Souris

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique pour l'implantation d'un organoïde cérébral humain, puis sont tuées deux à quatre semaines plus tard pour prélèvement du cerveau, non pour produire des connaissances mais pour former des étudiants, à raison d'un animal par étudiant et par instructeur. Le porteur décrit longuement les mini-cerveaux humains cultivés in vitro, tout en affirmant qu'ils cessent de croître après cinq semaines faute d'irrigation. Il justifie l'implantation chez la souris par la nécessité de leur fournir sang et nutriments.

Objectifs

Nous proposons de former de nouveaux chercheurs sur les méthodes modernes utilisées dans le domaine de la neuroscience. Pendant cette formation, nous travaillerons sur les organoïdes cérébraux, une masse de cellules mimant la structure et les fonctions principales du cerveau. Les organoïdes sont cultivés en laboratoire et Ils sont composés de tissus hétérogènes complexes, similaires au cortex cérébral immature. Pour faciliter leur maturité, ils sont transplantés dans le cerveau des rongeurs ce qui les permettre de développer leur système vasculaire. Cette technique permet de modéliser les affections cérébrales congénitales et les troubles neuropsychiatriques. La technique a aussi favorisé l'étude du développement du cerveau. Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront appris et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie leur permettra de réduire le nombre d’animaux lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront appris et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilises lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.

Procédures

Les animaux suivront une chirurgie stereotaxique pour implanter une organoïde cérébral. Entre deux - quatre semaines plus tard, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses immuno-histologiques. Tous les animaux suivront donc 2 procédures: Chirurgie stereotaxique (Durée prevue: 1 heure) + euthanasie.

Impact sur les animaux

Nuisances liées aux procédures chirurgicales : douleur post-opératoire, risque mineur d’infection de la cicatrice, perte de poids. Dans des cas très rares, le couvercle en verre peut se décoller.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses immuno-histologiques.

Remplacement

Les mini-cerveaux humains sont produits à partir de cellules souches humaines qui vont se différencier en cellules cérébrales et se développer en une structure mesurant quelques millimètres et imitant la structure physique et cellulaire d’une version complète du cerveau humain. Avec la culture in-vitro, les structures cessent de croître au bout de cinq semaines, car l’oxygène et les nutriments nécessaires n’arrivent pas à atteindre les cellules les plus internes. L’implantation d’organites du cerveau humain dans un cerveau de souris leur donne en revanche tout ce dont ils ont besoin pour grandir et se développer. Le cerveau hôte fournit effectivement suffisamment de sang et de nutriments aux mini-cerveaux pour les maintenir en vie et leur permettre de se développer pendant des mois. En l’espace de deux à 12 semaines, les organoïdes faisaient germer des neurones supplémentaires, y compris ceux trouvés dans des régions très spécifiques du cortex humain : des cellules gliales (y compris les astrocytes) et des cellules souches neurales. Au bout de 14 jours, presque tous les organites développent un riche réseau de vaisseaux sanguins transportant des nutriments et de l’oxygène, leur permettant de survivre jusqu’à 233 jours. Leur structure et leur maturation cellulaire étaient celles d’un nouveau-né.

Réduction

L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les actes de préparation chirurgicaux, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Par an, 20 étudiants et 10 instructeurs suivront les projets décrits dans cette DAP. Dans ce context, lors de la formation, les instructeurs réalisent une démonstration de la procédure puis les étudiants auront l’occasion de pratiquer la procédure sous-couvert des instructeurs. Nous utiliserons un animal par étudiant et par instructeur soit 30 souris/an.

Raffinement

Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie, une installation tout au long des procédures chirurgicales de contrôle de la température par tapis chauffant. Les souris seront placées en cage de 4-5 souris sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu (carrés de cellulose, maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher et/ou ronger) permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Les animaux opérés seront observés quotidiennement par l’expérimentateur pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les 4 jours suivant. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation incluant le poids de l'animal, l'état de la plaie, la mobilité de l'animal et les signes de douleur. Si l'animal présente un score entre 6 - 16, une injection de carprofène s.c. (dose 5 mg/kg pour souris) sera effectuée et reconduite toutes les 24h si les signes persistent lors des observations suivantes. Si l’animal n’a pas repris de poids au bout de 4 jours, ou si des signes de souffrance sont observés, le traitement sera étendu de 2 jours supplémentaires. Si la récupération ne s’effectue pas bien et si le score des critères de la grille d’évaluation est supérieur à 11 durant 2 jours consécutifs l’animal sera euthanasié par l'expérimentateur par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Avec la culture in-vitro, les organoides cessent de croître au bout de cinq semaines. L’implantation dans un cerveau de souris leur donne tout ce dont ils ont besoin pour grandir et se développer. Le cerveau hôte fournit suffisamment de sang et de nutriments aux mini-cerveaux pour les maintenir en vie et leur permettre de se développer pendant des mois. En l’espace de deux à 12 semaines, les organoïdes faisaient germer des neurones supplémentaires, y compris ceux trouvés dans des régions très spécifiques du cortex humain. Au bout de 14 jours, presque tous les organites développent un riche réseau de vaisseaux sanguins transportant des nutriments et de l’oxygène, leur permettant de survivre jusqu’à 233 jours. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des procédures chirurgicaux.

