Souris

Le muscle tibial antérieur d'une patte est retiré et remplacé par une matrice artificielle, puis enrichi par injection de cellules humaines. 120 souris immunodéficientes vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec six séances d'imagerie sous anesthésie et un transport à pied entre deux établissements. Le porteur ramène ces atteintes à des douleurs modérées et à un risque d'infection lié à l'immunodéficience, et prévoit que chaque souris serve de témoin à elle-même par comparaison de ses deux pattes. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever et analyser les muscles.

Objectifs

Ce projet vise à tester une nouvelle approche pour remplacer un muscle endommagé. Aujourd’hui, lorsqu’un muscle est perdu à cause d’une maladie ou d’un accident, il ne peut pas être remplacé. Nous développons une structure artificielle qui imite un muscle et qui peut être implantée à la place du muscle manquant. Cette structure est ensuite enrichie avec des cellules capables de former du tissu musculaire. L’objectif est de vérifier si cette approche permet de recréer un muscle fonctionnel dans un organisme vivant.

Bénéfices attendus

La perte d’un muscle, liée à une maladie ou à un accident, est aujourd’hui irréversible car il n’est pas possible de transplanter un muscle entre humains en raison des réactions du système immunitaire. Pourtant, ce type de handicap pourrait concerner des centaines de millions de personnes dans le monde. En effet, les maladies musculaires touchent une personne sur 3000 en Europe et la prise en charge actuelle varie entre 100 000 et 150 000 euros par patient et par an pour les formes les plus avancées. Ce projet propose une nouvelle approche pour répondre à ce besoin : remplacer le muscle manquant par une structure artificielle qui imite un muscle naturel. Une fois implantée, cette structure est enrichie avec différents types de cellules humaines capables de reconstruire un tissu musculaire. L’objectif est de démontrer que cette solution peut permettre de recréer un muscle fonctionnel. À terme, cette approche pourrait ouvrir la voie à de nouveaux traitements pour les personnes ayant perdu la fonctionnalité d'un muscle.

Procédures

Au cours du projet, les animaux auront une chirurgie sous anesthésie et analgésie (1 fois, durée : 15 minutes) et une injection de cellules sous anesthésie (1 fois, 5 minutes). Les animaux seront transportés d'un établissement 1 vers un établissement 2 (animaux vigiles, 10 minutes). Enfin, les animaux seront suivis par imagerie sous anesthésie (6 fois, durée : 15 minutes).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les animaux sont immunodéprimés ce qui les exposent à un risque accru aux infections. Plusieurs actes seront réalisés sous anesthésie (chirurgie, injection, imagerie), elle pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. L’intervention chirurgicale pourra engendrer des douleurs modérées et des risques d’infections. Les injections pourront induire une douleur légère de courte durée. Le transport entre les deux établissements pour la mise en oeuvre du projet et les imageries pourront engendrer un léger stress.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la procédure afin de prélever et analyser les muscles.

Remplacement

Avant toute utilisation chez l’animal, les différentes cellules sont étudiées en laboratoire grâce à des modèles in vitro. Ces tests permettent de vérifier leur bon fonctionnement et leur capacité à former des structures proches de celles observées dans l’organisme. Concrètement, certaines cellules sont sélectionnées pour leur capacité à former des fibres musculaires capables de se contracter, d’autres pour leur aptitude à former des vaisseaux sanguins, et d’autres encore pour leur rôle dans la production de composants essentiels du tissu. Ces propriétés sont évaluées à l’aide d’observations au microscope, de manière qualitative. Cette étape permet de s’assurer que les cellules présentent les caractéristiques attendues avant leur utilisation dans un organisme vivant. Cependant, à ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire l’ensemble des mécanismes impliqués dans la formation d’un muscle complet. Les interactions complexes entre les différents types de cellules, les vaisseaux sanguins et les tissus ne peuvent pas être modélisées de manière fiable uniquement en laboratoire. C’est pourquoi une approche in vivo reste nécessaire pour répondre aux objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été défini de manière à obtenir des résultats fiables tout en respectant la règle des 3R. Au total, jusqu’à 120 animaux seront utilisés dans le cadre du projet. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, chaque souris servira de contrôle pour elle-même lorsque cela est pertinent, notamment en comparant les deux muscles de l’animal. Cette approche permet d’augmenter la puissance des analyses sans augmenter le nombre d’animaux. Les données seront comparées entre groupes à l’aide d’analyses statistiques adaptées, afin de garantir la robustesse et la fiabilité des résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Pour limiter les risques d'infections liés au phénotype, les animaux auront de la nourriture, de la litière et des enrichissements stérilisés et l'eau de boisson sera purifiée. Les animaux seront également manipulés avec des gants sous hotte et hébergés en cages ventilées. L'ensemble des actes seront réalisés sous anesthésie générale et avec analgésie pour la chirurgie. Pendant l'anesthésie, les animaux sont placés sur tapis chauffant afin de maintenir leur température corporelle et un gel ophtalmique est appliqué pour prévenir le dessèchement des yeux. Avant et après la chirurgie, un gel nutritif sera introduit dans la cage ainsi que des croquttes au sol pour faciliter la prise hydrique et alimentaire. Pour le transfert entre les deux établissements, les animaux seront placés dans une boite de transport avec litière, croquettes et enrichissement. La boite sera placée dans un sac opaque pour préserver les animaux de la lumière extérieure. Le transport de l’établissement 1 à l’établissement 2 est de 10 minutes maximum à pied. Les examens seront réalisés après une semaine d’acclimatation. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

L’utilisation de souris immunodéficientes est indispensable pour ce projet, car elle permet d’évaluer la greffe de cellules humaines dans un organisme vivant. Ces animaux présentent une déficience du système immunitaire ce qui limite fortement le rejet des cellules humaines injectées. Cette caractéristique est essentielle pour permettre la survie, l’intégration et l’étude des cellules humaines dans le tissu musculaire. Le modèle murin est largement utilisé en recherche biomédicale pour l’étude de la régénération musculaire, en raison de sa pertinence biologique et de la disponibilité de modèles adaptés. Ainsi, l’utilisation de cette lignée permet d’obtenir des résultats fiables et pertinents au regard des objectifs du projet. Les animaux seront utilisés à un stade adulte (entre 2 et 8 mois), ce qui correspond à un organisme mature et permet d’étudier la régénération musculaire dans des conditions proches de celles observées chez l’humain adulte. Ce choix est particulièrement pertinent pour évaluer l’intégration de la matrice et la formation d’un tissu musculaire fonctionnel dans un environnement physiologique stabilisé.

