Souris
Evaluation de thérapeutique innovante dans des modèles de tumeurs cérébrales chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou par chirurgie dans le cerveau, puis des traitements, un suivi par imagerie et des prélèvements sanguins, avant une mise à mort pour prélever organes et fluides. Le porteur évalue de nouveaux médicaments contre les tumeurs cérébrales, des bénéfices situés à court terme mais "avant passage chez l'homme". Il affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution et que la souris est l'espèce la plus adaptée.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments dans des modèles pertinents de tumeurs cérébrales chez la souris. A noter, les tumeurs cérébrales touche plus de 360 000 personnes par an en France.
Bénéfices attendus
A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que les nouveaux traitements testées sont efficace et également d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage chez l'homme.
Procédures
Les animaux recevront 1 greffe de cellules tumorales soit par voie peu invasive (sous cutané) soit par chirurgie (injection dans le cerveau - durée de la chirurgie estimé à 5-10 min). Dès lors, des essais de traitements seront menés. En cas de prélèvement de sang ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à 1 par semaine et à un volume inférieur à 10 %. Une suivi par imagerie pourra être réalisé sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne < 10 min) ou encore par IRM (durée moyenne = 30 min).
Impact sur les animaux
Le développement de la tumeur chez la souris pourra à terme être associé à des effets secondaires. Dans ce contexte, la mise en place de points limites adaptés permettra de détecter ces signes au plus tôt. De même, l’utilisation de traitement novateur pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Encore une fois, la mise en place de points limites adaptés permettra d'agir rapidement. Les procédures chirurgicales intracérébrale repose sur la mise en place de protocoles chirurgicaux incluant une analgésie maitrisée ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum. Après récupération, les animaux sont maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies. L'ensemble des mesures décrites ci-dessus permet donc de réduire les contraintes potentielles pour l’animal à leur minimum.
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués le développement de la tumeur ou encore par le produit.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le cancer du cerveau. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques (test de comparaison entre groupe véhicule et groupes traités.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.
Choix des espèces
La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Utilisation de vecteurs viraux pour la création de modèles murins de Knock-In par la technique CRISPR/Cas9
- Enseignement supérieur
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mâles sont vasectomisés et hébergés seuls, les femelles reçoivent des embryons manipulés par chirurgie, et les souriceaux subissent une phalangectomie pour le génotypage, décrite comme "indispensable". Le porteur produit des lignées de souris knock-in par CRISPR/Cas9 à l'aide de vecteurs viraux, une mise au point de méthode destinée à être proposée comme prestation dans toute la France. Les femelles non fécondées sont réutilisées une fois puis tuées, les mâles gardés environ un an avant d'être tués.
Objectifs
Ce projet vise à la création de modèles murins par knockin, la matrice ADN de remplacement étant amené par un vecteur Adeno Associé ou AAV. Il se déroulera en deux étapes. La première étape aura pour objectif de définir le meilleur sérotype et le meilleur titre d'AAV par la manipulation de zygotes murins et l'analyse, d'une part de la fluorescence et d'autre part du nombre de copies du gène rapporteur codant pour la gfp, intégré au génome murin. Une fois les conditions optimales définies, des zygotes seront transduits et retransplantés dans des femelles pseudogestantes pour donner naissance à des souriceaux. Ces animaux seront eux-mêmes génotypés par analyse de la présence et du nombre de copies du gène codant pour la gfp.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de ceux ordres. Un bénéfice scientifique car, même si la technologie Crispr-cas9 devient de plus en plus utilisée et est de plus en plus efficace pour créer des modèles d'invalidation, elle pêche encore dans la création de modèles KI. L'utisation d'AAV amenant la matrice portant la ou les modifications est une voie d'amélioration de cette méthodologie. Techniquement, il s'agira d'électroporer les constructions dans les embryons au stade zygote. Cette étape, déjà nécessaire pour la création des modèles KO par Crsipr-cas9, se révèle demander peu d'animaux, bien moins que la méthodologie originelle d'invalidation dans les cellules souches embryonnaires par recombinaison homologue.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale. Pour certains des mâles, il s'agit de la stérilisation par vasectomie, opération qui ne dure que 15 minutes une fois l'animal anethésié. Pour les femelles pseudogestantes, il s'agit d'une petite chirurgie pour permettre l'implantation des embryons manipulés. Celle-ci n'excède pas 10 min une fois la souris anesthésie.
Impact sur les animaux
Les animaux obtenus à l'issue des manipulations seront élevés dans les conditions standards d'hébergement. Le seul acte qu'ils subiront sera une phalangectomie pour déterminer leur génotype, il n'y aura pas d'autre nuisance. Cet acte est indispensable pour permettre à la fois, lors d'un prélèvement unique, l'identification et le génotypage de l'animal. Pour ce qui concerne les animaux subissant des chirurgies, deux cas de figure se présentent. La nuisance pour les mâles vasectomisés réside essentiellement dans leur hébergement isolé un par cage. Pour la limiter ils seront tous hébergés dans la même pièce à proximité visuelle de leurs congénères. De plus, ils seront régulièrement mis en accouplement même en dehors des périodes nécessitant les retransplantations d'embryons manipulés. Pour ce qui concerne les femelles retransplantées, dans la mesure où les précautions pré- et post-opératoires sont respectées, il n'y a pas de nuisance particulière à craindre.
Devenir
Les femelles induites hormonalement et prise par les mâles (présence d'un bouchon vaginal) sont euthanasiées pour récolte des embryons. Celles qui n'auraient pas été accouplées sont gardées 5 jours avant réutilisation. A l'issue de cette nouvelle utilisation, celles qui n'auraient pas été prisee une deuxième fois sont euthanasiées. Les mâles vasectomisés et les mâles fertiles sont gardés environ un an puis euthanasiés.
Remplacement
L'approche méthodologique a tout d'abord été validée par modifications de cellules eucaryotes. Cependant pour travailler sur des modèles mimant des pathologies parfois complexes, la modification du génome murin par ces nouveaux outils de transgénèse demeure l'une des voies indispensables d'approche.
Réduction
Pour cette preuve de concept, l'analyse de la bibliographie a aidé au design des outils (sérotypes à tester, concentrations) et nous nous appuions sur notre savoir-faire pour toute la partie production des zygotes. Ce protocole sera mené en parallèle sur plusieurs plateformes technologiques ce qui permettra de ne pas multiplier en interne les lots expérimentaux et qui correspond au souhait de pouvoir, à terme, offrir les mêmes types de prestations sur toute la France. Aucun test statistique ne sera utilisé car il s'agit ici de produire des souris transgéniques. Le nombre de manipulations sera de deux pour la partie in vitro de détermination du sérotype et de la concentration de l'AAV et de quatre pour les expériences in vivo. Le nombre d'animaux utilisé est détaillé dans chaque procédure.
Raffinement
Les animaux sont suivis de manière quotidienne par du personnel formé et compétent. Du METACAM ND est administré par voie sous-cutané en pré et post-opératoire. Un mélange de kétamine/xylazine est utilisé pour les anesthésies (vasectomies et retransplantations). Du coton est ajouté à l'enrichissement habituel pour favoriser la création de nid par les femelles pseudogestantes. Les points limites de ce projet sont ceux classiquement décrits lors de tout expérience de transgénèse : prostration, perte de poids ou non prise de poids (femelles pseudogestantes), aréactivité lors de l'ouverture de la cage ou de la préhension, aspect corporel.
Choix des espèces
La souris fait partie des espèces historiques et de choix pour l’étude des conséquences de modifications géniques; elle est utilisée en transgénèse depuis 1981. D'autre part la méthodolgie CRISPR/Cas9 y a donné de très bons résultats lors de l'invalidation globale de gènes, résultats tellement bons que le nombre d'animaux utilisés a ainsi été grandement diminué. Enfin, il existe dans cette espèce de nombreux outils d’analyse aux niveaux moléculaire, cellulaire ou de l’animal in toto des caractéristiques phénotypiques. Tous les animaux seront utilisés à partir de leur maturité sexuelle puisque les objectifs sont la production de zygotes sauvages et la retransplantation d'embryons modifiés aux stades une ou deux cellules. Les femelles donneuses d'embryons C57BL/6J seront induites hormonalement puis sacrifiées entre 5 et 7 semaines d'âge. Les femelles pseudogestantes des fonds Swiss-CD1 ou B6CBA/F1 seront retransplantées entre 8 semaines et 6 mois d'âge. Les mâles Swiss-CD1 vasectomisés ou C57BL/6J fertiles seront utilisés à partir de 6 semaines et jusqu'à un an.
Etude par imagerie fonctionnelle Ultrasonore de l’effet du PLX5622 sur l’altération de la fonctionnalité des réseaux cérébraux dans un modèle murin de douleur neuropathique cornéenne.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'à sévère. Elles subissent l'ablation chirurgicale d'une glande lacrymale pour induire une sécheresse oculaire, l'application de filaments rigides sur la cornée vigile pour mesurer l'hypersensibilité, puis des séances de neuro-imagerie par ultrasons de trois à cinq heures sous anesthésie. Le porteur écrit que, voulant étudier les mécanismes de la douleur cornéenne persistante, il ne pourra pas soulager cette douleur. Il décrit les approches sur l'animal entier comme "incontournables" et affirme qu'aucune méthode substitutive n'existe.
