Souris
Régénération de cellules productrices d’insuline chez la souris à partir des cellules gastrointestinales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Rendues diabétiques par la streptozotocine, ces souris immunodéficientes subissent une à deux chirurgies de greffe d'organoïdes intestinaux, des injections répétées et des prélèvements de sang pour suivre la glycémie, avant la mise à mort pour examiner les greffons. Le porteur indique un risque d'infection et de détresse après chirurgie et une hyperglycémie pouvant être mortelle si elle est trop élevée. Il affirme que le diabète s'exprime à l'échelle de l'"organisme" entier et que son étude sur l'animal "ne peut être remplacée".
Objectifs
Le pancréas joue un rôle clé dans l'homéostasie nutritionnelle. Il contient des cellules exocrines et endocrines (îlots de Langerhans). Ces îlots se composent majoritairement de cellules α et β synthétisant respectivement les hormones glucagon et insuline, responsables de la régulation de la glycémie. Notre recherche se concentre sur le diabète de type 1, une maladie caractérisée par la perte sélective des cellules β. Sans traitement, cette condition peut avoir de graves complications telles que des dommages vasculaires. Le seul traitement efficace est la supplémentation en insuline exogène. Cependant des facteurs environnementaux peuvent provoquer de fortes variations de la glycémie malgré un traitement à l’insuline, et donc éventuellement conduire aux complications mentionnées. Nos travaux s’intéressent à la régénération des cellules β. Nous avons montré que la surexpression du gène Pax4 dans les cellules α résulte en leur régénération et conversion en cellules « β-like », capables de « soigner » un diabète chez la souris. Il est intéressant de noter qu'une telle conversion est aussi visible dans le tractus gastrointestinal (TGI). Cependant, il est difficile de savoir si les effets observés sur la glycémie sont causés par la contribution du TGI ou pancréatique. Pour solutionner ce problème, nous proposons de réaliser des expériences de transplantation (et transplantectomie) d’organoïdes gastrointestinaux dans un modèle murin diabétique afin d’étudier spécifiquement la fonctionnalité des cellules « β-like » gastrointestinales. Les organoïdes sont des micro-tissus multicellulaires en trois dimensions, dérivés de cellules souches et conçus pour imiter la structure et la fonctionnalité des organes. Nous utiliserons 144 souris pour l’ensemble de ce projet en accordant une attention particulière à l’application stricte de la règle des 3R : Remplacement : Le diabète résulte de l’intégration de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée. Réduction : Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’application de tests statistiques (G power) nous a permis de réduire le nombre d’animaux au minimum. Raffinement : Nous utiliserons une grille de score permettant de mesurer les éventuelles souffrances avec des points limites précoces et adaptés. Des dispositions (habituation) sont prises pour minimiser tout stress aux animaux, ceux-ci étant hébergés dans un environnement enrichi et en groupes sociaux.
Bénéfices attendus
Le but de ces travaux est de démontrer in-vivo la fonctionnalité des cellules « β-like » gastrointestinales et de mettre en lumière le potentiel des cellules endocrines du tractus gastrointestinal à constituer une source renouvelable de cellules β après reprogrammation pour restaurer la masse des cellules β chez les patients diabétiques de type 1.
Procédures
Des transplantations/transplantectomies d’organoïdes gastrointestinaux sont prévues (durée de l’intervention : ~20 min/animal, 1 ou 2 interventions espacées de 10 semaines, en fonction du groupe), nécessitant une mise à jeun de 5 heures avant la chirurgie et une anesthésie (durée totale de l’anesthésie : 30 min, 1 ou 2 interventions espacées de 10 semaines, en fonction du groupe). Les animaux recevront des injections quotidiennes (3 jours/semaine pendant 9 semaines, durée de l’intervention : ~5 s). Des prélèvements sont prévus pour suivre la glycémie des animaux (1 fois par semaine pendant 10 semaines, 1 goutte de sang, durée du prélèvement : ~10 s). En fin d'expérience, il sera réalisé un test nécessitant une mise à jeun de 5 heures puis une injection d’un produit augmentant transitoirement la glycémie (durée de l’intervention : ~5 s) suivie de 6 prélèvements d’une très faible quantité de sang à la queue (classiquement, l'expérimentateur fait perler le sang et 6 "perles" sont ainsi utilisées pour lectures de glycémie, durée d'un prélèvement : 10 s) à des intervalles de temps de plus en plus longs (entre 15 et 120 min).
Impact sur les animaux
Des transplantations/transplantectomies d’organoïdes gastrointestinaux sont prévues. Les animaux peuvent éventuellement développer une infection ou montrer des signes de douleur ou de détresse à la suite de la chirurgie. Le traitement à la streptozotocine va entrainer une hyperglycémie (qui peut s’avérer létale si elle est trop élevée). Pour ce projet, les animaux vont développer un diabète très modéré (hyperglycémie ne dépassant pas les 350 mg/dL). Concernant le traitement au tamoxifène, aucune douleur n’est escomptée. Cependant un léger gonflement des testicules peut être observer à forte dose. Cet effet indésirable, qui plus est indolore, n’altère en rien la fertilité et le comportement des animaux. Enfin, des prélèvements et injections sont prévus, et peuvent éventuellement être source de désagréments pour les animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour examen post-mortem des organes et des greffons en particulier.
Remplacement
Le diabète est une maladie d’origine multifactorielle (y compris environnementale). De plus, cette pathologie s’exprime à l’échelle d’un organisme et fait donc intervenir tous les organes susceptibles de stocker ou consommer du glucose (la plupart des organes). Ainsi, son apparition et sa gravité résultent de l’intégration de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée. De plus, nos résultats préliminaires obtenus ex-vivo sur des organoïdes gastrointestinaux sont très encourageants et justifient le développement de la partie in-vivo de ce projet.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’application de tests statistiques (G power sur des lots d'animaux précédant - puissance : 0,8 - p
Raffinement
Un anesthésique (isoflurane, 2L/min avec 2% O2) sera utilisé pour réduire le stress et angoisse chez l'animal et pour rendre l'anesthésie plus stable. Avant l'anesthésie, un analgésique (méloxicam, 2 mg/kg) sera administré afin de prévenir les sensations de douleur pendant et après la chirurgie. Durant toute la procédure, les animaux seront suivis en s’appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer et d’objectiver les éventuelles souffrances, et de mettre en œuvre des points limites précoces et adaptés. La bonne santé ou la souffrance des animaux seront observées selon des grilles d'évaluations indiquées ci-dessous et en annexe. En amont de chaque procédure, des dispositions (habituation) sont prises pour minimiser tout stress aux animaux. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi (maisonnettes, buchettes), en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
Ce projet a pour but de déterminer la fonctionnalité des cellules « β-like » gastrointestinales induites par l’expression du gène Pax4 dans un système biologique intégré. La souris correspond au meilleur compromis pour suivre sur le long terme le devenir de organoïdes transplantés. En effet, la souris est très proche de l’homme pour ce qui est des mécanismes de régulation de la glycémie/du nombre de cellules β. Nous utiliserons des animaux immunodéficients NSG âgés de 10 et 20 semaines. Des âges correspondant au stade adulte, un stade sélectionné comme le meilleur compromis. En effet, les souris sont alors considérées comme adultes et ne sont plus soumises aux conséquences métaboliques du sevrage. Elles sont donc obtenues rapidement et ne sont pas considérées comme trop âgées. De plus, nous avons choisi de travailler sur deux âges différents afin de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter la régénération des cellules gastrointestinales.
Modification spécifique du microbiote intestinal pour lutter contre l’inflammation du myocarde
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
4 307 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère. Elles reçoivent par gavage des bactéries intestinales et des injections de cellules immunitaires, avec des prélèvements répétés de sang et de fèces, pour tester une technique visant à bloquer un mimétisme moléculaire lié à une myocardite. Le porteur indique que le modèle de myocardite devient progressivement mortel et que, sur vingt semaines, jusqu'à la moitié des souris succomberaient ou seraient mises à mort, période qu'il prévoit de ramener à douze semaines. Il affirme que la complexité du microbiote et du système immunitaire ne peut être reproduite in vitro et qu'un modèle murin est "nécessaire".
Objectifs
Les maladies auto-immunes sont des maladies chroniques déclenchées par la perte de tolérance immunologique de l’organisme face à ses propres constituants. Dans leur grande majorité, ces dysfonctionnements du système immunitaire sont multifactoriels, compliquant de fait la détermination de l’origine exacte. Différents facteurs, tels que les facteurs génétiques, endogènes, exogènes et/ou environnementaux peuvent ainsi conduire ce dernier à s’attaquer aux constituants du soi. Notre susceptibilité à développer des maladies auto-immunes découlerait de l’exposition de notre système immunitaire aux micro-organismes viraux ou bactériens. L’une des théories est celle du mimétisme moléculaire. Celle-ci repose sur l’idée que les antigènes exposés par des micro-organismes puissent présenter des similitudes structurelles avec les antigènes du soi, ce qui induirait une réaction immunitaire chronique. Dans ce projet, nous nous intéressons au mimétisme moléculaire impliqué chez certains patients souffrant d’une myocardite inflammatoire. Une étude récente a démontré l’existence d’un mimétisme moléculaire entre un peptide de la myosine et celui d’une bactérie commensale du tractus gastro intestinal. Ce mimétisme peut causer ou aggraver la situation chez les patients souffrant de myocardite. Cette bactérie est une bactérie commensale retrouvée chez environ 80% de la population mondiale. Cette bactérie occupe de nombreuses fonctions indispensables pour notre santé, telle que l’absorption des fibres non digestibles de l’alimentation. Dans ce projet, nous avons pour ambition de développer une technologie nous permettant d’inhiber le mimétisme moléculaire de notre bactérie d’intérêt sans pour autant altérer sa présence dans l’intestin. En effet, au contraire des antibiotiques, notre technologie nous permettra de soulager les patients souffrant de myocardite sans pour autant impacter l’intégrité du microbiote intestinal. La réussite de ce projet ouvrira de nombreuses portes dans le développement thérapeutique de demain avec notamment le développement de traitements spécifiques contre toutes les pathologies auto-immunes déclenchées ou aggravées par ce phénomène de mimétisme bactérien.