Ascite et œdèmes attendus après l'injection du sérum néphrotoxique, au point que les animaux prennent du poids au lieu d'en perdre. 1 140 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les organes. Une chimiothérapie ou un sérum néphrotoxique leur est injecté sous anesthésie pour provoquer deux formes de maladie rénale, des minipompes osmotiques sont implantées chirurgicalement, et quatre prélèvements d'urine sont pratiqués au fil du protocole. Le porteur cherche à savoir si deux protéines protègent le rein et espère à terme un essai clinique chez des patients que les traitements actuels n'aident pas. Il retient la souris pour la simplicité de son hébergement, la maîtrise du modèle par son équipe et l'abondance de données déjà produites sur cette espèce, et note que les protocoles sont assez courts pour qu'aucune insuffisance rénale terminale ne devrait apparaître.

Objectifs

La maladie rénale chronique (MRC) représente un enjeu majeur de la santé publique, affectant environ dix pourcents de la population mondiale. Parmi les MRC, les glomérulonéphrites (GN) constituent une cause importante d’insuffisance rénale terminale, pour lesquelles aucun traitement curatif n’est disponible à ce jour. Les traitements actuels présentent de nombreux effets secondaires ce qui complique la prise en charge de ces maladies. Des données récentes suggèrent le rôle protecteur de deux protéines dans le rein. Ainsi, notre étude vise à explorer le potentiel thérapeutique de ces protéines dans les maladies rénales. Deux modèles de maladies rénales seront utilisés qui présentent des lésions similaires à celles retrouvées chez les patients. L’utilisation de ces deux modèles permettra de : 1. Caractériser le rôle de ces deux protéines dans des maladies rénales. 2. Etudier les limites et effets secondaires des traitements actuels de ces protéines. 3. Etudier l’effet d’un traitement actuel pour la GN sur l’expression des protéines. 4. Tester l’activation pharmacologique d'une des protéines. Ces travaux pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour le traitement des GN

Bénéfices attendus

La maladie rénale chronique (MRC) est un problème majeur de santé publique socio-économique affectant 10 pourcents de la population mondiale. Elle est la cause d’insuffisance rénale (IR) terminale nécessitant dialyse et transplantation, en raison d’absence de traitement curatif. L’IR est associée à une mortalité très élevée, même avant le stade de l’IR terminale. Les traitements utilisés ont des effets secondaires néfastes importants pour les patients. Le développement de nouvelles thérapies est primordial, c’est pour cela que ce projet a l'ambition de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Des études antérieures réalisées par notre groupe et d’autres équipes de recherches ont pu démontrer le potentiel protecteur de deux protéines dans le rein mais leur rôle dans les MRC et particulièrement dans les glomérulonéphrites n’a pas été étudié. Nous souhaitons ici étudier le rôle de ces deux protéines dans la MRC, identifier leur rôle et à quel moment ces protéines sont induites et exprimées afin de pouvoir établir le moment propice pour les cibler en thérapeutique. Ce projet, pourraient déboucher sur un essai clinique chez l’homme, en particulier chez des patients pour lesquels les traitements actuels n’ont aucun bénéfice, voire ont des effets secondaires néfastes.

Procédures

(1) Une partie des animaux recevra une injection de sérum physiologique ou d’une chimiothérapie pour induire un modèle de maladie rénale qui entraine une atteinte des podocytes. Environ 5 minutes par souris sous anesthésie générale. (2) D’autres animaux recevront une injection de sérum physiologique ou d’un sérum induisant une maladie rénale qui touche les glomérules. Environ 5 minutes par souris sous anesthésie générale. (3) Les traitement thérapeutiques seront administrés chirurgicalement avec implantation de minipompes osmotiques. Environ 5 minutes par souris sous anesthésie générale et analgésie. (4) L'ensemble des souris auront à subir un prélèvement d'urines quatre fois tout au long du protocole. Environ 1 minute par souris, sur animal vigile. (5) Prélèvement de sang sous anesthésie générale et analgésie, 1 minute environ par souris ; suivi de l'euthanasie par une méthode règlementaire en vue des différents prélèvements et analyses nécessaires.

Impact sur les animaux

Le stress et la douleur peuvent être générés par : 1. Douleur locale suite aux injections. Les injections seront de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale et un stress lors de la contention. 2. Stress en raison de manipulations des souris, les pesées et le recueil des urines qui se feront chaque 3 ou 5 jours. 3. Les complications associées au modèle murin. Suite à l'injection du sérum néphrotoxique, les animaux peuvent prendre du poids en raison de l'ascite et des œdèmes développés lors de la mise en place des lésions rénales. 4. Complications liées à l'anesthésie au moment de l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique). Les protocoles mis en place dans le projet sont relativement courts, nous ne devrions pas observer de complications associées à l'insuffisance rénale terminale (perte de poids, baisse de la température corporelle).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésique par une personne expérimentée afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs est la fonction rénale, qui doit être mesurée par le dosage de la concentration plasmatique, de créatinine et d'urée.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle du phénotype étudié (lésions tissulaires rénales) dans les deux modèles. Un effectif de 10 à 15 animaux par groupe a été déterminé sur la base d’un calcul de puissance statistique réalisé à priori, permettant de détecter les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux est de 1140 souris

Raffinement

Les nuisances pour les animaux seront réduites au maximum grâce à l’application de mesures de raffinement appropriées. Avant le début de la procédure, les animaux seront acclimatés dans l’animalerie pendant au moins une semaine afin de les préparer à leur environnement. Leur bien-être sera assuré par un enrichissement optimal de leur environnement, comprenant une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments de tailles différentes. Cette litière, initialement compacte, sera décompactée par les animaux eux-mêmes. Des morceaux de bois à ronger et un dôme refuge en cellulose seront fournis dans chaque cage, offrant aux animaux des éléments pour explorer et se cacher, contribuant ainsi à leur confort. La gestion de la douleur sera une priorité, avec l’utilisation de méthodes d’analgésie et d’anesthésie adaptées pour minimiser toute souffrance. Des points limites ont été définis pour assurer une surveillance stricte du bien-être des animaux tout au long de l’expérience. Afin de garantir leur état de santé optimal, une surveillance quotidienne de leur aspect physique et du poids des animaux sera effectuée par le personnel qualifié de l'animalerie ou les responsables du projet. Les animaux seront hébergés dans des conditions strictement conformes à la réglementation en vigueur. Chaque cage contiendra un maximum de cinq animaux, et l’animalerie respectera des conditions de température, d’humidité et de renouvellement de l’air rigoureuses. Des mesures de soins seront prises pour limiter l’inconfort des animaux suite aux injections en intraveineuse (nécessaire pour l’induction du modèle).

