Souris

Injectés dans une veine du visage sous cryo-anesthésie au premier jour de vie, dans la queue, dans un muscle de la patte, dans un ventricule cérébral ou dans le canal rachidien selon le groupe, des vecteurs viraux sont administrés une fois à chaque animal. 10 000 souris sont utilisées ainsi, dont 3 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer des thérapies géniques contre des maladies neuromusculaires. Le porteur décrit des lignées dystrophiques qui "conservent une très bonne santé générale et une espérance de vie normale", avec une dégénérescence musculaire progressive mais lente. Les souriceaux dont le génotype ou le sexe ne convient pas sont tués après génotypage, les autres suivis jusqu'à six mois puis tués après une chirurgie terminale de mesure de la force musculaire.

Objectifs

Nous développons de nouvelles approches thérapeutiques pour des maladies neuromusculaires, c’est-à-dire des pathologies qui affectent le fonctionnement des muscles et peuvent également impliquer les nerfs qui les contrôlent. Ces maladies entraînent une faiblesse musculaire progressive, pouvant altérer la mobilité, la posture et, dans certains cas, certaines fonctions vitales. Ces atteintes sont généralement liées à des anomalies au sein des cellules musculaires, notamment au niveau de structures essentielles à leur stabilité et à leur bon fonctionnement. Lorsque ces structures sont altérées, les fibres musculaires deviennent plus fragiles et se dégradent progressivement, conduisant à une perte de masse et de force musculaire. Certaines de ces maladies peuvent également toucher d’autres organes, ce qui en fait des pathologies complexes et hétérogènes. À ce jour, les options thérapeutiques disponibles restent limitées et ne permettent pas de traiter efficacement la cause de ces maladies. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies capables d’agir directement sur les mécanismes responsables des atteintes musculaires. Dans ce contexte, nous évaluons des approches innovantes visant à restaurer ou améliorer le fonctionnement des cellules musculaires. Ces stratégies sont d’abord étudiées sur des cellules humaines issues de patients, puis dans des modèles animaux, afin d’analyser leur efficacité et leur tolérance dans un environnement biologique plus complexe. Ces étapes sont indispensables pour mieux comprendre les effets du traitement et pour envisager, à terme, une application chez l’humain.

Bénéfices attendus

Les travaux proposés ont pour objectif d’évaluer et d’optimiser différentes approches thérapeutiques innovantes pour des maladies neuromusculaires d’origine génétique. Ces études reposent sur l’utilisation de modèles animaux présentant des altérations comparables à celles observées chez les patients, permettant d’étudier ces maladies dans un contexte biologique global et pertinent. À court terme, ce projet vise à analyser l’efficacité, la tolérance et la distribution dans l’organisme des approches développées. Il permettra notamment d’identifier les conditions d’administration les plus adaptées, telles que la dose ou la voie d’administration, afin d’obtenir une action efficace au niveau des muscles. Les effets du traitement seront évalués à l’aide de différents paramètres complémentaires, incluant la fonction musculaire, l’analyse des tissus et l’étude de marqueurs biologiques, afin de déterminer une éventuelle amélioration de l’état musculaire. Les bénéfices scientifiques immédiats résident dans l’acquisition de données essentielles sur l’efficacité et la sécurité de ces approches, constituant une étape indispensable avant toute application chez l’humain. À plus long terme, ces travaux contribueront à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans ces maladies et à orienter le développement de stratégies thérapeutiques plus performantes et mieux adaptées. Ainsi, ce programme présente un intérêt scientifique important en permettant de faire progresser de nouvelles approches thérapeutiques, avec des retombées potentielles significatives sur le plan médical et sociétal, notamment pour des maladies actuellement sans traitement curatif efficace.