Bénéfices attendus
Le mimétisme bactérien fait l’état d’une attention toute particulière ces dernières années. En effet, de nombreux laboratoires se sont lancés dans la compréhension des intéractions entre les maladies auto-immunes et le mimétisme bactérien de résidents du microbiote intestinal, afin de cibler spécifiquement cette communication dynamique pour le développement de nouvelle stratégie thérapeutique. Dans notre étude, nous nous intéressons au mimétisme moléculaire d’une espèce commensale du microbiote intestinal, présente chez environ 80% de la population humaine mondiale et qui pourrait avoir un impact important sur le développement et l’aggravation de la myocardite inflammatoire. À notre connaissance, aucun traitement efficace n’a été développé pour soigner ces patients. Ce projet servira non seulement à démontrer la puissance et la spécificité des stratégies développées dans un environnement aussi complexe que l’intestin de mammifère, mais permettra également de mieux appréhender les intéractions entre les bactéries de l’espèce B. theta et le système immunitaire de l'hôte. Par ailleurs, nous développerons un modèle de transfert de matériel fécal humain chez la souris. Notre étude permettra également d’en apprendre plus sur ce nouveau modèle au vu d’un développement futur. En effet, ce modèle murin à flore humanisée correspond aux conditions les plus proches de celles retrouvées chez l’Homme. Pour finir, le bénéfice ultime de ce projet concerne les patients souffrant de myocardite inflammatoire. A l'issue des 5 ans d’expérimentation, nous espérons acquérir des connaissances solides sur le développement d’une stratégie de traitement efficace pour lutter contre la survenue et l’évolution de cette maladie en forme grave. Cette preuve de principe ouvrira le chemin à de nombreuses applications de traitement contre d‘autres maladies auto-immunes liées au mimétisme bactérien.
Procédures
Dans ce protocole, les animaux recevront un gavage oral de quelques secondes avec des souches bactériennes. Celui-ci sera effectué à l’aide d’une canule souple adaptée à une utilisation chez la souris par un manipulateur expérimenté à cette technique. Des prélèvements de sang de quelques secondes seront effectués sur certains animaux de ce protocole à la fréquence d’une fois par mois pendant 3 mois. Des prélèvements de fèces seront également réalisés de façon non invasive sur nos animaux durant toute la durée des procédures de ce protocole (maximum 5 fois par semaine pendant 1 mois, puis 1 fois par semaine pendant 2 mois). L’injection intraveineuse de cellules immunitaires sera effectuée une fois dans la vie de certains animaux, pendant quelques secondes. L’ensemble de ces gestes seront effectués par des manipulateurs expérimentés à ces techniques.
Impact sur les animaux
Nos souches bactériennes d’intérêt ne sont pas des pathogènes murins et ne devraient déclencher aucun symptôme à elles seules dans le modèle d’intérêt. Un léger stress est attendu lors du gavage des animaux, mais la présence de praticiens expérimentés réduira ce stress au minimum. Les souris génétiquement modifiées d’intérêt vont-elles développer des symptômes d'inflammation après injection des cellules immunitaires reconnaissant la bactérie d’intérêt. Aucun symptôme n’est attendu en l’absence de cette bactérie. D’après la littérature, l’inflammation attendue se limitera à une augmentation des cytokines inflammatoires dans le sang, et une infiltration de cellules immunitaires sans avoir d’atteintes physiques sur les animaux. Enfin, le modèle de myocardite inflammatoire devrait entrainer une activation de ces cellules immunitaires et une inflammation chronique, en particulier au niveau du cœur. Après 6-8 semaines de colonisation, ce phénotype devient progressivement létal; après 20 semaines de colonisation, jusqu’à 50% des animaux succomberont ou seront mis à morts (données issues de la littérature). Nous prévoyons de réduire la période d’observation à 12 semaines, ce qui est le minimum requis pour obtenir des données exploitables. Dans tous les cas, ces souris seront surveillées de très près, et les points limites décrits dans les procédures correspondantes seront appliqués.
Devenir
Tous les animaux étant soit génétiquement modifiés soit colonisés par une bactérie (ou les deux), ils seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Dans un but de remplacement, une partie de notre étude se base sur des expériences préliminaires avec des cellules immunitaires en culture que l’on a stimulées en présence de différents peptides candidats pour être ‘non immunogènes'. Cependant, les résultats obtenus avec des cellules isolées ne sont pas représentatifs de la complexité du système immunitaire et des interactions qui peuvent avoir lieu dans un milieu structuré tel qu'un organisme vivant. De plus, les interactions entre membres du microbiote intestinal ne peuvent pas être totalement reproduites in vitro; or ces interactions sont primordiales pour évaluer l’efficacité de nos approches thérapeutiques, qui doivent pouvoir atteindre les bactéries cibles dans un contexte anatomique précis (survie des traitements dans le tractus gastro-intestinal, bactéries dans le lumen vs mucus du côlon, etc).
Réduction
Afin de réduire autant que possible le nombre d'animaux utilisés, une même expérience pourra être mise en place de manière à pouvoir répondre à plus d'une question scientifique en utilisant un même lot d’animaux. En amont de la phase d'expérimentation animale, nous avons comparé une collection de peptides candidats pour leur capacité à ne pas déclencher une activité dans des lymphocytes T répondants . Basés sur cette expérience, nous avons pré-sélectionné les meilleurs candidats pour ne pas avoir à comparer un trop grand nombre de peptides chez l’animal. De plus, nous allons vérifier la colonisation bactérienne dans l’intestin des animaux au cours de l’expérience à partir du matériel fécal; ce type de stratégie non invasive, que nous avons déjà mis en place dans le passé, nous permettra de réduire le nombre d’animaux à sacrifier sans perte de connaissance essentielle pour le développement et l'interprétation de nos expérimentations. En outre, pour investiguer la réduction de symptômes après traitement, nous avons choisi un modèle qui présente une très haute pénétrance dans le développement de la pathologie, afin d’optimiserle condtions expérimentales en réduisant le nombre d’animaux utilisés. L’utilisation de tests statistiques (t-test, Mann Whitney et ANOVA), et la consultation au besoin de biostatisticiens tout au long des séries d’expérimentation nous permettra de réduire au maximum le nombre d’animaux à utiliser tout en garantissant la qualité et la reproductibilité des résultats.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, les animaux ne seront jamais laissés seuls dans une cage pour faciliter les intéractions sociales. Les souris seront manipulées avant le début des expériences afin de les habituer et leur enlever un maximum de stress en début d’expérimentation. Les modèles animaux sont choisis avec soin en fonction de l’état actuel des connaissances ainsi que la finalité recherchée. Les procédures sélectionnées ont été préalablement étudiées pour réduire au maximum la souffrance animale. Ainsi, nous donnons une préférence aux procédures non invasives. Certaines mises seront effectuées autant que possible sur des animaux/modèles ne présentant pas de symptômes de pathologie, afin de minimiser le nombre d’animaux concernés par une procédure sévère. Les points limites établis préalablement seront bien évidemment respectés, et raffinés en fonction des résultats des premières expériences. Des tests statistiques seront utilisés tout au long du projet pour réajuster le nombre d’animaux en fonction des résultats obtenus. Dans le but de vérifier le niveau d’anxiété des animaux axéniques inoculés avec un microbiote, nous réaliserons un contrôle des expressions faciales. Aussi, dans le cadre de la seule procédure sévère de ce protocole, les animaux souffrant de déshydratation recevront une injection sous-cutanée d’une solution saline à 37°C.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous effectuerons au préalable des tests d’activités in vitro en conditions reflétant au maximum la réponse immunitaire des cellules T aux peptides candidats afin de sélectionner uniquement les meilleurs pour nos expériences chez l’animal. Cependant, un modèle qui mime les symptômes et qui nous permettra de quantifier l'efficacité de notre traitement est nécessaire; un tel modèle n’existe à notre connaissance que chez la souris, où il a déjà été développé par un chercheur expert de ce champ de recherche. De plus, il existe une version de ce modèle avec des symptômes beaucoup moins sévères, également en souris, ce qui nous permettra de répondre à de nombreuses questions scientifiques avant l’utilisation du modèle le plus symptomatique en fin de projet. Nous utiliserons dans ce projet des animaux jeunes adultes, entre 5 et 9 semaines, afin de laisser la flore intestinale se stabiliser post-sevrage avant notre intervention.
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 150
300 rongeurs, 150 souris et 150 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés d'une séance à l'autre. Les animaux sont utilisés lors de travaux pratiques où des stagiaires apprennent la préhension, la contention, les injections sous-cutanées et intra-gastriques et la surveillance sous anesthésie gazeuse. Le porteur indique une douleur légère liée aux injections et un stress de manipulation, les gestes étant d'abord répétés sur mannequins et cadavres. Il présente cette formation réglementaire à l'expérimentation comme "indispensable" et met en avant la sensibilisation au "bien-être" des animaux non-humains.
Objectifs
Notre formation a pour vocation à former des personnels à la manipulation et la réalisation de procédures expérimentales sur animaux de laboratoire. Cette formation est ouverte aux techniciens des laboratoires publics et privés dans le cadre de la formation continue, ainsi qu’à des étudiants en cursus initial de licence professionnelle. Ce type de formation réglementaire à l’expérimentation animale doit permettre l’acquisition de compétences théoriques et pratiques permettant la manipulation d’animaux dans le respect de leur bien-être. Au cours d’une procédure, le technicien doit ainsi être en mesure d’évaluer le degré de mal-être causé à l’animal et d'adapter ses pratiques afin de prévenir et de limiter ce mal-être au maximum. Cela nécessite un apprentissage, réalisé durant plusieurs séances de travaux pratiques. Les objectifs pédagogiques de ces travaux pratiques sont multiples : familiarisation des stagiaires avec les animaux et sensibilisation au respect du bien-être animal ; apprentissage des règles d’hygiène et de sécurité propres à la pratique de l’expérimentation animale ; apprentissage des calculs de dilution et de dose à injecter, connaissance du matériel nécessaire aux injections et aux prélèvements, préparation de ce matériel, notions d’asepsie ; acquisition des compétences techniques de préhension, contention et d'injections (sous-cutanée, intra-gastrique) ; acquisition de connaissances théoriques sur l’anesthésie et apprentissage des paramètres à prendre en compte et à surveiller pour assurer le confort de l’animal sous anesthésie ; acquisition de connaissance sur les cycles de reproduction et les méthodes d'élevage des rongeurs et lagomorphes. Pour répondre à ces objectifs, les travaux pratiques que nous souhaitons réaliser permettent une familiarisation progressive des techniciens avec les rongeurs de laboratoire. Ils sont réalisés en effectif réduit, sous la tutelle d’enseignants qualifiés et expérimentés portant grande attention au bien-être animal. Des enseignements plus théoriques de réglementation et d’éthique, d’éthologie, de physiologie du stress et de la douleur viennent compléter ces connaissances afin que les étudiants soient en mesure d’adapter leur pratique au comportement de l’animal qu’ils manipulent.
Bénéfices attendus
A l’issue de notre formation, il est attendu que les stagiaires se soient familiarisés avec les rongeurs de laboratoire (souris et rats), et qu’ils aient acquis des gestes techniques couramment utilisés en expérimentation animale (préhension/contention, injections, surveillance et soins pendant l'anesthésie). Nous souhaitons avant tout les sensibiliser au bien-être animal et à l’importance de l’éthique en expérimentation animale.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions. La première consistera uniquement à de la préhension-contention, et les stagiaires se seront préalablement entraînés sur des mannequins rats. Pour ce faire, chaque animal sera manipulé par un stagiaire quelques minutes, pour familiarisation, puis redéposé dans sa cage. Après un temps de pause, l’animal sera à nouveau manipulé, cette fois dans le but d’acquérir la technique de contention. Cette nouvelle manipulation pourra durer plus longtemps que la première, mais sans toutefois excéder 10 min, dans l’éventualité où le stagiaire éprouverait des difficultés à réaliser le geste correctement dès le premier essai. La seconde intervention impliquera jusqu’à deux types d’injection : sous-cutanée et intra-gastrique. Chaque injection ne sera réalisée que si la contention de l’animal est maîtrisée, et sous supervision par l’enseignant. Seule l’injection sous-cutanée sera obligatoire. Les stagiaires s’entraineront une première fois sur cadavre (lors de la séance de TP anatomie), puis pratiqueront le geste sur l’animal une première fois avec une seringue sans aiguille, avant de réaliser l’injection. L’injection intra-gastrique sera facultative, en fonction des attentes et des besoins de formation des stagiaires. Les stagiaires s’entraîneront préalablement sur des mannequins rats. Dans les deux cas, la réalisation de la procédure (contention suivie de l’injection) ne devra pas dépasser 1 min. Enfin, un nombre très limité d’animaux subira une anesthésie gazeuse, qui constituera la troisième intervention. L’induction de l’anesthésie sera réalisée par l’enseignant et les stagiaires seront chargés de surveiller l’animal et de tester ses réflexes pendant la narcose (sous la supervision de l’enseignant). L’anesthésie gazeuse ne sera pas maintenue au-delà du temps nécessaire pour que chaque stagiaire puisse réaliser les contrôles, et sera limitée à 20 min maximum. Chaque animal ne sera soumis qu’une seule fois à chacune des interventions, à l’exception de la contention dont l’apprentissage pourra nécessiter que certains stagiaires réalisent plusieurs tentatives avant de maîtriser la technique.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures appliquées lors des séances de TP sont de degré de sévérité modéré. Pour chaque procédure, il est prévu que l’enseignant en explique le principe et les étapes, puis qu’il réalise une démonstration avant que les stagiaires s’y exercent, toujours sous sa surveillance. Il n’est donc pas attendu que les animaux souffrent au-delà du stress induit par la manipulation et de la douleur légère liée à une injection. Si un accident venait toutefois à se produire, lors d’une mauvaise manipulation par un stagiaire malhabile et/ou stressé par exemple, l’enseignant veillera au bien-être immédiat de l’animal et les zootechniciens le prendront en charge. Ils surveilleront quotidiennement les animaux à l’animalerie, via l’emploi d’une grille d’évaluation du bien-être, et un traitement antalgique sera administré si besoin.
Devenir
Les procédures réalisées étant de sévérité modérée, les animaux peuvent être réutilisés au sein de ce même projet d'une séance de TP à l'autre (TP préhensions/contention, puis injections, puis anesthésie), après rétablissement complet (délai de quelques jours entre les séances de TP), ou pour d’autres projets se déroulant au sein de notre établissement (TP d'apprentissage de préhension/contention et d’injections, TP de physiologie-pharmacologie), après vérification de leur rétablissement complet si jamais ils avaient présenté des signes de souffrance.
Remplacement
Le recours à la pratique de l’expérimentation animale est nécessaire à la formation des personnes qui appliqueront des procédures expérimentales sur animaux, et conforme à l’agrément de cette formation réglementaire. Il apparaît indispensable que les stagiaires se familiarisent avec les animaux et qu'ils maîtrisent des gestes techniques classiquement utilisés lors de procédures expérimentales. Toutefois, les stagiaires commenceront par s’entraîner aux gestes techniques sur des modèles inertes (cadavres et/ou mannequins), afin de remplacer l’animal au stade le plus critique de l’apprentissage.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est limité au strict nécessaire, à savoir un animal de chacune des deux espèces considérées (c'est-à-dire un rat et une souris) par stagiaire et par séance, afin que les stagiaires soient en mesure de s'entraîner et d'acquérir les gestes techniques dispensés au cours des séances de TP de la formation. Cependant, les mêmes animaux seront réutilisés d'une séance à l'autre, afin de limiter le nombre total d'animaux utilisés. De plus, chaque animal ne sera soumis qu’une seule fois à chacune des procédures (à l’exception de la contention), et le nombre de procédures est très limité (certains actes ne sont abordés que par des vidéos de démonstration).
Raffinement
Le respect du bien-être animal est au cœur de l'approche pédagogique employée pendant les séances de TP, et les encadrants veillent à enseigner les bonnes pratiques pour la réalisation des gestes techniques dans un cadre éthique et réglementaire. Avant de pratiquer les procédures sur les animaux, les stagiaires doivent s’entrainer en répétant les gestes sur des mannequins (contention, injection intra-gastrique) ou des cadavres (injection sous-cutanée). Dans le cadre des injections, ils doivent également réaliser le geste une première fois sans aiguille ou sans sonde, avant de procéder à l’injection. Enfin, dans le cadre de l’anesthésie, le bien-être de l’animal est assuré par l’application d’un gel hydratant sur les yeux et l’utilisation d’un tapis chauffant pour prévenir l’hypothermie.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux de laboratoire les plus utilisés. La souris et le rat représentent ainsi les modèles animaux que les stagiaires seront le plus susceptibles de rencontrer dans leurs activités professionnelles. Nous utiliserons des adultes de plus de 6 semaines, plus faciles à manipuler que de jeunes animaux. Pour les rats, nous utiliserons des femelles afin de permettre la réalisation de frottis vaginaux lors de la 3ème séance de TP. Pour les souris, nous utiliserons également des femelles, plus dociles que les mâles.
Evaluation chez le rongeur, de la dose maximale tolérée (MTD) de composés biologiques ou chimiques d’intérêt.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 12500
Hamsters dorés : 500
Gerbilles de Mongolie : 200
25 700 rongeurs, souris, rats, hamsters dorés et gerbilles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, une partie réutilisée, 20 gerbilles placées et la grande majorité tuée. Ils reçoivent des composés chimiques ou biologiques par toutes les voies possibles, jusqu'à des administrations intracérébrales et par minipompe implantée, sur une période pouvant aller jusqu'à un an, pour déterminer la dose maximale tolérée. Le porteur décrit perte de poids, posture voûtée, cyanose et détérioration de l'état général, avec mise à mort dès 20 % de perte de poids ou lorsque 20 % des animaux d'un groupe ont dû être euthanasiés. Il affirme que les données in vitro sont "souvent insuffisantes" pour prédire la toxicité réelle et que la vérification chez le rongeur reste nécessaire.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérance des animaux pour un composé biologique ou chimique après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Ce projet permettra d’identifier la dose maximale aprés une ou plusieurs administrations qui n’engendre pas d’effet toxique chez les animaux (tolérance, Maximum Tolerated Dose, MTD).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer toxicité et la tolérabilité in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 1 an . Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.
Procédures
Afin d’évaluer la tolérabilité de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon); ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 1 an. Des effets secondaires des traitements (toxicité) pourront être observés et une grille de scoring et des points limites adaptés à l’objectif de l’étude ont été mis en place. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés.. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement (max une heure). En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Les animaux ayant subi une administration unique de produit n’ayant pas présenté d’effets secondaires ou de signes cliniques et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine pourront être gardés en vies sur avis du vétérinaire.
Impact sur les animaux
Lors de l’injection pour la première fois d’un composé les effets sur l’animal peuvent être : une perte de poids, un aspect corporel détérioré, une distension abdominale, une posture courbée, la texture de la fourrure altérée, une couleur des oreilles et des pattes plus pâles ou cyanosées, des expressions faciales de douleur, une respiration et des habitudes naturelles détériorées ; critères d’observation avancés : comportement provoqué anormal, déshydratation, diarrhée, hypothermie… Pour certaines administrations intravésicales, il pourra être nécessaire de priver les animaux d’eau au maximum 4h, cela pourra engendrer une sensation de soif. Dans le cas d’administrations par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille. Dans le cas d’intervention chirurgicale (pose de minipompe, implant, stéréotaxie etc), une douleur modérée transitoire pourrait être générée mais sera gérée par un traitement antalgique adéquat.
Devenir
Après chacune des deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques dont la toxicité et la tolérabilité seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (toxicité et efficacité cellulaire) afin d’éviter l’administration des composés présentant un mauvais index thérapeutique. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire les effets in vivo des molécules. La toxicité et la tolérabilité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.
Réduction
Dans la mesure du possible, afin de limiter le nombre d’animaux inclus dans une étude, le même animal recevra des doses croissantes du même composé (au minimum 72h d’élimination entre deux doses) plutôt que d’avoir recours à des animaux différents pour chaque dose. Dans le cas de recherche de toxicité aigüe avec différents groupes pour les différentes doses, dans la mesure du possible, le premier traitement des différents groupes sera décalé d’au minimum 24h, avec un lancement initialement du groupe recevant la plus faible dose. Ainsi l’administration n’aura pas lieu pour les groupes qui auraient dû recevoir une dose supérieure à celle du premier groupe dans lequel des effets secondaires seront observés. En pratique, si 20% c ou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite, le traitement à cette dose et à toute dose supérieure sera stoppé et il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure. Sur la base des expériences passées dans notre centre, le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure a été déterminé : 3 à 5 animaux par groupe seront utilisés. Ce nombre pourra augmenter jusqu’à 10 si nécessaire pour obtenir une puissance statistique différente, compte tenu des analyses ex-vivo prévues et de leur variabilité. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux par groupe. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Les analyses statistiques à réaliser sur les autres paramètres mesurés en cours d’étude seront effectuées au moyen du test ANOVA.
Raffinement
Une grille de scoring clinique a été mise en place (voir procédure). Les animaux seront pesés tous les jours dès l’administration de composés. Une perte de poids de plus de 20% constituera un point limite. Dans le contexte de première administration de composé non testé in vivo, les animaux sont scorés toutes les deux heures pendant les 6 premières heures post-administration. Un scoring clinique sera réalisé quotidiennement dès l’administration des composés. Si 20% iou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite, le traitement à cette dose et à toute dose supérieure sera stoppé et il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernaent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Dans le cas où l’administration de composé nécessite une chirurgie, une analgésie, un suivi adapté et des mesures post-chirurgicales sont mises en place pour prévenir la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la toxicité/tolérabilité des composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. Pour certaines études pré-réglementaires le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.
Analyse des effets de différents antalgiques à la suite de l’induction de blessure musculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une lésion musculaire est provoquée par injection d'une toxine dans la patte, puis leur activité est mesurée dans des roues pendant un isolement, avec des injections d'antalgiques, avant la mise à mort pour prélever le muscle. Le porteur présente le projet comme un raffinement visant à mieux évaluer la douleur d'un modèle de blessure musculaire par la mesure de l'activité motrice. Il affirme que ce raffinement d'un protocole in vivo rend l'expérimentation animale "indispensable".
Objectifs
Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Ce processus, habituellement efficace, peut être compromis dans certaines conditions (maladies métaboliques, vieillissement, myopathies). Le modèle standard de blessure musculaire est celui de l'injection d'une toxine dans la patte arrière de l'animal. Ce modèle est très courant et très standardisé. La lésion musculaire induit une douleur qui n'est pas quantifiable en analysant le comportement de l'animal. En vue de raffiner le protocole, l'étude vise à analyser l'effet de deux antalgiques sur l'activité motrice des animaux, indicative de la douleur, à la suite de l'induction de la lésion.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de définir le meilleur protocole pour raffiner le modèle expérimental. Il s'agit d'une part de valider l'impact de la blessure sur l'activité des animaux, d'analyse l'impact des analgésiques sur cette activité (les analyses seront réalisées en aveugle) et d'autre part de s'assurer que la prise d'antalgique n'impacte pas le processus de régénération musculaire.
Procédures
Les souris seront installés dans des cages individuelles équipées de roues d'activité pendant 24h. Les souris subiront des injections de faible volume en sous cutané (1 au maximum) et en intramusculaire (2 au maximum). La durée de ces injections est d'environ 10 secondes (contention totale 30 secondes).
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables modérés sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections intramusculaire, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress et une douleur modérés et de l'isolement des animaux pendant 48h, le temps de la mesure de leur activité physique avant et après la lésion.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en vue de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques et cellulaires.
Remplacement
L'analyse de la régénération musculaire peut être en partie étudiée in vitro. Cependant, la coordination des processus biologiques qui la régule ne peut se faire qu'in vivo. L'étude de composés favorisant la régénération musculaire ne peut se faire qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale. En outre, cette étude ayant pour but de raffiner un protocole expérimental in vivo, l'expérimentation animale est indispensable.
Réduction
L'expérience du laboratoire permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour les analyses. Le nombre de souris est diminué par deux car les deux pattes des animaux sont utilisées, sans que cela n'impacte la mobilité de l'animal.
Raffinement
L'étude vise à évaluer la meilleure prise en charge de la douleur à la suite d'une induction de lésion musculaire. Aucun comportement anormal n'est attendu dans ce protocole, les animaux reprenant une activité normale après l'induction de la lésion. L'évaluation de la douleur sera donc estimée par la mesure de l'activité physique des souris. Lors de l'induction de la lésion, des anesthésiques sont utilisés, et différents analgésiques seront comparés.
Choix des espèces
Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l’homme. Les animaux sont utilisés entre 6-8 semaines, à l'âge adulte.
Effet d’une stimulation non invasive sur l’insuffisance cardiaque
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une insuffisance cardiaque induite par délétion d'un gène, elles reçoivent des injections de tamoxifène, sont maintenues chaque jour dans un tube de contention pour une stimulation électromagnétique pendant trois à quatre semaines, puis subissent une échocardiographie sous anesthésie avant la mise à mort pour prélever le cœur. Le porteur indique un stress lié à la contention, atténué par une habituation préalable. Il présente cette stimulation non invasive comme une piste transposable à l'humain et affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la régulation cardiaque intégrée.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque est une pathologie sévère caractérisée par une incapacité du cœur à assurer sa fonction de pompe et à irriguer correctement les organes périphériques. Ainsi, une modification des propriétés contractiles et une altération de l'architecture cellulaire du muscle cardiaque conduisent à des phénomènes de remodelage cardiaque (hypertrophie/dilatation) aboutissant dans un deuxième temps à l'insuffisance cardiaque. Bien que la transplantation cardiaque demeure le seul traitement radical, la pénurie de donneurs et les complications d’une lourde immunosuppression en limitent nécessairement les indications. L’assistance ventriculaire mécanique reste principalement une solution temporaire dans l’attente d’une transplantation et la resynchronisation bi-ventriculaire ne s’adresse qu’à une catégorie ciblée de patients. Il y a donc un besoin réel d’options thérapeutiques nouvelles et c’est dans ce cadre que s'inscrit notre projet de stimulation électromagnétique répétée de basse intensité (LI-rMS) avec pour objectif premier d’améliorer la fonction cardiaque chroniquement défaillante. Ses principes reposent sur l’induction de manière non invasive et de manière focale des courants électriques dans des régions endommagées, et ceci en fonction de la fréquence et de la durée de la stimulation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en place et valider l'effet potentiellement bénéfique de la stimulation électromagnétique répétée de basse intensité (LI-rMS) avec pour objectif premier d’améliorer la fonction cardiaque chroniquement défaillante. A plus long terme nous pensons que cette stratégie serait transposable chez l'Homme.
Procédures
Les interventions sur les animaux seront: 1) 3 injections de tamoxifène (1 injection par jour) la durée de l'intervention est de 15 secondes par souris. 2 ) Stimulation éléctromagnétique (la durée de la stimulation est de 10 minutes quotidienne, pendant 21 ou 28 jours successives selon les groupes de souris avec une fréquence de 20Hz ou 40Hz. 3) Echocardiographie réalisé en dernière étape de la procédure sous anethésie (durée environ 30 minutes, 5 mesures).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables consistent en une réduction de la fonction cardiaque chez les souris suite à la délétion du gène étudié. La contention pour l'injection de tamoxifène et l'utilisation d'un tube à contention pour la stimulation éléctromagnétique pourrait générer du stress à l'animal, cependant le même expérimentateur sera chargé de l'acte et les souris seront préalablement habituées à la personne et le tube de contention.
Devenir
L'ensemble des animaux (n=180) sera euthanasié suite à cette procédure après la dernière étape d'echocardiographie, le tissu cardiaque sera prélevé pour des analyses morphologiques et moléculaires et ceci afin d'évaluer les effets potentiellement bénéfiques de la LI-rMS sur le coeur au niveau morphologique et moléculaire.
Remplacement
Seules des études sur les animaux permettent de savoir si l’inactivation ou la surexpression d’un gène ont un impact sur le remodelage et la fonction cardiaque. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle cellulaire in vitro qui puisse reproduire de manière intégrée la régulation physiologique et métabolique des paramètres cardiaques.
Réduction
L’utilisation du même matériel biologique pour 3 types d’analyse (morphologie, ARN et protéine) permet de diviser par trois le nombre de souris nécessaire. Le principe de réduction est appliqué par le calcul de puissance statistique de nos test basés sur des expériences de même type dans d’autres modèles de souris qui nous permettent de réduire à 15 souris par groupe, le nombre de souris utilisées. Ce projet nécessitera l’utilisation de 90 souris de la lignée SRF ainsi qu'un nombre équivalent en souris contrôle. Ainsi 180 souris sont prévues pour l'ensemble du projet.
Raffinement
Les souris seront maintenues en cages (5/cages) et suivies par un personnel compétent et le milieu sera enrichi avec des nids et des maisons en carton.La stimulation la stimulation électromagnétique de basse intensité (LI-rMS) sera précédée par une étape d'adaptation et d'habituation des souris au tube de contention afin de minimiser les phénomènes de stress. L’évolution du phénotype des souris sera surveillée par des personnes compétentes selon une grille de suivi qui sera mise en place. L'administration d’analgésique sera envisagée en cas de besoin. Enfin, la définition du point limite est clairement établie à partir d’un seuil d’insuffisance cardiaque observé qui déclenchera l’arrêt de l’expérience et l’euthanasie
Choix des espèces
La souris a été sélectionnée pour la possibilité de générer par recombinaison homologue ou transgénèse des modèles d’invalidation ou surexpression du gène. Les animaux utilisés auront entre 2 et 4mois d'âge (considéré comme l'âge où le coeur a fini sa croissance et represente les caractéristiques d'un coeur adulte) au début de la procédure. Les souris seront maintenues en cages (5/cages) et le milieu sera enrichi avec des nids et des maisons en carton.
Rôle du récepteur des glucocorticoïdes et de son co-régulateur Lsd1 dans l’atrophie musculaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent du tamoxifène puis des glucocorticoïdes par injection ou gavage, ou sont mises à jeun de 24 à 48 heures, pour étudier l'atrophie musculaire, avec des prélèvements de sang répétés à la queue. Le porteur indique une fonte musculaire pouvant atteindre 20 à 30 % du poids du muscle et affaiblir fortement les animaux, et précise ne prévoir ni anesthésie ni analgésique, l'anesthésie étant jugée plus "traumatisante" que les injections. Il affirme que l'étude de l'atrophie musculaire exige un "organisme entier" et que la souris est un modèle de référence.
Objectifs
Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) ont différents effets chez les mammifères, contribuant au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les agonistes synthétiques, par ex. la prednisone et la dexaméthasone (Dex) sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme, et certaines myopathies. Néanmoins, l'utilisation chronique de ces composés peut entraîner d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose, ou une atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont médiés par le récepteur des glucocorticoïdes (GR), un membre de la superfamille des récepteurs nucléaires. Dans le modèle classique, GR lié à une hormone est convoyé dans le noyau, où il se lie à ses éléments de réponse sur l'ADN de manière coopérative avec d'autres protéines appelées des corégulateurs. De plus en plus de preuves indiquent une spécificité tissulaire de ces corégulateurs. Lsd1 est un corégulateur qui interagit avec un autre membre des récepteurs nucléaires, le récepteur aux androgènes, dans les cellules cancéreuses de la prostate humaine. Nos données préliminaires montrent que Lsd1 interagit avec GR dans le muscle squelettique et que les niveaux de Lsd1 augmentent lors de la fonte musculaire induite par les glucocorticoïdes. De plus, les souris dépourvues de Lsd1 dans les myofibres ne parviennent pas à induire l’expression des gènes impliqués dans la protéolyse en réponse à la mise à jeun, ce qui indique que Lsd1 pourrait agir comme un coactivateur de GR pour favoriser le catabolisme musculaire. L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de Lsd1 dans les fibres musculaires adultes dans des conditions physiologiques et dans l'atrophie musculaire induite par les glucocorticoïdes soit par des traitements avec des composés analogues, soit par la mise à jeun.
Bénéfices attendus
Contrôler l'activité des GR en modulant celle des co-régulateurs tels que Lsd1 ouvrirait de nouvelles perspectives pour réduire les effets indésirables induits par les glucocorticoïdes.
Procédures
L'ensemble des animaux sera injecté au Tamoxifène par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous servira à étudier le rôle de Lsd1 dans le muscle sain subira ensuite une mesure de poids (30 sec/ souris), de glycémie (1 min/ souris), ainsi qu'un test de tolérance au glucose (IPGTT) et un test de tolérance à l’insuline (IPIST) (180 min au total / souris) par prélèvements sanguins au niveau de la veine caudale. Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle de Lsd1 dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 3 qui nous permettra de comprendre le rôle de Lsd1 dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 4 ne subira pas di'ntervention en dehors de l'injection au Tamoxifène mais sera mis à jeun de 24 à 48h.
Impact sur les animaux
L’injection de tamoxifène, de glucose, d'insuline et de dexaméthasone peut causer des infections. Le site d'injection sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. La mise à jeun sur 24 - 48h pourra fortement affaiblir les animaux. L'injection d'insuline pourra éventuellement provoquer une hypoglycémie. Le gavage peut conduire à des fausses routes. L'incision au niveau de la queue pour les mesures de glycémie n'est pas douloureuse mais peut entrainer un inconfort chez l'animal. La présence de sang dans la cage peut générer un comportement agressif et ses congénères. Les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de 20% du poids du muscle. Il en va de même avec la mise à jeun pour laquelle la fonte musculaire peut atteindre 30%, pouvant de ce fait impacter la mobilité des animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque PE pour des études moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes endogènes (mise à jeun) et synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence. En effet, l'histologie des muscles de la souris est similaire à celle de l'homme. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production de larges cohortes, contribuant à la production de résultats significatifs.
Réduction
De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.
Raffinement
Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, une euthanasie sera réalisée. Une seule injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur animal vigile car l'anesthésie serait plus "traumatisante" que les injections sur animaux non anesthésiés. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.
Choix des espèces
Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et son co-régulateur Lsd1 dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux seront donc injectés au tamoxifène entre 7 et 11 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection. Pour les études métaboliques, les animaux seront mis à mort à deux temps : (i) à 15 semaines, âge auquel le muscle utilise essentiellement des acides gras pour produire de l'énergie, (ii) à 30 semaines, âge auquel le muscle squelettique utilise principalement des sucres.
Etudes des mécanismes cellulaires et moléculaires de la mémoire associée au contexte de consommation d’alcool et cibler ces mécanismes avec la psilocybine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 802
320 souris et 802 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux sont entraînés à consommer de l'alcool pendant plusieurs semaines, reçoivent des injections répétées d'alcool, de lithium ou de psilocybine, une partie subissant une chirurgie cérébrale pour implanter des cannules ou injecter un vecteur viral, avant la mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur indique des douleurs post-chirurgicales et un isolement sans enrichissement pour certains animaux. Il affirme que l'addiction est un mécanisme trop complexe pour être remplacé par des méthodes in vitro ou in silico.
Objectifs
L'objectif principal de cette étude est d'étudier le rôle de la mémoire associée au contexte de la consommation d'alcool sur l'efficacité de la psilocybine à réduire la consommation d'alcool. Les objectifs secondaires seront d'étudier l'implication des récepteurs à la sérotonine et à la dopamine dans la réponse à la psilocybine en fonction des différents contextes de consommation d'alcool.
Bénéfices attendus
L'utilisation des psychédéliques dans le traitement de maladies psychiatriques est en plein renouveau depuis une petite dizaine d'années. Notre projet se place dans ce contexte et vise à mieux identifier les cibles moléculaires et les mécanismes cellulaires responsables de l'effet bénéfique de la psilocybine, un psychédélique issue de champignons, sur la réduction de la consommation d'alcool et sur la rechute après une période d'abstinence.
Procédures
Les souris seront soumises à des injections répétées (x 3) d'alcool ou de chlorure de lithium et une injection supplémentaire de psilocybine. Les rats recevront des injections de psilocybine et certains rats seront soumis à une chirurgie (30 minutes environ) visant soit à injecter un vecteur viral directement dans les structures cérébrales ciblées, soit à implanter des cannules d'enregistrement de l'activité dopaminergique. Les animaux seront également entrainés à consommer de l'alcool volontairement sur une période de 8 semaines à 4 mois.
Impact sur les animaux
Au cours des différentes expériences, les animaux ne subiront que des nuisances légères (injections uniques) ou modérées de courte durée (injections répétées - douleurs post-chirurgicales de palier 1-2). Les animaux consommeront volontairement de l'alcool pendant plusieurs semaines, certains animaux seront intégrés dans un protocole chirurgical visant à injecter un vecteur viral dans différentes structures du cerveau (durée de la nuisance: 3-4 jours). Les rats recevront 4 injections (3 de solution saline et une de psilocybine) au total. Les souris recevront entre 7 et 12 injections au cours des expériences de conditionnement de place. Dans certaines procédures, les animaux seront isolés et stabulés sans enrichissement du milieu. Ce manque d'enrichissement du milieu sera contrebalancé par des manipulations régulières voire quotidienne pour la majorité des animaux et par l'exposition à des contextes environnementaux différents aux cours des procédures fournissant ainsi un enricissement cognitif et psychomoteur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque expérience. En effet, nous aurons besoin de récupérer les cerveaux pour effectuer des vérifications histologiques des sites d'injections et d'implantation, ou nous effectuerons des études de biochimie et de biologie moléculaire sur les tissus collectés.
Remplacement
Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à une analyse statistique correcte pour chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant les mêmes modèles de consommation d'alcool. Nous avons également pris en compte la variabilité inter-individuelle observée dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet.
Raffinement
Nous utiliserons une échelle de suivi du bien-être animl par espèce. Ces 2 échelles sont mondialement reconnues pour être suffisament prédictive de tout mal-être/douleur ou souffrance perçue par l'animal. En fonction des scores obtenus à ces échelles nous apporterons une réponse antalgique adaptée (dose croissante d'antalgique en fonction du score observé) et dose modérée immédiate pour les périodes post-opératoires chez le rat. Les animaux seront stabulés à plusieurs (sauf période transitoire de mesure de la consommation d'alcool individuelle pour certains rats), ils seront manipulés quotidiennement (enrichissement inter-espèces) et différents contextes environnementaux (texture du sol, décoration des murs, appuis sur des leviers conduisant à l'apparition de stimuli visuels et sonores) leur seront présentés (enrichissement environnemental).
Choix des espèces
Le rat est actuellement le modèle animal le plus couramment utilisé dans les études utilisant le paradigme de l'auto-administration opérante. Néanmoins, pour les études de préférence de place conditionné, le rat n'est pas le modèle idéal. En effet le rat ne développe pas de préférence de place conditionnée pour l'alcool. Donc pour les quelques expériences utilisant ce paradigme spécifique nous utiliserons la souris et plus précisemment la souche DBA /2J qui est connue pour présenter un comportement de préférence de place pour l'alcool supérieur à celui d'autres souches commes les C57Bl/6J ou encore les Swiss. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte pour nous permettre de mimer les troubles de la consommation d'alcool observés chez l'être humain adulte.
Développement d’une méthode diagnostique et théragnostique dans le cadre de la maladie d’Alzheimer : enregistrement de l’activité de l’hippocampe par EEG
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la maladie d'Alzheimer, elles subissent une neurochirurgie pour implanter un dispositif d'enregistrement, puis des séances d'électroencéphalographie hebdomadaires pendant deux mois et, pour une partie, des injections quotidiennes dans l'abdomen, avant la mise à mort pour analyser le cerveau. Le porteur indique des douleurs post-opératoires et un hébergement en cage individuelle pour éviter que les animaux ne rongent le dispositif. Il présente cette technique comme un futur outil de diagnostic précoce chez l'humain, et affirme que ni la culture cellulaire ni les modèles informatiques ne reproduisent les interactions neurones-astrocytes visées.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives (900 000 personnes atteintes en France en 2021). Elle est caractérisée par une évolution lente mais progressive de l'atteinte neuronale affectant les capacités de mémorisation et de cognition des patients réduisant progressivement leur autonomie. Cette pathologie complexe est liée à un dysfonctionnement des connections entre neurones qui aboutit à la dégénérescence des neurones de l'hippocampe (structure impliquée dans la mémoire) puis de l'ensemble du cerveau. Les patients doivent endurer une perte irréversible de leurs fonctions cognitives puisqu'à l'heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper l'évolution de la pathologie. Ce constat est notamment dû au fait qu’on ne peut pas diagnostiquer la maladie suffisamment tôt pour proposer un traitement dans la phase de mise en place, encore réversible, de la maladie. Il a été récemment identifié un stade auquel il est possible de stopper la progression de la maladie avec une substance pharmacologique originale. Ce stade est notamment caractérisé par une activité anormale de l’hippocampe chez la souris. De manière intéressante, cette activité anormale de l’hippocampe a également été identifiée chez l’homme par des techniques d’imagerie médicale, qui restent couteuses et invasives. Cette activité de l’hippocampe est prédictive de l’apparition ultérieure de la pathologie chez l’homme. Ce projet vise à étudier la mise en place de cette activité par des techniques in vivo d’électroencéphalographie chez la souris afin de proposer cette technique en complément des techniques de diagnostic actuelles (reposant essentiellement sur des questionnaires cliniques) ou futures (marqueurs sanguins en cours de développement) mais également en suivi de l’efficacité d’un traitement. Des souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer qui manifestent, in vitro, cette activité anormale de l’hippocampe entre 1 mois et 3 mois post-natal seront utilisées. Cette technique in vivo d’enregistrement éléctroencéphalographique pourrait être facilement adaptable à l’homme et proposée en médecine de ville afin de statuer précocement sur la mise en place de la pathologie et proposer des thérapeutiques curatives précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de proposer une méthode diagnostique non invasive et peu couteuse, facilement mise en œuvre en médecine hospitalière et en médecine de ville et visant à mesurer l’activité hippocampale chez des patients susceptibles de présenter des troubles associées à la maladie d’Alzheimer. Chez l’homme, cette activité (mise en évidence par IRM) a été récemment associée aux phases précoces réversibles de la pathologie et est prédictive de l’évolution de la pathologie. Généraliser sa détection, par des techniques non invasives, pourrait permettre de proposer des traitements curatifs empêchant ou retardant l’évolution de la maladie. A l’heure actuelle, le diagnostic de la maladie est tardif car il est essentiellement clinique et s’appuie peu sur les techniques d’imagerie médicale qui restent couteuses. La technique d’électroencéphalographie pourra être envisagée à large échelle et proposée en médecine de ville ou en ambulatoire. Elle pourra également être associée aux méthodes de diagnostic en cours de développement (marqueurs sanguins, etc) pour confirmer le diagnostic, attester du stade de la maladie et proposer des thérapeutiques adaptées. Elle permettra également de suivre l’efficacité des thérapeutiques futures puisque la mise en place de l’activité anormale hippocampale semble être une des étapes critiques induisant l’irréversibilité de la neurodégénérescence.
Procédures
Les souris subissent une neurochirurgie pour une durée de 45 minutes, anesthésie incluse. L'activité des neurones cérébraux des souris sera enregistrée une fois par semaine pendant 1 heure sur une durée de 2 mois. Une partie des souris aura également des injections dans l'abdomen (durée 30 secondes) une fois par jour pendant 2 mois et demi.
Impact sur les animaux
Lors de l'installation du dispositif pour enregistrer l'activité des neurones, sous anesthésie générale, les nuisances ou effets indésirables pourront concerner d'eventuelles douleurs post-opératoires. Cet équipement nécessite de maintenir les animaux isolés en cages individuelles afin d’empêcher que les animaux ne cherchent à ronger le dispositif de leurs congénères. La perte du dispositif est un effet indésirable rare qui conduira à la mis eà mort de l'animal. L’injection quotidienne d’un traitement pharmacologique en intrapéritonéal peut éventuellement induire une douleur légère.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour effectuer des analyses des tissus cérébraux.
Remplacement
Notre approche méthodologique permet d'avoir accès à l’activité d’une structure dans un réseau complexe au sein du cerveau. L'activité des neurones est fortement influencée par la région à laquelle ils appartiennent mais également par l'interaction de ces neurones avec d'autres types cellulaires comme les astrocytes, notamment au sein de l'hippocampe. Ce modèle ne peut donc pas être remplacé par un modèle dépourvu de cette régionalisation et de ces interactions comme la culture cellulaire (in vitro). Même les modèles in vitro les plus performants (cultures tri-dimensionnelles ou organoïdes) ne permettent pas de reconstituer les interactions neurone-astrocyte qui sont impliquées dans la mise en place de l'hyperactivité de l'hippocampe. Par ailleurs, s'agissant des modèles computationnels, ceux-ci ne permettent pas de reproduire l'environnement physiologique dans lequel le peptide β-amyloide est libéré. Ils ne permettent pas non plus d'inclure tous les acteurs potentiels perturbés par cette pathologie.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupes et le nombre de répétitions des expériences sont réduites au maximum tout en optimisant l'interprétation statistique des résultats. Nous testerons 4 lots d'animaux transgéniques et contrôles que nous suivrons de manière hebdomadaire pour les enregistrements EEG : 1) Souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer suivis de 1 mois à 3 mois (périodes d’hyper puis d’hypoactivité hippocampique) : 15 animaux, 2) Souris non transgéniques contrôles suivis de1 mois à 3 mois : 15 animaux, 3) Souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer traitées par HC 030031 (Tocris) en injection ip (5 mg/kg/jour) de 14 jours post-natal à 3 mois : 15 animaux. 4) Souris non transgéniques contrôles traitées par HC 030031 (Tocris) en injection ip (5 mg/kg/jour) de 14 jours post-natal à 3 mois : 15 animaux. Soit, au total, 60 animaux sur 5 ans. Afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées, nous commencerons les enregistrements sur les animaux de 1 mois : si l’hyperactivité n’est pas mise en évidence ou peu perceptible, le projet ne sera pas poursuivi.
Raffinement
Deux jours avant la phase d’implantation, de la nourriture hydratée appétante est disposée dans la cage des animaux à opérer afin de les conditionner à cette prise de nourriture pour une meilleure récupération post-opératoire. L’état de santé des animaux sera suivi quotidiennement tout au long de l’expérience, notamment suite à la chirurgie qui sera effectuée sous anesthésie générale. En post-opératoire les animaux seront placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les douleurs post-opératoires seront prévenues par injection systématique d’un antalgique. Les cages sont enrichies selon un programme mis en place dans l'animalerie. L'isolement sera limité par le fait que nous utilisons des cages avec grilles, en portoir ouvert, proches les unes des autres. Ainsi, des interactions soaciales persitent, notamment à travers l'olfaction (essentielle), la vision et l'audition. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés avant chaque enregistrement. Les critères de poids, d’apparence physique et de comportement seront pris en compte dans ce suivi. Nous utilisons des seringues microfines pour éviter des nuisances liées aux injections quotidiennes. Les injections seront réalisées en amont des procédures d’implantation et d’enregistrement électroencéphalographique pour éviter d’interférer avec celles-ci (au moins deux heures avant).
Choix des espèces
Les animaux seront utilisés dès 14 jours post-natal (groupe traité pharmacologiquement) car c'est le stade correspondant à la mise en place de la pathologie dans ce modèle. Les implantations seront effectuées à 26 jours post-natal pour démarrer les enregistrements à 1 mois qui correspond au stade pré-symptomatqiue de la maladie dans notre modèle. Les enregistrements seront effectués de manière longitudinale (1 fois/semaine) entre 1 et 3 mois post-natal, qui correspondent respectivement à la phase d’hyperactivité (phase critique réversible) et d'hypoactivité (phase irréversible) dans l’évolution de la maladie d’Alzheimer. La phase d'hyperactivité semble être une étape critique dans le développement de la maladie et son identification par enregistrements électro-encépaholographiques permettrait un diagnostic précoce chez l'homme.
Vers le développement d’une nouvelle stratégie vaccinale anti-tumorale: étude de l’induction de réponses immunitaires efficaces par des nanoparticules dérivées de virus de plantes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une à deux injections de nanoparticules dérivées d'un virus de plante et des injections de cellules, ainsi que jusqu'à dix prélèvements sanguins sous anesthésie, avant la mise à mort pour prélever les organes. Le porteur indique une réaction inflammatoire locale de courte durée au point d'injection. Les retombées annoncées, une nouvelle stratégie de vaccination contre le cancer, sont renvoyées à un projet ultérieur, et il affirme qu'un "organisme animal" est "nécessaire" pour démontrer l'initiation d'une réponse immunitaire.
Objectifs
Depuis plusieurs années de nouvelles innovations révolutionnent et complètent l’arsenal de thérapies anti-tumorales. En effet, si les thérapies classiques comme la chimiothérapie ou la radiothérapie peuvent être efficaces elles affectent aussi les cellules saines non cancéreuses et sont responsables de lourds effets secondaires. De plus, certaines tumeurs développent même une résistance aux traitements. C’est pourquoi la recherche de stratégies thérapeutiques se poursuit en s’appuyant sur la compréhension des interactions entre les cellules du système immunitaire et les cellules cancéreuses. En particulier, il existe une population de cellules immunitaires qui sont de véritables chefs d’orchestre car elles sont capables d’induire et de contrôler une réponse immunitaire conduisant à la destruction des cellules tumorales mais pas des cellules saines. Alors développer des traitements qui ciblent ces cellules d’intérêt essentielles à la réponse immunitaire anti-tumorale est une stratégie thérapeutique prometteuse. Les nanoparticules sont des objets de petite taille (10-100 nm) et de composition variable (protéines, lipides…) qui peuvent pendant ou après leur synthèse être modifiés pour enfermer ou exposer différentes molécules d’intérêt (par exemple une molécule de ciblage et un agent thérapeutique). Les nanoparticules suscitent donc un grand intérêt pour des applications en vaccination antitumorale. Ce projet vise à étudier le potentiel thérapeutique d’une nouvelle nanoparticule protéique non-toxique dérivée d’un virus de plante qui peut renfermer à l’intérieur et/ou exposer à sa surface des molécules permettant son ciblage aux cellules d’intérêt et son activité anti-tumorale. Les molécules internalisées et exposées par cette nanoparticule peuvent être facilement remplacées par d’autres molécules ce qui permet de moduler la composition de la nanoparticule pour l’adapter au mieux à chaque type de cancer. Ici, nous souhaitons, en amont d’études sur des modèles de tumeurs, étudier si cette nanoparticule est capable de cibler les cellules d’intérêt et d’induire correctement une réponse immunitaire spécifique et robuste. Si les résultats sont concluants, nous mettrons en place un autre projet qui aura pour objectif d’étudier la capacité de cette nanoparticule à induire la destruction des cellules tumorales.
Bénéfices attendus
La nanoparticule plateforme de vaccination anti-tumorale de cette étude constitue une innovation intéressante qui pourrait enrichir les stratégies existantes pour lutter contre le cancer. En effet, si aujourd’hui les nouvelles immunothérapies ont certes permis d’améliorer la rémission de certains patients, d’autres demeurent résistants à ces composés. Pour ceux-ci, utiliser des nanoparticules innovantes seules ou en combinaison avec d’autres composés thérapeutiques déjà existants pourrait constituer une alternative thérapeutique. Par ailleurs, la fonctionnalisation de la nanoparticule utilisée dans cette étude est facilement modulable ce qui est un atout pour envisager des applications dans différentes pathologies tumorales.
Procédures
Au cours de l’expérimentation, les animaux seront soumis à plusieurs gestes techniques. Ils recevront : une ou deux injections de nanoparticules par voie intradermique dans l’oreille ou par voie sous-cutanée dans le flanc ainsi qu’une ou deux injections de cellules par voie intraveineuse. Par ailleurs, jusqu’à 10 prélèvements sanguins seront effectués. Ces trois types d’interventions (injections de nanoparticules ou de cellules et prélèvements de sang) seront tous réalisés sous anesthésie générale par un personnel compétent, habitué et formé au bien-être animal. L’anesthésie générale sera réalisée par induction gazeuse et durera 10 minutes pour les injections de nanoparticules, 1 minute pour les injections de cellules et 10 minutes pour les prélèvements sanguins. Par ailleurs pour les injections intraveineuses, l’anesthésié générale gazeuse sera complété d’une anesthésie locale au niveau du point d’injection. Les animaux se réveilleront rapidement (2 à 3 minutes) et en douceur de leur anesthésie. Les transferts de cellules se basent sur des protocoles largement décrits dans la littérature et sont des outils pour l’étude des caractéristiques de la réponse immunitaire provoquée par l’injection des nanoparticules. Les prélèvements sanguins quant à eux permettront de suivre au cours du temps dans le sang des animaux des marqueurs d’activation du système immunitaire comme par exemple, la production d’anticorps. Ils seront d’un volume adapté à la fréquence des prélèvements pour laisser le temps à l’organisme de l’animal de régénérer tout son volume sanguin avant le prélèvement suivant.
Impact sur les animaux
Les impacts cliniques prévus sur les animaux inclus dans cette étude sont décrits ci-dessous. Les injections de nanoparticules peuvent localement au niveau du site d’injection (oreille ou flanc) provoquer un une réaction inflammatoire locale courte et de faible amplitude qui pourrait causer une souffrance limitée (démangeaisons, rougeur cutanée, croûte) pour l’animal pendant au plus 2 jours. Dans de très rares cas, une infection pourrait survenir au niveau du site d’injection. La non-toxicité des nanoparticules a été vérifiée en amont ainsi, en elles-mêmes, les nanoparticules injectées ne seront pas sources d’effets indésirables. Les injections intraveineuses de cellules peuvent être la source du même genre de nuisance. Les cellules injectées proviendront d’animaux compatibles donc aucune réaction de rejet n’est à prévoir. Les prélèvements sanguins répétés (au plus 10) seront suffisamment espacés et d’un volume adapté pour laisser au temps à l’organisme de l’animal de regénérer son volume sanguin. Ainsi les animaux ne devraient que très légèrement être affaiblis par la réduction transitoire de leur volume sanguin. Après le prélèvement, au niveau du point de prélèvement du sang, une croûte pourrait se former et démanger l’animal, cette dernière devrait se résorber rapidement. Enfin toutes les manipulations répétées des animaux préalables aux injections et aux prélèvements sanguins peuvent être sources de stress. Pour limiter le stress et la douleur occasionnés par les injections et les prélèvements sanguins, les animaux seront placés sous anesthésie générale gazeuse parfois complétée avec une anesthésie locale au niveau du site d’injection. Les animaux seront toujours manipulés par du personnel compétent, habitué et sensibilisé au bien-être animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en sacrifice terminal en vue de récupérer les organes afin d’analyser les effets de la nanoparticule candidate sur la réponse immunitaire.
Remplacement
Lors d’études préliminaires in vitro nous avons obtenu des résultats très encourageants qui démontrent que les nanoparticules fonctionnalisées sont des outils prometteurs pour adresser spécifiquement une molécule bioactive aux cellules ciblées capables ensuite in vitro d’être fonctionnelles. Si ce type d’étude in vitro est une première étape pour la validation du potentiel thérapeutique des nanoparticules, il ne permet pas de démontrer qu’une réponse immunitaire est correctement initiée. Pour ces études, le recours à un organisme animal, dans lequel les cellules immunitaires interagissent entre elles de façon complexe au sein d’organes, est nécessaire. Nous pourrons alors étudier à l’aide de différents paramètres ou marqueurs la capacité des nanoparticules fonctionnalisées à favoriser l’initiation et le maintien d’une réponse immunitaire spécifique et robuste.
Réduction
Le nombre total de souris utilisées dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Il est prévu de réaliser chaque expérimentation 4 fois afin de s’assurer que les effets observés soient constants et reproductibles d’une expérimentation à l’autre. Pour chaque condition testée, 3 animaux seront inclus par expérimentations pour atteindre au plus 12 souris par groupe. Si dès la troisième répétition d’expérience (effectif de 9 animaux) des effets sont mis en évidence par les tests statistiques alors nous ne réaliserons pas la quatrième répétition, ce qui réduira le nombre d’animaux utilisés. Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adéquats qui permettront de mettre en évidence sur tous les paramètres étudiés des différences entre les groupes de souris (par exemple entre la nanoparticule d’intérêt et la nanoparticule contrôle ou entre la voie intradermique et la voie sous-cutanée pour les injections de nanoparticules).
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes dans des cages enrichies avec l’ajout de nids et de bâtons à ronger. Les animaux seront surveillés et manipulés par des personnes compétentes et formées au bien-être animal. Quotidiennement, leur état général sera surveillé afin de déterminer l’éventuelle présence de signes de stress ou de souffrance (attitude prostrée, dos voûté, démarche anormale, …). En cas d’atteinte d’un des points limites l’arrêt anticipé de l’expérimentation sera alors décidé. Les injections (intradermiques, intraveineuses, sous-cutanées) et les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress des animaux. Par ailleurs, dans le cas des injections par voie intraveineuse l’anesthésie générale sera complétée d’une anesthésie locale au niveau du site d’injection.
Choix des espèces
Les souris (Mus musculus) sont des mammifères dont le système immunitaire est très proche du système immunitaire humain tant du point de vue des caractéristiques des cellules immunitaires que des mécanismes globaux. En particulier, la type de cellules que nous souhaitons cibler dans cette étude est décrite avec des caractéristiques proches chez l’homme et chez la souris. Ainsi, pour nos études précliniques, la souris est un modèle de choix. Nous utiliserons des souris adultes jeunes (2 à 7 mois) qui possèdent un système immunitaire mature et fonctionnel.
Etude de l’inflammation dépendante des mastocytes chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère. Elles subissent trois modèles d'inflammation provoquée, cutanée aux oreilles par application d'acide arachidonique, rénale et arthritique, avec des injections répétées et des prélèvements de sang et d'urine, avant la mise à mort pour prélever les organes. Le porteur indique attendre gonflement, douleur articulaire et mobilité réduite, une buprénorphine étant prévue en analgésie. Il affirme avoir déjà caractérisé l'enzyme visée in vitro mais conclut que le remplacement complet par des méthodes sans animaux est "impossible", l'inflammation étant décrite comme un processus trop complexe.
Objectifs
L'inflammation est un mécanisme clé dans la réponse immunitaire. Néanmoins, une inflammation excessive, par exemple suite à des infections ou d'origine auto-immunitaire présente un risque sanitaire sérieux. Des traitements anti-inflammatoires existent mais ont des effets secondaires potentiellement importants. Une meilleure compréhension des acteurs cellulaires et moléculaires est donc requise pour une prise en charge optimale et un développement thérapeutique ciblé contre les acteurs de l’inflammation. Les mastocytes représentent un type de cellules immunes primordial dans l'orchestration de l'inflammation, mais dont le rôle précis reste à découvrir. Afin de limiter l’expérimentation sur l’animal, nous avons préalablement mené des études in vitro, qui nous ont permis d’identifier et de caractériser une enzyme présente dans les mastocytes. Nous avons démontré que cette enzyme est nécessaire à la libération de médiateurs pro-inflammatoires in vitro. En effet, les mastocytes dépourvus de cette enzyme présentent une diminution significative de la sécrétion des molécules pro-inflammatoires. De plus, des molécules bloquant l’enzyme étudiée sont disponibles. C’est pour cela que nous émettons l’hypothèse que l’enzyme d’intérêt est un nouveau candidat pour le traitement ciblé de l’inflammation indésirable. L'inflammation est un processus physiologique complexe impliquant le recrutement et l'activation de multiples acteurs cellulaires ainsi que les structures anatomiques, son étude in vitro reflète donc insuffisamment l'ensemble de ses mécanismes. C’est pour cela que l’utilisation de modèles inflammatoires in vivo chez la souris est indispensable. Nous prévoyons d’étudier le rôle de l’enzyme d’intérêt dans trois modèles inflammatoires in vivo. Dans chacun de ces modèles la gravité de l’inflammation de sera comparé entre les souris génétiquement invalidées pour l’enzyme étudiée, des souris traitées avec l’inhibiteur spécifique et des souris contrôles. Nous allons également reconstituer des souris dépourvues de mastocytes avec des mastocytes génétiquement invalidés pour l’enzyme étudiée ou contrôles. Ceci nous permettra d’évaluer la participation des molécules inflammatoires issues des mastocytes dans les pathologies étudiées. Ce projet aura donc pour objectif de consolider le rôle de l’enzyme en question dans l’inflammation dépendante des mastocytes et de la valider comme nouvelle cible thérapeutique potentielle.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus répondront à la fois à des questions de la recherche fondamentale en apportant une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’inflammation dépendante du mastocyte et également aux besoins de la recherche translationelle en permettant de valider la protéine d'intérêt comme nouvelle cible pour le développement de médicaments anti-inflammatoires à long terme.
Procédures
Modèle d’inflammation cutanée des oreilles: sur animaux vigiles: injection sous-cutanée d’un analgésique (1x, durée du geste
Impact sur les animaux
Les nuisances infligées aux animaux dans ce projet comprennent le stress et la douleur induits par la manipulation et l’injection des produits (i.p. et i.v.). L’application d’acide arachidonique déclenche une réaction allergique locale, caractérisée par un gonflement, de la chaleur et l’hypersensibilité cutanée. La douleur est attendue également suite au déclenchement de l’arthrite et l’inflammation rénale. Pour l’arthrite, la douleur dans les articulations des membres peut entrainer une mobilité réduite. Dans tous les cas, les protocoles expérimentaux prévoient la mise à mort à l’issue de la procédure. Les durées des procédures après déclenchement de l’inflammation sont variables en fonction de la pathologie declenchée (1 heure, 4 jours et 8 jours), ainsi limitant les nuisances potentielles, même légères, dans le temps. Une mise à mort anticipée aura lieu dès qu’un animal atteindra les points limites détaillés plus bas.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement et analyse des paramètres biochimiques des organes ciblés.
Remplacement
Les mastocytes dépourvus de la protéine d’intérêt ont été étudiés et caractérisés in vitro. Le mode d’action d’une molécule bloquant spécifiquement cette protéine a également été validé sur des cellules de cultures. Ces travaux préalables nous ont permis d’avoir recours à l’expérimentation animale de manière très ciblée en choisissant des modèles d’inflammation qui impliquent les mécanismes mis en évidence in vitro, notamment la sécrétion des médiateurs inflammatoires par les mastocytes. L'inflammation est un processus physiologique complexe impliquant le recrutement et l'activation de multiples acteurs cellulaires ainsi que les structures anatomiques; son étude in vitro reflète donc insuffisamment l'ensemble de ses mécanismes. C’est pour cela que le remplacement complet des modèles in vivo par des techniques in vitro dans le contexte de notre étude est impossible.
Réduction
Le nombre d’animaux est justifié par la nécessité d’atteindre des résultats statistiquement significatifs en utilisant des test statistiques adéquats. Le nombre a été calculé avec l’aide de l’assistant de conception expérimentale (NC3RS) et confirmé avec le logiciel invivostat, utilisant un calcul basé sur la puissance statistique 90% et signification à 5%. Ce nombre sera davantage réduit si les premières expériences effectuées avec les souris génétiquement modifiées ne montrent pas de différence comparable aux souris contrôles. Dans ce cas, les procédures ne seront pas appliquées sur les souris déficientes en mastocytes.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Afin de limiter la souffrance due aux injections sous-cutanées, i.p. et i.v., les injections seront réalisées avec des seringues à insuline très fines qui donnent une injection quasi indolore grâce au biseau à trois facettes. Les prélèvements sanguins par ponction à partir de la veine faciale seront réalisés avec une lancette pour animaux (traumatisme minime à l'encontre de l'animal). L’accès à l’eau pour une bonne hydratation des animaux sera contrôlé quotidiennement. Un traitement analgésique par injection sous-cutanée de buprénorphine à 0,1mg/kg est prévu pour tous les modèles d’inflammation. Si un animal démontre ressentir une douleur basée sur une expression modérée ou sévère, un renouvellement du traitement analgésique sera réalisée immédiatement. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes en carton ou des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Des points limites spécifiques à chaque procédure ont été définis. Pour toutes les procédures, tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort par inhalation de CO2 dans un système dédié.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de faciliter d’élevage et de reproduction. Le modèle murin permet également l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus de nombreux outils expérimentaux et analytiques ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. De surcroît, le modèle d’inflammation rénale murin partage avec l’homme un nombre de néphrons fixés après la fin de la néphrogénèse contrairement aux poissons et aux batraciens. C’est également un modèle indispensable pour les essais pré-cliniques. Souris adultes âgées de 8 à 12 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit développé pour l'étude de l'inflammation dépendante des mastocytes. De plus, le nombre de mastocytes augmente avec l'âge ainsi augmentant le phénotype dans les modèles choisis. L'age de 8 semaines est indiqué dans la littérature spécifique sur ce modèle d'arthrite auto-inflammatoire.
Etude du rôle du microbiote dans le processus cancéreux de tumeurs digestives
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. On leur greffe un tissu tumoral sous la peau, puis on leur administre une bactérie par voie orale ou par injection dans la tumeur trois fois par semaine pendant six semaines, certaines étant réopérées pour retirer la tumeur avant deux mois d'observation, avant la mise à mort. Le porteur décrit un retentissement qu'il présente comme limité, avec une faible perte de poids. Il indique s'appuyer sur des données cliniques de patients pour réduire le recours aux souris, mais retient la souris greffée comme "modèle préclinique pertinent" pour le processus cancéreux.
Objectifs
Le cancer de l’anus est une tumeur rare encore peu étudiée mais très invalidante et dont la fréquence augmente. Sa prise en charge thérapeutique conduit encore à des conditions de vie dégradées et à des échecs thérapeutiques chez de nombreux patients. Une meilleure compréhension de ce cancer est donc nécessaire pour améliorer in fine cette prise en charge. Nos travaux portent sur des analyses, non pas uniquement des cellules tumorales elles-mêmes, mais également de leur environnement afin de mieux comprendre ces cancers. Ainsi, nous étudierons plus particulièrement l’impact du microbiote intestinal. Le microbiote (ensemble des micro-organismes - bactéries, virus, parasites, champignons non pathogènes, dits commensaux - qui vivent dans un environnement spécifique) et son équilibre sont maintenant bien connus pour jouer un rôle prépondérant pour notre Santé. Ainsi, un germe majeur de ce microbiote intestinal a été analysé dans les tumeurs de la tête et du cou et dans les tumeurs du rectum. Sa présence a été associée pour les premiers (tête et cou) à un bon pronostic, contrairement aux tumeurs du rectum. Le cancer de l’anus est proche à la fois des tumeurs tête et cou par la nature de l’épithélium et de celui du rectum par sa localisation. Notre étude a pour but, à la fois d’acquérir une meilleure connaissance biologique des cancers de l’anus et d’aider à déterminer s’il existe un intérêt à cibler cette bactérie dans la prise en charge thérapeutique des patients.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces travaux a pour but d’acquérir de nouvelles connaissances sur la pathologie de ce cancer invalidant afin d’améliorer la prise en charge future des patients.
Procédures
Un premier groupe de souris sera greffé en sous-cutané avec du tissu tumoral sous anesthésie (20 minutes d’anesthésie pour la greffe qui nécessite une intervention chirurgicale très courte elle-même d’une durée de 2 min max). Ces souris recevront la bactérie d’intérêt par oral (animaux vigiles) ou bien par injection dans la tumeur (animaux anesthésiés) 3 fois par semaine (durée du geste < 30 secondes), pendant les 6 semaines de suivi de croissance tumorale avant d’être euthanasiées pour analyse post-mortem. Un deuxième groupe de souris sera greffé avec la tumeur (sous anesthésie : durée 20 min) et traité avec la bactérie de la même façon (injections intratumorales sur animaux anesthésiés ou gavage sur animaux vigiles : durée du geste
Impact sur les animaux
Ce travail porte sur des cancers qui se développeront chez des souris greffées. Selon la localisation de la greffe, la tumeur peut ne pas avoir de retentissement sur l’état général (croissance uniquement locale en sous-cutané) ou bien avec un retentissement général qui reste limité dans notre expérience (faible perte de poids, traitement antalgique permettant la prise en charge de la douleur induite par l’intervention chirurgicale). La durée est celle de l’expérience, de 6 à 14 semaines maximum. De plus, les nuisances attendues lors de l’administration de la bactérie seront celles liées à l’injection intra-tumorale ou par le gavage de produits non toxiques et non irritants.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Les données cliniques de tumeurs de patients ont été largement utilisées afin d’obtenir un maximum d’information sans avoir recours à l’animal. Elles permettent aussi de définir au mieux le plan expérimental ayant recours aux souris dans le but de réduire le nombre d’animaux. De même, des analyses sur du matériel congelé nous permettent de remplacer des approches chez l’animal pour sélectionner le modèle tumoral le plus susceptible d’être colonisé par la bactérie.
Réduction
Les analyses moléculaires préliminaires portent sur des tissus déjà congelés (pas de recours à de nouveaux animaux pour cette analyse) et permettront de ne greffer sur l’animal que les tumeurs de la collection présentant un intérêt pour l’étude. Une première expérience pilote sur un nombre faible d’animaux permettra de choisir le modèle d’infection le plus efficace qui sera utilisé dans la suite du projet. Le test de Mann-Whitney sera utilisé pour comparer le développement de métastases dans les différentes conditions.
Raffinement
Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et avec l’administration d’analgésique pour couvrir la période per et post-anesthésie. Les souris seront suivies au minimum 3 fois par semaine. Une grille de score sera mise en place pour évaluer de façon objective, l’état des animaux.
Choix des espèces
Le modèle de souris greffé avec des tumeurs dérivées de tumeur de patient est reconnu comme un modèle préclinique pertinent pour étudier le processus cancéreux. Souris nudes adultes afin de pouvoir réaliser une greffe en sous-cutané de tumeur.