Choix des espèces

-Pertinence du modèle souris en tant que mammifère grâces aux conditions simples à mettre en place pour son hébergement, tout en respectant les principes éthiques liés à l’expérimentation animale. -Modèle bien maitrisé dans cette espèce par le personnel du laboratoire -Nombreuses données relatives au projet déjà disponibles dans la littérature scientifique, et ont été obtenues grâces à cette espèce. -Lignée de souris génétiquement modifiées déjà générée et sans phénotype dommageable. Les procédures seront réalisées sur des souris livrées à l’âge de 8 semaines. Après une semaine d’acclimatation, les animaux seront soumis aux procédures à l’âge de 9 semaines (correspondant à un stade adulte jeune où la fonction rénale est mature sans présenter des lésions de vieillissement). Les souris génétiquement modifiées produites au laboratoire seront utilisées au même âge.

Un implant métallique glissé sous la peau, puis un chauffage local maintenu 48 heures par un champ magnétique, jusqu'à trois fois: 186 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La chirurgie d'implantation dure une vingtaine de minutes, suivie de vaccinations sous anesthésie et de prélèvements de sang. Le projet cherche à savoir si une hausse de température modifie la production d'anticorps après une vaccination. Le porteur y voit un moyen non médicamenteux d'améliorer certaines réponses vaccinales et d'évaluer l'effet des médicaments pris contre la fièvre après un vaccin.

Objectifs

La température du corps des mammifères, dont l’homme, est finement régulée, mais elle peut augmenter, par exemple lors d’une fièvre induite par une vaccination ou par une infection. Cette augmentation de la température est connue pour influencer le fonctionnement du système immunitaire. Cependant, l’effet de la température sur la réponse immunitaire humorale, qui correspond à la production d’anticorps par des globules blancs essentiels au système immunitaire appelées lymphocytes B, reste encore mal connu. La capacité des lymphocytes B à produire des anticorps en réponse à une vaccination ou à un microbe est un processus complexe. Elle nécessite la coopération avec d’autres types de cellules du système immunitaire et la formation de structures spécialisées situées dans certains organes, comme les ganglions lymphatiques ou la rate. La réponse humorale se caractérise également par la mise en place d’une mémoire immunitaire dirigée contre la cible vaccinale ou le microbe, qui peut persister pendant plusieurs mois, voire plusieurs années. Le maintien de cette mémoire repose sur des interactions entre différents types cellulaires dans plusieurs organes, notamment la rate et la moelle osseuse. Ces mécanismes complexes sont difficiles à reproduire en laboratoire sur des cellules isolées. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre comment une augmentation de la température peut influencer la réponse immunitaire humorale. Pour cela, le projet utilise un modèle expérimental chez la souris permettant d’augmenter la température de manière localisée, uniquement au niveau d’un ganglion lymphatique, de 1 à 2 degrés pour mimer l’intensité de l’élévation de température dans la fièvre. Le projet comporte deux objectifs successifs : 1/ vérifier que le dispositif expérimental permet d’augmenter localement la température de manière stable et réversible, sans affecter l’état général des animaux ; 2/ étudier si cette élévation locale de la température, appliquée au moment d’une vaccination, modifie la qualité et la durabilité de la réponse immunitaire. L’objectif principal est l’évaluation de la mémoire immunitaire à long terme. Des analyses réalisées à des temps plus précoces pourront permettre de mieux comprendre les mécanismes impliqués.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre l’effet de la température sur la réponse immunitaire humorale pourrait avoir un impact important dans le domaine de la vaccination. En particulier, l’élévation de la température pourrait, à terme, être envisagée comme un moyen non médicamenteux d’améliorer l’efficacité de certaines réponses immunitaires, une approche déjà explorée dans d’autres domaines, notamment en cancérologie. Par ailleurs, ce projet permettra d’évaluer plus précisément les conséquences de la prise de médicaments visant à faire baisser la fièvre après une vaccination. Cette pratique est très répandue, mais son impact potentiel sur la mise en place d’une réponse immunitaire efficace et durable reste encore mal compris. Les résultats de ce projet pourraient ainsi contribuer à améliorer les connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire et à guider, à plus long terme, certaines stratégies vaccinales.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions au cours du projet. Certaines souris subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale afin d’implanter un petit objet métallique sous la peau au niveau du flanc. Cette chirurgie est réalisée une seule fois par animal et dure environ 20 minutes, suivie d’une période de récupération de 3 à 4 semaines avant toute autre manipulation. Après la phase de cicatrisation, les souris seront placées dans un dispositif générant un champ magnétique permettant d’induire une élévation locale de la température au niveau de l’implant. Cette élévation de température est maintenue pendant 48 heures. Dans le cadre de la validation du modèle, certaines souris seront soumises à cette procédure jusqu’à trois fois, à une semaine d’intervalle. La température locale sera mesurée par imagerie infrarouge, sans contact avec l’animal. Des mesures de température corporelle seront également être réalisées à l’aide d’une sonde rectale. Ces mesures durent en moyenne 1 à 2 minutes par animal et sont répétées à différents temps pendant les 48 heures de chauffage. Dans la seconde partie du projet, certaines souris seront vaccinées sous anesthésie générale par injection sous-cutanée au niveau de la patte arrière, une à deux fois par animal (vaccination initiale et rappel), chaque injection durant moins d’une minute. Des prélèvements sanguins seront réalisés à plusieurs endroits et à plusieurs temps (jusqu’à trois fois par animal), chaque prélèvement durant environ 1 minute. Enfin, les expériences se termineront par l'euthanasie des animaux sous anesthésie, avec un prélèvement sanguin final, d’une durée d’environ 2 minutes.