Procédures

Administrations de vecteurs rAAV : Chaque animal recevra une seule administration de vecteur ou de solution contrôle, par l’une des voies suivantes selon le groupe expérimental et l’âge : injection intraveineuse (veine faciale chez le nouveau-né P0–P1 ou veine caudale chez l’adulte), injection intramusculaire (muscle tibial antérieur), injection intracérébroventriculaire, ou intrathécale. La durée de chaque injection est comprise entre 2 et 10 minutes. Les injections chez l’adulte sont réalisées avec ou sans anesthésie selon la voie, et les injections néonatales sont effectuées sous cryo-anesthésie. Biopsie auriculaire pour le génotypage : Une biopsie auriculaire unique est réalisée chez les animaux issus de l’élevage afin de permettre leur génotypage. Cette procédure, réalisée sur animal vigile sous contention douce, dure moins de 2 minutes par animal. Tests fonctionnels comportementaux et moteurs : Les animaux subiront une session unique de tests fonctionnels comprenant le rotarod, le test de suspension sur fil (hang wire) et le test de force de préhension (grip strength). La durée totale de cette session est d’environ 30 à 45 minutes par animal, incluant les périodes de repos entre essais. Ces tests sont réalisés sur animaux vigiles. Chirurgie terminale pour l’évaluation de la fonction musculaire : En fin de protocole, les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale terminale sous anesthésie générale (kétamine/xylazine), visant à la mesure ex vivo de la force isométrique du muscle tibial antérieur. Cette procédure dure environ 30 à 60 minutes par animal. Les animaux sont ensuite euthanasiés sans réveil, conformément à la réglementation. Les animaux sont maintenus en expérimentation pour une durée maximale de 6 mois après injection, tandis que les animaux reproducteurs sont conservés jusqu’à 12 mois.

Impact sur les animaux

A) Nuisances liées au phénotype Modèles hDMDmdx, hDMDmdxDel44 et hDMDmdxDelCH2 Ces lignées expriment soit la version sauvage (hDMD), soit des versions mutées du gène DMD humain (hDMDmdxDel44 et hDMDmdxDelCH2). Elles présentent un phénotype musculaire comparable à celui observé dans d’autres modèles de dystrophie de Duchenne, mais d’intensité légère à modérée. Ces animaux conservent une très bonne santé générale et une espérance de vie normale. La surexpression de la dystrophine humaine ne provoque pas de pathologie connue. Une dégénérescence musculaire progressive mais lente peut apparaître à partir de l’âge de 3 à 12 semaines, sans impact significatif sur la locomotion ni sur la survie. Modèles FVB, HSAlr et DMSXL Ces lignées expriment soit la version sauvage (FVB), soit des versions mutées du gène DMPK (HSAlr et DMSXL). Elles présentent un phénotype musculaire comparable à celui observé dans d’autres modèles de DM1, mais d’intensité légère à modérée. Pour la HSAlr, le gène muté n’étant exprimé que dans les cellules musculaires, ces souris ne développent qu’un phénotype musculaire, principalement des myotonies de certains muscles mais qui n’affectent pas leurs espérances ou leurs qualités de vie. Pour les DMSXL, ces souris ont principalement un très léger phénotype neuronale qui également ne changent pas leur durée de vie ou leur bien-être. Effets liés aux injections d’AAV (U7-ACCA, U7-del44, U7-delCH2, U7-DM1) Les vecteurs AAV9 ont été utilisé plusieurs fois dans des essais cliniques aux doses proposées dans ce projet. Ils ne sont pas attendus comme toxiques même à long terme sur la base des données générées au préalable (études menées en utilisant 1.e15vg total dans des souris P0-P1 jusqu’a 18 mois). . Chez certaines lignées (notamment hDMDmdxDel44 et hDMDmdxDelCH2), une dégénérescence musculaire très lente et modérée peut être observée, sans impact significatif sur la survie. Aucun effet systémique majeur n’est anticipé. Ces vecteurs ont par le passé était injecté pour générer des données préliminaires et aucun effets négatifs n'a été observé. Toutefois, une vigilance particulière sera maintenue durant la confirmation des données préliminaires préalablement obtenues surtout sur les études à long terme.

Devenir

Les souriceaux issus des portées seront génotypés par biopsie caudale afin d’identifier les animaux présentant le génotype et le sexe d’intérêt pour les études expérimentales. Les animaux ne correspondant pas aux critères requis (génotype ou sexe non adaptés aux objectifs du projet) seront euthanasiés après génotypage. Les animaux sélectionnés seront inclus dans les études expérimentales et suivis jusqu’à 6 mois, selon les différents protocoles d’administration et de suivi prévus dans le projet. À l’issue des expérimentations, l’ensemble des animaux inclus sera euthanasié afin de permettre la réalisation des analyses post-mortem (analyses histologiques, moléculaires et biochimiques).

