Souris

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un test de tolérance au glucose et un test à l'insuline avec prélèvements sanguins répétés, deux isolements de 48 heures et deux échographies sous anesthésie, sous régime enrichi en lipides, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur décrit un stress d'isolement et des lésions cutanées possibles liées au sur-toilettage, et présente ces tests comme "incontournables". Il indique combiner modèles cellulaires et animaux pour étudier une protéine impliquée dans une maladie mitochondriale.

Objectifs

Dans le cadre de ce projet nous nous intéressons à une famille d’enzymes, dont un membre de la famille est responsable d’une maladie mitochondriale caractérisée par des atteintes neuromusculaires sévères. A ce jour, les causes de cette pathologie sont inconnues. Récemment, en utilisant des cellules en culture, une sous-famille unique de ces enzymes dont les membres sont très similaires à l’enzyme responsable de la pathologie mitochondriale a été mise en évidence. Cette sous famille de protéines est également impliquée dans l’activité énergétique de la mitochondrie. Dans des modèles in vitro, un mécanisme pouvant expliquer l’atteinte mitochondriale observée chez les patients a été récemment décrit. Afin de confirmer que ce mécanisme est bien à la base de la pathologie et de la régulation du métabolisme énergétique mitochondrial, nous voulons étudier le rôle d’une protéine appartenant à cette sous famille. Pour cela un modèle de souris avec cette protéine désactivée a été généré. Nous voulons ainsi étudier les effets de la suppression de cette protéine en particulier sur les fonctions physiologiques en condition normale et sous régime riche en lipides. Nos objectifs spécifiques sont donc chez 36 souris : D’analyser les effets cardiaques et métaboliques en condition normale et en condition de régime riche en lipides. De mesurer les variations de la biochimie du sang en condition normale et en condition de régime riche en lipides. De réaliser une étude tissulaire en condition normale et en condition de régime riche en lipides.

Bénéfices attendus

La mitochondrie est un élément présent dans les cellules et jouant un rôle central dans plusieurs fonctions. Elles produisent l’essentiel de l’énergie nécessaire au bon fonctionnement des différents organes chez l’homme. Cette activité énergétique mitochondriale est donc cruciale et son altération entraine des maladies rares et sévères. A l’heure actuelle, plus de 120 syndromes mitochondriaux ont été décrits pour lesquels aucun traitement n’existe. Aussi, la compréhension des mécanismes régulant ces activités énergétiques mitochondriales représente une étape essentielle vers le développement d’approches thérapeutiques contre ces pathologies. Dans ce projet, nous souhaitons comprendre le rôle important joué par une protéine dans la régulation du métabolisme énergétique mitochondriale. Celle-ci fait partie d’une famille de protéines dont certains membres sont responsables de syndromes mitochondriaux et dont la fonction reste inconnue. A court terme, en comprenant le mode d’action et l’impact de notre protéine sur la mitochondrie, notre projet permettra d’établir les causes des pathologies mitochondriales associées à cette famille. A long terme, notre projet permettra d'identifier les cibles sur lesquelles agir afin d'améliorer les fonctions mitochondriales. Ainsi, une fois que nous aurons détaillé le mode d’action de cette protéine, nous souhaitons identifier des molécules actives sur celle-ci et utiliser ces molécules pour restaurer les fonctions mitochondriales dans des pathologies.

Procédures

Durant ce protocole, une cohorte de 36 animaux suivra une série de tests qui viseront à déterminer l'effet d'un régime enrichi en lipides sur les fonctions métaboliques. Pour cela, nous effectuerons un seul test de tolérance au glucose par souris, dans lequel l'animal reçoit une injection intrapéritonéale de glucose suivi de 5 prélèvements d'une goutte de sang à la queue afin de suivre sa glycémie ; tout comme peut le faire l'homme en cas de diabète. Un seul test de sensibilité à l'insuline par souris sera aussi effectué, assez similaire au précédent mais avec une injection intrapéritonéale d'insuline entrainant une réduction de la glycémie. Ce test permet de vérifier si un diabète de type I ou type II est installé chez l'animal. Ces deux tests durent environ 3 heures durant lesquelles l'animal est placé dans un tube de contention afin de prélever des gouttes de sang à plusieurs temps (5 gouttes sur la durée du test). Un test de calorimétrie permet de vérifier la consommation en oxygène des animaux et nécessite d'isoler les souris durant 48h, ce qui peut être un stress d'isolement. Ce test sera répété deux fois par souris. Néanmoins, elles retrouvent ensuite leurs groupes sociaux. L'échographie sera réalisée deux fois par souris, elle nécessite que l’animal soit sous anesthésie. La procédure dure environ 20 min par souris. Enfin, des prélèvements sanguins seront effectués en fin d’étude pour analyser des paramètres biochimiques. Ces prélèvements, un par souris, se font en quelques minutes.