Impact sur les animaux

L’implantation chirurgicale de l’objet métallique peut entraîner une douleur et un inconfort modérés et transitoires, associés à une inflammation locale liée à la chirurgie, généralement limités à quelques jours après l’intervention. L’élévation locale de la température peut être associée à une sensation de chaleur localisée et à un inconfort transitoire pendant la durée du chauffage. Les vaccinations et les injections sous-cutanées peuvent provoquer une gêne locale temporaire et une réaction inflammatoire modérée au site d’injection. Les prélèvements sanguins et les mesures de température peuvent entraîner un stress passager lié à la manipulation des animaux. L'ensemble de ces interventions peut conduire a une légère perte de poids et des modifications transitoires du comportement. Les expériences se terminent par l'euthanasie des animaux.

Devenir

À l’issue des procédures, les animaux sont euthanasiés afin de permettre le prélèvement de sang en quantité suffisante ainsi que de différents organes du système immunitaire (ganglions lymphatiques, rate, moelle osseuse). Ces prélèvements sont indispensables à l’analyse de la réponse immunitaire humorale, de la mémoire immunitaire induite par la vaccination et des mécanismes associés. Ces analyses nécessitent des prélèvements terminaux et ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux.

Remplacement

Nous avons effectué des expériences in vitro afin d’étudier l’effet d’une élévation de la température sur les lymphocytes B. Il est cependant impossible in vitro de reproduire l’environnement complexe impliquant la coopération dans le temps et l’espace entre de nombreux types cellulaires qui permet aux lymphocytes B de produire des anticorps in vivo et de devenir des cellules mémoires capables de survivre pendant plusieurs mois. Il est donc nécessaire d’étudier cette réponse dans un organisme entier vivant, dans un modèle animal dont le système immunitaire et le contrôle de la température est proche de l’homme, comme la souris.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au maximum (186) grâce à une organisation progressive du projet. Une première étape permet de valider le dispositif expérimental avant son utilisation, afin d’éviter de réaliser des expériences inutiles sur un grand nombre d’animaux. Des tests ont également été réalisés en dehors de l’animal pour vérifier le bon fonctionnement du dispositif. De plus, chaque animal peut être utilisé pour plusieurs mesures, ce qui permet de limiter le nombre total d’animaux. Enfin, le nombre d’animaux nécessaires a été calculé à l’avance afin d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le minimum d’animaux possible. Certaines analyses ne seront réalisées que si nécessaire, afin de ne pas utiliser d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Les procédures impliquant une intervention chirurgicale, ainsi que les injections liées à la vaccination, sont réalisées sous anesthésie générale avec analgésie. Un suivi clinique quotidien est mis en place après chaque intervention et jusqu’à la fin de la procédure afin de détecter précocement tout signe de douleur, de stress ou de dégradation de l’état général. Pour cela, une grille d’observation est utilisée, prenant en compte des critères tels que la perte de poids, l’apparence générale, le comportement et la présence de signes cliniques anormaux comme un écoulement nasal, permettant d’établir un score de douleur. Des points limites ont été définis. En fonction du score de douleur et de sa persistance, la douleur sera traitée soit par analgésie jusqu'à l'amélioration du score (les animaux seront euthanasiés après 3 jours si le score ne s'améliore pas), soit les animaux seront euthanasiés. Une perte de poids pouvant être liée à une déshydratation est prise en charge par une réhydratation adaptée. Afin de réduire le stress lié aux manipulations et aux changements d’environnement, les souris sont habituées progressivement aux conditions expérimentales, notamment aux manipulations, à la prise de température et aux cages utilisées pour les expériences. Tout au long du projet, les animaux sont maintenus en groupes sociaux, sans isolement, dans un environnement enrichi comprenant des matériaux de nidification et des objets à ronger, avec un accès libre à la nourriture et à l’eau, et sont observés tous les jours.

Choix des espèces

La souris a été choisie car son système immunitaire fonctionne de manière comparable à celui de l’être humain et est très bien étudié. Comme l’homme, la souris est un animal qui régule sa température corporelle, ce qui permet d’étudier de façon pertinente l’effet d’une augmentation de la température sur les défenses immunitaires. Toutes les expériences seront réalisées chez des souris adultes, âgées de 8 à 10 semaines au début des interventions. À cet âge, les animaux ont une taille suffisante pour permettre les interventions chirurgicales, et leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui est indispensable pour étudier correctement la réponse à une vaccination et la mise en place d’une mémoire immunitaire.

Sensibilisées à des allergènes, exposées deux fois par semaine pendant six semaines par inhalation, prélevées chaque semaine, 5 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les modèles reproduisent l'asthme allergique, l'allergie alimentaire et la réaction anaphylactique, cette dernière pouvant faire chuter la température corporelle. Une trachéotomie terminale sous anesthésie clôt le protocole, sans réveil possible. Toutes les souris sont ensuite tuées pour prélever sang et organes.

Objectifs

Les maladies allergiques, qu’elles soient respiratoires (comme l’asthme allergique) ou alimentaires, sont en constante augmentation dans le monde, aussi bien dans les pays développés que dans les pays en développement. En France, on estime qu’environ un tiers de la population est concerné par au moins une forme d’allergie. Certaines de ces pathologies peuvent être graves, voire mettre en jeu le pronostic vital, comme certaines formes sévères d’asthme ou les réactions allergiques aiguës liées à l’ingestion de fruits à coque. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de prévenir efficacement les allergies ou d’en contrôler durablement les symptômes. Les mastocytes, qui sont des cellules du système immunitaire, jouent un rôle central dans les réactions allergiques. Leur activation, notamment via les immunoglobulines E (IgE), déclenche les phénomènes inflammatoires responsables des symptômes. Dans ce contexte, ce projet propose d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques reposant sur l’utilisation d’anticorps humanisés ciblant les IgE. Ces stratégies seront étudiées dans différents modèles d’allergies majeures, incluant l’asthme allergique, l’allergie alimentaire et les réactions anaphylactiques. L’objectif est d’améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans les allergies et d’identifier de potentielles pistes de traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans les maladies allergiques, en particulier dans l’asthme allergique, les allergies alimentaires et les réactions anaphylactiques. Ces pathologies, fréquentes et parfois graves, représentent un enjeu important de santé publique. Le projet proposé permettra de mieux caractériser le rôle de certains acteurs clés du système immunitaire dans le déclenchement et l’amplification des réactions allergiques. Cette meilleure compréhension est indispensable pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. À plus long terme, les connaissances acquises dans le cadre de ce projet pourraient contribuer au développement d’approches thérapeutiques innovantes, visant à prévenir ou à mieux contrôler les réactions allergiques, et ainsi à réduire leur impact sur la qualité de vie et la santé des patients.