Remplacement

Les approches in vitro ont été considérées et utilisées autant que possible dans les phases préliminaires du projet, notamment pour la conception et la validation des constructions génétiques (vecteurs AAV, U7snRNA, etc.). Cependant, ces modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité des tissus vivants, ni d’évaluer la distribution, la persistance ou la tolérance des vecteurs in vivo. En particulier, l’efficacité du transfert de gène observée dans une lignée cellulaire in vitro ne reflète pas la biodistribution ni la régulation tissulaire du vecteur dans un organisme entier. De plus, les mécanismes d’expression du transgène, la réponse immunitaire, et les effets sur la fonction musculaire (force, régénération, structure histologique) ne peuvent être étudiés qu’au sein d’un organisme complet. Les modèles murins utilisés reproduisent de manière fidèle les caractéristiques physiopathologiques des maladies neuromusculaires humaines, tout en restant compatibles avec des analyses longitudinales et non létales. Ils constituent actuellement l’unique moyen expérimental pertinent pour démontrer la faisabilité et l’efficacité des approches de thérapie génique évaluées. Ainsi, le recours à l’animal est nécessaire et justifié pour atteindre les objectifs du projet, car aucune alternative in vitro ou in silico ne permet de reproduire la complexité des interactions tissulaires et fonctionnelles impliquées dans les pathologies musculaires humaines.

Réduction

Le nombre d’animaux a été estimé à partir des données de la littérature et de nos expériences antérieures avec des modèles similaires de dystrophie musculaire. Les effectifs ont été calculés afin d’obtenir une puissance statistique suffisante pour démontrer les différences significatives entre groupes expérimentaux, tout en limitant strictement le nombre d’animaux utilisés. Chaque expérience est conçue pour maximiser les informations obtenues par animal : • Recueil simultané de plusieurs types de données (force musculaire, histologie, biologie moléculaire, imagerie, analyses biochimiques) sur les mêmes individus. • Utilisation de groupes témoins communs lorsque cela est possible (par exemple, les groupes injectés avec PBS peuvent servir de contrôle pour plusieurs constructions). • Regroupement des temps d’analyse pour limiter le nombre total de prélèvements et de dissections. • Réutilisation des échantillons tissulaires pour plusieurs analyses complémentaires (ex. qPCR, Western blot, immunofluorescence, histologie). Les calculs d’effectifs sont régulièrement réévalués au fur et à mesure des résultats intermédiaires afin d’ajuster les expériences futures. Si les données préliminaires permettent de démontrer une efficacité claire, certains groupes ou doses pourront être supprimés. Ainsi, tout est mis en œuvre pour minimiser le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la validité scientifique du projet.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. L’ensemble de ces points est décrit dans le paragraphe 4.2.1. Le bien-être animal passera également par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur (animaux hébergés à plusieurs par cage, dans la limite réglementaire ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum) avec un enrichissement du milieu (mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative). 4) Une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates (cf exemple en ANNEXE 2 de la saisine). 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Les souris ont été choisies comme espèce modèle en raison de leur proximité biologique avec l’Homme et de l’existence de modèles reproduisant les principales caractéristiques des maladies neuromusculaires étudiées. Ces modèles présentent des altérations génétiques distinctes affectant une même fonction musculaire, permettant de mimer la diversité des atteintes observées chez les patients. En effet, une même pathologie peut résulter de différentes anomalies génétiques, entraînant des degrés et des mécanismes d’atteinte variables. L’utilisation de plusieurs modèles complémentaires permet ainsi d’évaluer l’efficacité de différentes approches thérapeutiques en fonction du type d’altération présente, et d’anticiper leur pertinence pour des sous-groupes de patients présentant des profils génétiques distincts. Ces modèles reproduisent les principales conséquences de la maladie, notamment la faiblesse musculaire progressive et les altérations des tissus musculaires, ce qui en fait des outils pertinents pour des études précliniques. Les animaux sont utilisés à différents stades de développement afin de répondre aux objectifs du projet. Une administration précoce permet d’évaluer l’effet des traitements avant l’apparition des symptômes, tandis que des administrations à un stade plus avancé permettent d’analyser leur efficacité dans un contexte pathologique établi, plus proche de la situation clinique. Les animaux sont suivis puis analysés à différents temps afin d’étudier l’évolution des effets du traitement sur la fonction musculaire et la progression de la maladie. Enfin, ces approches ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives, car elles nécessitent une évaluation intégrée à l’échelle de l’organisme entier, incluant la distribution du traitement, les interactions entre tissus et les effets fonctionnels globaux.

Une partie des souris porte une mutation qui provoque tremblements et difficultés motrices à partir de 200 jours, l'incapacité de se déplacer vers 400 jours, un risque accru de cancers et une durée de vie réduite. 330 souris vont être utilisées, dont 268 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent trois tests moteurs chaque mois, extension des pattes, coordination et motricité, et une partie reçoit une thérapie génique dont l'injection expose à un œdème pulmonaire et à un risque rare de lésion oculaire. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever les organes, le porteur espérant qu'un résultat concluant justifie plus tard un projet à plus grande échelle.