Objectifs
La douleur neuropathique cornéenne (DNC) est une douleur chronique qui s’accompagne d’une hypersensibilité sensorielle (air, lumière, contact) et qui affecte de façon dramatique la qualité de vie des patients. Par ailleurs, un ensemble grandissant d’études montre que l’initiation et le maintien de la DNC pourrait être lié à un dysfonctionnement d’un type particulier de cellules gliales cérébrales appelées ‘les cellules microgliales’. Cependant à l’heure actuelle, les traitements de la DNC restent insatisfaisants et les circuits neuronaux impliqués n’ont été que très partiellement caractérisés, du fait de difficultés techniques notamment en recherche préclinique où l’étude des réseaux neuronaux chez le petit animal reste complexe. Dans cette étude, nous proposons d’étudier les changements fonctionnels et structurels des différentes régions cérébrales impliquées dans la DNC et en particulier le rôle des cellules microgliales grâce à l’utilisation d’une technique innovante de neuroimagerie.
Bénéfices attendus
Nos travaux visent à définir 1) les circuits fonctionnels neuronaux impliqués et leurs modifications dans la douleur cornéenne normale et pathologique (chronique) et 2) le rôle spécifique de la microglie dans le développement de la douleur chronique et comment elle peut finement moduler les réseaux de la douleur cornéenne en condition normale et pathologique. A cette fin nous disposons d’un modèle murin de douleur oculaire chronique liée à la sécheresse oculaire développé au sein de l’équipe de nos collaborateurs. Le modèle de douleur cornéenne persistante est un excellent modèle translationnel et pré-clinique qui permet de développer nos connaissances des réseaux neuronaux de la douleur cornéenne et de leurs altérations en cas de douleur chronique. Cette plasticité inadaptée se développe à différents niveaux des systèmes nerveux périphérique et central et a été observée dans de multiples syndromes douloureux chroniques. L’étude de cette plasticité, de l’impact de l’inactivation des cellules microgliales, ainsi que l’existence (ou non) d’un dimorphisme sexuel dans ces mécanismes aideront à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à cette douleur persistante cornéenne, est un point critique pour l’établissement de liens entre observations cliniques et mécanismes endogènes, afin de développer des traitements réellement efficaces.
Procédures
- Réduction du nombre de cellules microgliales des animaux par ingestion de PLX5622 (molécule détruisant la microglie) présent dans leur nourriture. Durée : 3 semaines. Nombre d’animaux impactés : 80. Nombre de répétitions par animal : 1. - Chirurgie de mise en place du modèle de sécheresse oculaire consistant en l’ablation des glandes lacrymales de l’œil droit. Pour la moitié des animaux, ces glandes ne sont pas retirées mais le reste de la chirurgie est inchangée (incision, suture, anesthésie, soin, ...). Réalisée sous anesthésie générale et avec un suivis et une gestion de la douleurs après l’opération. Durée de la chirurgie : 15 à 20 minutes. Nombre d’animaux impactés : 200. Nombre de répétions par animal : 1. - Imagerie de l’œil pour déterminer l’apparition de lésion lors du développement du modèle. Deux types d’imageries sont réalisées sous anesthésie générale pour permettre l’immobilité des animaux. Durée du test : 8 minutes. Nombre d’animaux impactés : 200. Nombre de répétitions par animal : 3. - Mesure des seuils de sensibilité mécanique par application de filaments de plus en plus rigides (jusqu’à ce que l’animal réagisse) sur la cornée d’animaux vigile. Cela permet de mesurer si les animaux développent une hypersensibilité après la mise en place du modèle. Durée du test : 60 à 75 minutes par groupe mais l’application des filaments ne dure que 3 secondes et cette application n’est répétée qu’entre 5 et 8 fois par animal. Nombre d’animaux impactés : 200. Nombre de répétitions par animal : 6. - Neuro-imagerie par ultrason permettant de mesurer de manière non invasive l’activité cérébrale des animaux et leurs réponses à une stimulation des yeux. Réalisée sous anesthésie générale pour permettre l’immobilité des animaux. Durée d’une session : 3 à 5 heures. Nombre d’animaux impactés : 250. Nombre de répétitions par animal : 1.
Impact sur les animaux
Suite aux chirurgies et malgré l’utilisation d’antalgiques pendant et après ces procédures chirurgicales, les animaux peuvent présenter une activité réduire et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée en fonction de la réponse aux traitements antalgiques administrés. Comme nous voulons étudier les mécanismes cérébraux associés à la douleur cornéenne persistante, nous ne pourrons pas soulager cette douleur. Notons que nos analyses en imagerie se feront sur animal anesthésié, limitant ainsi la perception douloureuse de l’animal. Néanmoins, l’anesthésie prolongée des animaux pour les séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Celles-ci seront monitorées grâce au suivi des fréquences cardiaques et respiratoires. Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux d’anesthésique gazeux pour maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal).
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés pour la mise au point des protocoles d’anesthésies et pour l’identification du réseau cérébrale impliqué dans la perception de la douleur cornéenne seront mis à mort en fin d’expériences de neuroimagerie, sans qu’ils ne reprennent conscience, pour qu’ils ne soient pas impactés par les stimulations de l’œil réalisées. Le reste des animaux de ce projet seront mis à mort en fin d’expérience de neuroimagerie, toujours sous anesthésie, afin de permettre le prélèvement de leurs cerveaux. Ces cerveaux seront ensuite analysés pour révéler les niveaux de présences de marqueurs biochimiques permettant d’aider à l’interprétation des résultats obtenus dans l’étude.
Remplacement
Notre projet porte sur la plasticité des aires cérébrales dans le contexte de la douleur cornéenne. Dans ce contexte, les approches intégratives sur l’animal entier restent incontournables. A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro, ex vivo ou in silico pour obtenir des données sur des processus cognitifs complexes et pour l’étude et l’analyse des mécanismes de la douleur.
Réduction
Pour ce projet et afin de respecter la règle de réduction, nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée (analyse de variance suivi d'un test post-hoc paramétrique si la distribution est normale ou un test non paramétrique dans le cas contraire). Ce nombre sera gardé le plus petit possible et a été estimé grâce aux outils disponibles de calcul de puissance statistique.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. Un suivi quotidien sera assuré contrôlant leur comportement général, leur apparence et la présence d’eau et de nourriture. Les animaux seront hébergés de deux à six par cage dans le respect des surfaces réglementaires avec enrichissement (tunnel, bois à ronger). Nous avons déterminé des points limites anticipés, liés à l’état général de santé et de bien-être et liés au modèle expérimental et aux procédures. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons défini, en fonction des observations quotidiennes. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou, enfin, de mettre à mort l’animal en dernier recours. Les chirurgies seront réalisées en conditions aseptiques. Pour réduire la douleur pendant la chirurgie, elle sera effectuée sous anesthésie avec un antalgique. De plus, des antalgiques seront injectés à la fin et le lendemain de la chirurgie.
Choix des espèces
Dans la littérature, les modèles de douleur oculaire ont majoritairement été développés chez des souris mâles et femelles adultes. Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis (ce n'est pas le cas du rat). Ce projet de recherche portant sur la douleur oculaire nécessite d’utiliser des animaux adultes, âgés de plus de 6 semaines.
Étude de l’organotropisme du virus Oropouche chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
1 568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le virus Oropouche puis subissent des prélèvements de sang à la queue tous les deux jours et un prélèvement final avant la mise à mort, qui sert à prélever leurs organes. Le porteur indique que l'infection peut provoquer fièvre, tremblements, prostration, troubles de la motricité et perte de poids, et que chez le hamster elle tue la moitié des animaux, les souris atteignant un score défini étant mises à mort. Il reconnaît la souris comme peu sensible à ce virus et prévoit d'utiliser des lignées à l'immunité affaiblie pour rendre l'infection possible.
Objectifs
Les Orthobunyavirus dont fait partie Oropouche sont des virus émergents très peu étudiés. Ils ont de plus la particularité de pouvoir former des virus recombinés, gagnant en sévérité ou en infectiosité. Il est alors important d’accroitre nos connaissances à leur sujet et plus particulièrement sur les mécanismes de réplication virale et d’infection. Ce projet a donc pour objectif d’améliorer les connaissances sur la pathogenèse de ce virus qui a été récemment responsable d’une épidémie en Guyane française.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension du pouvoir pathogène du virus Oropouche. Ce virus étant émergent et pouvant causer des épidémies au niveau mondial il est important de développer des moyens de préventions et traitements efficaces contre ce virus. De plus, sa capacité à se recombiner pourrait donner naissance un jour à des virus plus pathogènes ou plus infectieux. Les résultats de ces recherches, intégrés dans un projet de plus grande ampleur permettront d’ouvrir la voie au développement de traitements et moyen de préventions.
Procédures
Des prélèvements seront réalisés tous les 2 jours à la queue après une petite incision (volume de 30 ml) de J-1 à J15. Chaque prélèvement ne dure que quelques secondes. Un prélèvement final de 200 ml sera réalisé par voie rétro-mandibulaire juste avant le sacrifice (30 secondes).
