Souris

Jusqu'à deux heures d'IRM sous anesthésie par semaine, plus une échographie de vingt à trente minutes, pour chacune des 368 souris suivies en imagerie. 408 souris au total portent une tumeur osseuse greffée dans la patte arrière et vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyser la tumeur. Elles reçoivent jusqu'à six injections de chimiothérapie, d'immunothérapie, d'anti-angiogénique ou de sérum salé sur animal éveillé, et sont transportées entre deux établissements. Le porteur annonce une gêne à la marche quand la tumeur grossit, des difficultés respiratoires en cas de métastases pulmonaires, et compte sur ces images pour repérer plus tôt, chez les patients, les traitements qui ne fonctionnent pas.

Objectifs

L’ostéosarcome est un cancer des os rare mais agressif, qui survient principalement chez les enfants et les jeunes adultes. Malgré des traitements lourds (chimiothérapie, chirurgie), les options thérapeutiques n’ont que peu évolué depuis 50 ans. Aujourd’hui, il est crucial de trouver des moyens pour détecter plus tôt si un traitement fonctionne ou non, afin d’éviter des thérapies inefficaces et d’adapter rapidement la prise en charge. Ce projet a pour but d’évaluer si des techniques d’imagerie non invasives (échographie et IRM) peuvent aider à suivre l’évolution des tumeurs d’ostéosarcome en temps réel. Ces examens permettraient d’évaluer des changements dans la microstructure de la tumeur (taille, vascularisation, rigidité) et d’identifier des signes précoces de résistance aux traitements. L’objectif final est d’améliorer la prise en charge des patients en personnalisant les thérapies selon la réponse de leur tumeur. L’étude utilisera des modèles expérimentaux de tumeurs chez la souris, ce qui permet de contrôler et de reproduire les expériences avant d’envisager des essais cliniques chez l’humain. Les mesures d’imagerie seront comparées à des analyses réalisées après l’expérience sur les tissus, afin de mieux comprendre les mécanismes de résistance aux traitements. L’objectif de ce projet est donc de suivre l’évolution d’un ostéosarcome chez la souris au cours du temps et d’évaluer la réponse à différents traitements à l’aide de techniques d’imagerie non invasive. L’étude vise à mieux comprendre la dynamique tumorale et à identifier des marqueurs précoces de réponse, tout en limitant le recours à des mises à mort intermédiaires. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont doubles : 1. Pour les patients : Actuellement, il faut attendre plusieurs semaines et réaliser des biopsies ou des chirurgies pour savoir si un traitement contre l’ostéosarcome est efficace. Grâce à ces nouvelles méthodes d’imagerie, les médecins pourraient détecter en quelques jours si une tumeur répond au traitement, et ainsi adapter la thérapie plus rapidement pour chaque patient. 2. Pour la recherche : En comprenant mieux comment la résistance aux traitements se développe, ce projet pourrait aider à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et à concevoir des stratégies pour contourner cette résistance. À terme, cette approche pourrait réduire la durée des traitements inefficaces, améliorer la qualité de vie des patients, et augmenter leurs chances de guérison.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Implantation tumorale : 408 souris recevront une injection sous-cutanée de cellules tumorales dans la patte arrière, sous anesthésie générale à l’isoflurane. L’injection dure environ 10 à 20 secondes ; la durée totale d’anesthésie est d’environ 5 à 10 minutes. Cette intervention est réalisée une seule fois par animal. Traitements expérimentaux : Les 408 souris recevront des injections de traitement (chimiothérapie, immunothérapie, anti-angiogénique ou solution saline), administrées par voie intrapéritonéale (IP) ou intraveineuse (IV), au maximum 2 fois par semaine pendant la durée de l’étude (jusqu’à 3 semaines, soit un maximum de 6 injections par animal). Chaque injection dure environ 10 à 30 secondes. Les injections sont réalisées sur animaux vigiles par du personnel qualifié, selon des techniques limitant le stress et l’inconfort. Examens d’imagerie : Parmi ces animaux, 368 souris bénéficieront d’examens d’imagerie pour le suivi tumoral. • Échographie : réalisée sous anesthésie générale, durée 20 à 30 minutes, au maximum une fois par semaine. • IRM : réalisée sous anesthésie générale, durée 60 à 120 minutes selon les séquences acquises, au maximum 1 fois par semaine. Chaque séance d’imagerie comprend l’induction anesthésique, l’examen et le réveil surveillé (ou anesthésie sans réveil lorsque requis par l’analyse séquentielle). Surveillance : Les 408 souris feront l’objet d’un suivi au minimum deux fois par semaine (poids, comportement, état général), renforcé si nécessaire. Chaque observation dure quelques minutes.

Impact sur les animaux

Pour cette étude, des souris développeront une tumeur osseuse au niveau de la patte, afin de reproduire les caractéristiques de l’ostéosarcome humain. Les animaux pourront ressentir : Un inconfort et un stress temporaire lors de l’implantation de la tumeur, réalisé sous anesthésie et des manipulations pour le suivi de la pousse tumorale et les injections de traitements. Les procédures d’imagerie nécessitent des anesthésies répétées et prolongées, pouvant entraîner une fatigue temporaire. L’injection de certains agents de contraste peut provoquer un léger inconfort, mais ces substances sont rapidement éliminées par l’organisme et ne présentent pas de risque durable. Un stress léger lié aux manipulations régulières (pesées, mesures de la tumeur) et aux examens d’imagerie, qui nécessitent une anesthésie gazeuse. Une gêne à la marche si la tumeur grossit, mais des aménagements (nourriture accessible, cages adaptées) seront mis en place pour leur bien-être. Les animaux peuvent également être exposés à un stress environnemental, lié au transport entre les installations et aux manipulations pour les mesures et pesées régulières. Dans certains cas rares, l’apparition de métastases pulmonaires pourrait provoquer des difficultés respiratoires.

Devenir

À la fin de l’étude, tous les animaux seront mis à mort de manière indolore. Cette étape est indispensable pour pouvoir analyser précisément la tumeur. Les tissus prélevés après le décès permettront d’étudier en détail les effets des traitements au niveau biologique. Ces résultats seront comparés aux images obtenues pendant l’étude (échographie et IRM) afin de mieux comprendre l’évolution de la tumeur et l’efficacité des traitements.