Procédures

Chaque injection se fera sur animal vigile et sous contention (20 sec), alors que les inhalations (2x par semaine pendant 6 semaines) et les injections intra-dermiques (1x dans le modèle de PCA) se feront sous anesthésie gazeuse, (induction/perte de conscience : 2min ; inhalation 20 sec). Des prélèvements sanguins seront réalisés en sub-mandibulaire sur animal sous anesthésie gazeuse au minimum 1 fois par semaine, avec alternance des joues de prélèvement (induction/perte de conscience : 2min ; prélèvement : 30 sec). Une trachéotomie sera réalisée sous anesthésie générale, après vérification de la profondeur de la narcose et suppression de tout réflexe (10-15min), par du personnel diplomé en « chirurgie de l’animal de laboratoire », en fin de procédure expérimentale et sans réveil possible (procédure sans réveil).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus chez les animaux sont principalement liés aux procédures expérimentales et aux modèles d’allergie utilisés. Les administrations de traitements par injection peuvent entraîner une douleur aiguë de courte durée liée à la piqûre (quelques secondes) ainsi qu’un inconfort transitoire au point d’injection. Des nuisances spécifiques sont attendues en fonction des modèles d’allergie étudiés. Dans le modèle d’asthme allergique, l’exposition aux allergènes par voie respiratoire peut induire une gêne respiratoire transitoire. Dans le modèle d’allergie alimentaire, le gavage peut entraîner un stress de courte durée lié à la contention et à l’administration (environ 20 secondes). Ce modèle peut également provoquer des troubles digestifs (diarrhées, inconfort abdominal). L’induction d’une réaction anaphylactique peut entraîner une baisse transitoire de la température corporelle. Dans le modèle d’anaphylaxie cutanée, une inflammation locale (gonflement de l’oreille) est attendue, pouvant être associée à une sensibilité ou une douleur locale, difficilement quantifiable en l’absence de signes comportementaux marqués. Afin de limiter la douleur et le stress, plusieurs mesures seront mises en place. Les procédures potentiellement les plus invasives ou stressantes (notamment certains prélèvements sanguins et expositions par inhalation) seront réalisées sous anesthésie lorsque cela est compatible avec les objectifs scientifiques. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière permettant de détecter précocement tout signe de souffrance, et des critères d’arrêt seront appliqués si nécessaire.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser des prélèvements de sang et d’organes pour analyser les cellules et les tissus, notamment grâce à des techniques permettant d’identifier les différents types de cellules et d’observer leur organisation au sein des tissus (comme la cytométrie en flux ou l’histologie).

Remplacement

Bien que des expériences in vitro avec des cellules humaines ou d’animaux sont réalisées au laboratoire, celles-ci expériences in vitro ou méthodes alternitives ne permettent pas de reproduire la réponse systémique d’un organisme complet. Les maladies allergiques sont des maladies multifactorielles complexes dans lesquelles plusieurs organes du corps jouent un rôle important (épithélium, organes lymphoïdes secondaires, système vasculaire…). C’est pourquoi, l’utilisation d’animaux est primordiale afin d’étudier les mécanismes mis en jeu dans les différents modèles allergiques.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans l'analyse de ces divers modèles de pathologies et la présence des données préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne de 4 animaux contrôle versus 4 animaux allergiques de même âge et sexe pour chaque expérience. Pour certaines procédures, chaque souris sera son propre contrôle (une oreille traité vs. une oreille contrôle). Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs, un des tests statistiques suivants sera utilisé :1-way ou 2-way ANOVA, Mann-Whitney ou unpaired 2-tailed Student’s t test.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et les conditions d'hébergement (enrichissement des cages avec des carrés de ouates, igloos...) seront également surveillées. Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, le souris auront une phase d’acclimatation dans une pièce séparée sur portoirs ventilés d’au moins cinq jours. Les souris seront hébergées à maximum 5 par cage de 500cm² en portoir ventilé dans un environnement contrôlé. L’enrichissement sera constitué d’une maison en plastique et de frisure de papier kraft pour faire un nid. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Bien que des signes de douleur ne semblent pas apparaître dans nos modèles d’allergie, tout animal, présentant une douleur évidente (isolement, baisse importante de l’activité, perte de poids > 10%, pilo-érection et/ou grimace) sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponible chez la souris et sous un fond génétique bien contrôlé. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Pour la majorité des expériences, les animaux seront utilisés entre 7 et 12 semaines, ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature.

Tuées à l'issue même quand la tumeur régresse, 200 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules cancéreuses humaines sous anesthésie, puis des lymphocytes humains modifiés, avec un suivi par imagerie. Le projet teste des cellules CAR contre des cancers du sang et des tumeurs solides, sur la base de résultats obtenus en culture. Le porteur justifie la mise à mort de toutes les souris, y compris celles en rémission, par le risque d'une reprise de la tumeur et de la souffrance associée.

Objectifs

L’immunothérapie anticancéreuse est une approche dont le succès en clinique a récemment été validé avec l’approbation de stratégies d’immunothérapie visant à traiter des cancers avancés. Ces immunothérapies sont basées sur le transfert adoptif des cellules immunitaires du patient qui ont été modifiées pour reconnaitre la tumeur. Malgré son efficacité dans le traitement de cancers sanguins comme la leucémie, le succès de cette thérapie dans le traitement des tumeurs solides reste encore très limité. Ce projet vise donc à étudier l’efficacité anticancéreuse des cellules immunitaires humaines activées in vitro et injectées dans des souris porteuses de tumeurs humaines. Les résultats obtenus devraient contribuer à améliorer les immunothérapies dans le traitement du cancer. Le projet se déroule dans 2 EU différents.