Impact sur les animaux
Les animaux seront infectés sous anesthésie générale afin de réduire le stress et la douleur liés à l’inoculation. L’infection des souris par des Orthobunyavirus est encore très peu décrite car souvent non sensible. Cependant, le hamster est un modèle animal sensible à l’infection. Bien que difficile d’extrapoler les symptômes d’une espèce à l’autre, on peut s’attendre chez la souris à des symptômes similaires. On s’attend alors dans le cas d’infections légères à ce que les animaux manifestent un manque d’hygiène et d’alimentation dans les premiers jours de l’infection. En cas d’infections modérées, des symptômes plus sévères peuvent apparaitre tels que de la fièvre, des tremblements ainsi qu’un état prostré. Ceux-ci peuvent également être accompagnés de troubles de la motricité et de l’équilibre ainsi que d’une perte de poids. Enfin, il a été remarqué chez le hamster que l’infection par le virus Oropouche pouvait entrainer la mort des animaux chez la moitié des animaux, les autres ne répondant pas à l’infection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car nous avons besoin de leurs organes pour étudier la physiopathologie du virus Oropouche par des techniques de biologie moléculaire, cellulaire et d’histologie.
Remplacement
Dans un souci de remplacement, nous envisageons dans un premier temps de tester le tropisme de ces virus sur des cellules afin d’étudier le rôle joué par leurs protéines non structurales, cependant, il deviendra indispensable d’utiliser un modèle animal afin d’étudier l’infection au niveau systémique afin de mimer l’infection par un arthropode.
Réduction
Nous envisageons de faire une première expérience sur un petit nombre d’animaux par groupe (6 animaux des deux sexes) afin de déterminer les lignées de souris qui seront les plus sensibles. Dans le cadre de la deuxième expérience, nous prévoyons d’utiliser 8 individus par groupe, soit un sous-total (par expérimentation) de 256 individus répartis en 2 cages par groupe (4 individus par cage). En supposant un effet cage de 25 %, les effectifs proposés devraient nous permettre d'obtenir, pour chaque répétition de l'expérimentation, des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.47 (effets forts à très forts).
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement dès l’apparition d’une gêne quelconque. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur prenant en compte l’ensemble des symptômes susceptibles d’être déclarés lors de l’infection, notamment les symptômes neurologiques (grille jointe à la dap). Dès que le score atteindra 1, les animaux seront observés bi-quotidiennement. Du dietgel sera ajouté dans la cage si les animaux présentent un amaigrissement supérieur à 10% ou bien si leur mobilité diminue. Si un score égal à 2 est atteint, les animaux seront mis à mort. Des igloos en carton ou du coton seront mis à disposition dans chaque cage afin que les animaux soient dans une ambiance confortable.
Choix des espèces
La souris est un animal de choix dans le cadre de l’expérimentation animale. Bien que ce modèle soit naturellement peu sensible à l’infection par certains Orthobunyavirus, nous estimons que l’utilisation de deux modèles d’étude devraient permettre de surmonter cet obstacle. En effet, les souris issues de croisements génétiques présentent une diversité génétique qui devrait permettre d’identifier une lignée qui sera sensible à l’infection. Le recul que nous avons à ce propos dans le cadre de l’étude de la pathogénicité des arbovirus montre en effet que certaines lignées présentent une virémie et des symptômes qui se rapprochent de ceux observés chez l’homme. Si toutefois aucune lignée ne répond de façon pertinente au virus, nous utiliserons comme alternative des souris dont la réponse immunitaire innée est invalidée (souris IFNAR-/-). Ce modèle est très utilisé dans le cadre de l’étude du pouvoir pathogène de nombreux arbovirus auxquelles elles sont très sensibles. Nous privilégierons l’utilisation de souris dont la réponse à l’interféron est temporairement invalidée par injection avant infection d’anticorps anti-IFNAR. Ces souris seront donc sensibles à l’infection mais recouvreront leur réponse immunitaire, ce qui les rendra plus résistantes aux effets pathogènes plus sévères que l’on peut observer chez les souris KO IFNAR-/-. Dans une première approche, les animaux seront utilisés à l’âge de jeunes adultes de 6 semaines. Les infections avec des arbovirus chez la souris sont en général dépendantes de l’âge et les souris plus âgées sont moins sensibles que les souris jeunes. En cas d’échec de l’infection, des animaux plus jeunes (3-4 semaines) pourront être utilisés afin de vérifier si des animaux dont le système immunitaire est moins mature seraient plus permissifs à l’infection.
Etude d’efficacité et de tolérabilité en modèles rongeurs de candidats médicaments ciblés à la tumeur pour le traitement du cancer chez l’homme
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 120
3 460 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils reçoivent une greffe de cellules tumorales, des injections répétées d'anticorps conjugués à un médicament, un suivi tumoral trois fois par semaine et des prélèvements sanguins sous anesthésie, avant une mise à mort pour prélever organes et tumeurs. Le porteur teste des candidats médicaments contre le mélanome, des retombées pour les patients renvoyées au conditionnel et au stade préclinique. Il affirme que les études de stabilité et de toxicité ne peuvent se faire que sur l'animal vivant et conclut au recours aux modèles murins.
Objectifs
Plusieurs traitements reposant sur la chimiothérapie, des thérapies ciblées ou des immunothérapies sont disponibles pour le traitement de nombreux cancers. Cependant, les réponses à ceux-ci peuvent être variables, en fonction non seulement des patients mais aussi des indications, conduisant dans la majorité des cas à des rechutes. C’est pourquoi le développement de nouvelles alternatives thérapeutiques est primordial. Les ADC pour « anticorps conjugués à un médicament » constituent une de ces alternatives. Un ADC permet de délivrer un agent de chimiothérapie de manière spécifique et ciblée au niveau de la tumeur grâce à un anticorps qui reconnait une cible exprimée à la surface des cellules tumorales. Nous avons montré qu’un ADC prototype, combinant un anticorps dirigé contre une cible exprimée préférentiellement sur des cellules de mélanome, à un agent de chimiothérapie, pouvait avoir une efficacité in vitro par l’induction de la mort de cellules cancéreuses, et in vivo par la réduction et l’inhibition de la croissance tumorale dans des modèles de mélanome chez la souris. Ce projet engage plusieurs objectifs : 1) sélectionner l’ADC candidat en évaluant différentes technologies d’ADC que ce soit via la molécule de chimiothérapie fixée sur l’anticorps ou via le lien chimique permettant de l’y fixer et de la délivrer de façon optimale au niveau de la tumeur. Cette évaluation permettra i) de mesurer l’efficacité de l’ADC seul, c’est-à-dire sa capacité à induire la diminution ou l’inhibition de la croissance tumorale, ii) d’étudier la toxicité de l’ADC dans les modèles murins (souris ou rat) et enfin iii) de mesurer la stabilité de l’ADC dans le plasma en étudiant la libération non contrôlée de la chimiothérapie. 2) mesurer la synergie relevant de la combinaison de l’ADC avec les traitements standard du mélanome, les ICI (Inhibiteurs de point de contrôle immunitaire). En effet, il a été constaté dans la littérature que certaines chimiothérapies délivrées par les ADC pouvaient induire une réponse immunitaire capable d’optimiser la réponse anti-tumorale. Cette réponse immunitaire pourrait contribuer à la réussite du traitement de l’ADC en monothérapie mais aussi améliorer et optimiser les résultats des traitements par les ICIs. C’est pourquoi les différentes technologies évaluées pourront être testées seules ou combinées avec les standards actuels de traitement du mélanome, afin d’améliorer le bénéfice thérapeutique pour les patients en rechute.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait apporter des bénéfices sur plusieurs plans. Sur le plan scientifique, il devrait confirmer la puissance du rationnel de la cible identifiée dans le traitement du mélanome, qui amène la preuve de concept préclinique d’un candidat ADC ayant un fort potentiel de stratégie de développement et devrait permettre par ailleurs, d’ouvrir la voie pour d’autres indications d’intérêt pour lesquelles cette cible est aussi présente. Sur le plan technologique, ce projet crée un axe de développement d’ADC de construction à haut DAR (Ratio de chimiothérapie par anticorps), une grande première dans le mélanome, permis par les avancées technologiques que ce soit au niveau des chimiothérapies ou des liens chimiques actuellement développés. Sur le plan clinique, ce projet devrait permettre d’une part de montrer qu’une chimiothérapie peut fonctionner dans le mélanome si elle est vectorisée par une bonne cible, le mélanome étant connu jusqu’à présent pour être une tumeur difficilement traitable par chimiothérapie. D’autre part, ce projet devrait contribuer à confirmer que les meilleures combinaisons avec les ICI demeurent la chimiothérapie surtout si ces derniers représentent traitement standard du mélanome et si une synergie d’action entre ADC et ICI est démontrée.