40 souris âgées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation, une greffe de moelle osseuse, puis une blessure musculaire provoquée par injection d'un agent chimique dans les deux pattes, pour étudier le rôle d'une protéine dans la régénération du muscle vieillissant. L'irradiation provoque une immunodépression et une fatigue de plusieurs jours. Le tissu musculaire est prélevé après la mise à mort, et le porteur indique avoir mené en amont des essais sur cultures cellulaires.

Objectifs

Le muscle adulte a la capacité de régénérer complètement après une lésion. Certaines cellules de l'immunité jouent un rôle important dans ce processus, comme les macrophages. Cependant, au cours du vieillissement, le processus de réparation musculaire se fait mal, en partie car les macrophages fonctionnement moins bien. Une protéine X a été montrée comme régulant l'activité des macrophages dans des modèles mimant la réparation musculaire in vitro. La validation du rôle de cette protéine dans les macrophages au cours de la régénération musculaire in vivo chez la souris âgée nécessite l’utilisation d’un modèle de souris présentant une inactivation du gène à l’origine de cette molécule. Une approche réductrice en nombre d'animaux consiste à transplanter les cellules de la moelle osseuse d’un animal déficient pour la molécule dans des souris receveuses âgées saines. De cette manière, seuls les macrophages sont inactivés pour la molécule dans les animaux transplantés. Ensuite, une blessure musculaire avec un agent chimique est réalisée afin de pouvoir analyser la régénération musculaire de ces souris. L’objectif de cette étude est de valider le rôle de cette molécule dans les cellules immunitaires au cours de la régénération musculaire dans la souris âgée.

Bénéfices attendus

Le processus de régénération musculaire, bien qu'habituellement très efficace est altéré au cours du vieillissement. La connaissance des mécanismes moléculaires du processus de régénération pourrait ouvrir des voies thérapeutiques afin d'aider ce processus. L'étude permettra d'identifier si la molécule est nécessaire dans les macrophages pour la régénération musculaire dans le sujet âgé.

Procédures

Les souris subiront les interventions suivantes : - irradiation (1 fois 10 minute) - injection intraveineuse de moelle osseuse (1 fois 10 minutes sous anesthésie) - prélèvement sanguin (1 fois 10 minutes sous anesthésie) (pour un seul groupe de souris, 1/3) -traitement antalgique par injection sous cutanée - induction de blessure musculaire : injection dans les deux pattes d’un agent chimique dans le muscle situé le long du tibia (1 fois 10 minutes sous anesthésie et analgésie).

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (irradiation, injections, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress et une douleur. L'irradiation puis la transplantation provoquent une immunodépression transitoire. Ceci induit une fatigue générale chez les animaux et une perte de mobilité pendant environ 4 jours, et peut entraîner chez certains individus à une perte de poids de corps jusqu'à 5 jours après l'irradiation, et qui est récupérée ensuite. L'induction de la blessure musculaire engendre un inconfort passager (la douleur étant traitée par analgésique).

Devenir

Les animaux sont mis à mort en vue de de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques et cellulaires.

Remplacement

Les alternatives non animales ont déjà été utilisées en amont de ce projet. Il s'agit d’expériences de culture cellulaire in vitro, qui montrent un rôle de la molécule dans la fonction des macrophages dans des modèles qui miment la régénération musculaire in vitro. L'étude analysant les effets du vieillissement, des souris agées (24 mois) sont utilisées.

Réduction

Le modèle mis en œuvre dans ce projet a été choisi car il permet de répondre à la question et car c’est celui qui permet de réduire le plus possible le nombre d’animaux. Les études précédentes ont montré qu’un nombre de 5 individus par point d’analyse est suffisant pour réaliser des statistiques. De plus, l'établissement d'une lésion aux deux pattes de chaque souris permet de réduire par deux le nombre d'animaux, sans impact sur la mobilité des animaux.