Impact sur les animaux

Durant le projet, les animaux subiront un prélèvement sanguin, qui dure quelques minutes. Nous étudierons les mécanismes de régulation du glucose et la sensibilité à l'insuline. Dans ce protocole, les animaux recevront une injection d'insuline et de glucose, et subiront des prélèvements de gouttes de sang à intervalle réguliers sur une période de 3 heures, afin de suivre leur glycémie. Pour connaitre leur métabolisme énergétique, ils seront isolés pour une période de 48h. Ce test sera répété deux fois par souris. Cet isolement permet de connaitre la valeur de chaque individu et est indispensable pour pouvoir conclure sur ce paramètre. Les deux échographies se déroulent quant à elles sous anesthésie à l'isoflurane pendant toute la durée du test. Les animaux seront rasés et une crème dépilatoire hypoallergénique sera appliquée. Enfin, le régime enrichi en lipides peut entrainer la présence de lésions cutanées dues à un hyper-toilettage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour collecter des tissus qui seront analysés afin de déterminer l'impact de ce régime et de la mutation génétique sur les organes.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet, nous combinons l’utilisation de modèles in vitro et d'animaux. L’utilisation des modèles animaux est limitée aux études qui ne peuvent être conduites sur les modèles in vitro. Ainsi, les tests en conditions de régime riche en lipides et les analyses biochimiques, morphologiques et structurelles des tissus sont des impératifs incontournables de notre projet qui, en l'état des connaissances et des méthodes disponibles, ne peuvent pas s'affranchir de l'utilisation d'un modèle animal. En revanche, les investigations des mécanismes cellulaires et moléculaires sont développées sur des modèles cellulaires in vitro.

Réduction

D'un point de vue général, nous réalisons une grande partie de notre projet sur des modèles cellulaires in vitro et limitons autant que possible les approches expérimentales réalisées sur l'animal. Ces dernières sont uniquement destinées à valider/confirmer l'implication des processus révélés in vitro dans le domaine physiopathologique. Pour notre projet, nous avons procédé à une réflexion pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Nous avons établi strictement le nombre d’animaux nécessaire incluant mâles et femelles porteurs des génotypes KO et wild-type. de plus, les groupes contrôles et expérimentaux ont un fond génétique identique. Afin de limiter l'utilisation d'animaux, nous avons opter pour une approche intégrative où les animaux sont utilisés pour différents tests et analyses. Tous les types de tissus que nous souhaitons étudiés seront prélevés sur chacun des animaux utilisés. Pris dans son ensemble, le design de notre projet permet d'optimiser au maximum la quantité d’animaux nécessaire à sa réalisation.

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Ainsi, durant le prélèvement sanguin, nous réaliserons des injections de sérum physiologique tiède afin de compenser la perte hydrique. Une surveillance accrue et quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux sera mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure, si ces derniers sont atteints nous procéderons à l'arrêt de l'expérience.

Choix des espèces

Le modèle expérimental utilisé dans ce projet et le modèle murin, largement utilisé dans le contexte de modifications génétiques. La souris est un modèle établit et solide concernant l’étude des pathologies mitochondriales. En effet, ce modèle permet d'exprimer fortement les syndromes mitochondriaux incluant les atteintes de différents systèmes, l’intolérance à l’effort et les déficits neurologiques. Les animaux seront utilisés à 8 semaines, soit le début de l’âge adulte.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par voie orale des parasites issus de produits de la pêche, puis des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie, avant d'être tuées pour examiner leurs organes. Le porteur écrit que ces parasites sont inoculés pour la première fois à des souris et que "la prédiction des effets indésirables est impossible", avec un risque de paralysie et de déshydratation entraînant une mise à mort anticipée. Il présente le recours au rongeur comme "indispensable" pour évaluer le potentiel zoonotique de ces parasites.

Objectifs

Le présent projet vise à acquérir des données sur les parasites dans les produits de la pêche potentiellement zoonotiques, et leur pouvoir pathogène, en développant des outils d’expérimentation animale pour une meilleure définition des risques zoonotiques liés à leur présence.

Bénéfices attendus

Les données acquises permettront à moyen ou long terme une meilleure évaluation et une maîtrise accrue du risque lié aux parasites présents dans les produits de la pêche. A ce jour peu connu et peu décrit dans la littérature, le caractère zoonotique de ces parasites doit être étudié. Le projet lui-même est tourné vers le pouvoir pathogène et infectieux des parasites des produits de la pêche sur mammifère terrestre.

Procédures

Chaque souris sera attrapée légèrement à l’arrière de la tête, puis l’embout de la pipette sera introduit dans la gueule et les 20 µL seront donnés à boire à la souris qui les absorbera par déglution naturelle (1 seule intervention de moins d'1 minute). Prélèvement de sang chaque semaine sur chaque souris après anesthésie par inhalation d’isoflurane (4 interventions d'1 minute chacune).

Impact sur les animaux

C’est la première fois que ces parasites seront inoculés à des souris. La prediction des effets indésirables est impossible. Les animaux seront contrôlés chaque jour pour arrêter l'expérience si nécessaire. Les points limites observés dans le modèle souris OF1 infectées par Trichinella spp. seront observés. Chaque souris sera observée le matin à l’arrivée des expérimentateurs et des zootechniciens et en fin de journée avant de leur départ. Au moindre signe neurologique (début de paralysie notamment) ou de déshydratation (dû à une potentielle diarrhée), l'animal sera mis à mort.