Procédures
Lors des différentes procédures, les animaux pourront être soumis aux interventions suivantes : •L’injection de cellules tumorales afin de permettre le développement de la tumeur pour évaluer l’efficacité antitumorale des ADC ou de la combinaison des ADC avec les ICI actuellement utilisées comme standard de thérapie en oncologie. Cette intervention ne durera que quelques minutes à partir du moment où les animaux auront été anesthésiés. •La deuxième intervention concerne l’injection des ADC et/ou des ICI entrant dans le processus de traitement des tumeurs, afin d’évaluer leur efficacité. Chaque ICI sera injectée 4 fois à 3 jours d’intervalle sur la durée de l’étude. Chaque ADC sera injecté jusqu’à 3 fois avec un maximum de 7 à 10 jours d’intervalle. Chaque injection prendra au maximum 5 minutes et sera réalisée après l’anesthésie et l’analgésie des animaux. •La troisième intervention concerne la mesure du volume tumoral ainsi que le suivi du poids des animaux qui auront lieu 3 fois par semaine. Le temps d’intervention sera limité à un maximum de 5 minutes par mesure afin de limiter l’anxiété des animaux. •La quatrième intervention concerne les prélèvements sanguins, qui auront lieu notamment pour les études de stabilité des différentes technologies ADC ou encore pour suivre la toxicité des ceux-ci lors de leur injection. Les prélèvements auront lieux au moins deux fois sur chaque animal. L’espèce utilisée sera adaptée aux analyses qui seront réalisées. Les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie gazeuse et n’excèderont pas 5 minutes après endormissement de l’animal.
Impact sur les animaux
La réception des animaux peut engendrer un stress qui pourrait compromettre le bon déroulement des différentes procédures réalisées. C’est pourquoi après réception une période d’acclimatation est prévue afin de réduire ce stress. Les différentes procédures qui seront réalisées sur les animaux après cette période d’acclimatation pourront générer différents types d’effets indésirables : •Lors de l’injection des cellules, un stress des animaux pourrait être observé ainsi que des douleurs au site d’injection. De plus, le développement des tumeurs pourrait conduire à une perte de poids ainsi que des douleurs qui pourraient être délétères pour l’animal. •Lors des injections des ADC de l’anxiété ou des douleurs pourront être observées. •Pour certaines études, des prélèvements sanguins pourront être réalisés, engendrant un stress lors de la manipulation. Les effets indésirables majeurs de ces études seront donc un stress lié à la manipulation fréquente des animaux, des douleurs ainsi qu’une éventuelle cachexie liée au développement tumoral pouvant conduire à une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés au cours des différentes procédures. Lors de l’euthanasie des animaux, les organes ou les tumeurs pourront être prélevés afin de réaliser des études histologiques dans le but de valider l’expression de la cible ou pour rechercher des signes de toxicités.
Remplacement
Les études préliminaires réalisées avec un ADC prototype ont permis de démontrer in vitro, que celui-ci est capable de se lier à des cellules tumorales de mélanome ou d’autres cancers exprimant la cible à leur surface. Il est aussi capable d’induire la mort cellulaire de ces mêmes cellules. In vivo l’efficacité anti-tumorale de celui-ci a pu être démontrée dans des modèles de mélanome induits chez la souris, via l’inhibition et la régression de la croissance tumorale. Les modèles utilisés pour valider l’efficacité de l’ADC prototype sont des modèles imparfaits. En effet, les modèles in vitro, ne permettent pas de prendre en compte la stabilité du composé tandis que les modèles in vivo reposent sur l’utilisation de modèles murins dont le système immunitaire est déficient. Ainsi, les études de stabilité des différents ADC testés ne peuvent être réalisées que in vivo afin d’évaluer l’impact de leur circulation dans l’organisme. Il en est de même pour les études de tolérabilité du composé, à savoir si celui-ci induit des toxicités. En effet, seule l’administration dans des modèles animaux peut montrer une modification de comportement, une libération d’enzymes hépatiques ou une perte de poids liée à une toxicité du composé. Concernant l’étude du traitement des ADC seuls ou en combinaison avec les ICI, l’utilisation d’animaux ayant un système immunitaire compétent permettra d’étudier les mécanismes d’action permettant d’obtenir une réponse anti-tumorale durable.
Réduction
Des premiers tests avec un ADC prototype ont permis de démontrer in vitro une activité cytotoxique et in vivo une activité anti-tumorale avec une inhibition et une régression de la croissance tumorale sur des modèles de mélanome chez la souris. Avant toute étude in vivo et pour chaque technologie évaluée, une étude préliminaire in vitro sera conduite afin de confirmer la liaison de l’ADC à sa cible exprimée sur les cellules tumorales et de confirmer son activité cytotoxique sur ces mêmes cellules. Ainsi, seules les technologies démontrant une efficacité anti-tumorale in vitro seront testées in vivo. De plus, pour chaque lignée cellulaire utilisée in vivo une étude de tumorigénicité sera réalisée sur un nombre de 10 animaux afin de confirmer la prise tumorale ainsi que l’hétérogénéité de la croissance tumorale. Les études réalisées avec l’ADC prototype ont permis d’établir que 10 souris au maximum seraient nécessaires par groupe afin de générer une courbe de croissance tumorale, une courbe de survie mais aussi des données statistiques pour comparer les différentes technologies ADC ou les différentes combinaisons de traitement. Le nombre d’animaux par groupe pourra ainsi être réduit en fonction de la variabilité intra et inter-groupe observée dans les études de tumorigénicité et dans les études préliminaires.
Raffinement
Les différentes procédures entraînent plusieurs nuisances sur les animaux comme du stress, des douleurs et des pertes de poids. Tous ces paramètres ont été pris en compte afin de les réduire. Pour limiter le stress des animaux, une période d’acclimatation est prévue avant le démarrage des études. Un enrichissement adapté à l’espèce utilisée (souris ou rat) est aussi ajouté dans chaque cage. Toutes procédures induisant des douleurs et du stress seront réalisées sous anesthésie gazeuse et analgésie locale. Le suivie de la croissance tumorale et du poids des animaux sera monitoré 3 fois par semaine afin de procéder à une supplémentation en nourriture ou à l’euthanasie des animaux en cas de pertes de poids non contrôlées même sous supplémentation ou de croissance tumorale trop importante ou gênant les déplacements de l’animal. De plus, en fonction du comportement des animaux pouvant traduire des signes de douleurs, tels que la prostration de l’animal ou des gémissements, les animaux seront euthanasiés. Une grille de score a été mise en place afin de suivre les animaux sur différents critères, regroupant leur comportement, les effets liés au développement tumoral et aux traitements, afin de pouvoir adapter leur suivi et définir quand il est nécessaire de les euthanasier.
Choix des espèces
Au cours des différentes études menées pour la sélection de l’ADC candidat et de la définition des conditions de traitements à utiliser, plusieurs espèces seront utilisées : • La comparaison des différentes technologies ADC pour la sélection du candidat thérapeutique sera réalisée dans des souris immunodéficientes. Ces souris ont été choisies car elles sont classiquement utilisées dans les études d’efficacité des médicaments expérimentaux évalués en oncologie. Les lignées cellulaires utilisées pour la génération des tumeurs sont des lignées humaines, par conséquent leur système immunitaire déficient n’entraîne pas de rejet de ces cellules tumorales implantées et n’interfère donc pas avec les résultats d’efficacité liée à l’activité cytotoxique anti tumorale de l’ADC. • Pour les études de stabilité et de tolérabilité des ADC, le choix de l’espèce murine utilisée sera dicté par les études in vitro réalisées à la suite de l’injection des ADC. Des souris immunocompétentes seront utilisées, car ce sont des modèles classiquement utilisés pour ces études et qui permettront de faire le lien avec les études d’efficacité réalisées en souris. Les rats pourraient être préférés aux souris afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés dans les études du fait de la disponibilité de plus grande quantité de sang pour les analyses. Les rats sont aussi couramment utilisés pour les études de stabilités des composés. • Les études de combithérapie associant les ADC avec des ICI seront quant à elles réalisées dans des souris immunocompétentes afin d’étudier les mécanismes immunitaires mis en jeu lors de la réponse anti-tumorale de l’ADC, seul ou en combinaison. Pour toutes les études, les souris ou les rats utilisés seront des femelles âgées de 6 à 8 semaines, âge considéré comme l’âge adulte, puisque les traitements étudiés ont pour but de traiter des tumeurs chez l’adulte ayant un système immunitaire mature. De plus, nous n’attendons pas de différence de résultat entre des souris mâles ou femelles. C’est pourquoi des souris femelles seront utilisées pour faciliter l’organisation des cages et limiter les bagarres entre individus pouvant générer du stress risquant de nuire à l’interprétation de l’étude.
Enregistrements par la technique d’électrophysiologie ex-vivo de l’activité électrique des cellules neuronales chez des rongeurs (2023-E-021)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 707
6512 rongeurs, 5805 souris et 707 rats, vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Ils sont anesthésiés puis décapités, parfois après une perfusion du coeur, pour prélever le cerveau et enregistrer l'activité électrique des neurones sur des coupes. Le porteur, une société privée, présente ce recueil comme un moyen de comprendre le fonctionnement cérébral en vue de traitements chez l'humain. Il affirme que ces enregistrements ne peuvent être reproduits en culture cellulaire et assure respecter l'éthique animale.
Objectifs
L’activité électrique des cellules neuronales (cellules nerveuses) constitue un des mécanismes fondamentaux sous-tendant le fonctionnement cérébral. Il y a donc un intérêt majeur à recueillir de tels signaux électriques directement au sein du cerveau pour mieux comprendre son fonctionnement afin de permettre la mise au point et l’amélioration des techniques de prise en charge en cas de dysfonctionnement ou d’atteintes cérébrales. Pour des raisons éthiques évidentes, les scientifiques qui étudient ces signaux enregistrés directement dans le tissu cérébral s’appuient principalement sur des travaux chez l’animal. L’objectif de ce projet est d’étudier l’activité électrique des cellules neuronales par la technique d’électrophysiologie, sur coupes cérébrales, chez des rongeurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre la physiologie des cellules neuronales, dans le but de développer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’Homme afin de traiter les pathologies cérébrales.