Objectifs

L’Ataxie Apraxie Oculomotrice de type 1 (AOA1) est une maladie neurologique rare héréditaire qui touche le système de réparation de l’ADN dans les cellules du système nerveux central (SNC), en particulier une zone spécifique appelée le cervelet, mais aussi le système nerveux périphérique et la moelle épinière. Cela se caractérise chez les patients, en particulier des enfants entre 2 et 10 ans, par une ataxie cérébelleuse, une apraxie oculaire, une absence de réponse musculaire aux stimuli, et un handicap moteur sévère avant l’âge de 25 ans. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement pour cette pathologie. Un modèle animal de la pathologie a été développé afin de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et tenter de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'objectif de ce projet sera de caractériser ce modèle animal puis d'évaluer l'efficacité d'une approche de thérapie génique avec ce modèle.

Bénéfices attendus

L’Ataxie Apraxie Oculomotrice de type 1 (AOA1) est une maladie neurodégénérative rare de la famille des ataxies cérébelleuses autosomiques récessives. Cette pathologie neurologique héréditaire se caractérise par une ataxie cérébelleuse à début précoce (âge moyen d’apparition : environ 4 ans) et entraine un handicap moteur sévère, avant l’âge de 25 ans. A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif pour les patients. Le bénéfice de ce projet sera tout d’abord d’obtenir une caractérisation du modèle murin de la pathologie d’AOA1 afin de s’assurer de sa fiabilité pour l’évaluation de stratégies thérapeutiques. Si cette première étape est concluante ce projet permettra également d’évaluer l’efficacité d’une thérapie génique. Si l’efficacité de cette thérapie est démontrée sur ce modèle animal, à plus long terme, cela pourrait contribuer à demander un projet à plus grande échelle visant à proposer un essai thérapeutique chez des patients atteints d’Ataxie Apraxie Oculomotrice de type 1.

Procédures

Une partie des animaux aura une injection de thérapie génique sous anesthésie générale (durée 5 minutes au total, une fois). Tous les animaux réaliseront 3 tests comportementaux répartis sur 3 jours chaque mois (14 fois maximum), pour évaluer leur motricité. Nous aurons un jour avec un test évaluant l’extension des pattes (1 essai de 10 secondes maximum). Puis un jour avec un test évaluant la coordination générale (1 essai d’entrainement et 3 essais de 2 minutes maximums avec une pause de 30 minutes entre chaque essai). Enfin un jour avec un test d’évaluation de la motricité (1 essais d’entrainement suivi de 3 essais de 5 minutes maximums avec une pause de 30 minutes entre chaque essai).

Impact sur les animaux

Une partie des animaux, en raison de leurs modifications génétiques, présenteront des difficultés motrices significatives et des tremblements (phénotype dommageable) à partir de l’âge de 200 jours s’accentuant jusqu’à l’atteinte d’incapacité à se déplacer à partir de l’âge de 400 jours. Ces animaux présenteront également un risque augmenté de développement de certains cancers, des anomalies immunitaires et une durée de vie réduite. L’anesthésie générale réalisée pour administrer la thérapie génique pourra engendrer des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de difficultés cardiaque et respiratoire. Ces risques demeureront rares en raison de la courte durée de l’anesthésie. L’injection de la thérapie génique sera associée à des risques d’inconfort au niveau de la zone d’injection, de saignement après injection et un risque rare de lésion oculaire. En fonction du poids des animaux cette injection pourra être associée à un risque d’œdème pulmonaire qui se visualiserait chez l’animal par des difficultés respiratoires. Les tests comportementaux pourront générer un stress en lien avec le changement d’environnement et le test en lui-même.