Devenir

Les souris seront mises à mort et des prélèvements d’organe seront réalisés afin d’étudier les éventuelles lésions ou réactions de l’hôte provoquées par la présence des parasites

Remplacement

Le projet lui-même est tourné vers le potentiel zoonotique et le pouvoir pathogène et infectieux des parasites des produits de la pêche sur mammifère terrestre. Le recours au modèle rongeurs est donc indispensable.

Réduction

3 lots de souris seront constitués (1 pour chaque parasite étudié (2 espèces de parasites) + 1 groupe contrôle). Nous souhaitons utiliser : 10 souris par lot.

Raffinement

Chaque groupe d’animaux sera hébergé en cages séparées (10 souris/ cage) dans leurs conditions classiques avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (balle, morceau de bois pour lapin ; carré de coton, maison en plastique pour les souris, roues). Un suivi quotidien des souris sera réalisé : poids, aspect de selles, comportement, quantité d’eau bue. D’autre part, des prélèvements journaliers des selles seront pratiqués afin d’observer la présence ou l’absence des parasites. Les expériences se poursuivront jusqu’au trentième jour d’infection. Si les points limites sont atteints, les souris seront mises à mort immédiatement.

Choix des espèces

Les souris sont sensibles à l’infection par de nombreux parasites. La lignée OF1 a été choisi car les souris ne sont pas consanguines et sont plus représentatives de la diversité des hôtes. D’autre part, il s’agit de la lignée de souris utilisée pour les infections du parasites zoonotiques transmis par les aliments, Trichinella spp., modèle d’étude parfaitement maitrisé au laboratoire. Adultes de 5 semaines, utilisé dans le modèle d’infection par Trichinella spp.

3240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de tumeurs, elles reçoivent des agents d'imagerie et sont soumises à des séances d'imagerie sous anesthésie, jusqu'à huit par animal sur sept jours, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur indique que la croissance tumorale peut gêner les mouvements et provoquer une cachexie, et que le suivi s'arrête à un volume de tumeur défini comme point limite. Il affirme que l'imagerie divise par deux le nombre d'animaux et qu'aucun test in vitro ne prédit la biodistribution, pour sélectionner des produits de diagnostic et de traitement du cancer.

Objectifs

L'objectif de cette étude est d'évaluer les propriétés pharmacocinétiques (adsorption, distribution, métabolisme et excrétion) d'agents d'imagerie diagnostique et thérapeutique dans le domaine de l'oncologie préclinique. Le développement de ces nouveaux agents est nécessaire pour faire progresser le diagnostic et le traitement du cancer. Dans un premier temps, les composés seront évalués sur des cellules (in vitro) pour connaître leurs propriétés de base. Cependant, il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, et certainement pas sa pharmacocinétique, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent. Par conséquent, pour s'assurer que les produits nouvellement développés présentent des propriétés pharmacocinétiques favorables, ils seront d'abord testés in vivo sur de petits rongeurs.

Bénéfices attendus

En cancérologie, les enjeux actuels sont d’améliorer le diagnostique en étant plus précoce mais aussi plus spécifique, afin d’adapter au mieux le choix du traitement et ainsi limiter les effets indésirables. Les études que nous mènerons dans le cadre de ce projet nous permettront de sélectionner les produits d'imagerie diagnostique et thérapeutique les plus prometteurs sur la base de leurs propriétés pharmacologiques chez les petits rongeurs. Ceux-ci seront ensuite sélectionnés pour un développement plus approfondi, ce qui dépasse le cadre de ce projet. Les autres candidats, moins prometteurs, seront écartés et ne seront pas utilisés dans de futures études. En outre, les produits prometteurs (basés sur des données obtenues précédemment) pourront être testés dans différents modèles de tumeurs afin de déterminer leurs propriétés pharmacocinétiques dans ces modèles précliniques. Cela nous permettra de choisir le modèle de souris le plus optimal pour des études ultérieures d'efficacité ou de thérapie et d’utiliser le moins de souris possible dans ces études.

Procédures

- Observation des souris (poids, santé générale) : toutes les souris, sur des animaux vigiles, deux fois par semaine. Durée : quelques secondes par souris - Injection d'un agent d’imagerie seul ou avec compétiteur : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes - Imagerie : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, au maximum huit points d'imagerie sur une période de sept jours après l'injection de l'agent d’imagerie. Selon l'agent d'imagerie utilisé, différentes techniques peuvent être employées : Tomographie par émission de positons (TEP), imagerie par résonance magnétique (IRM), imagerie optique ou une combinaison de différentes techniques, telles que par exemple TEP/IRM, TEP/tomodensitométrie (CT) ou Tomographie par émission monophotonique (SPECT)/CT. Durée : maximum 60 minutes d’anesthésie - Prélèvement de sang : sur animaux anesthésiés, au maximum 2 fois. 10 minutes maximum d’anesthésie - Euthanasie et prélèvement des différents organes : toutes les souris, les souris seront profondément anesthésiées avant que la procédure n'ait lieu, dernière expérience.