Procédures
Euthanasie : Administration du mélange d’anesthésiques/analgésiques (par injection, 10 secondes), anesthésie gazeuse de la souris (maximum 5 minutes), décapitation (3 secondes). Perfusion intracardiaque : Selon la structure cérébrale à enregistrer, une perfusion intracardiaque de liquide cérébrospinal artificiel (aCSF), après anesthésie profonde des animaux, pourra être réalisée afin de permettre un meilleure survie des neurones: Injection d'analgésique trente minutes avant l’anesthésie des animaux (10 secondes), injection intrapéritonéale d'anesthésiques/analgésiques (30 secondes) ou anesthésie gazeuse (5 minutes), ouverture de la cage thoracique pour accéder au coeur afin d’y insérer la canule de perfusion dans le ventricule gauche (30 secondes), perfusion intracardiaque d’aCSF (30 secondes), décapitation (3 secondes).
Impact sur les animaux
Ce projet sera réalisé sur des souris ou des rats naïfs de toute expérimentation et non génétiquement modifiés. Pour la perfusion intracardiaque, afin d'éviter toute souffrance, des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrales sur ces coupes.
Remplacement
L'organisation des réseaux neuronaux peut être étudiée sur des coupes cérébrales de rongeurs par électrophysiologie. Ces expériences ne peuvent pas être reproduites, ni étudiées dans des modèles de cultures cellulaires in vitro. Nos expérimentations au sein de la société, même si elles nécessitent l’utilisation d’animaux, sont pratiquées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux et de bien-être pour nos animaux en expérimentation. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect de l'éthique animale.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques. Nous adapterons les tests statistiques en fonction des observations.
Raffinement
Avant le prélèvement du cerveau en vue des enregistrements électrophysiologiques, une période d’acclimatation des animaux d’au moins 5 jours sera respectée. Afin d'éviter toute souffrance, des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés tout au long des expériences. Des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués et les animaux seront évalués grâce une fiche de suivi.
Choix des espèces
Nos expérimentations sont réalisées chez la souris ou le rat, dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour la communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes du fonctionnement cérébral. Les animaux seront utilisés de l'âge de 3 semaines à 40 semaines, afin de couvrir tous les âges, du jeune à l'adulte.
Évaluation d’un modèle de traitement de l’épilepsie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
165 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur provoque chez elles un état de mal épileptique et des crises, avec deux chirurgies dont une pose d'implants d'une heure et demie, avant prélèvement du cerveau. Il teste une thérapie génique visant des récepteurs de l'hippocampe, en vue de nouvelles cibles présentées comme lointaines. Il affirme que l'étude est impossible in vitro et in silico, faute de méthode alternative.
Objectifs
L'objectif principal de ce protocole et d'utiliser un modèle murin d'épilepsie afin de tester de nouvelles approches de thérapie génique par injection de vecteurs viraux exprimant des micro-RNA (acide ribonucleique). Des données récentes de la littérature indiquent en effet un rôle des récepteurs kaïnate de l'hippocampe dans l'épilepsie temporale. En particulier il a été démontré que l'inhibition des récepteurs kaïnate permettait de réduire significativement l'épilepsie temporale. Ce protocole vise à tester l’effet de l’inhibition de l’expression des récepteurs kaïnates sur le développement des crises d’épilepsie.
Bénéfices attendus
Le développement d’un protocole d'étude de l'épilepsie nous permettra de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques de cette pathologie et de développer de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Induction du status epilepticus et des crises d’épilepsie (impossible de quantifier le nombre en amont). Opérations chirurgicales : tous les animaux sont soumis à deux procédures chirurgicale. La première chirurgie dure environ 20 mins. Au cours de la deuxième procédure des implants sont positionnés. Cette deuxième chirurgie dure environ 1h30. Prélèvements de tissus : tous les animaux sont soumis au prélèvement du cerveau après perfusion intracardiaque à la fin de l'expérimentation.
Impact sur les animaux
Les sources éventuelles de douleurs ou souffrance dans notre procédure : la chirurgie, les crises d’épilepsie ainsi que l'isolement des animaux en cage individuelle.
Devenir
Euthanasie de l'ensemble des animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever le cerveau.
Remplacement
Nous étudierons l'effet de traitements innovants sur l'épilepsie chez des souris libres de leur mouvement afin de quantifier précisément l'occurrence des crises d'épilepsie et leur réduction après traitement. Par conséquent, il sera impossible de mener cette étude in vitro. Enfin, compte tenu de l’état actuel des connaissances, les questions que nous abordons ne peuvent être traitées in silico. Il n'existe donc pas de méthodes alternatives.
Réduction
Un test statistique a été utilisé pour calculer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour ce projet. Ce nombre est de 165 animaux pour la réalisation de ce protocole.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la souffrance des animaux, nous appliquons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisées sous anesthésie gazeuse. L’évaluation du poids de l’animal est effectuée de façon journalière à partir du moment où il est isolé en cage individuelle et rentre dans la phase expérimentale. Ces mesures ont lieu lors de la manipulation journalière des animaux en même temps que la vérification de l’état général de l’animal. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience. Sur la base des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et les zootechniciens seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez les souris.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude de l'épilepsie. Les animaux seront utilisés entre 2 et 6 mois post natal afin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.
Validation de la pré-vascularisation d’un greffon de tissu conjonctif oral cellularisé obtenu par bio-impression 3D
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Elles reçoivent sous la peau un substitut de gencive obtenu par bio-impression, puis des séances d'imagerie sous anesthésie jusqu'au douzième jour, avant mise à mort pour vérifier au microscope la connexion des vaisseaux. Le porteur cherche à valider un greffon vascularisé transposable à d'autres tissus, une preuve de concept encore initiale. Il affirme qu'aucun modèle hors animal vivant ne reproduit une circulation sanguine réelle.
Objectifs
L’objectif principal du projet est de valider l’efficacité de pré-vaisseaux contenus dans des substituts de gencive obtenus par bio-impression 3D sur un modèle de souris immunodéprimée en implantation sous-cutanée. Ceci a pour but de démonter la connexion du substitut au réseau vasculaire de la souris par la présence de globules rouges dans les pré-vaisseaux contenus dans le substitut. Les objectifs secondaires sont : -de confirmer la compatibilité biologique de l’hydrogel servant de matrice au substitut (absence de réaction inflammatoire) -de montrer la faisabilité chirurgicale de l’utilisation de ce type de greffon (maniabilité)
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont d’abord la validation du modèle de pré-vaisseaux produits in vitro dans un système vivant. Ceci permettrait de montrer la capacité des pré-vaisseaux à se connecter à la vascularisation de l’organisme hôte sans provoquer d’inflammation ni de dégradation. Ce modèle bio-imprimé applicable à la gencive pourra être transposable à d’autres modèles de tissus. La muqueuse orale (doit la gencive fait partie) forme une barrière protectrice contre les agents pathogènes de l’environnement tels que les bactéries, les virus, les produits chimiques et l’abrasion due à la mastication. Cependant dans le cas d’inflammations récurrentes, de certaines infections, de traumatismes ou de tumeurs, le potentiel de défense de la muqueuse peut être dépassé, laissant les pertes de substances tissulaires progresser jusqu’à la perte de l’os sous-jacent et des dents. Ainsi, une procédure de reconstruction des tissus mous oraux peut être nécessaire pour restaurer efficacement la fonction de protection muqueuse. Une augmentation des tissus mous oraux peut donc être envisagée pour reconstituer en épaisseur et/ou en hauteur les tissus dans un contexte d’édentement, de racine dentaire ou d’implant exposé. L’autogreffe de gencive est la technique de choix pour reconstruire, et repose sur un prélèvement chez le même patient (le plus souvent au niveau de la muqueuse du palais). Cette technique a le plus de recul clinique et assure l’obtention d’un greffon très proche biologiquement du tissu perdu avec une intégration sans risque de rejet. Cependant, l’autogreffe présente des inconvénients certains tels que (i) une insuffisance de tissu selon l’anatomie du palais et les tissus résiduels du patient, (ii) le besoin d’avoir un site chirurgical supplémentaire pour prélever le tissu et (iii) des suites post-opératoires prolongées. A terme, l’obtention de substituts gingivaux pré-vascularisés permettrait de contourner ces inconvénients en ayant des greffons de taille personnalisée, vascularisés et sans site opératoire additionnel.
Procédures
Les animaux seront soumis à un implantation sous-cutanée sous anesthésie et analgésie avec une durée d’intervention inférieure à 10 minutes (anesthésie comprise). Afin d’observer les vaisseaux au microscope à luminescence, une injection de luciférine et les acquisitions seront effectuées sous anesthésie (une vingtaine de minutes par animal). Les observations au microscope a luminescence seront effectuées aux jours de suivi J2, J5, J7 et J12 post-implantation.
Impact sur les animaux
L’implantation sous-cutanée étant une chirurgie peu invasive et de courte durée, les nuisances ou effets indésirables sont réduits. En effet, un inconfort dû aux points de suture au niveau dorsal est possible, pouvant occasionner une modification du comportement des animaux (soit évitement et fatigue soit au contraire interaction des animaux avec risque d’arrachage des points). L’implantation sous-cutanée ne laisse pas de séquelle sur l’animal. De plus, le risque de contamination des plaies est extrêmement réduit car la chirurgie est effectuée en conditions stériles. Ainsi, le degré de dommages et l’impact sur le bien-être des animaux seront légers à modérés.