Raffinement

Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d’élevage et de bien-être afin d’enrichir l’environnement des souris. Le raffinement inclut l'anesthésie et l'analgésie lors de l'injection de la moelle osseuse, du prélèvement sanguin et de l'induction de la blessure musculaire et lors de la mise à mort des animaux. Le raffinement inclut le maintien des animaux dans des conditions prophylactiques strictes et une surveillance quotidienne des animaux après l'irradiation comprenant le dépôt de nourriture hydratée et de gel nourrissant directement dans la cage, une pesée trihebdomadaire, la surveillance de l'état général des individus. Ces mesures de raffinement sont issues de recommandations publiées issues de travaux de la communauté scientifique. Des points limites ont été établis sur l'observation du comportement des animaux et leurs poids.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'Homme dans sa structure et son fonctionnement. Les mêmes séquences de l'inflammation chez la souris et chez l'homme sont observées au cours de la régénération musculaire. Le modèle murin permet des explorations moléculaires, cellulaires, tissulaires et fonctionnelles (évaluation de la fonction contractile du muscle). L'existence de lignées murines génétiquement modifiées et permettant le traçage des populations de macrophages est un argument supplémentaire pour l'utilisation de cette espèce. Les souris sont utilisées à l'âge de 22 mois car le projet concerne la régénération musculaire chez l'individu âgé.

785 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une implantation sous-cutanée de cellules de glioblastome issues de patients, puis jusqu'à cinq types d'interventions, imagerie de fluorescence, injections répétées sur cinq semaines, gavages sur cinq cycles et perfusion cardiaque. Le sang et les organes sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme que le passage par un modèle animal est "indispensable" avant de tester ces molécules sur des patients.

Objectifs

Le glioblastome (GBM) est le cancer cérébral le plus fréquent et le plus agressif, avec 200 000 décès par an dans le monde. Le traitement standard actuel (extraction chirurgicale, radiothérapie et chimiothérapie) n’est malheureusement pas curatif et la survie médiane des patients est de 14 mois. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles thérapies contre ce cancer. Le projet compte évaluer des molécules capables de cibler et d’éliminer les cellules de GBM, seules ou en combinaison avec des nanotechnologies. Le développement pharmaceutique de ces formulations a permis de formuler ces médicaments pour une utilisation clinique (formulations validées sur des lignées cellulaires de GBM humain). Il est maintenant important d’évaluer l’intérêt thérapeutique de ces nouvelles molécules sur différents modèles animaux, avant d’envisager un essai clinique chez l’Homme. Le projet consiste à développer des modèles murins de GBM sous-cutanés à partir de cellules dérivées de patients, dans le but d’évaluer l’intérêt thérapeutique de plusieurs candidats médicaments après administrations répétées (intraveineuses ou sous-cutanées).

Bénéfices attendus

Le but de ces travaux consiste à développer des modèles murins de GBM sous-cutanés à partir de cellules dérivées de patients (PDX), dans le but d’évaluer l’intérêt thérapeutique de plusieurs candidats-médicament après administrations répétées (intraveineuses ou sous-cutanées). Si l’intérêt thérapeutique est attesté et les doses maximales tolérées et efficaces déterminées, ces travaux pourront servir pour réduire le nombre de souris utilisées lors d’une future étude sur des modèles PDX où les cellules tumorales seront injectées au niveau du cerveau (= modèle orthotopique), modèle plus proche de l’Homme. La combinaison des résultats sur ces modèles sous-cutanés et orthotopiques de PDX serviront de base pour la mise en place d’essais pré-cliniques règlementaires avant la mise en place d’essais cliniques.

Procédures

Dans la mise au point du modèle, les animaux subiront 2 types d'intervention : l’implantation tumorale sous-cutanée et le suivi de la croissante tumorale qui durent quelques minutes. Dans l’étude de biodistribution et pharmacocinétique tissulaire, les animaux subiront jusqu'à 5 types d’intervention : l’implantation sous-cutanée tumorale et le suivi de la croissante tumorale qui durent quelques minutes, un suivi de la biodistribution des molécules par imagerie de fluorescence (3 sessions au maximum sur une semaine qui durent plusieurs dizaines de minutes chacune), des injections intraveineuses ou sous-cutanées sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours) et une perfusion cardiaque. Dans l’étude d'efficacité, les animaux subiront jusqu’à 4 types d’intervention : l’implantation sous-cutanée tumorale et le suivi de la croissante tumorale qui durent quelques minutes, des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) et des gavages répétés (1 gavage par jour pendant 5 jours suivi de 2 jours de repos, sur 5 cycles maximum).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des candidats médicaments seront évalués lors de chaque phase du projet. Certains candidats médicaments pouvant être composés d’un anticancéreux, des effets indésirables communément retrouvés après injection de ce type de composé pourraient être observés (modification de la formulation sanguine, perte de poids, faiblesse, etc.). Les effets indésirables peuvent être également liés à l’injection des traitements (rougeur, inflammation, etc.).