Impact sur les animaux

La croissance de la tumeur pourrait avoir des effets négatifs sur les animaux, comme une gêne des mouvements de l’animal ou des pertes de poids (cachexie). L'évolution de la taille de la tumeur sera donc suivie de près et l'étude sera terminée lorsque les tumeurs auront atteint la taille mentionnée dans les points limites. L’état général de l’animal ainsi que son poids seront aussi suivis et un complément alimentaire sous forme de gel pourrait être fournis pour limiter les impacts. La majorité des procédures (injection [intraveineuse, sous-cutanée, intrapéritonéale], prélèvements de sang et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit chauffant réduisant la douleur et l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Peu ou pas d'effets indésirables dus à l'injection du traceur sont attendus (les doses de traceurs sont très faibles).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés, car les organes seront prélevés pour une évaluation ultérieure par des techniques ex vivo. Ces informations visent à renforcer les données d'imagerie.

Remplacement

Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été, si possible,au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types de cellules et/ou de tissus sont impliqués. En cas d’observation d’effet secondaire lié à l’injection intraveineuse du traceur, l’étude sera stoppée. La biodistribution réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, les nouveaux agents seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo. Le nombre d'animaux utilisés a été déterminé en partie sur la base de plans expérimentaux précédents et a été confirmé à l'aide de calculs statistiques. En comparaison avec une étude classique qui nécessite la mise à mort des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie peut être répétée à différents temps et permet de réduire le nombre d’animaux d’autant. . L'imagerie permet une diminution par environ 2 du nombre d’animaux en comparaison d'une étude n'utilisant pas l'imagerie.

Raffinement

L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures (injection, prélèvements et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. . Les expériences sont menées, dans une très large majorité sur des animaux pour lesquels le volume de la tumeur n’excède pas 1000-1200 mm3 (plus rarement, il est toutefois possible d’inclure des animaux dont le volume de la tumeur est supérieur à 1000-1200 mm3, mais sans dépassement de point limite). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les animaux seront hébergés par 5 ou 10 en fonction de la taille des cages et le nombre d’animaux par groupes mais l’hébergement individuel sera proscrit. L’eau et la nourriture seront donnés ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera mis dans chaque cage (sizzle-dri ou tubes en polycarbonate).

Choix des espèces

Au cours de ce projet, nous utiliserons des souris adultes (âge minimum de 8 semaines au début de l'expérience) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles. Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont l’une des seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus diverses souches de souris immunocompétentes sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. D’autre part, de nombreux modèles de cancers humains sont en place et très bien caractérisés chez la souris par l’établissement producteur permettant d’éviter une mise en place de modèle qui nécessiterait beaucoup plus d’animaux.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intraveineuses de cellules qui induisent des tumeurs pulmonaires, puis des chimiothérapies, avant d'être tuées à J13 ou J17 pour prélever leurs poumons. Le porteur indique que l'injection provoque un stress lié à la contention et une douleur de faible intensité, et affirme s'appuyer sur plus de dix ans d'expérience du modèle. Il conclut que le recrutement des globules blancs au site tumoral ne peut s'appréhender in vitro et doit être confirmé dans un "organisme entier".

Objectifs

NLRP3 est une protéine largement décrite pour ses fonctions dans l’inflammation, dans des globules blancs appelés myéloïdes. Nos données préliminaires obtenues d’autres globules blancs appelés lymphocytes, isolés de souris montrent que NLRP3 est présent dans ces cellules. En l’absence de NLRP3 ces globules blancs ont une activité anti-tumorale marquée contre différents types de tumeurs. L’absence de NLRP3 dans ces globules blancs semble impacter le recrutement de ces cellules au site tumoral. Grâce à des cellules isolées des tumeurs de souris déficientes pour NLRP3 nous avons pu observer une différence dans l’expression de certains récepteurs membranaires suspecter d’être impliqué dans le recrutement des globules blancs déficients pour NLRP3. Le récepteur appelé CXCR3 interagit avec 3 molécules ayant des effets différents. Différentes lignées tumorales sont capables de les produire. Nous avons validé in vitro la différence de recrutement. Au regard de ces résultats, nous souhaitons aujourd’hui valider ces observations in vivo. En effet, la complexité de la réponse immunitaire anti-tumorale est telle que les résultats obtenus in vitro ne sont pas suffisants pour affirmer que les mécanismes de recrutement des globules blancs identifiés in vitro sont transposables à un organisme entier et qu’ils pourraient servir de cible thérapeutique. Pour confirmer nos hypothèses in vivo, nous utiliserons des souris contrôles ou déficientes pour NLRP3 comme donneurs de globules blancs. Ces globules blancs seront injectés à des souris ayant de tumeurs au niveau pulmonaire. Ainsi, nous pourrons comparer le recrutement des globules blancs contrôles ou déficients pour NLRP3 dans des tumeurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : - apporter des connaissances nouvelles concernant NLRP3. - évaluer si NLRP3 pourrait être une cible thérapeutique ou un complément à l’immunothérapie

Procédures

Les injections de cellules seront réalisées en iv sur souris vigiles (2 par souris, chaque injection dure quelques secondes). Les traitements par chimiothérapies seront réalisés en ip sur souris vigiles (4 par souris, chaque injection dure quelques secondes). La mise à mort sera réalisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane.