Devenir
Aux temps correspondants, un sacrifice des animaux sera effectué car il est nécessaire de valider de manière histologique la connexion vasculaire entre le substitut et la souris.
Remplacement
Le remplacement n’est pas possible car aucun modèle non animal ne permet d’étudier la connexion vasculaire entre le substitut de gencive et un organisme vivant. En effet, la connexion vasculaire ne peut être prouvée sur des modèles ex vivo et in vitro car il est nécessaire d’avoir une circulation du sang dans le substitut pré-vascularisé. Aucun système hors in vivo n’a réussi à reproduire la circulation sanguine pour prouver la connexion entre les vaisseaux du substitut et les vaisseaux de l’organisme recevant le substitut.
Réduction
Le substitut de gencive contenant des pré-vaisseaux a été optimisé lors de tests in vitro, ceci permettant de limiter le nombre d’expériences in vivo et donc le nombre d’animaux. De plus, une expérimentation préliminaire afin d’optimiser les conditions expérimentales sera effectuée en amont. Enfin, le suivi cellulaire par imagerie permettra également de limiter le nombre d’animaux nécessaires. La pertinence et la puissance des résultats sera évaluée à l’aide de tests statistiques.
Raffinement
L’implantation sous-cutanée est une chirurgie relativement peu invasive qui sera réalisée par des personnes qui maîtrisent ce type de chirurgie. Une anesthésie locale en complément de l’anesthésie gazeuse permettra d’améliorer le confort per et post-opératoire. Les souris étant immuno-déficientes, des précautions particulières seront prises en termes d’hébergement, d’habituation et de suivi. La souffrance, les activités et les comportements des animaux seront surveillés très régulièrement par le personnel de l’animalerie et par les expérimentateurs. Toute souffrance persistante sera traitée avec des antalgiques.
Choix des espèces
Les souris utilisées seront des adultes (7 à 8 semaines au moment de l’implantation). Ceci permet d’éviter une interférence entre la croissance des animaux et les processus d’angiogénèse et de vascularisation. Etant donné que c’est la première fois que ce type de substitut est testé in vivo, il semble nécessaire d’effectuer une première preuve de concept sur le petit animal (souris) dans un modèle d’implantation sous-cutanée avant de passer à un modèle de chirurgie gingivale sur un animal plus volumineux.
Exploration du rôle du système nerveux périphérique sensitif dans des modèles murins de pathologies inflammatoires
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une partie des souris est génétiquement modifiée pour que les neurones de la perception de la douleur puissent être supprimés, et d'autres subissent cette suppression par un traitement dès l'âge de trois ou quatre semaines. 1 808 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement des pattes, de la moelle épinière et des ganglions rachidiens. Elles développent une arthrite ou une forme de sclérose en plaques provoquée par l'équipe, sans que le résumé décrive comment, et reçoivent jusqu'à 21 injections quotidiennes de TAFA4. La sclérose induite paralyse leurs membres arrière. Le porteur écrit qu'"aucun analgésique ne peut être utilisé" sans compromettre ses résultats, et promet dans le même texte un "soin particulier" pour éviter la souffrance.
Objectifs
De nombreuses études suggèrent que les neurones impliqués dans la perception de la douleur jouent un rôle important dans le développement des maladies inflammatoires. Notre projet a pour objectif de déterminer le rôle de ces neurones sur l’évolution de deux maladies inflammatoires : la polyarthrite rhumatoïde, causant une inflammation des articulations et la sclérose en plaque, causant une inflammation de la moelle épinière. Un objectif secondaire de ce projet sera également d’étudier le potentiel thérapeutique d’une molécule aux propriétés anti-inflammatoires.
Bénéfices attendus
A ce jour, peu d’études décrivent comment les neurones impliqués dans la perception de la douleur influencent l’apparition et l’évolution des maladies inflammatoires. Notre projet permettra donc à la fois de mieux comprendre comment ces neurones influencent ces maladies inflammatoires et permettra également d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques dans ces maladies chroniques, très invalidantes et nécessitantes de nouvelles thérapies.
Procédures
Outre l’induction de l’arthrite et du modèle de sclérose en plaque qui sont l’objet de notre étude, les animaux vont subir des injections quotidiennes de traitement. La durée de l'intervention (contention + injection intra péritonéale) est de moins d'environ 45 secondes par animal. Les injections de TAFA4 pourront durer jusqu'à 21 jours (une injection par jour soit 21 injections).
Impact sur les animaux
Nos expériences sont susceptibles de déclencher des douleurs chez les animaux. Compte tenu de la nature même du projet qui propose d’explorer l’effet des neurones impliqués dans la perception de la douleur, aucun analgésique ne peut être utilisé sans compromettre les résultats expérimentaux. Notre modèle de sclérose en plaque induit une paralysie des membres inférieurs entrainant une difficulté à accéder aux croquettes. Une nourriture gélifiée sera ajoutée systématiquement lors pour prévenir la dénutrition des souris.
Devenir
mise à mort des animaux à la fin des procédure. En effet, pour cette étude nous avons besoin de prélèver différents organes (pattes, moelle épinière, ganglions rachidiens) pour analyser leur composition immunitaire, le score histologique etc.. afin de comprendre les mécanismes de ces pathologies. Les prélèvements nécessitent une euthansie de l'animal.
Remplacement
Nous proposons que les neurones responsables du ressenti de la douleur joue un rôle dans le développement des maladies inflammatoires telles que la polyarthrite rhumatoïde et sclérose en plaque. Seuls les modèles animaux mimant la complexité du système nerveux périphérique ainsi que de la réponse inflammatoire permettront de vérifier cette hypothèse. Ces interactions ne peuvent à ce jour pas être modélisées ni in vitro ni in silico. Cependant, pour la recherche du mécanisme de l’interaction neurone/cellule immunitaire nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques de remplacement.
Réduction
Le plan de nos expériences sera construit de sorte à limiter le nombre de souris. Le modèle d’arthrite a été choisi et optimisé afin d’obtenir une incidence proche de 100% et une variabilité minimale, permettant ainsi de réduire au minimum le nombre de souris nécessaire. Le modèle de sclérose en plaque est quant à lui le seul modèle murin mimant la pathologie humaine. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisé nous avons modélisé les tests statistiques en amont de nos expériences pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire et suffisant pour répondre à chacune de nos hypothèses de travail.
Raffinement
Stratégie de réduction du stress : Pour réduire l’angoisse des animaux, un temps d’acclimatation d’au moins une semaine sera respecté avant toute procédure expérimentale. Les souris seront hébergées en cage standard avec toit filtrant au nombre de 5 par cage, avec de la sciure de bois utilisée comme litière, des lanières de papier kraft comme matériau de nidification et des maisons de souris en dôme de cellulose et fournies pour l'enrichissement environnemental. Les souris sont nourries et boivent ad libitum, et sont libres de leur déplacement. Stratégie de réduction du la souffrance : Une surveillance quotidienne est réalisée par des spécialistes animaliers permettant de subvenir aux besoins nécessaires au bien-être des animaux. Un soin particulier sera apporté pour éviter la souffrance des animaux par la surveillance de signes extérieurs de souffrance. L’atteinte d’un point limite entrainera la décision d’euthanasie de l’animal concerné. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage des animaux souffrant de sclérose en plaque pour assurer une alimentation suffisante.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle idéal pour notre étude dû au haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, l’état des connaissances actuelles, les outils et structures disponibles pour sa manipulation et un temps de reproduction court. En particulier, la génération de souris génétiquement modifiées bien maitrisée dans notre laboratoire dans lesquelles les neurones sujets de notre étude peuvent être déplétés font de la souris un modèle non remplaçable. Des souris d’âge minimum de 6 semaines seront utilisées afin d’avoir un système immunitaire et sensitif mature. Pour les expériences utilisant une déplétion pharmacoloqique de ces neurones, nous utiliserons des souris âgées de 3-4 semaines. En effet, l’injection doit être effectuée le plus précocement possible lors du développement du système nerveux afin d’obtenir une déplétion optimale. La sclérose en plaque et l’arthrite seront ensuite induites à partir de 6 et 8 semaines, respectivement.
Oncologie : modèles d’études précliniques d’analyse des métastases
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 1245
6195 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection de cellules tumorales déclenchant des métastases, puis des administrations de substances jusqu'à quatre fois par jour, avec perte de poids, hypothermie et difficultés respiratoires déclarées. Le porteur développe ces modèles pour tester des anticancéreux pour "des clients du secteur industriel privé" comme pour la recherche publique. Il affirme que les métastases ne peuvent être reproduites in vitro.