Remplacement

Avant d’utiliser des animaux, des études ont été réalisées uniquement sur des cellules cultivées en laboratoire, en deux et trois dimensions. Ces expériences ont permis de développer et tester les méthodes d’imagerie et d’identifier les paramètres les plus importants pour analyser les tumeurs. Ces travaux in vitro ont ainsi remplacé de nombreuses expérimentations animales exploratoires, réduisant le nombre d’animaux nécessaires. Cependant, les modèles cellulaires ne reproduisent pas la complexité d’une tumeur dans un organisme vivant : ils ne possèdent pas de vaisseaux sanguins fonctionnels, d’interactions avec le système immunitaire ni l’organisation complète des tissus. Or, ces éléments sont essentiels pour mesurer correctement les paramètres d’imagerie envisagés dans ce projet. Pour que les méthodes d’imagerie soient pertinentes et applicables au suivi thérapeutique chez l’humain, il est donc nécessaire de les valider dans un modèle animal vivant, reproduisant fidèlement la physiologie tumorale. Ainsi, bien qu’aucune alternative complète ne permette de remplacer l’expérimentation animale, cette approche progressive permet de limiter le nombre d’animaux utilisés et d’optimiser leur utilisation. Cette stratégie respecte le principe de remplacement en expérimentant d’abord sur des modèles in vitro avant de passer à l’in vivo.

Réduction

Des études préliminaires sur des cellules en laboratoire ont permis de différer l’utilisation des animaux et de réduire leur nombre au strict nécessaire. Ces travaux ont aidé à définir précisément les paramètres à étudier, de sorte que seules les questions ne pouvant pas être résolues autrement soient testées chez l’animal. Le nombre d’animaux a été fixé pour garantir des résultats fiables tout en restant le minimum nécessaire pour évaluer l’intérêt des techniques d’imagerie utilisées. Le projet utilise un modèle tumoral déjà étudié en culture cellulaire, ce qui permet de cibler les expériences in vivo et d’éviter des ajustements ultérieurs susceptibles d’augmenter le nombre d’animaux. Ce projet est organisé de manière séquentielle ce qui permet d’observer l’évolution des tumeurs à différents moments au sein d’un même groupe, sans multiplier les groupes expérimentaux. Les résultats des premières étapes sont utilisés pour ajuster les étapes suivantes, limitant ainsi la duplication des expériences. Les tissus prélevés seront analysés pour plusieurs paramètres, maximisant l’information obtenue par animal.

Raffinement

La nourriture des animaux sera facilement accessible, notamment déposée au fond des cages si des difficultés de déplacement sont observées. Le protocole d’injection des tumeurs et d’imagerie est réalisé sous anesthésie générale avec analgésie adaptée, en utilisant les techniques les moins invasives possibles afin de réduire au maximum la douleur, le stress et l’inconfort. Le suivi des animaux est régulier et cinétique, basé sur des critères précis (poids, mobilité, comportement, respiration, tumeur) permettant de détecter rapidement tout signe de mal-être et d’intervenir avant l’apparition de complications avancées, telles que les métastases pulmonaires. Si nécessaire, le protocole sera arrêté et l’animal mis à mort pour éviter toute souffrance inutile. Les examens d’imagerie se déroulent également sous anesthésie, avec surveillance continue de l’état général et de la respiration. La température corporelle est maintenue à l’aide de dispositifs adaptés pour assurer une récupération optimale (tapis ou lit chauffant). En cas d’anesthésies prolongées, des mesures de soutien, comme la réhydratation et une surveillance renforcée pendant le réveil, seront mises en place.

Choix des espèces

Le modèle d'ostéosarcome établi chez des souris immunocompétentes est décrit depuis plus de 10 ans, et ses caractéristiques (implantation, évolution, réponse à la chimiothérapie) sont bien connues. Les ostéosarcomes sont particulièrement résistants aux traitements conventionnels. Il est donc important de pouvoir valider de manière précoce si une thérapie est efficace ou non afin d’en changer si besoin. Le modèle d’ostéosarcome murin utilisé est obtenu par greffe de cellules murines chez des souris immunocompétentes. L’évolution de ce modèle et sa réponse à des thérapies conventionnelles sont bien connues. De plus, nous avons une bonne maîtrise de ce modèle et une première validation ex vivo des mesures de paramètres ultrasonores liés à la microstructure. Les souris utilisées auront 5 semaines. C’est l’âge minimal pour effectuer les greffes. Les traitements commencent 10 jours après la greffe et se poursuivent pendant 3 semaines à raison de 2 traitements par semaine ce qui amène les animaux à un âge de 12 semaines maximum

Au moins dix-huit mesures du Digit Abduction Score, un score d'écartement des doigts de la patte qui quantifie la paralysie obtenue, sept séances d'imagerie sous anesthésie et une électroporation du muscle soléaire. 541 souris femelles vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les muscles injectés. Le porteur teste huit candidats ARNm dans trois formulations censées relâcher les muscles sur des durées variables, et attend une altération de la locomotion qui est précisément l'effet recherché. Il ne nomme aucune des maladies visées, s'en tenant à des "maladies de la contraction musculaire", et retient des souris de six semaines parce que leur réflexe moteur est plus marqué et plus reproductible que celui d'animaux plus âgés.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter certaines maladies qui provoquent des contractions musculaires anormales. Pour cela, nous testons chez la souris des molécules appelées ARNm, qui permettent aux cellules de produire temporairement des protéines capables de relâcher les muscles. Ces traitements sont conçus pour agir pendant une durée limitée, sans modifier le patrimoine génétique. Différentes formulations sont évaluées afin de contrôler la durée d’action du traitement, de courte à plus prolongée. L’étude vise à comparer leur efficacité, leur durée d’action et leur tolérance, afin d’identifier les solutions les plus prometteuses. Les résultats permettront de mieux comprendre comment adapter ces traitements et de guider le développement de futures thérapies pour les patients.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement, tels que la dystonie ou la spasticité, représentent un enjeu médical et sociétal important en raison de leur caractère chronique et invalidant. Les traitements actuels, bien qu'efficaces, présentent des limites en termes d’effets secondaires, de rapidité d’action et de durée d’efficacité. Le présent projet vise à développer une approche innovante reposant sur des ARNm codant des protéines myorelaxantes, administrés localement. Les bénéfices attendus sont les suivants : Amélioration de la rapidité d’action : obtention d’un effet myorelaxant plus précoce après administration, comparé aux approches actuelles ; Prolongation de la durée d’efficacité : maintien d’un effet thérapeutique sur une période plus longue, réduisant la fréquence des injections ; Réduction des effets secondaires systémiques : grâce à une administration localisée et une expression transitoire contrôlée ; Amélioration de la qualité de vie des patients : diminution des symptômes moteurs et meilleure prise en charge des pathologies chroniques ; Optimisation des stratégies thérapeutiques : identification de candidats offrant le meilleur compromis entre efficacité, tolérance et durée d’action. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de traitements plus ciblés, mieux tolérés et adaptés aux besoins des patients atteints de troubles de la contraction musculaire.