Devenir

En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements d’organes d’intérêts, et leurs analyses, nécessaires pour répondre à notre question scientifique

Remplacement

Il a été démontré qu’un modèle in vitro d’AOA1 peut être généré à partir de cellules souches spécifiques provenant de patients. Bien que ce modèle cellulaire constitue un outil pertinent pour l’étude des altérations moléculaires et cellulaires associées à la pathologie, il présente des limitations majeures. En particulier, il ne permet pas de reproduire le phénotype ataxique ni d’évaluer les conséquences fonctionnelles et comportementales de la maladie. Dans ce contexte, le recours à un modèle in vivo apparaît indispensable afin de reproduire de manière adéquate les troubles moteurs et neurodégénératifs observés chez les patients. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de recourir à des études pré-cliniques chez l’animal. La souris représente un modèle pertinent pour approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques de l’AOA1 et pour évaluer des approches thérapeutiques, notamment de thérapie génique, susceptibles de ralentir la progression de la maladie et potentiellement la guérir. Étant donné qu’un modèle de l’AOA1 associé à la mutation génétique que nous voulons cibler a déjà été créé chez cette espèce, ce modèle constitue un outil particulièrement pertinent et approprié pour nos études de recherche.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 10 à 30 souris par groupe a été choisi pour nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et ainsi réaliser des tests statistiques fiables. De façon générale nos résultats seront analysés avec les tests statistiques appropriés. Un nombre total maximal de 330 souris sera nécessaire pour ce projet. Le projet comprend deux procédures, les résultats de la première conditionneront la réalisation de la deuxième, ainsi le nombre d’animaux déclaré ici est un maximum mais tous ne seront peut-être pas utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’eau et de croquettes à volonté, ainsi que d’un enrichissement de leur environnement composé à minima d’un carré de coton pour nidifier et d’un bâtonnet de bois à ronger. Ils seront observés quotidiennement et pesés une fois par semaine minimum. En cas d’anomalie celle-ci sera transmise à la structure chargée du bien-être animal, au vétérinaire et à notre équipe afin de mettre en place une prise en charge rapide et adaptée pour l‘animal. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux. Pour les souris génétiquement modifiées susceptibles de développer une ataxie à partir de l’âge de 200 jours, nous mettrons en place des mesures supplémentaires afin d'assurer leur bien-être. En plus de l’observation quotidienne nous les surveillerons spécifiquement, les pèserons 2 fois par semaine et ajouterons un soutien nutritionnel dans le fond de la cage (eau gélifié, croquettes humidifiées ou non) pour pallier les difficultés motrices et en cas de perte de poids. Un enrichissement supplémentaire sera également ajouté dans les cages (maisonnette). Pour les tests comportementaux les animaux bénéficieront d’une période d’habituation de 30 minutes à la pièce d’expérimentation avant chaque test. Les tests seront répartis sur 3 jours afin de laisser un temps de repos aux animaux entre chaque test. Pour les tests nécessitant 3 essais, les animaux bénéficieront d’une période de repos de 30 minutes entre chaque essai. Les injections de thérapie génique seront réalisées sous anesthésie générale afin de réduire le stress et bénéficier d’une bonne immobilité de l’animal. Du gel oculaire sera appliqué à la fin de la procédure d’injection pour réduire l’inconfort et une surveillance spécifique des animaux sera mise en place sur les jours suivants.

Choix des espèces

La souris est une espèce largement utilisée pour modéliser les pathologies humaines. Son génome est bien connu et des outils sont disponibles pour le modifier. Dans le cas de l’Ataxie Apraxie Oculomotrice de type 1 un modèle de souris génétiquement modifié a été créé pour modéliser cette pathologie et donc permettre d’observer les symptômes de la pathologie tels qu’observés chez l’humain. Nous avons donc choisi de l’utiliser pour ce projet pour reproduire et étudier la pathologie et surtout pour évaluer l’effet de notre approche de thérapie génique. Pour caractériser notre lignée de souris génétiquement modifiées elles seront utilisées à partir de l’âge de 1 mois jusqu’à l’âge de 8 mois maximum. En effet d’après les caractéristiques déjà connues de cette lignée, les signes de problèmes moteurs importants devraient apparaitre à un âge compris entre 6 et 7 mois, ainsi réaliser la caractérisation de 1 à 8 mois nous permettra de détecter l’apparition des troubles moteurs et suivre leur évolution à l’aide de tests spécifiques. Par la suite, pour évaluer l’efficacité de notre thérapie génique avec ce modèle, nous injecterons la thérapie à des souris d’un âge compris entre 1 et 4 mois, soit avant l’apparition des troubles moteurs attendus à un âge de 6-7 mois. Afin d'observer efficacement les effets à long terme de notre thérapie génique, les animaux seront suivis pendant une période maximale de 8 à 14 mois.