Objectifs
Le cancer est un problème de santé publique majeur et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les métastases correspondent à un processus de migration des cellules tumorales de la tumeur primaire vers des organes distants. Les métastases sont la principale cause de décès par cancer. Il reste ainsi nécessaire de disposer de modèles complexes et prédictifs pour évaluer la complexité du microenvironnement tumoral. Dans ce projet, des cellules issues de tumeurs seront injectées à des rongeurs selon différentes voies d’administration afin de permettre d’examiner de larges cohortes de tumeurs dont la croissance et la réponse aux médicaments pourront être évaluées. Les modèles de métastases chez l’animal sont complexes mais récapitulent l’effet de molécules sur le microenvironnement « normal » des métastases et reste prédictif de la réponse aux traitements en recherche. Dès lors l’utilisation d’animaux vivants est donc nécessaire afin de tester de nouvelles substances pharmacologiques. Les procédures décrites dans ce projet correspondent à la création de différents modèles de métastases chez le rongeur (souris ou rat). L’objectif est de mesurer différents critères (taille de la métastases, survie...) afin d’évaluer l'efficacité ou la toxicité de molécules aux propriétés anticancéreuses décrites ou potentielles.
Bénéfices attendus
Le projet consistera à développer des modèles de métastases chez le rongeur pour les différentes indications en oncologie, qui permettra de tester l'efficacité d'anticancéreux pour des clients du secteur industriel privé ou des laboratoires de recherche publique ou dans un contexte de recherche interne. De plus, il permettra aussi d'évaluer l'expression de certains biomarqueurs en amont d'une étude de pharmacologie ou de générer des modèles animaux pour des procédures de test dans un autre laboratoire dans le cas de collaboration.
Procédures
Les animaux subiront une anesthésie d’environ 5 à 30 minutes pour les phases de chirurgie ou d’injection. Toujours sous anesthésie, les animaux subiront une injection rapide (
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables inhérents au développement tumoral pourront apparaître pendant une étude : - Une perte de poids corporel - Un comportement amorphe marqué pendant les périodes de vigilance - Une hypothermie persistante - Une distension anormale de l’abdomen pouvant être le signe d’un épanchement - Des problèmes de respiration pour l’animal - Une incapacité de se nourrir ou boire L’ensemble de ces symptômes sera monitoré pendant l’étude afin d’appliquer des mesures pouvant amener à l'euthanasie de l’animal avant la fin de l’étude pour raison éthique.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’étude car les animaux présentent des tumeurs et cela ne permet pas un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de métastases s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in-vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux. De plus, les traitements utilisés subissent toutes les différentes phases incluant administration, distribution, métabolisme et élimination, étapes ne pouvant être reproduites in-vitro.
Réduction
Des analyses in-vitro pourront être réalisées en amont de l'étude permettent de sélectionner des lignées/types de cellules présentant une sensibilité à la substance d'essai afin de limiter le nombre d'animaux. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet, la comparaison par rapport à une substance de référence, et un effectif suffisant de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Dans cet objectif, une analyse sera réalisée afin d’estimer le nombre d’animaux nécessaire pour observer une diminution du volume tumoral mesuré d'au moins 50%.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales afin de réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, …), permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. Le programme d’anesthésie, d’analgésie et de chirurgie (incluant oxygène à concentration ajustable et des tapis chauffants) est défini en accord avec un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères... En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu’à normalisation ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation inclut une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions… Une évaluation interne incluant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à posteriori la catégorie si nécessaire.
Choix des espèces
Les rongeurs rats et souris demeurent essentiel à étudier les tumeurs in vivo et à comprendre les mécanismes moléculaires de la pathogenèse du cancer. En effet, les métastases présentent une accumulation de multiples aberrations génétiques qui transforment les cellules, entraînant une croissance anormale et une forte prolifération des cellules. Il n’est pas possible de reproduire ces éléments in vitro et nécessite une système complexe comme les modèles animaux. Les deux genres mâle et femelle seront utilisées car le cancer affecte aussi bien les hommes que les femmes. De plus, la nécessité d'utiliser les 2 genres est aussi due au type de cancer (exemple : femelle pour le cancer des ovaires, mâle pour le cancer de la prostate). Tous les animaux seront utilisés à partir de 5 semaines de développement que ce soit des rats ou des souris. Dans certains cadres, les animaux pourront être utilisés avant sevrage dans des modèles génétiques ou de tumeurs pédiatriques.
Effet d’un probiotique sur le métabolisme énergétique de souris juvéniles
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
60 souris juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime pauvre en protéines et riche en graisses, un probiotique, puis des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec sept prélèvements de sang à la queue, avant mise à mort pour prélever les organes. Le porteur étudie l'effet d'une bactérie sur le métabolisme de souriceaux mal nourris, en vue de futures cibles pour la malnutrition infantile. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit un organisme entier.
Objectifs
La malnutrition infantile est un problème majeur à travers le monde. Elle inclut la sous-nutrition, mais également l’obésité chez les enfants, résultant toutes deux d’un régime alimentaire déséquilibré. Des études ont montré que le microbiote des individus mal nourris était sévèrement impacté. De plus, une intervention probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au- delà des effets nutritionnels traditionnels) permettait de compenser partiellement les effets négatifs de la sous-nutrition protéique chez un modèle préclinique de rongeur. Cependant, les effets de ce probiotique dans un contexte nutritionnel lié à l’obésité infantile ainsi que les mécanismes d’action de ce dernier sont encore mal connus. Des études précédentes portant sur des régimes riches en graisses ont permis de montrer qu’un traitement avec ce probiotique permettait d’améliorer l’équilibre glucidique, en particulier sur des périodes longues de régimes riches en graisses et pauvres en protéines (ce type de régime reproduit un régime occidental). Il serait donc intéressant d’explorer de façon détaillée l’effet du probiotique en conditions contrôle ou riches en graisse et pauvre en protéines, et sur des périodes de temps plus courtes, après le sevrage. En utilisant un modèle murin de régime pauvre en protéines et riche en graisses permettant une approche de physiologie intégrée, l'objectif de ce projet est de caractériser finement le métabolisme des souris et les potentiels effets bénéfiques d'une bactérie probiotique dans un contexte nutritionnel contrôle ou de régime occidental.
Bénéfices attendus
Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition dans un contexte juvénile sont encore mal connues, de même que les effets bénéfiques du probiotique. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises qui s’opèrent lors d’un régime métaboliquement délétère et d’évaluer les potentiels effets positifs d’un traitement avec la bactérie probiotique. Il sera possible d'identifier au cours du projet de futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de syndrome métabolique au travers d’un traitement nutritionnel et probiotique adapté.
Procédures
Les animaux seront soumis à un régime nutritionnel faible en protéine et riche en graisse (qui mime un régime occidental) ou à un régime contrôle pendant la durée de la procédure, ainsi qu’à un traitement avec une bactérie probiotique ou un placebo dans le creux de la joue 5 jours sur 7. Un test de tolérance au glucose sera réalisé sur les animaux vigiles (voie orale par gavage) et 7 prélèvements sanguins (2-3 μL) seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer la glycémie au cours du temps, ainsi que trois prélèvements de 20 µL pour mesurer l’insulinémie au cours du temps. Les animaux nourris avec le régime nutritionnel « occidental » seront soumis à un test de tolérance à l’insuline. Pour cela les animaux recevront une injection intrapéritonéale d’insuline et 7 prélèvements sanguins (2-3 µL) seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer la glycémie au cours du temps. Les animaux nourris avec un régime contrôle seront soumis à un test de tolérance au glucose par voie intrapéritonéale. Ils recevront une injection intrapéritonéale de glucose (2mg/L) et 7 prélèvements sanguins (2-3 µL) seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer la glycémie au cours du temps. Enfin, un prélèvement de sang dans la veine porte sera réalisé 15 minutes après un gavage au glucose. Pour cela, après une injection de buprénorphine, les animaux seront anesthésiés avec de la kétamine et de la lidocaïne et une laparotomie sera réalisée. L’ensemble des interventions seront réalisées sur 60 animaux.
Impact sur les animaux
Cette procédure devrait entraîner des nuisances modérées sur les animaux. Le régime pauvre en protéines et riche en graisses (RO) utilisé dans le cadre de cette procédure a déjà été utilisé et il n’engendre pas de phénotype délétère. Ce régime vise à modéliser les altérations métaboliques induites par un régime occidental. Aucune modification de l’activité, ni de stress anormal n’a cependant été détecté chez les animaux nourris avec le régime pauvre en protéines et riche en graisses (RO). Pour limiter les effets délétères du régime RO, leur poids sera surveillé de façon régulière et les animaux seront mis à mort si un des points limites est atteint. Leur comportement sera également surveillé de manière quotidienne. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline impliquent des prélèvements sanguins au bout de la queue pouvant induire une douleur et un stress. L’injection sous-cutanée peut entraîner un gonflement ou un œdème, dont l’apparition sera surveillée quotidiennement après la procédure. La cicatrisation du bout de la queue sera également surveillée. Lors du test de tolérance à l’insuline, si la glycémie des animaux chute sous 60 mg/dL au cours de l’expérience, celle-ci sera arrêtée et les animaux recevront une injection intrapéritonéale d’une solution de glucose à 20%.
Devenir
L'ensemble de animaux mis en procédure seront mis à mort après le prélèvement en veine porte en vue du prélèvement des organes d'intérêt. Les mères qui n'auront pas subi de procédure expérimentale, seront réformées dans l'animalerie.