Devenir

A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements de sang et/ou d’organes.

Remplacement

L’utilisation des candidats médicaments étant à visée humaine, il est nécessaire de réaliser des études précliniques pharmacologiques non-réglementaires, comme ici des études de biodistribution et d’efficacité pour démontrer et valider sans aucune ambiguïté leur intérêt thérapeutique avant les études précliniques réglementaires et les essais cliniques chez l’Homme. Ces traitements visent les femmes et les hommes, c’est pourquoi il est important de démontrer leur efficacité chez les deux sexes. Des travaux in vitro sur cultures cellulaires vont être menés sur les cellules tumorales utilisées dans ce projet préalablement à son démarrage pour valider les formulations testées. Il est indispensable de passer sur un modèle animal mimant les conditions de développement du GBM avant de pouvoir tester les molécules sur des patients atteints de ce cancer. Le développement de ces types de modèle dans ce projet ne peut pas être remplacés par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques dans un microenvironnement particulier, notamment dans le cas du GBM, ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.

Réduction

L'étude de toxicité que nous allons effectuer dans un autre projet (n° APAFIS 38113) va nous permettre de raffiner la dose administrée. Le nombre d’animaux d'un sexe sera également réduit au strict minimum en fonction des résultats obtenus chez l'autre sexe. Un seul modèle tumoral sera testé chez le deuxième sexe. Le nombre d’animaux choisi par groupe est suffisant pour garantir des données précises, représentatives de l’espèce, et statistiquement exploitables. Il est préférable de ne pas utiliser moins d’animaux, au risque d’être confronté à des variations entre des animaux d’un même groupe.

Raffinement

La douleur et l’angoisse de chaque animal seront évaluées par un suivi quotidien. Afin d’évaluer de façon raffinée la souffrance/douleur des animaux tout au long de l’expérimentation, un système de score sera mis en place pour chaque animal et pour chaque paramètre contrôlé. Dans le cas où un animal présenterait un ou des signes de souffrance, un médicament contre la douleur serait administré jusqu’à ce que ces signes disparaissent. L'atteinte d'un des points limites par un animal impliquera sa mise à mort. Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi, mais la décision finale sera prise dans les 24h par le porteur de projet.

Choix des espèces

Des recherches bibliographiques montrent que la souris est l'espèce la plus utilisée et adaptée pour l’implantation de cellules de GBM, qu’elles soient issues de lignées immortalisées ou de patients. Il s'agit de l'espèce la mieux décrite dans la littérature. Les souris seront utilisées entre 6 et 8 semaines d’âge. Cet âge est majoritairement retrouvé dans les études bibliographiques in vivo sur modèle sous-cutané de GBM chez la souris.

6300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie et l'administration de composés une à deux fois par jour pendant jusqu'à 42 jours, pour tester des traitements anticancéreux. Les organes sont prélevés après la mise à mort pour mesurer l'efficacité des molécules. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité d'une tumeur et conclut à la nécessité du recours à la souris.

Objectifs

Les cancers font partie des maladies les plus complexes à traiter. Notre projet propose de trouver de nouvelles thérapies anticancéreuses et permettra de comprendre pourquoi on observe un échappement de la maladie lors de traitement à base d’anticorps ou de molécules pharmaceutique mais également de proposer des stratégies pour rendre ces thérapies plus efficaces.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels ne permettent pas de traiter 100% des patients atteint d’un cancer et l’on observe de plus en plus d’échappement aux thérapies déjà existantes. Ces études permettront à la fois d’expliquer le mécanisme d’échappement à ces traitements mais aussi d’expliquer le mécanisme d’action de certains traitements. Ces résultats seront comparés à ceux obtenus in vitro au préalable mais également avec ce que l’on attend des différents traitements observés lors des phases clinique chez l’homme. De plus, ces études permettront de tester de nouvelles thérapies plus innovantes et donc de proposer de nouveaux traitements plus efficaces aux patients atteint de cancer.