Impact sur les animaux

Les tumeurs seront induites dans les poumons suite à une injection intra veineuse dans la veine caudale. Cet acte peut engendrer du stress chez l’animal car il doit être maintenu dans un système de contention. L’injection induit une douleur de faible intensité au site de l’injection. Les foyers tumoraux au niveau des poumons permettent d’obtenir des résultats plus clairs et de meilleure qualité. Les animaux seront mis à mort à J13 ou J17 post-injection des cellules tumorales. A ce stade, il y a entre 100 et 200 foyers tumoraux sur les poumons (d’environ 1mm de diamètre) et cela n’impacte pas la vie des animaux (nous avons plus de 10 ans d’expérience sur ces modèles).

Devenir

Les 260 souris seront toutes euthanasiées afin de prélever les poumons

Remplacement

Nous avons déjà réalisé un certain nombre d’expériences in vitro pour caractériser les différences entre les CD8 issus de souris C57Bl6 et les CD8 déficients pour NLRP3. Ceci nous a permis d’identifier des marqueurs d’intérêt et des phénomènes à explorer in vivo. Malheureusement, le recrutement au site tumoral et l’implication dans la réponse immunitaire antitumorale ne peuvent pas être appréhendés in vitro à l’heure actuelle car ce sont des mécanismes trop complexes qui font intervenir plusieurs acteurs cellulaires et moléculaires.

Réduction

Dans un souci de réduction et étant donné que nous voulons confirmer des résultats obtenus in vitro, les expériences ne seront réalisées que 2 fois avec 5 souris par groupes et par des personnes parfaitement formées aux gestes permettant d’optimiser la reproductibilité. De plus, chaque expérience sera accompagnée d’une analyse complète de l’infiltrat immunitaire afin de récolter un maximum d’informations sur les mêmes souris sans avoir besoin de recommencer les expériences (1 lobe pour l’analyse de l’infiltrat et 1 lobe pour les marquages). Enfin, un « go-no go » est appliqué à la fin de chaque phase du projet. En d’autre terme si les résultats de la phase n ne confirment pas l’hypothèse, la phase n+1 ne sera pas réalisée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Ils seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (la fréquence de surveillance sera bien entendu augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux). Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.

1 800 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour la recherche mais pour des travaux pratiques de formation. Des stagiaires débutants s'exercent sur animal vigile au gavage, aux injections et au prélèvement sanguin, chaque animal subissant jusqu'à deux tentatives par geste, les exercices non maîtrisés étant pratiqués sur cadavres. Le porteur présente ces séances de deux heures comme une obligation réglementaire et emploie des animaux de "surplus d'élevage" destinés à être tués. Il affirme que les réactions de l'animal vigile ne peuvent être reproduites par des méthodes substitutives et juge le remplacement "non envisageable".

Objectifs

Conformément à la réglementation, les personnes chargées de réaliser les protocoles scientifiques et d’appliquer les procédures expérimentales sur les animaux doivent suivre, dans l’année suivant leur prise de poste, une formation spécifique. L'organisme de formation spécialisé dans le domaine de l’animal de laboratoire, dispense chaque année environ 3 sessions de cette formation spécifique d’une durée totale de 45h (volume horaire réglementaire), intégrant des cours théoriques (38h), des travaux dirigés (5h) et des travaux pratiques (2h). La séance de travaux pratiques permet aux participants d’acquérir quelques gestes techniques basiques. Le projet consiste donc à réaliser une séance de 2h de travaux pratiques sur animaux, lors de chaque session de formation réglementaire en expérimentation animale destinée aux personnes appliquant les procédures expérimentales sur animaux. Le principe est d’enseigner aux stagiaires, en petits groupes de 6 stagiaires maximum pour 1 encadrant : - Les bonnes pratiques d’approche de l’animal, en maîtrisant toute appréhension du stagiaire et tout stress pour l’animal - Les bons gestes pour la contention, dans le respect de l’animal - Quelques techniques simples d’administration de substances et de prélèvement sanguin

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont le bon niveau de formation des personnes travaillant au quotidien sur l’animal de laboratoire, le respect des dispositions réglementaires relatives aux compétences des personnels, ainsi que la diffusion d’une culture de la bientraitance des animaux.

Procédures

Au cours de la séance de 2h de travaux pratiques, quelques techniques simples d’administration de substances et de prélèvement sanguin peuvent être réalisées, selon le niveau de maîtrise des participants : ces gestes ne seront réalisés sur animal vivant que lorsque la contention est parfaitement maitrisée par les stagiaires et validée par l’encadrant. Les gestes qui peuvent alors être appris sont : - le gavage par voie orale (VO), avec 10 mL/kg de sérum physiologique (NaCl 0,9%) d'une durée de 10 minutes maximum - l’injection intra-péritonéale (IP), avec 10 mL/kg de sérum physiologique (NaCl 0,9%) d'une durée de 10 minutes maximum - l’injection sous-cutanée (SC), avec 10 mL/kg de sérum physiologique (NaCl 0,9%) d'une durée de 10 minutes maximum - le prélèvement sanguin (PS) à la veine mandibulaire, dans la limite de 10% du volume sanguin total d'une durée de 10 minutes maximum. Chaque animal pourra faire l’objet au maximum d’une administration (gavage ou injection) et d’un prélèvement sanguin. Ainsi, au maximum, pour les 3 animaux dédiés à un participants, il peut y avoir : - Animal 1 : gavage VO + PS - Animal 2 : injection IP + PS - Animal 3 : injection SC + PS En cas d’échec lors d’une administration ou d’un prélèvement, un second essai peut être autorisé par l’encadrant sur le même animal, mais pas au-delà. (Nombre de tentatives = 2 maximum)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles pour les animaux sont : - le stress lié à une préhension et contention d’un manipulateur non expérimenté - la souffrance pouvant être liée à une administration de produit ou prise de sang incorrectement réalisées La durée de ces effets est au maximum de 2h, durée de la seance de travaux pratiques. Si un animal présente des signes de stress ou souffrance, la procédure en cours sera immédiatement interrompue et l’encadrant prendra la décision adéquate pour l’animal (euthanasie si nécessaire, voir points limites)