Remplacement
Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires et d’une bactérie probiotique, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier, ce qui est nécessaire pour l'étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C'est pourquoi cette étude nécessite l'expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s'agit d'un bon modèle pour étudier les modifications induites par divers régimes alimentaires et une bactérie probiotique sur le métabolisme dans un contexte physiologique.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres étudiés. Dans une optique de réduction,l'ensemble des organes impliqués dans le métabolisme mais qui ne seront pas analysés dans le cadre de ce projet seront prélevés et conservés au congélateur pour d'éventuelles analyses ultérieures. Le protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agrée. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif. Les mères epourront être réutilisées pour d’autres procédures.
Raffinement
Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de cette procédure expérimentale, une surveillance accrue des animaux sera mise en place avec des visites quotidiennes. La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront tatoués en début de procédure afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Lors des tests de tolérance au glucose et à l’insuline, l’apparition d’un œdème ou d’un gonflement au point d’injection sous-cutanée ainsi que la bonne cicatrisation du bout de la queue suite aux prélèvements sanguins seront surveillés quotidiennement et pourront donner lieu à l’application locale d’antiseptiques le cas échéant. L’atteinte des points limites entraînera la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental et l’administration de probiotique, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale.
Choix des espèces
La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un probiotique dans une étude nutritionnelle. Les animaux utilisés seront suivis à partir du jour d'identification par tatouage dans la paume de pate arrière, et pendant les 35 jours de traitement post-sevrage. . L'objectif du projet est d'étudier les effets d’un probiotique sur le métabolisme pendant la période juvénile. Pour cela, les animaux doivent être inclus dans la procédure dés le sevrage, qui est une période clé pour la croissance et la maturation métabolique.
Nouvelle thérapie anti-inflammatoire dans différents modèles d’inflammation aigue chez la souche murines C57BL/6 et Balb/c
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
1290 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent trois modèles d'inflammation provoquée, dont un psoriasis induit par une crème et une péritonite par injection, avec perte de poids, lésions cutanées et diarrhée déclarées. Le porteur teste des molécules ciblant la résolution de l'inflammation, en réponse aux effets secondaires des traitements actuels du psoriasis. Il indique avoir présélectionné ses molécules in vitro pour limiter le nombre d'animaux.
Objectifs
L’objectif de ce projet sera d’étudier l’efficacité préclinique de molécules ciblant les voies de la résolution de l’inflammation dans des pathologies pour lesquelles il a été décrit un déficit de cette résolution. Depuis quelques années il a été démontré que de nombreuses maladies inflammatoires chroniques sont causées par un échec de résolution de l’inflammation, c’est notamment le cas dans les maladies de la peau telles que le psoriasis. Les traitements les plus utilisés sont des pommades locales à base de dermocorticoïdes. Pour les formes les plus graves, des immunosuppresseurs peuvent être prescrit mais aussi de la chimiothérapie . Elles visent à inhiber le système immunitaire permettant une rémission des patients mais apportant de nombreux effets secondaires. Aujourd’hui de nouvelles stratégies thérapeutiques doivent être développées afin de proposer aux patients résistants ou en échecs de nouvelles possibilités d’avenir. Chez ces patients, un échec de résolution de l’inflammation a déjà été démontré. Ce mécanisme de résolution met en jeu différents récepteurs exprimés par les cellules de l’immunité et ciblés par des médiateurs lipidiques. Nous souhaitons, par ce projet, étudier l’efficacité préclinique chez la souris, de nouvelles molécules ciblant les récepteurs de la résolution de l’inflammation et permettant d’activer cette résolution lorsqu’elle est mise en échec. Pour cela nous comparerons notre traitement à un traitement de référence défini pour chaque modèle. Le nombre d’animaux utilisé sera de 1290 pour combiner un nombre réduit d’animaux avec une pertinence statistique. Au préalable des études in vitro seront effectuées afin de sélectionner 2 molécules à tester. Le suivi des animaux sera quotidien lors de la phase d’inflammation et de récupération afin de maitriser le plus adéquatement possible la douleur chez l’animal et de lui apporter les soins nécessaires le plus rapidement possible. Pour limiter le stress et l’inconfort, les animaux sont maintenus dans des cages ventilées dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté ainsi qu’un nombre maximum de 5 animaux/cage et des brindilles de papier pour s’enfouir et se cacher.
Bénéfices attendus
Actuellement les traitements pour les patients atteints de psoriasis sont des dermocorticoïdes, de la chimiothérapie ou bien des immunosuppresseurs. Depuis quelques années, les immunothérapies sont utilisées pour les formes sévères du psoriasis qui touchent environ 20% des patients. Les dermocorticoïdes, la chimiothérapie ainsi que les immunosuppresseurs induisent néanmoins de nombreux effets secondaires tels qu’une prise de poids, de l’hypertension, vomissement, perte de cheveux et des vertiges. Les immunothérapies utilisées lors des formes sévères, induisent, elles, une immunodépression du patient le rendant plus sensible aux infections du quotidien. De plus, et malheureusement, il a été démontré un échappement à ces immunothérapies dans 60% des cas moins d’un an après le début du traitement. Il est donc primordial de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces patients. Nous avons donc développé une nouvelle molécule ciblant les récepteurs de la résolution de l’inflammation. Ces molécules ne modifient pas l’initiation de l’inflammation et donc permettraient aux patients de ne plus être immunodéprimés et de pouvoir répondre à tout type d’attaque extérieur puisque leur système immunitaire serait totalement fonctionnel. Chez l’animal nous espérons pouvoir accélérer la phase de récupération des différents modèles que ça soit au niveau des signes cliniques pour le modèle de psoriasis ou sur l’infiltration cellulaire pour les modèles d'inflammation aigue. Si ces études in vivo sont bénéfiques pour l’animal nous envisageons de pouvoir débuter un essai clinique chez l’Homme afin de traiter les patients ayant échappés aux immunothérapies et de leur proposer une nouvelle stratégie thérapeutique.
Procédures
Pour l'un des modèles d'inflammation aigue les animaux subiront des injections en sous-cutanée afin de former la poche d'air (2 injections) et d'injecter l'agent inflammatoire (une injection), de plus ils subiront une injection intrapéritonéale pour les traitements. Le second modèle d'inflammation aigue sera induit par une injection intraperitonéale de l'agent inflammatoire et une injection intraperitonéale pour les traitements. Pour le modèle de psoriasis, les animaux seront traités par voie intrapéritonéale (injection 3 fois/semaine) et pourront subir un prélèvement sanguin (une fois). De plus une application quotidienne de crème Aldara sera faite durant 6 jours.
Impact sur les animaux
Modèle 1) l’application de crème induit une perte de poids chez l’animal durant les 4 premiers jours d’application, les souris récupèrent spontanément ensuite. Une perte de poids ainsi que la formation d’érythème et de desquamation seront observés chez l’animal, induisant une douleur légère durant les cycles d’application de la crème. Modèle 2) l’injection de l'agent inflammatoire dans le péritoine provoque quelques effets indésirables les premières heures : diarrhée, frisson, immobilité. Dès le lendemain les animaux ont récupéré. Modèle 3) La poche d’air n’induit aucune nuisance sur l’animal. L’injection de l’agent inflammatoire peut parfois amener des effets indésirables les premières heures : diarrhée, frissons mais cela est transitoire et s’estompe rapidement.
Devenir
Les animaux ne seront pas gardé une fois l'expérience terminée. En effet pour chaque modèle, differents prélèvements seront fait induisant obligatoirement la mort de l'animal.
Remplacement
Avant l’utilisation chez l’animal, nous sélectionnerons préalablement nos molécules par différents tests in vitro notamment d’affinité et d’avidité pour le récepteur mais aussi d’efficacité sur des cellules humaines. Cela nous permettra de réduire le nombre d’animaux puisque seulement 2 molécules seront étudiées dans nos modèles.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis ainsi que les études pilotes permettent de réduire l’utilisation de l’animal puisque l’étude principale ne sera exécutée que sur l’étude pilote ayant démontrée une efficacité thérapeutique. En amont nous avons définis par un test statistique le nombre d'animaux nécessaire afin d'observer une différence significative dans nos expériences. Basé sur un test de distribution normale d'échantillons nous avons déterminé un nombre de 25 animaux necessaire pour obtenir une différence significative entre le groupe contrôle et le groupe traité dans nos expériences.
Raffinement
Les animaux auront une phase d’acclimatation de 5 jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. En amont de l’expérience le protocole sera entièrement planifié afin d’éviter du stress à l’animal et les points limites seront définis afin d’anticiper toute souffrance. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront des anti-douleurs 2 fois/jours puis dans l’eau de biberon pour la nuit. Lorsque les points limites seront atteints, les animaux seront mis à mort. Les animaux ne seront pas maintenus au de-là des délais décrit pour chaque modèle, limitant leur utilisation si cela n’est pas nécessaire. L’animal sera maintenu en groupe (5 animaux/cage), avec des brindilles pour se camoufler ainsi que des dômes lorsque cela sera nécessaire. Si un animal montre de l’agressivité il sera isolé afin de préserver les autres animaux et mis dans une cage avec des enrichissement de type : dôme ou tunnel, brindilles
Choix des espèces
Le modèle de psoriasis et de péritonite seront étudié sur une souche de souris qui est la plus sensible pour déclencher un psoriasis et une péritonite. Le modèle d’AirPouch sera lui étudié sur une autre souche qui est la souche décrite pour ce modèle. Les animaux seront utilisés entre 7 et 10 semaines car l’inflammation générée les différents agents inflammatoires est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces où avancés ou les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.