Jusqu'à 41 contentions et administrations orales par animal, 17 instillations nasales sous anesthésie, 28 pesées, une administration intrarectale. 2 136 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever les organes, dont 984 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nées par césarienne, elles reçoivent des formules de lait infantile, avant de subir soit une inflammation du côlon déclenchée par voie intrarectale, soit un asthme provoqué par de la poussière d'acariens instillée dans le nez, pour vérifier si ces formules restaurent le microbiote. Sur un effectif de 2 136 animaux, le porteur écrit utiliser "toujours une approche statistique" pour dimensionner ses groupes, sans donner un seul chiffre.

Objectifs

Le microbiote intestinal est une communauté dynamique, composée de microorganismes (bactéries, champignons, virus) influencée par de multiples facteurs tout au long de la vie d’un individu. La transmission du microbiote par la mère est le facteur le plus important qui conditionne le schéma de colonisation microbienne chez le nouveau-né (primocolonisation). Des perturbations au cours de cette période peuvent avoir un impact sur le développement et des conséquences néfastes pour la santé du nouveau-né au cours de sa vie. Des études chez l’homme ont démontré que le microbiote des nouveau-nés mis au monde par césarienne est modifié par rapport à celui des enfants nés par voie naturelle. Par ailleurs, leur risque de développer des maladies chroniques, notamment des maladies inflammatoires de l’intestin et de l’asthme, est également plus important. Notre hypothèse est que la modulation du microbiote intestinal du nouveau-né par le biais de l’administration d’une formule de lait en poudre pour nouveaux-nés améliorée pourrait prévenir le développement de maladies chroniques, notamment les maladies inflammatoires de l’intestin et du poumon comme l’asthme. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle de souris née par césarienne pour déterminer la capacité d’une supplémentation avec différentes formules infantiles à restaurer les interactions microbiote-hôte. Pour évaluer si cette restauration est bien fonctionnelle, nous allons soumettre les souris soit à un modèle d’inflammation du côlon soit à un modèle d’asthme.

Bénéfices attendus

Le bénéfice essentiel de ce projet est d’évaluer la capacité de formules infantiles à améliorer la résilience du microbiote intestinal et les conséquences physiologiques liées à la naissance par césarienne. Il s’agit donc d’améliorations de connaissances fondamentales et de perspectives potentielles d’utilisation de formules spécifiques pour aider à la restauration d’un microbiote altéré par la césarienne.

Procédures

- Contentions et administrations orales sur animal vigile: 7 fois pour 180 animaux 14 fois pour 90 animaux 21 fois pour 90 animaux 22 fois pour 720 animaux 28 fois pour 336 animaux 41 fois pour 720 animaux Chaque contention/administration orale dure environ entre 15 secondes et une minute. - Contention et administration intra-nasale sur animal anesthésié : 11 fois pour 720 animaux 17 fois pour 720 animaux Chaque contention/administration nasale dure environ 15 secondes. - Prélèvement de fèces sur animal vigile : 1x pour 90 animaux 2x pour 1 482 animaux 3x pour 48 animaux 6x pour 336 animaux Chaque prélèvement dure quelques minutes. - Anesthésies injectables: 1 fois pour 336 animaux ; Une anesthésie correspond à une piqûre réalisée en 15-20 secondes environ. - Anesthésies gazeuses : 11 fois pour 720 animaux et 17 fois pour 720 animaux - Administration intrarectale sur animal anesthésié : 1 fois pour 336 animaux ; Une administration dure 20 secondes. - Prélèvement de sang : sur animal vigile, 1 fois pour 696 animaux ; sur animal anesthésié, 1 fois pour 1 440 animaux. Un prélèvement a une durée totale de 1 minute environ. Pesées des animaux vigiles : 1x pour 360 animaux 10x pour 720 animaux 24x pour 336 animaux 28x pour 720 animaux Une pesée dure environ 5 secondes.

Impact sur les animaux

L’inflammation intestinale est très localisée au niveau du côlon et peut générer des douleurs modérées pendant quelques jours. Les animaux subiront une perte de poids pendant 2 à 3 jours ainsi qu’une potentielle constipation. La poussière d’acariens, administrée dans le nez, entraîne une inflammation pulmonaire localisée. Elle pourra induire un léger retard de la prise de poids chez les souriceaux. Les souris exposées aux allergènes ressentiront un bref inconfort suite aux instillations et pourraient présenter des modifications respiratoires passagères immédiatement après l'administration de la poussière d’acariens (d’une durée de quelques minutes). La présence de symptômes tels que des éternuements ou des démangeaisons au niveau du museau pourrait être observée transitoirement, mais aucune difficulté respiratoire à long terme n'est attendue. La contention, les administrations orales peuvent générer un inconfort et un stress transitoires pour les animaux. La piqûre nécessaire pour les anesthésies génère une douleur légère et passagère. Par ailleurs, nous isolerons les animaux dans des pots en plastique transparents afin de collecter des fèces individuellement. Cet isolement dure quelques minutes et pourra générer un stress de courte durée. Enfin, en fin d´essai, nous réaliserons un prélèvement de sang. Ce prélèvement génère une brève douleur passagère pour les animaux non anesthésiés (certains le seront).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