Procédures

Mesure du DAS : Au minimum 18 fois (30 sec/animal) = 9 min /animal Injection / électroporation : une injection= 5 min / animal Pesée : 4 Pesées, 30 sec/ animal = 2 min /animal Imagerie BLI + Injection Luciférine : 7 mesures, 10 min maximum / animal = 70 min.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales peuvent entraîner des nuisances modérées liées à l’administration intramusculaire des composés et aux manipulations répétées. Les principaux effets indésirables attendus sont : Douleur ou inconfort local au site d’injection intramusculaire (muscle soléaire), pouvant être transitoire ; Stress lié aux manipulations répétées (contention, pesée, injections, imagerie) ; Effets liés à l’anesthésie utilisée pour les mesures de bioluminescence (BLI), incluant une récupération transitoire ; Altération transitoire de la locomotion due à l’effet myorelaxant recherché ; Risque de perte de poids ou de diminution de l’état général, surveillé tout au long de l’étude.

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, il n’est malheureusement pas possible de les réutiliser dans une nouvelle série d’expériences. De plus, dans ce projet, les muscles injectés seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Le recours à l’animal est nécessaire pour évaluer l’efficacité et la tolérance des candidats ARNm dans un organisme entier. Les effets étudiés reposent sur des interactions complexes entre le système nerveux et le muscle, ainsi que sur la cinétique d’expression et la réponse fonctionnelle (DAS), qui ne peuvent pas être reproduites par des modèles in vitro ou ex vivo. Des études préalables in vitro ont permis de sélectionner les candidats les plus pertinents, limitant ainsi le recours à l’animal au strict nécessaire..

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. La taille des groupes expérimentaux a été déterminée de manière à garantir des résultats robustes tout en évitant une utilisation excessive d’animaux. La stratégie expérimentale est organisée en étapes successives (tolérance, dose-réponse, sélection), permettant de réduire progressivement le nombre de candidats testés et d’éviter des expérimentations inutiles. Les données obtenues à chaque étape orientent la suite du projet et limitent le recours à des groupes supplémentaires. Enfin, le suivi longitudinal des mêmes animaux (mesures répétées de BLI et DAS) permet de maximiser les informations obtenues par individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions expérimentales sont optimisées afin de limiter la douleur, le stress et la détresse des animaux tout au long de l’étude. Les injections intramusculaires sont réalisées par du personnel formé, avec des volumes adaptés et dans des conditions d’asepsie strictes. Une anesthésie est utilisée pour l’injection et les mesures de bioluminescence, et les animaux sont surveillés jusqu’à récupération complète. L’électroporation, est réalisée selon des paramètres optimisés pour minimiser l’inconfort (analgésie pré/post et anesthésie) Les animaux bénéficient d’un suivi clinique régulier (état général, comportement, poids, score DAS), permettant une détection précoce de tout signe de souffrance. Des points limites prédéfinis sont appliqués afin d’intervenir rapidement (adaptation de la procédure ou mise à mort anticipée si nécessaire). Les conditions d’hébergement respectent les standards en vigueur (enrichissement du milieu, hébergement en groupe lorsque possible), contribuant au bien-être des animaux. Enfin, les procédures sont planifiées afin de réduire le nombre de manipulations et de regrouper les interventions, limitant ainsi le stress global. De plus, tout autre signe clinique observé, indépendamment des procédures (pendant la période d’acclimatation par exemple), fera l’objet de soins tels que définis en accord avec le vétérinaire suivant le tableau fourni en annexe.

Choix des espèces

Le modèle murin est particulièrement adapté à l’évaluation de candidats myorelaxants dans le cadre des maladies de la contraction musculaire. La souris présente une organisation neuromusculaire et des mécanismes de contraction comparables à ceux de l’Homme, permettant une évaluation pertinente de l’effet fonctionnel des traitements. Le test de Digit Abduction Score (DAS) est une méthode validée et largement décrite chez la souris pour mesurer l’activité myorelaxante, offrant un readout fonctionnel direct et reproductible. Par ailleurs, ce modèle est compatible avec le suivi de l’expression des ARNm par bioluminescence (BLI), permettant de corréler la cinétique d’expression avec l’effet pharmacologique. Enfin, la souris constitue un modèle de référence en préclinique pour l’étude des approches basées sur les acides nucléiques (ARNm), notamment en termes de tolérance, biodistribution et efficacité, ce qui en fait un système pertinent pour la sélection et l’optimisation des candidats avant un développement ultérieur. Les études seront réalisées chez des souris Swiss femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation et âgées de 8 à 12 semaines maximum en fin d’expérimentation, correspondant à des animaux jeunes adultes. Ce choix est justifié par leur capacité optimale à exprimer un réflexe moteur reproductible lors du test de Digit Abduction Score (DAS). Les animaux plus jeunes présentent une réactivité neuromusculaire plus homogène et plus marquée, facilitant l’évaluation de l’effet myorelaxant. À l’inverse, les animaux plus âgés peuvent présenter une réponse moins spontanée et plus variable aux stimulations, rendant l’interprétation des résultats moins robuste. Par ailleurs, leur poids modéré permet une manipulation plus aisée et standardisée lors des tests fonctionnels, contribuant à la réduction de la variabilité expérimentale et du stress induit.