Devenir

Les animaux euthanasiés sont utilisés pour réaliser les gestes techniques n’ayant pas pu être pratiqués sur animal vigile, lorsque la contention n’est pas suffisament maîtrisée.

Remplacement

Diverses méthodes ont été mises en œuvre au cours de notre formation pour remplacer l’animal. Ainsi, les travaux dirigés d’anatomie sont exclusivement réalisés à l’aide de planches anatomiques et d’un puzzle 3D inerte. Les méthodes d’identification par pose de bague auriculaire et emporte-pièce sont enseignées sur des morceaux de carton. Un mannequin ou une peluche sont utilisés pour les démonstrations de contention. Néanmoins, pour l’apprentissage de l’approche de l’animal, de sa contention et des gestes techniques, les réactions comportementales de l’animal vigile ne peuvent être reproduites par des méthodes alternatives et restent indispensables pour finaliser une formation efficiente et pour permettre aux participants d’aborder les animaux dans les conditions les plus proches de leur réalité quotidienne. La réglementation et la Commission Nationale de l’Expérimentation Animale imposent d’ailleurs l’utilisation d’animaux vivants pour cette partie pédagogique de l’enseignement dans les formations initiales en expérimentation animales. C’est pourquoi le remplacement de l’animal n’est pas envisageable pour ces travaux pratiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés à des fins scientifiques, nous utilisons uniquement des animaux de surplus d’élevage, qu’il est prévu d’euthanasier dans la semaine, issus majoritairement soit de l’élevage de l’établissement d’accueil, soit éventuellement d’un éleveur agréé. Nous réduisons également au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque stagiaire. Néanmoins, afin de limiter le nombre de gestes appliqués à chaque animal (au maximum : contention, 1 administration et 1 prélèvement sanguin), 3 animaux par participant sont nécessaires. Afin de limiter églement le nombre de participants, nos formations ne sont dispensées qu’aux personnes ayant l’obligation réglementaire de la suivre du fait de leurs missions professionnelles.

Raffinement

En termes de raffinement, nous nous efforçons toujours de limiter au maximum le stress des animaux en commençant les travaux pratiques par une approche douce : en présentant simplement, un à un, leur main dans la cage des animaux, les stagiaires prennent tout le temps nécessaire pour maîtriser leur propre appréhension et habituer les animaux à leur présence. Une grande importance est donnée à l’observation des animaux, la détection et la prise en compte de tout signe de stress de l’animal afin de préserver son bien-être. Pour la contention, les différentes méthodes montrées sont parmi les moins stressantes pour l’animal, en utilisant par exemple pour les souris un tube de plexiglas transparent ou les 2 mains en « bol ». Les notions d’entrainement des animaux, de bientraitance, de raffinement des techniques sont enseignées. Pour des raisons éthiques, les gestes techniques (administration et prélèvement sanguin) ne sont réalisés sur animal vivant que lorsque la contention est parfaitement maitrisée par les stagiaires, avec validation de l’encadrant. Lorsque la contention n’est pas validée, les gestes sont uniquement appliqués sur cadavres. Le nombre de geste technique appliqué à chaque animal est limité : chaque animal fait l’objet au maximum d’une administration (gavage ou injection) et d’un prélèvement sanguin. En cas d’échec lors d’une administration ou d’un prélèvement, un second essai peut être autorisé par l’encadrant sur le même animal, mais pas au-delà. (Nombre de tentatives = 2 maximum) Enfin, l’encadrant veille tout au long de la séance de travaux pratiques au respect de l’éthique et de la bientraitance des animaux, il sensibilise en continu les stagiaires au raffinement des techniques.

Choix des espèces

La formation réglementaire dispensée comprend un module général (13h) et un module spécifique des rongeurs et lagomorphes (32h). Les animaux utilisés pour cette formation sont donc spécifiquement des rongeurs ou lagomorphes. Les participants travaillant au quotidien sur rongeurs, ce qui correspond à la grande majorité de nos participants puisque les rongeurs sont les animaux les plus utilisés en recherche, sont orientés vers des travaux pratiques réalisés exclusivement sur rongeurs (en grande majorité des souris), tels que ceux que nous souhaitons organiser à l’établissement d'accueil. Les animaux sont au stade adulte, à partir de 8 semaines ou au delà, leur âge n’a pas d’importance pour ce projet.