Les rongeurs sont utilisés pour les études des interactions microbiote-hôte, car de telles expériences ne peuvent pas être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes. A l’heure actuelle, les études in vitro des effets de bactéries, de composés bactériens ou d’autres substances sur l’inflammation intestinale ou l’asthme comportent encore des limites. Des modèles cellulaires existent et sont bien décrits : ils seront d’ailleurs utilisés en amont de notre projet pour effectuer un premier criblage de composés candidats. Cependant, ces modèles in vitro ne reflètent pas de manière idéale la complexité des interactions entre le microbiote intestinal et les bactéries ou composés candidats. L’intérêt d’un modèle in vivo est également d’étudier la réponse du système immunitaire de l’hôte à l’administration de ces bactéries ou composés bactériens. Malgré le fait que certains paramètres peuvent être évalués à partir de modèles in vitro, la complexité des mécanismes immunitaires chez l’hôte fait que ces modèles in vitro ne sont pas suffisants.

Réduction

Les formules testées seront issues d’un programme préalable de criblage in vitro afin de ne conserver, pour les études sur les animaux, que des bactéries ayant montré un potentiel dans ces modèles. Par ailleurs, nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles.

Raffinement

Les animaux sont hébergés à plusieurs afin de ne pas les exposer à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux seront séparés pour être manipulés ne représentent qu’un temps très court (10 minutes maximum), pour la récupération de fèces dans des pots. Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la nidification, bâtons à ronger, maisonnettes en carton (sans encre). Le matériel utilisé est adapté pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Les manipulateurs maitrisant les gestes, le temps d’intervention et donc le stress seront réduits. Nous utiliserons des anesthésies adaptées en temps et aux besoins des essais. Lors des anesthésies, un gel oculaire sera appliqué pour prévenir le dessèchement des yeux des animaux. Des pads, avec une température stabilisée de 37°C, seront également placés sous les cages pour maintenir la température corporelle des animaux pendant l’anesthésie. Des tapis chauffants électriques pourront aussi être utilisés. Des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux. Une grille de score sera utilisée et mènera à des actions permettant d’agir selon un arbre décisionnel adapté et prédéfini.

Choix des espèces

La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie et un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales et respiratoires humaines. La lignée retenue pour ce projet a été sélectionnée car elle a de fortes performances de fertilité et une bonne taille de portée. Les souris seront utilisées au stade du nouveau-né, nécessaire pour observer les phénomènes de colonisation bactérienne au moment de la mise-bas, et au stade adulte pour les effets de l’inflammation intestinale ou de l’asthme.

Tout ce projet consiste à fabriquer deux lignées de souris invalidées pour un gène de défense antivirale. 412 souris y sont utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les femelles reçoivent jusqu'à cinq injections hormonales en 48 heures, certaines subissent une chirurgie de quinze minutes, et des mâles sont vasectomisés pour rendre des femelles pseudogestantes. 24 souris transgéniques de troisième génération sont conservées pour propager les lignées et subir une infection grippale, tout le reste est tué, y compris les mâles vasectomisés devenus trop vieux à la fin du projet.

Objectifs

Ce projet cherche à établir une lignée de souris transgéniques qui permettra de comprendre comment une protéine d’intérêt aide notre corps à se défendre contre les virus. Des premiers résultats montrent qu’elle pourrait empêcher les virus de se multiplier dans nos cellules. Mais pour vraiment comprendre son rôle, il faut observer ce qui se passe dans un organisme entier, car le système immunitaire est très complexe.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche vise à créer des animaux génétiquement modifiés qui permettront de mieux comprendre comment notre corps se défend contre les virus qui attaquent nos poumons. Le but est d'observer comment l'absence ou la présence de cette protéine modifie la façon dont l'organisme réagit à une infection. Ces recherches permettront de mieux comprendre comment lutter contre les virus et pourraient aider à développer de nouveaux traitements. À long terme, elles pourraient aussi nous aider à mieux faire face aux épidémies et aux infections graves.