Procédures

1) Injection de cellules tumorales en moins de 3 minutes sous anesthésie une seule fois dans l'étude, 2) l'imagerie de la tumeur une fois par semaine pendant 6 semaines se fera sous anesthésie pendant 5 min apres une injection de sonde bioluminscente, 3) Prélèvements sanguins une fois par semaine pendant 6 semaines: prelevement en moins d'une minute avec anesthésie pas plus de 2 fois dans l'etudes ou intraveineux sans anesthesie ou en moins d'une minute, 4) Administration des composés à tester ou de leur solvant en moins d'une minute par animal, une à deux fois par jour pendant un maximum de 42 jours

Impact sur les animaux

L’injection en sous cutané de cellules tumorales chez la souris va induire le développement d’une tumeur qui va grossir au fur et à mesure. Les effets indésirables attendus chez la souris sont dans un premier temps une perte de poids, une diminution de l’activité. Les animaux seront également manipulés délicatement mais rapidement afin d'eviter au maximum le stress de la manipulation, des administrations et du gavage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la progression d’une tumeur où son échappement à une thérapie. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'études in vivo pour comprendre ce phénomène et évaluer de potentiels candidats médicaments. Afin de réduire au maximum le nombre d’étude et donc le nombre d’animaux utilisés, les différentes stratégies antitumorales seront préalablement testées in vitro. Et ne seront testés les traitements, les molécules ou anticorps, ayant montré le plus d’efficacité dans ces modèles.

Réduction

Pour respecter le principe des 3R, nous veillerons à ce que toutes les expériences qui pourront être réalisées in vitro le soient et que ne seront testés, in vivo, que les meilleures molécules ou anticorps obtenus in vitro. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe afin d’obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05. L’utilisation de l’imagerie bioluminescente et de cellules tumorales exprimant la luciférase permettront un suivi longitudinal des animaux et donc diminuera le nombre d’animaux utilisé dans les études. Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation de 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations. Les animaux et leurs conditions d’hébergement seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d'étude. La bonne connaissance des études permettra de raffiner et d’anticiper le développement de la maladie chez l’animal et donc d’anticiper la mise à mort éthique. Pour cela, un programme d'analgésie ainsi qu'une grille de score, l'utilisation de points limites adaptés, d'un arbre décisionel et de critére d'arret de souffrance sont mis en place.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus utilisée pour ce type de modèle et donc le plus décrit. Son utilisation permettra de bénéficier de toute la littérature scientifique déjà parue sur ce modèle utilisant cette espèce. Nous nous appuierons sur de la bibliographie solide et sur un modèle déjà bien documenté afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour la mise au point Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte afin de travailler sur des organes parfaitement développés.

370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la maladie de Huntington, elles subissent des injections intracérébrales sous anesthésie, des gavages répétés sur quatre mois, de l'imagerie cérébrale et une batterie de tests comportementaux évaluant motricité, sociabilité, vocalisation, anxiété et anhédonie, avant la mise à mort pour analyser les tissus. Le porteur n'attend que peu d'effets indésirables hormis la douleur des chirurgies et le stress de la contention. Il affirme que les interactions entre neurones et astrocytes ne sont pas reproduites in vitro ou in silico et qu'un modèle murin est nécessaire pour tester cette thérapie génique.

Objectifs

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative d’origine génétique sans traitement curatif. Elle se caractérise par la mort de neurones du système nerveux central, ce qui provoque d’importants troubles moteurs, cognitifs et comportementaux chez les patients. Un défi majeur est de retarder l’âge d'apparition des symptômes et de ralentir la progression de la maladie de Huntington. La production et l’élimination du cholestérol, qui est essentiel pour le cerveau, est altéré dans la maladie de Huntington. Le métabolisme du cholestérol implique un dialogue finement régulé encore mal compris entre les neurones mais aussi leurs partenaires, les astrocytes. Les études pilotes montrent que la thérapie génique avec CYP46A1, qui vise à rétablir le métabolisme du cholestérol, impacte aussi les astrocytes et les rend réactifs. Nous faisons l’hypothèse que les astrocytes réactifs sont impliqués dans les effets bénéfiques de cette stratégie thérapeutique. L’objectif de ce projet est de mieux définir le potentiel thérapeutique de CYP46A1 dans un modèle murin pertinent de la maladie de Huntington et de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. D’une part, il s’agit d’établir si les astrocytes réactifs sont impliqués dans les effets thérapeutiques de la CYP46A1 : une approche préclinique complète évaluera les effets thérapeutiques au niveau moléculaire, histologique, biochimique, métabolique, comportemental et de la connectivité cérébrale. Il s’agit également de comprendre quels sont les effets de CYP46A1 sur la morphologie des astrocytes du striatum et leur transcriptome (ensemble des gènes exprimés par une cellule). Pour cela, les souris anesthésiées recevront des injections intracérébrales de vecteurs viraux dans le striatum ou un traitement pharmacologique oral qui mime les effets d’une surexpression de CYP46A1. Ces souris seront analysées par un panel d’approches précliniques (analyse des performances motrices et des altérations comportementales par des tests du comportement, de l’imagerie cérébrale non invasive sur souris anesthésiée, par résonance magnétique nucléaire pour identifier des altérations morphologiques et du métabolisme cérébral et enfin par des techniques d’analyses post-mortem variées).