Pour mettre au point un modèle de migraine déclenchée par le stress, 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles passent deux heures par jour immobilisées dans un tube, trois jours de suite, puis reçoivent sous la peau une injection d'une molécule qui déclenche la crise. La douleur de la tête est mesurée en piquant le visage avec des filaments semi-rigides, deux fois par semaine jusqu'à ce que la sensibilité revienne à la normale, et jusqu'à cinq prélèvements de sang sont faits à la queue sur animal éveillé. Le porteur qualifie ce stress de "modéré et temporaire, soigneusement contrôlé dans le temps", et prévoit de tuer l'animal en dernier recours si un antalgique ne suffit pas.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer et valider un modèle chez la souris permettant de mieux comprendre la migraine. Ce modèle cherche à reproduire un phénomène observé chez les patients : après un épisode de stress ou une première crise, le système nerveux devient plus sensible, ce qui peut favoriser le déclenchement de nouvelles crises, même en réponse à des stimuli habituellement sans effet. Plus précisément, ce projet vise à déterminer si un stress modéré mais répété peut entraîner cette augmentation durable de la sensibilité, et si l’administration ultérieure d’une faible dose d’une molécule impliquée dans la migraine, peut déclencher des signes caractéristiques d’une crise. L’étude permettra également d’évaluer les effets du stress sur la sensibilité à la douleur au niveau de la tête ainsi que sur certains comportements liés à l’anxiété. Le développement de ce modèle constitue une étape importante pour mieux comprendre les mécanismes de la migraine et, à terme, identifier de nouvelles pistes pour améliorer la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de développer et valider un modèle expérimental chez la souris, plus proche de ce qui est observé chez les patients migraineux. Ce modèle aidera à mieux comprendre comment un stress modéré peut rendre le système nerveux plus sensible et favoriser l’apparition de crises de migraine. À moyen terme, ce modèle constituera un outil important pour étudier les mécanismes biologiques impliqués dans la migraine, ainsi que les circuits du cerveau impliqués dans la perception et la modulation de la douleur. À plus long terme, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques et à l’identification de nouvelles cibles pour le traitement, afin de proposer des alternatives aux patients qui ne répondent pas aux traitements actuels.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 5 : Stress modéré : les animaux seront placés dans des tubes adaptés qui leur permettent de respirer normalement et d’éviter toute blessure. Chaque séance durera 2 heures et sera répétée pendant trois jours consécutifs. Mesure de la sensibilité à la douleur au niveau de la tête : cette évaluation sera réalisée avant le stress, après chaque séance, le lendemain, puis deux fois par semaine jusqu’à ce que la sensibilité revienne à la normale. Chaque mesure dure environ 30 minutes. Injection sous-cutanée d’une molécule capable de déclencher une crise de migraine ou d’une solution contrôle : chaque injection prend moins de 2 minutes. Prélèvements sanguins : réalisés au niveau de la veine de la queue, ces prélèvements permettent de prélever le sang plusieurs fois (jusqu’à 5 fois) sur des animaux vigiles, mis en contention dans des tubes adaptés. Prélèvement vaginal : sera réalisé le jour de l'injection de la molécule déclenchant une migraine. Il se fera sous anesthésie gazeuse, et durera moins de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée chez l’animal. Cette douleur survient après l’injection mais n’empêche pas l’animal de se déplacer normalement. Lors des tests de sensibilité avec des filaments semi rigides, l’animal retire sa tête ou son visage, ce qui indique une douleur modérée. L’animal peut éviter cette stimulation car il n’est pas immobilisé, et chaque stimulation dure moins de 3 secondes. Le protocole de stress induit un stress modéré et temporaire, soigneusement contrôlé dans le temps. Cette procédure est courte et conçue pour minimiser au maximum l’inconfort des animaux.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des techniques/procédures subies et seront de ce fait mis à mort.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation de souris afin de développer et valider un modèle réaliste de migraine. Les mécanismes étudiés, notamment la façon dont le cerveau devient plus sensible après un stress et comment certaines molécules peuvent déclencher des crises, ne peuvent pas être reproduits avec des modèles informatiques ou des cellules en culture. L’étude in vivo est donc indispensable pour obtenir des résultats fiables et pertinents.

Réduction

Le nombre de souris dans chaque groupe a été déterminé grâce à des calculs statistiques afin d’obtenir des résultats fiables, tout en utilisant le moins d’animaux possible. Ces calculs tiennent compte du niveau de certitude souhaité pour les résultats et s’appuient aussi sur nos expériences précédentes et sur la variabilité habituellement observée dans ce type d’étude. L’étude sera réalisée sur des souris mâles et femelles. Chez les femelles, les différentes phases du cycle hormonal seront prises en compte pour vérifier si elles influencent les résultats. Si l’on observe que les résultats sont similaires entre mâles et femelles et que le cycle hormonal n’a pas d’effet, les données pourront être regroupées. Cela permettra de réduire le nombre total d’animaux nécessaires.

Raffinement

À leur arrivée, les souris seront hébergées dans des cages enrichies avec des matériaux pour faire leur nid, par petits groupes de cinq. Elles auront accès librement à la nourriture et à l’eau. Les cages seront maintenues dans une animalerie où la température et l’humidité sont contrôlées, et la litière sera changée une fois par semaine. Si une souris devient agressive envers les autres, elle sera placée seule pour éviter les blessures. Les animaux seront surveillés régulièrement afin de vérifier leur état général et leur comportement (par exemple l’aspect du pelage, la posture ou une éventuelle agitation). Une attention particulière sera portée à l’apparition de signes inhabituels afin de détecter rapidement toute atteinte au bien-être des animaux et d’adapter leur prise en charge si nécessaire. Si un animal présente des signes de douleur pendant l’expérience, un médicament antalgique sera administré pour la soulager. Si son état ne s’améliore pas, la vétérinaire responsable sera consultée. En dernier recours, si l’état de l’animal ne s’améliore pas malgré les soins, il sera mis à mort selon une procédure adaptée afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris, une espèce largement utilisée en neurosciences et dans les études sur la douleur. Leur cerveau et leurs circuits nerveux sont suffisamment similaires à ceux des humains pour permettre l’étude de la vulnérabilité aux crises de migraine. Cette souche peut également être modifiée par des techniques génétiques ou virales, ce qui est utile pour notre projet. Les animaux auront entre 7 et 12 semaines, un âge correspondant à l’état adulte chez la souris.

Un lot de souris femelles est privé de ses ovaires par chirurgie et reçoit un implant hormonal, pour les rendre réceptives et servir de partenaires aux tests de comportement sexuel des mâles. 2 916 souris au total vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie du cerveau de trente à quarante-cinq minutes, les mâles sont hébergés seuls avant les tests d'accouplement qui durent neuf heures, et le porteur relève lui-même le stress lié à cet isolement. La majorité est tuée pour prélever le cerveau, une petite partie est tuée sans aucun prélèvement, parce que ces femelles ne servent plus une fois leur implant hormonal périmé.

