chez les patients en utilisant une nouvelle technologie d'invalidation de l'expression de gènes.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait générer un modèle préclinique immunocompétent de glioblastome de type mesenchymateux qui récapitule au plus près les altérations moléculaires des glioblastomes de patients. En effet, afin de traduire de façon efficace nos résultats de recherches fondamentales à la clinique il est indispensable de se rapprocher au plus près de la pathologie humaine. Nos résultats devraient permettre de proposer des nouvelles aprroches thérapeutiques pour la prise en charge des patients avec un glioblastome.

Procédures

La procédure expérimentale sera réalisée sur des souris adultes agées de 6-8 semaines et comprend 4 actes techniques incluant une injection intra-crâniale de lentivirus nécessitant un acte chirurgical, une série d'injections, un suivi de la croissance tumorale par bioluminescence et des traitements. La chirurgie prendra environ 30-40min par animal. Les injections d'une durée de 10-20 secondes, seront réalisées 1 fois par jour pendant 5 jours consécutifs. La quantification de bioluminescence sera réalisée deux fois par semaine, toutes les semaines. Cette mesure est indolore et dure selon l'intensité de la bioluminescence entre 1 et 4 min. Les traitements d'une durée de 10-20 secondes, seront administrés pendant 5 jours consécutifs et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines. L'administration d'anticorps bloquants se fera en 4 injections espacées de deux jours et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines.

Impact sur les animaux

Ce projet comporte deux étapes où des effets indésirables sont attendus sur les animaux, la procédure chirurgicale et la charge tumorale. La procédure chirurgicale est invasive, il s'agit d'une injection stéréotaxique de lentivirus dans le ventricule latéral effectué sous anesthésie/analgésie mais qui entraîne des nuisances (risques anesthésiques, douleur post-opératoire, risque infectieux). Concernant la charge tumorale, les nuisances sont une variation du poids corporel notamment une perte de masse musculaire, le développement d'une masse tumorale gênant la mobilité ou les fonctions normales de l'animal, une dégradation de l'état général de l'animal (signes cliniques généraux parmi lesquels posture et état de vigilance, prostration ou décubitus, déshydratation, lésions cutanées). Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et les animaux seront pesés quotidiennement pendant les 5 jours suivant la chirurgie et deux fois par semaine par la suite.

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées en fin de procédure. En effet, l'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever le cerveau des souris et d'analyser la tumeur cérébrale induite pendant la procédure, au niveau moléculaire et histologique.

Remplacement

En parallèle de ce projet in vivo, nous caractériserons des prélèvements chirurgicaux de glioblastomes de patient collectés avant et après traitement. Ce matériel est rare car la survie des patients après diagnostic est inférieure à 15 mois. Cette étude fondamentale demeurera néanmoins descriptive ; pour avancer dans le développement de nouveaux traitements nous devons réaliser des études fonctionnelles dans un modèle animal. Dans un souci de remplacement et réduction, nous projetons de générer des organoides à partir de glioblastomes de patient afin de tester de nouveaux traitements in vitro. Cependant, l'environnement tumoral, et notamment le système immunitaire, est essentiel à la réponse aux traitements et à ce jour, il n'existe pas encore de modèle d'organoides conservant le microenvironnement global (notamment, la microglie, les monocytes et les cellules T infiltrants, les cellules endothéliales et les péricytes). Notre équipe de recherche participe activement à un projet collaboratif visant à générer des organoides de glioblastomes incluant de la microglie et des monocytes infiltrants. Selon les résultats obtenus sur ce projet, nous pourrons remplacer une partie de nos expériences in vivo par des expériences réalisées sur ces organoides.

Réduction

Nous veillerons à utiliser le moins d’animaux possible pour l’ensemble de nos expériences, leur nombre est de 460 pour cette prodédure. Nous utiliserons pour chaque type d’expérience 10 animaux. Ce nombre, qui peut paraître élevé, est nécessaire pour l’obtention de résultats reproductibles et statistiquement significatifs car les gliomes sont par nature très hétérogènes. Afin d'éviter l'euthanasie séquentielle d’animaux au cours du temps pour évaluer l’apparition de la tumeur, son volume et sa croissance, nous utiliserons la méthode de suivi in vivo par bioluminescence grâce à l'expression de la luciférase dans les cellules tumorales. A chaque euthanasie des animaux afin d'éviter tout double emploi des animaux, nous collecterons divers tissus sur un même animal (cerveau, ganglions, rate, sang). De plus, la tumeur fluorescence sera localisée dans le cerveau disséqué à la loupe binoculaire. Immédiatement après son prélèvement, la tumeur sera séparée en deux parties, une pour les analyses histologiques et immunologiques et une autre pour les analyses moléculaires et biochimiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux conformément à la réglementation. L'enrichissement initial de la cage est composé bandes de papier kraft pliées en accordéon. Les animaux seront analgésiés et anesthésiés avant et pendant toute la procédure chirurgicale. Post-chirurgie, les animaux seront placés dans une salle de réveil chauffée, la qualité du réveil sera observée pour détecter toute anomalie potentielle de la procédure anesthésique. Pendant 48 heures post-chirurgie, nous administrerons un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement et euthanasiés dès que les points limites seront atteints. A cet effet, nous avons mis en place une grille de score afin d'établir un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de souffrance. Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et le poids des animaux deux fois par semaine.s

Choix des espèces

Les nombreux outils génétiques développés et caractérisés chez la souris font de cette espèce un modèle de choix pour l’étude in vivo des tumeurs. De plus, les modèles les plus représentatifs de la biologie et de la génétique des tumeurs humaines sont établis chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes de 6-8 semaines pour induire de novo des glioblastomes. En effet ce type de tumeur est diagnostiqué chez des sujets adultes d'âge médian de 59 ans, cette tumeur se développe donc à l'âge adulte. Notre projet, qui vise à évaluer l'effet de drogues sénolytiques dans un nouveau modèle immunocompétent de glioblastome, utilisera uniquement des souris femelles. En effet, les modèles de glioblastomes murins se développent de façon similaire chez les mâles et les femelles. De façon plus importante dans une étude récente, nous avons montré que l’enrichissement de la signature murine de sénescence chez les patients avec un glioblastome est un facteur de mauvais pronostique quel que soit le sexe. Ces résultats montrent donc que l’étude de la sénescence dans le contexte des glioblastomes peut être réalisée sur un seul sexe. Nous avons choisi pour ce projet de travailler sur des femelles en effet, elles sont moins agressives et donc plus faciles à manipuler, ne se battent pas et peuvent être regroupées dans une même cage si besoin.