Procédures

Pour les injections, chaque souris est injectée au maximum 5 fois (sur une durée de 48h). Ces interventions sont rapides (une injection dure quelques secondes). Les interventions chirurgicales sous anesthésie générale sont réalisées une fois et durent une quinzaine de minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les souris concernent : (1) douleurs liées aux injections, et 2) risques d’infection ou hémorragies et douleurs liées aux interventions chirurgicales. Les souris pourront subir jusqu’à cinq injections, pouvant provoquer une légère douleur comparable à une piqûre. Certaines auront également une intervention chirurgicale d’environ 15 minutes, entraînant des douleurs modérées pendant quelques jours le temps de la cicatrisation. Aucun effet négatif particulier lié aux hormones n’est attendu, mais le bien-être des animaux sera surveillé attentivement.

Devenir

Tous les animaux ayant servi à la création et au développement des lignées seront mis à mort, à l’exception de 4 mâles et 8 femelles transgéniques (troisième génération) qui seront conservés pour chacune des deux lignées afin de propager ces lignées et réaliser l’analyse de leur résistance à une infection virale influenza. A la fin du projet, les mâles vasectomisés seront trop vieux pour être utilisés et seront donc euthanasiés.

Remplacement

Notre recherche porte sur le rôle d’un gène dans la défense contre les virus. Pour bien comprendre son fonctionnement, nous devons étudier ce qui se passe dans un organisme vivant entier, et pas seulement sur des cellules en laboratoire. En effet, la réponse du corps face à une infection est très complexe. Elle implique la coopération de plusieurs systèmes (comme le sang, les ganglions lymphatiques et les tissus infectés) et la mobilisation coordonnée de différentes cellules immunitaires. Ces interactions ne peuvent pas être reproduites de manière fiable en dehors d’un organisme vivant. De plus, certains aspects importants (comme la manière dont un virus se propage dans le corps, les organes qu’il infecte, ou encore les réactions inflammatoires) ne peuvent être observés que chez un organisme complet. C’est pourquoi nous utilisons des modèles animaux, en particulier des souris génétiquement modifiées qui ne possèdent pas ce gène. Cela nous permet de mieux comprendre son rôle réel dans la défense contre les infections et dans la mémoire immunitaire.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire au projet a été optimisé pour permettre la production de huit souris mutantes pour un gène d’intérêt et l’obtention au final de deux lignées de souris invalidées pour le gène d’intérêt. Ces lignées de souris n’existent pas actuellement. Ce nombre est basé sur l’expérience du laboratoire pour la production de lignées de souris transgéniques avec ces outils et à l’aide des principes généraux fournis par le guide européen « animaux génétiquement altérés » pour la procédure d’évaluation du bien-être animal des deux lignées créées.

Raffinement

Toutes les souris (mâles, femelles et juvéniles) seront élevées en groupe avec un enrichissement dédié dans chaque cage (maison en carton et coton). Les souris mâles adultes vasectomisées utilisées pour les accouplements seront hébergés avec des femelles de compagnie (souvent de vieilles femelles). Une observation quotidienne des animaux sera réalisée pour évaluer leur bien-être et en cas de douleur suspectée par l’évaluation quotidienne des animaux, une injection d’analgésique sera administrée en sous-cutanée. Des analgésiques seront administrés en pré-opératoire et en post-opératoire en sous-cutané. Du gel sera appliqué pour éviter tout dessèchement oculaire au cours des interventions chirurgicales. Les interventions chirurgicales seront réalisées sur un tapis thermorégulé afin d’éviter toute hypothermie, sous anesthésie et analgésie. Des points limites seront appliqués afin d’éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle souris pour deux raisons principales. D'abord, c'est un animal dont on peut facilement modifier l'ADN en manipulant des œufs juste après fécondation: cela nous permet de « désactiver » certains gènes pour comprendre leur rôle et de modifier ainsi le génome dans toutes les cellules de l’animal, y compris les cellules germinales (transmission alors du génotype par reproduction sexuée). Ensuite, la souris est un modèle couramment utilisé pour étudier la réponse aux infections grippales. Le virus s'attaque aux mêmes organes et provoque une maladie respiratoire très proche de celle de l'être humain, ce qui en fait un excellent modèle pour tester des traitements. Pour la production de la lignée génétiquement modifiée, nous utiliserons des souris adultes. Pour la caractérisation du bien-être de la lignée, nous utiliserons des souris des stades nouveau-né à adulte.