Bénéfices attendus

Cette analyse préclinique va permettre de confirmer les effets bénéfiques d’une thérapie génique et pharmacologique sur les altérations comportementales typiques de la maladie de Huntington mais rarement étudiées dans les protocoles précliniques. De plus, l’analyse par une méthode non-invasive par imagerie cérébrale va permettre d’évaluer l’effet de ces approches thérapeutiques sur un ensemble de paramètres fonctionnels pertinents pour une future étude clinique. Enfin une meilleure compréhension du rôle des astrocytes, des partenaires essentiels aux neurones, permettra de mieux comprendre les effets intracérébraux de ces thérapies et d’affiner leur utilisation clinique.

Procédures

Certaines souris seront soumises à une injection unique intracérébrales sous anesthésie et analgésie pendant environ 30 min, puis à des tests comportementaux étalés sur plusieurs jours avec au moins 2 jours de repos entre chaque tests, qui visent à évaluer les capacités motrices, la sociabilité, la vocalisation, l’anxiété et l’anhédonie des souris. Chacun de ces tests durent moins de 30 min par souris, sauf la cage d’activité qui permet de suivre le comportement spontané de la souris dans une cage dédiée pendant 24h. Certaines souris auront aussi deux sessions d’imagerie cérébrale sous anesthésie (moins de 2h30/souris). Certaines souris recevront à des injections intracérébrales sous anesthésie et analgésie de 30 min, puis une injection retro-orbitaire 6 mois plus tard, sous anesthésie gazeuse, pendant 5 min. D’autres souris recevront des gavages en contention pendant 1 min, 3 fois par semaine pendant 4 mois. souris seront habituées à l’expérimentateur et à la contention avant de démarrer les gavages.

Impact sur les animaux

Très peu d’effets indésirables sont attendus sur les animaux utilisés dans ce protocole à part la douleur lors des chirurgies intracérébrales, le stress lié à la contention lors du gavage et à la manipulation lors des tests comportementaux.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées, pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.

Remplacement

Ce projet est basé sur des résultats obtenus in vitro qui ont mis en évidence les effets bénéfiques de la modulation du métabolisme du cholestérol dans le contexte de la maladie de Huntington. Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones et différentes cellules, dont les astrocytes. Ces interactions qui sont très probablement à la base des effets thérapeutiques ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles in vitro ou in silico, ce qui nécessite l’utilisation de modèles animaux. En particulier, il existe des souris transgéniques modèles de la maladie de Huntington qui ont la mutation génétique responsable de cette maladie et permettent d’étudier les neurones et les astrocytes dans leur environnement cérébral. Ces souris modèles ont également l’avantage de permettre d’évaluer des symptômes cliniques très importants de la maladie de Huntington : les altérations comportementales (ex. atteintes motrices, anxiété), les déficits métaboliques et les altérations des connections cérébrales, ainsi que leur potentielle restauration par nos stratégies thérapeutiques.

Réduction

Le projet prévoit au maximum 370 souris. Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux sera réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats. Plusieurs paramètres sont mesurés sur les mêmes souris. Par exemple, les mêmes souris auront une évaluation extensive de leur comportement ainsi qu’une analyse de plusieurs paramètres par imagerie et pour finir une analyse histologique complète du cerveau avec quantification d’une dizaine de paramètres/souris. Ceci permet d’exploiter au mieux les informations biologiques de chaque souris, et de réduire le nombre total d’animaux utilisés, selon le principe des 3R.

Raffinement

Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation, permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. La gestion de la douleur et de l’inconfort liée aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. L’habituation des souris à l’expérimentateur avant les sessions de tests comportementaux et l’habituation à la contention permet de réduire le stress des souris. Un soutien thermique sera mis en place lors des chirurgies et sessions d’imagerie.

Choix des espèces

Les souris modèles de la maladie de Huntington permettent d’étudier les cellules cérébrales (neurones, astrocytes…) in situ, dans un contexte génétique permettant le développement de la maladie de Huntington. Ces souris présentent des altérations moléculaires, cellulaires et comportementales caractéristiques de la maladie de Huntington. Les souris seront injectées à l’âge de 4 mois et seront analysées entre 7 et 12 mois en fonction du décours des symptômes analysés. La MH est une maladie qui se déclare chez l’adulte. Les souris seront injectées à l’âge de 4 mois et seront analysées entre 7 et 12 mois en fonction du décours des symptômes analysés.