Objectifs

L’infertilité est aujourd’hui un enjeu majeur de santé publique dont les causes et les mécanismes d’action demeurent mal compris. La fertilité repose sur une régulation adéquate par le cerveau des régions impliquées dans les fonctions de reproduction. L'organisation de ces structures cérébrales, en particulier dans l’hypothalamus, est contrôlée par les hormones stéroïdes sexuelles, testostérone et estradiol, pendant des périodes critiques de développement, de la naissance à la puberté. Le but de ce projet de recherche est de comprendre le rôle de l’œstradiol au cours du développement pubertaire dans les changements de plasticité de l’hypothalamus. Des souris seront utilisées afin d’investiguer les mécanismes d’action de l’œstradiol dans l’organisation pubertaire des réseaux neuraux sous-jacents la régulation des fonctions de reproduction. Les données issues de ce projet aideront à mieux comprendre les troubles pubertaires et contribueront à élucider les mécanismes d’actions impliquées dans le contrôle des fonctions de reproduction mâle et femelle. Cela pourrait ainsi conduire à développer des stratégies thérapeutiques spécifiques au sexe et à l’âge pour remédier aux troubles de la fertilité.

Bénéfices attendus

La puberté est une période critique de la vie qui permet d’atteindre la maturité sexuelle et ainsi permettre la reproduction. C’est une période cruciale de transition entre l’enfance et l’âge adulte qui, en plus de l’apparition des caractères sexuels secondaires, s’accompagne d’importants changements psychiques et comportementaux. Néanmoins de manière surprenante les mécanismes cérébraux sous-tendant ces changements sont aujourd’hui encore mal compris. Les données obtenues dans ce projet contribueront à déterminer les mécanismes d’action qui contrôlent l’organisation pubertaire du cerveau par les hormones stéroïdes sexuelles. Ceci est particulièrement pertinent si nous voulons développer de meilleurs traitements pour les troubles de la puberté mais également pour les troubles psychiatriques et comportementaux qui se manifestent souvent pendant cette période.

Procédures

Une partie des souris mâles et femelles subira une chirurgie au niveau du cerveau sous anesthésie générale et avec une analgésie pré et post-opératoire. La chirurgie durera entre 30 et 45 minutes maximum. Un lot de souris femelles subira un acte de chirurgie afin d’induire la réceptivité par retrait chirurgical des ovaires et pose d’un implant hormonal. La chirurgie durera maximum 10 minutes sur animaux anesthésiés et recevant une analgésie pré et post-opératoire. Ces femelles subiront également 2 injections d’hormones avant les tests de comportement sexuels. Le comportement des mâles et femelles sera analysé à l’âge adulte : - comportement spontané d’accouplement (2 tests séparés de 15 jours, d’une durée 9h pour les mâles ; 3 tests séparés de 10 jours d’un durée de 30 minutes pour les femelles, sur animaux vigiles). - test d’activité locomotrice spontanée (durée de 120 minutes sur animaux vigiles) et test d’anxiété spontanée (durée de 9 minutes sur animaux vigiles). Une partie des animaux subiront une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésique d’une durée de 20 minutes maximum. Les animaux restants seront anesthésiés profondément et euthanasiés. A l’issue de cet acte terminal les prélèvements sont réalisés pour analyse.

Impact sur les animaux

Les chirurgies au niveau du cerveau des souris se feront sous anesthésie. Les éventuels nuisances et effets indésirables à court et à long terme liés à cette chirurgie sont une hypothermie, un arrêt cardio-respiratoire liée à l’anesthésie, une douleur post-opératoire se traduisant par une apparence, une position et des comportements anormaux ainsi qu’une perte de poids rapide. Les injections d’anesthésiques et d’antalgiques peuvent générer une douleur légère au point de piqure. Un léger inconfort peut être généré par la première introduction des souris dans les dispositifs liés aux tests comportementaux. Un stress peut être lié à l’hébergement individuel des mâles avant les tests de comportements. L’anesthésie effectuée pour les ovariectomies est également associée à certains risques (hypothermie, arrêt cardio-respiratoire…). De plus, un stress peut être lié à la chirurgie effectuée chez les femelles. Cette chirurgie peut également entrainer des douleurs.

Devenir

La majorité des animaux seront euthanasiées afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses histologiques et fonctionnelles. Une faible partie des animaux seront euthanasiés sans prélèvement à la fin des expériences de comportement car ces souris femelles ne peuvent être réutilisées au-delà de la période de validité des implants délivrant des hormones pour étudier le comportement sexuel des mâles.

Remplacement

L'étude du rôle de l’œstradiol dans la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire nécessite des modèles animaux pour pouvoir étudier le réseau neuronal complexe au sein de l’organisme entier. Des animaux vivants seront donc nécessaires pour ce projet. Ce projet comporte des analyses neuroanatomiques et neuroendocrines. Il n'est donc pas possible de le développer par des méthodes alternatives et/ou substitutives.

Réduction

Le nombre total d'animaux utilisé est de 2916, ce qui permet une analyse combinée des mâles et des femelles et cela à différents stades du développement pubertaire. Des protocoles biologiques différents ne permettent pas d’effectuer toutes les analyses sur les mêmes échantillons. L’expertise scientifique de l’équipe dans l’étude neuroanatomique des fonctions de reproduction permet de connaitre le nombre d’animaux nécessaire par groupe afin d’obtenir des résultats fiables. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, nous déterminerons avec une première cohorte d’animaux les meilleures conditions d’injection des vecteurs viraux. Les effectifs utilisés ont été calculés au plus juste grâce à un calcul de puissance. Des analyses statistiques seront effectuées afin de réaliser une interprétation fiable des résultats. Afin de réduire le nombre d'animaux, les organes non utilisés dans ce projet (hypophyse, ovaire, dents, squelette...) seront proposés aux collaborateurs de l'équipe comme cela est fait habituellement. Par ailleurs, les résultats obtenus au fil de la réalisation de ce projet nous permettront d’affiner nos besoins et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires. En effet, nous envisageons de sélectionner les conditions induisant une perturbation du comportement sexuel à l’âge adulte, lors des premières expérimentations, afin de conserver uniquement celles-ci dans les expérimentations suivantes. Le nombre d’animaux indiqué dans cette demande correspond donc au nombre maximal d’animaux pouvant être utilisés dans cette étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie, sous la supervision de soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L'hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE en termes d'espace et d'environnement. Les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l'enrichissement, un nid sera placé dans la cage. Avant chaque procédure chirurgicale, une analgésie sera effectuée par l’injection d’un analgésique 20 minutes avant la procédure. Les souris seront surveillées et pesées quotidiennement en post-opératoire, puis hebdomadairement afin de s'assurer que toute souris présentant un ou plusieurs points limites sera euthanasiée. La douleur post-opératoire sera prise en charge par injection d’un analgésique durant les 3 jours suivant les chirurgies. Toutes les euthanasies des animaux seront effectuées sous anesthésie générale. L'anesthésie profonde de l'animal est vérifiée par le pincement de la patte arrière et l'absence du réflexe de clignement de paupière suite à une stimulation de l'œil. Une analgésie sera effectuée 20 minutes avant la chirurgie terminale.