444 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections destinées à induire une arthrite psoriasique, une arthrite rhumatoïde ou une spondylarthrite, avec inflammation des orteils et des pattes suivie par scoring pendant plusieurs semaines, des traitements par gavage ou injection et un prélèvement sanguin terminal par ponction cardiaque. Le porteur teste de nouveaux traitements anti-inflammatoires, les pathologies induites étant irréversibles. Il indique n'utiliser les animaux qu'après des tests in vitro et ex vivo.

Objectifs

Les maladies inflammatoires ostéo-articulaires sont parmi les pathologies douloureuses et invalidantes les plus courantes et les plus répandues dans le monde, dont la prévalence devrait augmenter principalement en raison de l'augmentation de l'espérance de vie. Ces pathologies sont le plus souvent difficiles à repérer, mais peuvent avoir des répercussions sur l’état psychologique des personnes affectées par les douleurs chroniques qu’elles engendrent, et à plus long terme sur la vie professionnelle. On estime que 25 % des personnes atteintes d’ostéoarthrite sont incapables d'accomplir leurs activités quotidiennes. De plus en plus de preuves indiquent maintenant que l'inflammation, locale et systémique, est à l'origine de dommages aux articulations et aux os. Le projet décrit dans cette demande consiste au développement de modèles pathologiques chez le petit animal de laboratoire (souris) afin d’évaluer la pharmacocinétique et l’efficacité thérapeutique de cellules médicaments ou de nouvelles molécules (études de PK/PD) dans le domaine des maladies inflammatoires ostéo-articulaires telles que l’arthrite psoriasique, l’arthrite rhumatoïde et la spondylarthrite ankylosantes. L’objectif sera de valider leurs propriétés immunomodulatrices, anti-inflammatoires et anti-fibrotiques afin de les proposer comme nouvelles modalités de thérapies dans le traitement des maladies inflammatoires ostéo-articulaires.

Bénéfices attendus

Faire émerger de nouveaux outils de thérapies dans le traitement des maladies inflammatoires ostéo-articulaires.

Procédures

L’induction du modèle d’arthrite psoriasique nécessite une injection intrapéritonéale de mannan. Cette induction entrainera une inflammation de la peau et des articulations évaluée quotidiennement par scoring pendant 7 jours. L’induction du modèle d’arthrite rhumatoïde nécessite l’injection intradermique d’une émulsion de collagène. Cette induction entrainera une inflammation des orteils et des pattes entières évaluée tous les 3 à 4 jours par scoring pendant 40 à 50 jours. L’induction du modèle de spondylarthrite ankylosante nécessite 3 injections intrapéritonéale de protéoglycane (la première réalisée sur des animaux de 12 semaines, puis 3 et 6 semaines plus tard. Cette induction entrainera une inflammation des orteils et des pattes entières évaluée deux fois par semaine par scoring de l’œdème et de la douleur pendant 20 jours. Les traitements évalués pour lutter contre l’inflammation seront administrés soit par voie orale (gavage), soit par voie sous cutanée au niveau de la nuque, soit par voie intraveineuse (veine caudale), soit par voie intrapéritonéale, soit par voie topique. Des prélèvements sanguins de 50µl seront également effectués une fois par semaine maximum avant et pendant les phases de traitement. Un dernier prélèvement, terminal, sera réalisé en fin de protocole par ponction cardiaque juste avant mise à mort, sans réveil. Chaque procédure d’administration étant pratiquée par du personnel formé, chaque geste ne prendra que quelques secondes. Pour les protocoles d’imagerie (Tomographie moléculaire de fluorescence, Tomodensitométrie et Tomographie par émission de positons) les animaux subissent une injection intraveineuse (animal vigile pour la fluorescence, anesthésié dans les autres cas) avant imagerie sur animaux anesthésiés.

Impact sur les animaux

Le psoriasis est une maladie auto-immune entraînant une inflammation chronique de la peau qui, lorsqu'elle s'étend dans les articulations, résulte en arthrite psoriasique. Le modèle induit permet de reproduire des lésions semblables à celles observées chez l'Homme (inflammation et hyper prolifération cutanées avec atteintes articulaires). L'inflammation de la peau pourra se traduire par un épaississement des oreilles et de la desquamation. L'inflammation articulaire pourra entrainer un gonflement des orteils, chevilles ou des articulations.

Devenir

Les pathologies induites dans le cadre de cette étude étant irréversibles, les animaux seront tous mis à mort en fin de procédures expérimentales (prélèvement sanguin trans-thoracique terminal).

Remplacement

L’utilisation des animaux ne se fera qu’en dernier recours après des tests préalables de criblage et d’efficacité in vitro et ex vivo.

Réduction

Le design de l'étude étant un plan d'expérience contrôlé en mesures répétées, le nombre d'animaux est réduit à 8 animaux par groupe. Ce nombre d’animaux nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats des études réalisées. L'utilisation de l'imagerie permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés grâce au suivi longitudinal du même animal.

Raffinement

L’enrichissement du milieu d’hébergement sera contrôlé. Une évaluation quotidienne du bien-être animal sera réalisée selon une grille de scores spécifiques, établie selon des paramètres physiologiques (prise de poids, hydratation par exemple) mais également selon des critères décrivant de façon précise l’apparence physique et le comportement général de chaque animal. Ainsi, l’ensemble de ces observations permet d’intervenir au plus tôt dans la prise de décision de la poursuite du protocole pour un animal donné, cela avant même d’atteindre les points limites pré-établis et fixés par la procédure.