411 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est génétiquement modifiée et suivie jusqu'au développement de lymphomes, une autre reçoit une injection de cellules de lymphome puis des anticorps, avant la mise à mort pour étudier le rôle du gène Jarid2. Le porteur indique que les lymphomes provoquent de gros ganglions et une augmentation de la rate et du foie, la mise à mort intervenant à la palpation d'une hépatosplénomégalie ou à 20 % de perte de poids. Il affirme que ce cancer exige un microenvironnement complet et que les modèles génétiques ne sont disponibles que chez la souris.

Objectifs

Il a été décrit ces dernières années une nouvelle entité de lymphome, à la fois chez la souris et chez l'homme, dont la cellule d'origine est un lymphocyte T non conventionnelle appelé lymphocyte NKT. Afin de comprendre les mécanismes impliqués dans ce cancer, des études du génome c'est à dire au niveau de l'ADN, ont été réalisées sur les lymphomes générés chez la souris et ont mis en évidence des altérations du gène Jarid2. Ce gène est particulièrement intéressant car son implication dans la biologie des lymphocytes NKT normaux a déjà été décrit. Ces résultats suggèrent que ce gène pourrait jouer un rôle essentiel dans les mécanismes à l'origine de ce cancer. L'objectif de ce projet est donc d'étudier chez la souris l'impact de l'invalidation du gène Jarid2 sur la survenue de ces cancers et d'identifier de potentielles voies thérapeutiques qui pourront être testées dans ces modèles de souris.

Bénéfices attendus

Les mécanismes moléculaires associés à ces lymphomes sont encore mal connus et la mise en évidence d'un gène responsable de ce cancer peut constituer une nouvelle approche thérapeutique pour des patients dont la survie à 5 ans ne dépasse actuellement pas 30% et pour lequel les solutions thérapeutiques sont mimines.

Procédures

Génération d'une nouvelle lignée par croisement de souris avec différentes modifications génétiques puis observation des souris afin de mettre en évidence le dévelopement de rares lymphomes. Injection unique de cellules de lymphome par voie intraveineuse après anesthésie (durée de quelques secondes). Injections répétées d'anticorps 1 jour sur deux pendant 2 semaines par voie intrapéritonéale (durée de quelques secondes).

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables seront associés au développement de tumeur et en particulier de lymphome qui se caractèrisent par des adénopathies (gros ganglions) ou des hépato-splénomégalie (grosse rate, gros foie). Cependant, les nuisances de ces souris seront modérées car les points limites mis en place permettront de mettre à mort la souris dès les premiers signes de souffrance. Suite aux transferts de lymphomes aux souris C57BL/6, celles-ci vont développer assez rapidement (de 30 à 60 jours post-transfert) des lymphomes NKT. Les nuisances seront alors modérées car les points limites mis en place permettront de mettre à mort la souris au premier signe de souffrance. L'injection des cellules de lymphomes préalablement congelées dans des souris receveuses syngéniques C57BL/6 n'entrainera qu'une nuisance légère. L'injection des anticorps bloquants anti-ICOS se fera sur animaux vigiles par voie intrapéritonéale et n'entrainera qu'une nuisance légère.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort soit parce qu'elles développent une pathologie soit en raison d'un vieillissement avancé. Pour les expériences de transfert de lymphome, toutes les souris seront mises à mort car elles auront toutes été transférées avec des cellules de lymphome NKT et développeront donc toutes une lymphome.

Remplacement

Les objectifs du projet ne peuvent pas être réalisés en faisant des expériences alternatives in vitro car le développement des lymphomes NKT nécessite la présence d’un microenvironnement qui joue un rôle clef dans le développement et le maintien du lymphome. Aussi les invalidations génétiques nécessaires à ce projet ne sont disponibles que chez la souris, justifiant le développement de ces modèles chez la souris.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation nous allons : 1- mutualiser au sein de l’équipe les ressources cellulaires post-mortem en congelant le maximum de cellules et de morceaux d'organes afin que ceux-ci soient exploités pour diverses études in vitro sur ces lymphomes et ainsi éviter l'utilisation itérative de souris. 2- effectuer une étude statistique descriptive qui déterminera les différences qualitatives et quantitatives entre les groupes des souris. Cela permettra d’éviter la répétition de l’expérience et de réduire au minimum l’utilisation des animaux.