Choix des espèces

La souris est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et neuroanatomiques grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...), et de données dans la littérature permettant d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Des souris mâles et femelles adultes seront utilisées. De plus, des souris mâles et femelles seront utilisées à différents âges prépubertaires et pubertaires. Ce projet vise à étudier la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire, l’utilisation de ces différents âges permettra d’étudier le plus précisément possible les mécanismes d’action de l’estradiol lors du développement pubertaire.

Ce projet fonctionne comme un criblage in vivo de conjugués anticorps-médicament et de nanoparticules lipidiques censés contrer l'épuisement des lymphocytes CAR-T. 2 200 souris immunodéficientes y sont utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de tumeur, deux à six injections de cellules ou d'agents pharmacologiques, jusqu'à dix séances d'imagerie par bioluminescence et jusqu'à six prélèvements de sang. Le porteur décrit une leucémie disséminée, une anémie, un risque d'ulcération de la tumeur, une gêne respiratoire progressive et une maladie du greffon contre l'hôte, puis conclut que seul un criblage in vivo permet d'identifier des cibles de façon fiable.

Objectifs

Les thérapies cellulaires adoptives, notamment les lymphocytes T exprimant un récepteur antigénique chimérique (CAR-T), représentent une avancée thérapeutique majeure en oncologie. Leur efficacité reste cependant limitée, en particulier dans les tumeurs solides, principalement en raison du phénomène d'épuisement fonctionnel des lymphocytes T. Cet état se caractérise par une perte progressive des fonctions effectrices, une diminution de la capacité d'auto-renouvellement et une persistance réduite dans un microenvironnement tumoral immunosuppresseur, souvent associé à la surexpression de récepteurs inhibiteurs. Ce projet vise à évaluer des stratégies pharmacologiques innovantes et complémentaires pour contrer cet épuisement et potentialiser les thérapies cellulaires, en ciblant deux classes d'agents : des conjugués anticorps-médicament permettant de délivrer spécifiquement un agent cytotoxique ou immunomodulateur aux cellules T exprimant un récepteur de surface ; ou des • nanoparticules lipidiques ciblées pour l'inhibition in vivo de gènes clés de l'épuisement. Ce projet intègre également l'évaluation de lymphocytes T humains génétiquement modifiés par édition du génome. Ces stratégies visent à produire des cellules T dotées d'une résistance accrue à l'épuisement, à la suppression immunologique et au rejet allogénique.

Bénéfices attendus

Court terme : identification des stratégies pharmacologiques et des modifications génétiques les plus efficaces pour limiter ou reverser l'épuisement des CAR-T ; mise en évidence de combinaisons thérapeutiques plus efficaces contre des tumeurs hématologiques et solides réfractaires. Moyen terme : génération de données mécanistiques permettant de comprendre les bases biologiques des effets observés ; définition de fenêtres thérapeutiques sûres pour chaque agent ; validation de la stratégie d'édition génomique pour produire des cellules T améliorées. Long terme : développement d'essais cliniques combinant thérapies cellulaires génétiquement optimisées et modulateurs pharmacologiques ciblés, avec amélioration attendue du pronostic de patients pour lesquels les options thérapeutiques actuelles sont limitées.

Procédures

Une injection de greffe tumorale par animal. Durée : 5–10 minutes par intervention (incluant contention, anesthésie et réveil). Toujours réalisées sous anesthésie générale. • Injections de thérapies cellulaires et d’agents pharmacologiques 2 à 6 injections par animal au total (incluant les injections de cellules et des agents pharmacologiques, réparties sur la durée de l’étude). Durée : 5 minutes par séance d’injection (induction anesthésie + injection + réveil). Toutes les injections sont réalisées sous anesthésie générale . • Imagerie in vivo par bioluminescence pour suivi de la charge tumorale et de la persistance des cellules thérapeutiques. 3 à 10 séances au maximum selon le modèle tumoral et la survie des animaux. Durée : 10–20 minutes par séance (incluant anesthésie générale, injection de substrat si nécessaire, acquisition des images et réveil). • Prélèvements sanguins : 2 à 6 prélèvements par animal sur l’ensemble de l’étude. Durée : 5 minutes par prélèvement, animaux anesthésiés lors des procédures les plus invasives.

Impact sur les animaux

Pour certains animaux, les nuisances sont liées à la dissémination leucémique progressive (altération modérée de l'état général) et aux cytopénies secondaires, notamment une anémie modérée bien tolérée dans les délais de l'expérience. Les injections répétées induisent un stress ponctuel limité par l'anesthésie systématique. Pour d'autres animaux, les nuisances sont liées à la croissance tumorale au flanc (gêne mécanique, risque d'ulcération) et aux injections répétées sous anesthésie. Pour le modèle orthotopique pulmonaire, les nuisances spécifiques sont liées à l'atteinte fonctionnelle pulmonaire progressive (dyspnée, diminution modérée de la capacité respiratoire). Pour d'autres animaux (modèle humanisé) : Les nuisances incluent la croissance tumorale, les injections répétées sous anesthésie, et le risque de maladie du greffon contre l'hôte — nuisance spécifique modérée. D'autres animaux pourront avoir des nuisances liées à la croissance tumorale (gène mécanique, diminution d'apétit modérées).

Devenir

À l’issue des procédures expérimentales, tous les animaux seront euthanasiés pour des analyses immunologiques, histologiques, moléculaires et multi-omiques approfondies. Ces analyses nécessitent la mise à mort des animaux.