Bénéfices attendus

La recherche qui est proposée dans ce projet a pour objet d’améliorer les thérapies anticancéreuses de type immunothérapie en ciblant des cancers agressifs. Nos résultats préliminaires in vitro ont d’ores et déjà démontré que les cellules CAR-T diminuent la prolifération de plusieurs cellules cancéreuses (lymphome, cancer du sein et cancer du poumon). Les résultats qui découleront de ce projet permettront d’accroitre nos connaissances sur les immunothérapies en cancer et d’améliorer leur efficacité.

Procédures

Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse pendant 10 minutes maximum et recevront une injection sous-cutanée (s.c) ou intraveineuse (i.v) de cellules cancéreuses à l’aide d’une seringue (EU1). Cette injection se réalise en 10 secondes par souris. A ce moment, chaque souris entre dans une phase d’expérimentation de 5 semaines maximum avant la mise à mort. Le traitement par injection i.v de lymphocytes humains sera administré dans les mêmes conditions (EU1). Un suivi de la croissance tumorale et du poids des animaux seront réalisés tous les 2 jours, des mesures qui se font respectivement en 10 et 5 secondes pour chaque animal. Des imageries par bioluminescence nécessiteront des injections de luciférine qui se feront en IP sur animal vigile (EU2). Chacune de ces administrations se fera en 15 secondes maximum par animal, prise de l’animal par l’expérimentateur comprise. Lors du suivi de croissance tumorale par imagerie, les souris seront sous anesthésie gazeuse. À la fin de l’expérimentation, les animaux seront mis à mort après anesthésie générale à l’isoflurane (EU2).

Impact sur les animaux

L’injection des cellules cancéreuses par voie sous-cutanée et intraveineuse peut occasionner des dommages dans la queue si les animaux venaient à bouger avec la conséquente angoisse. Les injections se feront donc sous anesthésie à l’isoflurane. D’autres nuisances comme une nécrose pourrait apparaitre si la taille de la tumeur est très grande (plus de 1500 mm3 pour les tumeurs sous cutanées). L’apparition de gêne respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) ou une parésie des membres arrière peuvent être observées (pour la tumeur Raji).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure. Lorsque l’effet thérapeutique (disparition ou diminution de la tumeur) est observé, ce qui devrait arriver au plus tard à la quatrième semaine, les animaux qui n’auront pas atteint le point limite seront aussi mis à mort sous anesthésie préalable. En effet, compte tenu du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, et même si des régressions tumorales pourront être observées, une reprise de la croissance tumorale après la période d’arrêt des traitements est toujours possible et nécessite la mise à mort de l’ensemble des souris pour se prémunir de la souffrance qui peut en résulter.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences in vitro (remplacement) au préalable qui nous ont permis de déterminer l’efficacité de la thérapie CAR-T dans notre modèle ainsi que son potentiel dans l’immunothérapie en cancer. Pour valider nos résultats, nous devons utiliser un modèle murin afin d’étudier notre hypothèse dans l’environnement tumoral. En effet, les études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire d’identifier l’efficacité in vivo mais aussi les effets indésirables potentiels des traitements.

Réduction

Les groupes expérimentaux sont constitués de n=10 individus/condition et l’expérience sera réalisée 2 fois ce qui donnera une puissance statistique fiable. Le fait que ces animaux soient génétiquement les mêmes, permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. L’utilisation des souris de manière indépendante nous permet d’avoir une réelle puissance statistique. Nous avons choisi de mesurer les tumeurs par bioluminescence, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux tout en conservant une puissance statistique suffisante. Les expériences ne seront réalisées que deux fois, les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de l’étude.

Raffinement

Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Les souris chez lesquelles les tumeurs solides et sanguines sont implantées seront examinées trois fois par semaine pour surveiller leur inconfort (taille de la tumeur gênant la mobilité, isolement du groupe, absence de toilettage). Par ailleurs, les injections se feront sous anesthésie gazeuse pour limiter le stress. Des analgésiques seront utilisés en cas de douleur. De plus, les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence des éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés à la cage. Également, des points limites spécifiques seront appliqués. Pour le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs (500 mètres environ), nous transporterons à pied les souris dans des cages filtrées et dans l’obscurité pour limiter le stress causé par le transport. A leur arrivée dans l’établissement utilisateur 2/2, les cages des souris seront changées et placées sur portoir ventilé pour protéger les souris immunodéprimées (phénotype dommageable). Les souris ne seront déplacées qu’une seule fois pour limiter le stress du transport. Ces mesures assureront ainsi le raffinement de l’étude.

Choix des espèces

Il est impossible à nos jours de reproduire avec fidélité l’environnement tumoral et sa réponse à l’immunothérapie. Pour prouver les mécanismes immunitaires impliqués dans la maladie et tester l’efficacité de l’approche thérapeutique, nous devons recourir à l’utilisation d’un modèle animal et l’utilisation de la souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques et des modèles humanisés. Etant donné que l’objectif à long terme sera d’évaluer l’efficacité des cellules CAR-T en thérapie anticancéreuse, nous devons utiliser une espèce présentant une physiologie proche de l’Homme, telle que la souris, qui est un modèle de référence en cancérologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.

Rendues transgéniques pour ne plus produire une protéine des parois artérielles, puis nourries au régime gras, des souris développent des plaques dans leurs artères: 1 882 animaux vont être utilisés dans des procédures classées modérées, tous tués. Le génotypage passe par un prélèvement d'oreille sur près de mille souriceaux, et 893 animaux transgéniques peuvent voir leur mobilité se réduire aux stades avancés. Le porteur veut établir le rôle de cette protéine dans l'athérosclérose, première cause de maladies cardiovasculaires. Les souris d'élevage sont tuées à neuf mois, les autres après sept à huit mois de régime gras, délai qu'il juge "suffisant pour conclure".