Choix des espèces

La souris s’est rapidement imposée au cours du temps comme un modèle fondamental dans la recherche biomédicale. Dans le domaine particulier de la recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation et les pathologies associées, l’essentiel de la littérature est obtenue chez cette espèce pour diverses raisons (i) scientifiques, les mécanismes moléculaires et cellulaires décrits dans ces espèces sont retrouvés chez l’homme et (ii) pour un intérêt pratique: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et très bonne adaptation aux conditions expérimentales, l’intérêt majeur étant en premier lieu, l’historique de la connaissance de ces animaux, chez lesquels l’essentiel des traitements utilisés en clinique humaine de la douleur aujourd’hui ont été évalués et validés. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~7-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. En effet, il est bien établi dans la littérature que l'induction d’une inflammation menant au développement de maladies ostéo-articulaires chez des animaux jeunes adultes est efficace, fiable et reproductible. Dans le cas de notre étude, ce stade de développement est en parfaite adéquation avec la pathologie humaine, notamment en lien avec ses similarités physiologiques et moléculaires. De plus, il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouveaux outils thérapeutiques. Il s'agit également du stade auquel les animaux sont les moins susceptibles de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale.

6 300 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié tués à l'issue pour prélever des tissus, l'autre réutilisée dans d'autres études. Pour accentuer l'anxiété avant le test du labyrinthe en croix surélevé, chaque animal peut être isolé jusqu'à quinze jours et privé d'enrichissement, puis reçoit un composé et des prélèvements sanguins. Le porteur teste l'effet anxiolytique ou anxiogène de candidats médicaments, des retombées thérapeutiques renvoyées au long terme et au passage chez l'humain. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne suffit et que le rat et la souris restent "un passage obligatoire".

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer un potentiel effet anxiolytique (diminution de l’anxiété) ou anxiogénique (augmentation de l’anxiété) d’un candidat-médicament chez le rat ou la souris avec le test du labyrinthe en croix surélevé. Les rongeurs ont une tendance naturelle à éviter les environnements lumineux et ouverts et à rechercher la sécurité des endroits exigus et sombres. Le test du labyrinthe en croix surélevé consiste à placer les rongeurs dans un labyrinthe surélevé par rapport au sol d’environ 60 cm et constitué de 4 bras en forme de croix (2 bras fermés avec des parois hautes et opaques et 2 bras ouverts sans parois) pendant 5 minutes. Les rongeurs vont avoir tendance à se réfugier dans les bras fermés (plus sombres et exigus, donc plus sécurisants) et à passer peu de temps dans les bras ouverts, dans lesquels leur curiosité naturelle les pousse à explorer. Le niveau d’anxiété des animaux est évalué par le temps passé et le nombre d’entrées effectuées dans les bras ouverts pendant les 5 minutes du test.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter différentes pathologies telles que les troubles anxieux ou le stress post-traumatique. Du fait de la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rat et souris) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendu. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée et d’évaluer ses éventuels effets secondaires sur le stress avant son passage en phase I chez l’humain. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.

Procédures

Au maximum, l’animal pourra être isolé socialement jusqu’à 15 jours avant l’expérience afin d’augmenter son état d’anxiété. Un composé pourra lui être administré une ou plusieurs fois avant le test (~2 minutes par administration). Il pourra subir des prélèvements de sang vigile ou anesthésié selon les recommandations éthiques en vigueur (~2 minutes par prélèvement). Le test de comportement dure au maximum 5 minutes.

Impact sur les animaux

Au maximum, l’animal pourra être isolé socialement jusqu’à 15 jours avant l’expérience afin d’augmenter son état d’anxiété et permettre une meilleure évaluation d’un composé anxiolytique. Dans ce cadre, il pourrait être privé d’enrichissement afin de maintenir un état d’anxiété suffisant pour les tests. L’administration et les prélèvements de sang seront effectués par un personnel entraîné et la douleur associée sera réduite à son minimum et sera l’équivalent d’une piqûre.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux sont gardés en vie et peuvent être réutilisés dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire. Sinon, les animaux sont euthanasiés afin de réaliser des prélèvements de tissus (organes, sang, etc…).

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet pratiqué sur l’animal ne peut être remplacé par d’autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution n’existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez les rongeurs car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l’état de type anxieux. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat et la souris sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures les moins invasives possibles, le suivi d’éventuels signes cliniques, la détermination des points limites et le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire. Les effets potentiellement indésirables des candidats-médicaments qui seront testés dans ce modèle feront l’objet d’échange avec les inventeurs du médicament et les responsables du bien-être animal afin d’adapter les outils d’observations des animaux pour permettre la mise en place de traitements des potentiels signes cliniques. L’administration et les prélèvements de sang seront effectués par un personnel entraîné et la douleur associée sera réduite à son minimum et sera l’équivalent d’une piqûre.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d’un produit sur l’état de type anxieux. Dans ce projet, seuls les animaux adultes seront utilisés car il n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.