Remplacement

À l’heure actuelle, il n’existe pas d’alternative pertinente à l’utilisation de modèles in vivo pour atteindre les objectifs de ce projet. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire l’environnement immunosuppresseur complexe auquel est soumis le système immunitaire in vivo. Le système immunitaire est fortement compartimenté entre les organes lymphoïdes et les tissus, avec une régulation fine des flux cellulaires et des signaux (cytokines, chimiokines) entre ces compartiments. Seule une approche de criblage in vivo permet de prendre en compte ces interactions dynamiques entre cellules tumorales, cellules immunitaires et agents pharmacologiques, et ainsi d’identifier de manière fiable des cibles présentant un potentiel thérapeutique majeur.

Réduction

L’ensemble du plan expérimental a été conçu pour utiliser le nombre minimal d’animaux compatible avec la robustesse scientifique des résultats. L’imagerie longitudinale non invasive permet de suivre l’évolution tumorale chez un même animal au cours du temps, chaque individu servant en partie de son propre contrôle, ce qui réduit le nombre total de souris nécessaires. Les tailles de groupes ont été déterminées à partir de calculs de puissance statistique, en tenant compte de la variabilité attendue du modèle, afin de limiter le nombre d’animaux tout en garantissant la détection des effets biologiquement pertinents. Les analyses de croissance tumorale ainsi que l'évolution des maladies seront réalisées par tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux en procédure auront un examen clinique quotidien. Toutes les procédures invasives, y compris l’imagerie, seront réalisées sous anesthésie générale appropriée, associée à une analgésie systématique et préemptive lorsque cela est indiqué, afin de minimiser douleur, stress et inconfort. Les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi (abris, matériaux de nidification, objets d’exploration) et manipulés par du personnel formé aux bonnes pratiques visant à réduire le stress. Un suivi clinique quotidien sera assuré à l’aide d’une grille de score standardisée (poids, aspect du pelage, posture, activité, prise alimentaire, taille et aspect de la tumeur, etc.) et des points limites précocesseront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est le modèle préclinique standard en immuno-oncologie. Les lignées immunodéficientes utilisée permettent la xénogreffe de tumeurs humaines et l'injection de cellules immunitaires humaines en créant un microenvironnement tumoral et immunitaire proche de la situation clinique. Aucune espèce alternative ne permet de réunir ces propriétés. L'ensemble des animaux est utilisé au stade adulte, entre 6 et 12 semaines (jusqu’à 16 semaines pour les suivis prolongés). Ce stade est le seul pertinent pour les objectifs du projet : les études d'efficacité antitumorale et d'immunothérapie nécessitent un système immunitaire mature et fonctionnel, une capacité de greffe tumorale établie.

Mises en reproduction, nourries pour une partie d'un aliment enrichi en sucre du lait humain, les femelles sont tuées au dix-neuvième jour de gestation pour une hystérectomie. Les nouveau-nés extraits sont imprégnés de l'urine d'une femelle adoptante puis glissés dans sa portée, avec de la nourriture au fond de la cage pour limiter le cannibalisme. À 28 et 38 jours ils reçoivent une injection d'allergène dans l'abdomen, à 45 jours un gavage du même allergène déclenche la réaction, température rectale et symptômes relevés pendant trente minutes. 144 souris sont utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées. Les reproductrices à l'hystérectomie, les adoptantes après le sevrage, la descendance le jour où l'allergie est provoquée.

Objectifs

Les allergies alimentaires peuvent apparaitre tôt dans la vie, car elles sont liées à des anomalies du système immunitaire, du microbiote et de la barrière intestinale dès la naissance. L’alimentation maternelle peut influencer la maturation de ces systèmes et donc le risque d’allergie. Les sucres du lait humain ont la capacité de renforcer la barrière intestinale, favoriser les bactéries bénéfiques pour la santé et d’induire la tolérance immunitaire. Nous avons démontré qu’une supplémentation en sucre du lait maternel pendant la grossesse protégeait la descendance de l’allergie alimentaire chez la souris, grâce à la présence d’une empreinte immune chez le fœtus et microbienne associé à la protection de la descendance. Chez la souris, nous avons démontré que la naissance par césarienne, supprimant l’empreinte microbienne, ne permettait plus la protection des descendants à l’allergie alimentaire par la supplémentation en sucre du lait maternel pendant la grossesse, malgré la présence de l’empreinte immune chez la descendance. Ces résultats permettent de dire que le transfert microbien à la naissance semble nécessaire à la prévention de l’allergie alimentaire. Dans ce projet, nous souhaitons comprendre si ce transfert à la naissance suffit à prévenir l’allergie alimentaire chez la descendance à lui seul, ou si l’empreinte immune et le transfert microbien sont tous deux nécessaires. L’objectif de ce projet est de ne pas induire l’empreinte immune liée à la supplémentation en sucre du lait maternel chez le fœtus, mais de coloniser des souriceaux nés par césarienne par un transfert de bactéries fécales de mères supplémentées en sucre du lait maternel. Nous pourrons alors évaluer si l’effet préventif de la supplémentation en sucre du lait maternel sur l’allergie alimentaire chez la descendance est toujours présent.

Bénéfices attendus

Nous avons déjà démontré chez la souris qu’une supplémentation prénatale en sucre du lait maternel pendant la grossesse protégeait de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. Nous avons également caractérisé les transferts immuns entre la mère et son foetus ainsi que l’empreinte microbienne spécifique transmise de la mère au souriceau. Nous avons démontré que le transfert microbien à la naissance est nécessaire à la prévention de l’allergie alimentaire chez la descendance et que l’empreinte immune n’est pas suffisante pour prévenir l’allergie. Au cours de ce projet, nous souhaitons définir si le transfert du microbiote à la naissance, issus de femelles gestantes supplémentées ou non avec le sucre du lait maternel, peut à lui seul permettre la protection de la descendance, ou si l’empreinte immune associée au transfert microbien à la naissance sont nécessaires à la prévention de l’allergie chez la descendance.

Procédures

Des pesées (1-2 minutes) seront réalisées pouvant induire du stress chez la souris, réduit par l’utilisation de tube de transport pour éviter de prendre la souris en main. Une partie des femelles reproductrices sera exposée à un aliment enrichi en un oligosaccharide du lait maternel, dès leur arrivée à l’animalerie et ceci jusqu’à leur mise à mort au 19ème jour de gestation. Des fèces seront récoltées chez les femelles gestantes au jour 18 de gestation (fin de gestation) et la descendance au jour 22 et 44 de vie. L’animal sera placé dans une cage propre sous un poste de sécurité microbiologique pendant quelques minutes, le temps de récupérer les fèces. Une injection intrapéritonéale sera effectuée sur les descendants à 28 et 38 jours de vie afin de les sensibilisées à l’allergène. Lors de l’injection, la souris sera prise en contention pendant quelques secondes afin de réaliser une injection sûre avec une douleur minime. L'adjuvant présent dans la solution de sensibilisation peut enrainer de léger maux de vantre, entrainnant une surveillance des animaux le jour de la sensibilisation. A 45 jour de vie, un challenge oral par gavage de l’allergène sera réalisé sur la descendance. Lors du gavage, la souris sera prise en contention pendant quelques secondes afin de réaliser un gavage oral sûr sans douleur. La température rectale et corporelle et les symptômes cliniques de l'allergie seront suivis les 30 minutes suivants le challenge oral.

Impact sur les animaux

La reproduction ainsi que les pesées, pour confirmer la gestation, peut occasionner un stress chez la souris par la répétition des gestes et la sortie des cages. Un stress sera induit aux femelles adoptantes lors de l’échange de portée. Lors de l’injection intrapéritonéale de l’allergène, une petite lésion au niveau de l’introduction de l’aiguille peut avoir lieu. L’Alhydrogel, un adjuvant présent dans la solution de sensibilisation, peut induire des maux de ventres aux souris. Lors du gavage oral, les symptômes de l’allergie sont provoqués chez les souris (baisse de température, irritation bouche/oreille, isolement/diminution de l’activité). Lors de la prise de température rectale pour mesurer la chute de température induite par la réaction allergique, une irritation du colon peut avoir lieu.

Devenir

A la fin de ce projet, la totalité des animaux seront mis à mort. Les femelles reproductrices seront mises à mort à 19 jours de gestation afin de réaliser les hystérectomies. Les femelles adoptantes seront mises à mort après le sexage et la fin du sevrage. La descendance sera mise à mort à la suite du protocole de sensibilisation et du challenge oral dans le cadre de l'allergie alimentaire.

Remplacement

Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes que sont le microbiote et le système immunitaire intestinaux in vitro ou in silico, et ce, notamment dans le cadre d’interactions complexes comme ici avec des HMO et leur influence au cours de la période prénatale.

Réduction

Ce modèle animal utilisé a été conçu pour permettre de réduire un maximum le nombre d’animaux grâce à notre connaissance sur l’efficacité des reproductions sur 12h, les taux de cannibalismes et d’adoption après hystérectomie, et du nécessaire pour obtenir une différence des paramètres observés statistiquement différent entre les groupes (Annexe 2 et 3). Des outils statistiques ont été utilisés afin de réduire au maximum le nombre de souris par groupe pour être statistiquement relevant sur le paramètre principal de l’étude : la présence ou non de symptômes de l’allergie. Nous avons prix en compte le taux de mortalité lors des hystérectomies mais aussi lors des adoptions. Les souris de la procédure 1 qui n’auront été utilisées que pour la récolte de fèces seront utilisées pour augmenter le n de notre précédent protocole. Les souris surnuméraires ou non utilisées seront mises à mort ou utilisées pour des protocoles in vitro.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales, pour assurer les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux, avec un suivi quotidien des animaux. Les souris seront hébergées dans des cages dans un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité) à 2 (femelles reproductrices), 1 (mâle reproducteur) et 4 (descendance) par cage selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton). Nous avons observé que les mâles entrés en reproduction deviennent plus agressifs envers leurs congénères du même sexe. Les mâles reproducteurs seront hébergés à 5 par cage avant la première reproduction puis 1 par cage par la suite. Une demande de dérogation pour l’hébergement des mâles a été ajouté à ce projet. Pour limiter le stress des pesées, les souris seront déplacées avec un tube en plastique, présent dans la cage, lui permettant de s’y glisser. Pour limiter cannibalisme ou rejet pendant les adoptions, les nouveau-nés seront imprégnés de l’odeur de la femelle adoptante par l’urine de la femelle et par la litière avant de placer les nouveau-nés dans la cage. L’échange des petits sera rapide sans déplacer le nid. Les femelles adoptantes seront le moins touchées possible. Les adoptions auront lieu dans une salle où seul deux expérimentateurs pourront entrer. De la nourriture sera placée dans le fond de la cage pour limiter le risque de cannibalisme. En cas de rejet, les petits seront séparés de la femelle adoptante pour être placés dans une autre portée, ou euthanasiés si des signes de souffrances ou des blessures sont observés. Pour obtenir le matériel fécal nécessaire à la procédure 2, nous avons besoin de femelles gestantes CT et 2’-FL. Afin d’optimiser l’utilisation de ces animaux, nous allons les utilisés pour augmenter le nombre de groupe d’un projet précédent. La sensibilisation et l’induction de l’allergie alimentaire peut induire un mal-être chez l’animal (Annexe 2). Une surveillance plus élevée des animaux est réalisée au cours de la journée des sensibilisations. Au cours des 30 minutes suivants le gavage oral, un suivi des symptômes cliniques (Annexe 2) et de la température rectale nous permettra de statuer sur l'état de la souris. En cas d'une chute de température supérieur à 5°C ou d'un mal-être trop important chez l'animal, nous prendrons la décision de mettre à mort l'animal avant la fin des 30 minutes.

Choix des espèces

Nous avons démontré chez la souris qu'une supplémentation durant la grossesse en prébiotiques et en sucre du lait maternel protégeaient la descendance de la survenue de l’allergie alimentaire. Afin de rester cohérent dans nos études, nous devons rester sur la même espèce. Les souris mâles et femelles reproducteurs seront âgées respectivement de 10 et de 6 semaines à leur arrivée. Les souris seront mises en reproduction à 11 et 7 semaines de vie, l’âge où elles sont mâtures sexuellement. Les souris gestantes seront mises à mort au 19ème jour de gestation afin de réaliser les hystérectomies. Si la reproduction sous 12h n’a pas été efficace, les souris non-gestantes seront de nouveau accouplées avec d’autres mâles la semaine suivante et ceci, jusqu’à ce que le nombre de descendants nécessaire soit atteint. Les souris certifiées gestantes seront utilisées pour l’adoption des nouveau-nés venus au monde par hystérectomie. Après le sevrage des petits à 21 jours de vie, les adoptantes seront mises à mort. La descendance sera sensibilisée à l'allergie à partir de 4 semaines de vie puis provoquée avec le même allergène, puis mise à mort le jour de la provocation de l'allergie à 6 semaines de vie afin d’étudier les cellules immunes dans divers organes.