Objectifs

L'athérosclérose est la principale cause de maladies cardiovasculaires. Elle se caractérise par l’accumulation de lipides dans la paroi des artères ce qui engendre la modification de la composition du tissu sous-jacent à ces dépôts et par conséquent la fragilisation des vaisseaux sanguins. Notre équipe de recherche s’intéresse à la protéine X. Cette protéine est présente dans de nombreux tissus sains et notamment dans la paroi des artères. L’absence de cette protéine X chez l’homme est associée à une fragilité et un dysfonctionnement des vaisseaux sanguins (ecchymoses spontanées, complications hémorragiques avec saignements gastro-intestinaux et hémorragies post-partum ainsi que anévrismes aortiques thoraco-abdominaux) et les mêmes conclusions ont été établies dans notre modèle de souris transgéniques déficientes en protéine X. Notre objectif est de démontrer le rôle prépondérant de la protéine X dans le développement de l’athérosclérose. Pour cela, nous accouplerons des souris déficientes en protéine X avec des souris transgéniques développant des plaques graisseuses dans la paroi des artères quand elles sont nourries avec un régime riche en graisse. Chez ces souris doublement transgéniques, nous analyserons la vitesse de formation des plaques graisseuses et la composition de la paroi des artères malades. Nous étudierons également comment la protéine X évolue (diminue ou augmente) dans la paroi des artères de souris transgéniques développant des plaques graisseuses quand elles sont nourries avec un régime riche en graisse.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de comprendre l’évolution de la présence de la protéine X dans le développement de l’athérosclérose ; de comprendre son rôle sur celle-ci (rôle positif ou négatif) ; et à terme, d'envisager cette protéine comme un marqueur pour permettre le dépistage précoce de l’athérosclérose et peut-être de cibler cette protéine pour le traitement des patients.

Procédures

Pour le génotypage, un prélèvement sur souris vigile d'un bout d'oreille (

Impact sur les animaux

240 animaux au total seront nourris avec un régime riche en gras à partir de 8 semaines post-naissance, ce qui entraînera une augmentation de la masse corporelle et pourra provoquer un inconfort digestif ou une stéatose hépatique (foie gras) pouvant conduire à une jaunisse. Cependant aucun symptôme évident (troubles majeurs de l’alimentation, comportement…) associé au développement de la pathologie n’a été rapporté chez ces souris aux stades étudiés. Des difficultés d'agrippement pourraient être observées sur une partie des souris transgéniques (893 animaux au total) conduisant à une mobilité légèrement réduite à des stades avancés (>8 mois). De manière générale, les animaux subiront différentes contentions pouvant générer un stress léger de quelques minutes.

Devenir

Tous les animaux d'élevage seront mis à mort à 9 mois. Une reproduction au-delà de ce point de cinétique pourrait impacter le bien-être des animaux et pourrait conduire à une baisse de la fertilité. Pour l'analyse du rôle de la protéine X dans l’athérosclérose, les animaux seront mis à mort au maximum à 8 semaines + 24 semaines de régime riche en graisses soit entre 7 et 8 mois, temps nécessaire et suffisant pour conclure sur le rôle de la protéine X.

Remplacement

Des travaux préalables ont été réalisés dans notre équipe et notamment des analyses sur des aortes de souris déjà prélevées. Toutefois, le développement de la lésion d’athérosclérose implique la participation de nombreux tissus environnants (vaisseaux sanguins, système immunitaire) et de l’organisme dans son ensemble. Il nous est impossible de reproduire les conditions d’initiation et de développement de la pathologie dans des modèles cellulaires. Ainsi, le recours aux modèles de souris génétiquement modifiées est nécessaire pour comprendre le rôle de la protéine X dans l’athérosclérose.

Réduction

Pour l'élevage des souris transgéniques, nous avons réduit le nombre de souris générées au minimum pour réaliser l’ensemble de notre projet. Pour l'analyse du rôle de la protéine X dans l’athérosclérose, nous avons choisi nos effectifs d’après la littérature, nos connaissances des modèles transgéniques utilisés et le type d’analyses à réaliser sur les tissus collectés. Ainsi, le nombre d’individus utilisés est minimal et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en réduisant la souffrance subie par les animaux.

Raffinement

Aucune des souris transgéniques utilisées ne présente de défauts de reproduction ou de vieillissement, ni de sensibilité à des pathogènes communs. Cependant, les souris déficientes en protéine X sont hyperlaxes et présentent des difficultés légères à l'agrippement, même si leur locomotion n'est pas altérée. Pour s'assurer du bien-être des souris, elles seront surveillées de leur naissance à leur mort quotidiennement et seront mises en reproduction de 6 semaines à 9 mois, âge maximal de leur mise à mort. Une surveillance des souris sera réalisée quotidiennement et les animaux seront pesés 1 fois par semaine au cours du développement de l’athérosclérose et notamment dès le début de la mise en place du régime riche en lipides. La qualité de l’alimentation sera également vérifiée (aspect, fraicheur) toutes les semaines et l’alimentation sera changé si besoin. Le même soin sera apporté aux changements des litières pour éviter les dépôts de gras dans la cage. Dans tous les cas, l’alimentation sera changée au minimum systématiquement toutes les 2 semaines pour s’assurer de sa qualité et éviter tout problème d’appétence ou trouble digestif pour les animaux. Le projet a été établi de manière à réduire au minimum les gestes invasifs réalisés sur les animaux. Ainsi, pour les souris transgéniques dont le génotype est certain (parents de même génotype), il sera vérifié après la mise à mort en fin de procédure, évitant ainsi le prélèvement d’une biopsie. Nous testerons également sur 2 lots de souris, une nouvelle technique de prélèvement des aortes sur animaux fraichement mis à mort pour vérifier que la qualité des échantillons est toujours optimale pour nos marquages tissulaires. Si les marquages sont toujours de qualité, nous réaliserons le prélèvement des tissus aortiques après la mise à mort pour toutes les autres souris concernées de la DAP, ce qui participera au raffinement de nos procédures. Lors de la mise à mort par injection, les souris seront préalablement endormies et la solution sera diluée pour que celle-ci ne soit pas irritante (et donc douloureuse) pendant l’injection. Enfin, certains animaux subiront une diète de 20 semaines maximum (au lieu de 24), pour tenir compte d’un éventuel développement plus précoce de la pathologie. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris au maximum (suivant le poids des souris) par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, bâton, et maison en carton).