Raffinement

Pour réduire au minimum la douleur associée aux lymphomes, des points limites prédictifs pour limiter les souffrances seront mise en place. La mise à mort sera pratiquée lorsque l'un des points limites suivants sera atteint : mise en évidence d'une hépatosplénomégalie par palpation de l'abdomen des souris, réduction de l’activité (prostration), poil hérissé et dos vouté. Dans le cadre des premiers travaux, la plupart des souris ne développeront pas de lymphome et un grand nombre d'entre elles vont entrer dans un processus de vieillissement avancé. Au delà de 15 mois, ces souris seront donc surveillées 3 fois par semaine avec prise de poids et prise de température. Dès qu'une perte de poids de 10% sera constatée, il sera ajouté de la gelée et des croquettes mouillées dans la cage. Si une perte de poids de 20% est constatée, la souris sera immédiatement mise à mort. Pour les souris ayant une température entre 34 et 36°C, placer les souris dans une enceinte chauffante pendant 48h. En dessous de 34°C, l’animal devra être mis à mort.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale de choix pour étudier l'impact de l'invalidation d'un gène sur le développement de lymphome. En effet, nous disposons chez cette espèce des souris pour lesquelles le gène Jarid2 a été invalidé. D'autre part, le modèle de lymphome étudié a été développé chez la souris p53KO et le croisement de ces souris p53KO avec les souris invalidées par Jarid2 permettra de comprendre le rôle de ce gène dans le développement de ce cancer. Les souris seront générées par croisement au sein de notre établissement utilisateur et seront suivis jusqu'à la mise à mort des souris lorsque les points limites seront atteints. Pour les expériences de transfert, les souris receveuses seront commandées à l'âge de 6 à 7 semaines et seront utilisées à l'âge de 8 à 12 semaines correspondant à l'âge adulte de ces souris. L'utilisation de souris adultes est justifiée par le besoin d'avoir des souris receveuses ayant un système immunitaire mature.

750 souris et 750 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un candidat médicament leur est administré par différentes voies, dont une injection dans le cerveau après chirurgie sous anesthésie, avec des prélèvements de sang, un isolement après opération et un jeûne de dix-huit à vingt heures. Le porteur indique s'attendre à des effets secondaires liés à la molécule testée et justifie la mise à mort par des prélèvements d'organes incompatibles avec la survie. Il affirme que l'animal est un "passage obligatoire" avant toute administration à l'humain et qu'aucune méthode de substitution n'est suffisante.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d'évaluer la tolérabilité de futurs candidats médicaments après leur administration chez le rongeur (rat et souris). Dans le cadre de développement de nouveaux candidats médicaments, une modification de la formulation, de la voie d'administration ou un ajustement de la dose thérapeutique peut amener à étudier les effets sur l'état général de l'animal ou les effets uniquement en local vis à vis du composé dans ces nouvelles conditions. Le projet consiste donc à évaluer sur un petit groupe d'animaux ces effets avant de continuer sur une étude avec un nombre plus grand d'animaux. Après administration du composé, une observation régulière des animaux sera réalisée grâce à un outil de surveillance spécifique (par exemple observations du comportement, des réflexes, de la température) à chaque espèce utilisée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Suivant la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire.

Procédures

Afin d'administrer les candidats médicament aux animaux, différentes voies d'administration pourront être utilisées (2 minutes ou moins). Pour réaliser l'administration du produit dans le cerveau, les animaux pourront être soumis à une anesthésie et une chirurgie sous anesthésie (45 minutes), des administrations d'anti-douleur (jusqu'à 5 administrations, moins de 30 secondes pour chaque administration), des prélèvements de sang sur animaux vigiles (2 minutes) ou anesthésiés (environ 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une injection du candidat médicament par différentes voies d'administration. Les animaux seront anesthésiés pour réaliser l'injection des candidats médicaments dans le cerveau et ils recevront jusqu'à 5 injections d'anti-douleur. Selon le mécanisme d'action de la/des substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet, on s'attend à observer des effets secondaires qui disparaitront une fois que la substance sera éliminée par l'organisme. Egalement, les animaux pourront être isolés dès après la chirurgie, jusqu'à la fin de l'étude pour les souris, et jusqu'à la cicatrisation avancée des plaies pour les rats. Les animaux pourront également être mis à jeun pour une période de 18-20h avec complémentation en glucose ou non.

Devenir

Sacrifice des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l'organisme. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat et la souris sont les espèces qui sont la plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Une analyse statistique pourra éventuellement être envisagée et sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuels signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont parmi les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer la tolérabilité d'un candidat médicament. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.