Choix des espèces

Notre objectif est de comprendre le rôle de la protéine X dans le développement de l’athérosclérose. Le modèle murin est un modèle de choix pour les études des maladies cardiovasculaires. En effet, la proximité génétique et physiologique de la souris avec l’homme permet de reproduire de nombreux aspects de la pathologie humaine, tant sur le plan moléculaire que cellulaire. Le modèle de souris transgénique utilisé est un modèle d’athérosclérose connu et documenté. Il est considéré comme la référence pour l’étude du développement de la pathologie. La cinétique de la pathologie a été largement étudiée et nous savons donc que les stades de développement des plaques chez la souris imitent de manière étroite la progression de l'athérosclérose humaine. Pour l'élevage, les souris seront mises en reproduction à 6 semaines post-naissance jusqu'à 9 mois max. Les souris ne sont pas utilisées au-delà des 9 mois pour éviter une baisse de fertilité potentielle et tout mal-être potentiel. Les souris seront soumises à une diète riche en graisse à partir de 8 semaines après la naissance et seront suivies jusqu'à leur mise à mort (maximum 8 + 24 semaines = 32 semaines). Les souris génétiquement modifiées utilisées n'ont pas de problème de reproduction, ni de vieillissement, mais montrent des difficultés légères lors de tests d'agrippements et de suspension. Pour éviter leur mal être induit par une période de reproduction avancée, elles ne seront mises en reproduction qu'à partir de 6 semaines jusqu'à 9 mois post-naissance. Nous travaillerons sur des souris adultes, donc matures sexuellement pour standardiser notre modèle et cette maturité est atteinte chez le mâle et la femelle entre 5 et 7 semaines.

Soumises à une occlusion provoquant un accident vasculaire cérébral, sous anesthésie, 1 888 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. À l'accident vasculaire s'ajoutent une hyperglycémie induite, trois à huit injections et des prélèvements de sang. Le porteur indique que le modèle peut provoquer douleurs, prostration et difficultés à se déplacer, et que la baisse des plaquettes expose à des saignements. L'étude porte sur les hémorragies intracrâniennes de l'AVC aggravé par un excès de sucre dans le sang, situation qu'il dit rencontrer chez environ 40 % des patients.

Objectifs

En France, l’accident vasculaire cérébral reste une cause majeure de handicap, de troubles cognitifs et de mortalité. Le traitement actuel repose sur la dissolution du caillot par un médicament et/ou son retrait mécanique, quand cela est possible dans les premières heures. Cependant, malgré ces traitements, certains patients s’aggravent rapidement. Un facteur de risque important est l’excès de sucre dans le sang, observée chez environ 40 % des patients. Elle peut provoquer des saignements intracrâniens, aggraver les lésions cérébrales et stimuler des cellules sanguines impliquées dans l’inflammation. Les objectifs du projet sont, d’une part, de mieux comprendre la physiopathologie des saignements intracrâniens chez les patients présentant un accident vasculaire cérébral associé à un excés de sucre dans le sang et, d’autre part, d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements visant à protéger le cerveau contre ces complications hémorragiques.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet donnera des résultats concernant la physiopatholgie de la survenue des saignements intracrâniens et l'efficacité thérapeutique de différents candidats médicaments pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux présentant des saignements. Il permettra ainsi d’envisager une meilleure prise en charge des patients atteints d’un accident vasculaire cérébral ischémique et ainsi une amélioration de la fonction neurologique et de l’état de santé chez ces patients.

Procédures

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de souris d’accident vasculaire cérébral ischémique, procédure réalisée systématiquement sous anesthésie et analgésie. L’intervention chirurgicale dure environ 30 minutes. Chaque animal recevra entre trois et huit injections (traitements, diabète anesthésie profonde et analgésie) ainsi que deux prélèvement sanguins (réalisé à J-1 et J1). L’injection dure en moyenne 10 secondes, tandis que le prélèvement sanguin ne dépasse pas 2 minutes. Toutes les souris feront l’objet d’une évaluation neurologique qui dure environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les modèles d’accidents vasculaires cérébraux peuvent provoquer des douleurs anisi que prostration et difficultés à se déplacer. L’injection de médicament et d’analgesie peuvent provoquer un stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer un stress et une douleur légère de courte durée L’hyperglycémie aiguë peut également entraîner une déshydratation chez l’animal. La diminution des globules blanc peut induire un risque infectieux. La diminution des plaquettes peut induire un risque de saignement. Les tests comportementaux induisent un stress de l’anxiété ou un stress modéré de courte durée

Devenir

Les souris seront mises à mort afin de prélever les tissus cérébraux pour des analyses biologiques.

Remplacement

Aucun modèle in vitro ne permet de rendre compte de l’efficacité d’un traitement thérapeutique à la phase aiguë d’un accident vasculaire cérébral associé à une hyperglycémie aiguë. L'effet biologique des molécules utilisées sur leur cible a été démontré in vitro. La démonstration de leur effet bénéfique thérapeutique avant transposition chez l'homme ne peut se faire que dans un modèle animal proche de la physiopathologie humaine. Les modèles de souris d'accident vasculaire cérébral permettent de reproduire la physiopathologie de l'occlusion de l’artère cérébrale chez l'homme.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons réalisé une étude statistique préalable à l’aide d’un logiciel spécialisé. Cette analyse nous permet de déterminer précisément le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Nous avons conçu nos groupes de manière optimisée en nous basant sur des études antérieures, garantissant ainsi l’utilisation du strict nécessaire d’animaux. De plus, le modèle d’accident vasculaire cérébral hémorragique que nous utilisons est bien maîtrisés par notre équipe, ce qui nous permet de mener nos recherches de façon rigoureuse et éthique. Pour analyser les résultats, nous appliquerons des méthodes statistiques adaptées, garantissant une interprétation fiable des données tout en respectant notre engagement à réduire l’usage des animaux

Raffinement

Leur suivi sera assuré par une équipe qualifiée : un soigneur spécialisé s’occupera d’eux chaque jour, et un chercheur expérimenté effectuera un contrôle approfondi deux fois par semaine. Les souris seront hébergées par groupes de cinq dans des cages ventilées, équipées de materiel pour leur permettre de construire des nids et d’améliorer leur confort. Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique en pré et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 24h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie, nous surveillerons attentivement leur état de santé grâce à une grille d’évaluation précise, prenant en compte des points limites stricts et adaptés au projet. Cette méthode permettra de détecter rapidement toute souffrance et d’y remédier. En cas de douleur, un traitement adapté sera administré, et si nécessaire, une mise à mort sera réalisée selon les réglementations en vigueur afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés