Souris
Approche therapeutique pour la maladie de Huntington : validation d’un candidat médicament
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
636 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un candidat médicament contre la maladie de Huntington par mini-tablettes ou, en cas d'échec, par pompes osmotiques posées chirurgicalement jusqu'à quatre fois en six mois, et subissent des tests comportementaux dont le test d'alimentation supprimée par la nouveauté et l'actimétrie. La mise à mort sert à prélever les tissus cérébraux. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne mime les modèles comportementaux ni la complexité d'un "organisme entier".
Objectifs
A la suite d’une étude sur un système cellulaire permettant l’analyse du trafic intracellulaire des neurones, nous avons mis en évidence qu’une drogue était capable de restaurer la dynamique intracellulaire déficiente dans la maladie de Huntington. Nous avons ensuite démontré, avec des premiers résultats preuve de concept, l’intérêt thérapeutique de cette molécule dans un modèle souris de la maladie. L’objectif de ce projet est maintenant de 1/ caractériser l'efficacité de cette molécule et son mécanisme d’action moléculaire et 2/ définir les bénéfices d’un traitement long terme chez des animaux à des stades d’avancement de la maladie variables, reflétant la situation chez les patients et permettant de définir le meilleur schéma de traitement à envisager dans de futures études cliniques.
Bénéfices attendus
La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (18000 personnes atteintes en France et environ 300 000 personnes dans le monde) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Elle se caractérise par l’apparition de symptômes moteurs, cognitifs et psychiques conduisant à une altération de l’état général des patients (perte de poids, fonte musculaire, fatigue, douleurs et déformations articulaires puis inexorablement à leur décès. La maladie est causée par une mutation hétérozygote du gène de la huntingtine, elle-même à l’origine d’un défaut de transport du facteur neurotrophique dérivé du cerveau, un facteur de survie neuronal essentiel. Le projet présenté a pour objectif de confirmer l’intérêt thérapeutique du candidat médicament identifié par des approches ex vivo comme restaurant le transport neuronal. Très concrètement, les résultats du projet permettront de 1/ valider que l’administration du médicament par voie orale à un intérêt thérapeutique comparable à la voie sous cutanée en continu 2/ évaluer si le traitement peut empêcher l’apparition des symptômes (stade présymptomatique), les ralentir (stade symptomatique) ou encore les faire reculer (stade avancé). Ces résultats permettront le développement clinique de la première molécule administrable par voie orale ciblant les causes de la maladie de Huntington avec pour objectif de répondre à une forte attente des patients et de combler un besoin médical non pourvu.
Procédures
2 actes expérimentaux impliqueront d’éventuelles nuisances mineures à l'animal: 1/ Lors de notre étude de l'efficacité d'un traitement long terme sur les animaux modèles de la maladie de Huntington, le traitement sera réalisé de préférence oralement au moyen de mini-tablettes appétentes ingérables par les souris dans un temps restreint. Or, dans le cas d’un échec du traitement oral, il pourra être envisagé que le traitement des animaux soit réalisé par voie sous-cutanée, via la pose de mini-pompes osmotiques. Dans ce cas, les animaux seront opérés sous anesthésie générale (procédure courte de 15-20 minutes par animal) avec un changement de pompe au bout de 6 semaines permettant un traitement long terme et nécessitant une nouvelle procédure chirurgicale dans la limite de 4 opérations sur 6 mois. Cette procédure est toutefois largement décrite et maitrisée dans la littérature. 2/ Au cours de cette même procédure, les animaux seront évalués par des tests comportementaux permettant d’évaluer leur capacités locomotrices et cognitives. Ces tests sont non invasifs et seuls deux sont considérés comme générant un stress de classe légère : le test d'alimentation supprimée par la nouveauté, requérant une mise jeun de 24h et l’actimétrie requérant un isolement des souris pendant 48h.
Impact sur les animaux
Nous pouvons identifier 3 nuisances potentiellement attendues sur les animaux : 1/ induction d'une légère inflammation dûe à la mise en place d'une minipompe osmotique dans l'espace intrascapulaire. Cette inflammation sera soulagée par une injection d'anti inflammatoire non stéroïdien; 2/ induction d'un stress léger lors du traitement oral : isolement des souris pendant le traitement, pour limiter ce stress les souris seront de moins en moins longtemps soumises à cet isolement selon leurs performances et ne seront pas isolées plus de 4h pendant la période d'habituation; 3/ induction d’un stress léger lors des tests de comportements impliquant une mise à jeun (test d'alimentation supprimée par la nouveauté) ou un isolement prolongé de 48h (actimétrie) : pour limiter ce stress et éviter qu’il n’impacte le reste des expérimentations, les tests comportementaux n’auront lieux qu’une fois tous les 3 mois et le test d'alimentation ne sera réalisé qu’une seule fois, en toute fin de procédure.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études immunohistochimiques et biochimiques qui nous permettrons de comprendre les mécanismes du traitement.
Remplacement
Notre projet correspond à un travail de phase préclinique visant à tester l'effet thérapeutique du candidat médicament pour traiter les symptômes de la maladie de Huntington et d’évaluer son mécanisme d’action dans le cerveau. C'est donc un passage obligé vers la clinique et l'Homme. Il n'existe pas actuellement de modèle in vitro permettant de mimer les modèles comportementaux et de reproduire la complexité d’un organisme vivant.
Réduction
Pour notre première procédure, afin de caractériser le candidat médicament, nous utilisons le minimum d'animaux nécessaire pour assurer des analyses quantifiables et reproductibles (6 animaux par groupe d'étude). Cet effectif est le minimum à partir duquel des analyses statistiques peuvent être réalisées. Dans le cas de l'étude de l'efficacité du traitement par voie orale, puisque nous avons observé que le comportement de souris pouvaient varier en fonction du sexe dans ce modèle de la maladie de Huntington, nous incluront systématiquement des mâles et des femelles dans tous les groupes afin de pallier les potentiels disparités dans les résultats. Le nombre de 20 animaux par condition (10 mâles et 10 femelles) a été déterminé à l’aide d’un test statistique et des études préliminaires afin de réduire également au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. De plus, nous analyserons également l'ensemble de ces animaux qui effectueront les tests de comportement au niveau cérébral en fin de procédure.
Raffinement
L'ensemble des procédures vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le bien-être animal. Les souris seront habituées en amont à l'expérimentateur et à la manipulation et seront pesées régulièrement une fois par mois pour s'assurer d'une évolution pondérale correcte. Les souris seront quotidiennement observées et tout comportement anormal signe de mal être (poils, prostration) sera monitoré afin de prendre en charge la douleur. Pour exemple, une perte de poids de plus de 20% ou des signes indicatifs de douleur ou stress tels que la prostration, le renfoncement des yeux ou l’arrêt du toilettage entraîneront l'administration d'un supplément d'alimentation hypercalorique et hydratée fournie par l'animalerie ou d'un analgésique (carprofène). Des points limites suffisamment précoces et adaptés aux procédures expérimentales ainsi que des critères d'arrêt des souffrances sont mis en place.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la huntingtine. Pour cela, nous utilisons des souris issues de la transgénèse classique. Le modèle souris choisi permet de comprendre le rôle de la huntingtine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier.
Evaluation de l’efficacite et de la persistance des cellules T genetiquement modifiees dans des modeles murins
- Recherche appliquée
- Cancers
705 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des cellules T génétiquement modifiées puis onze prélèvements sanguins hebdomadaires, le porteur décrivant une inflammation sévère avec perte de poids, pilo-érection et prostration. L'objectif est d'obtenir des données précliniques d'efficacité et d'absence de toxicité avant les premiers tests chez l'humain. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit in vitro la complexité des échanges entre les cellules impliquées dans la dissémination tumorale et le système immunitaire.
Objectifs
Les objectifs du projet sont : 1) vérifier l'impact des modification génétiques sur la persistance des cellules de l'immunité, c'est à dire à leur capacité à perdurer longtemps sans mourir dans un environnement complexe. 2) évaluer l'efficacité des cellules immunitaires génétiquement modifiées dans des modèles d'oncologie par bioluminescence
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont: 1)obtenir des données précliniques d'efficacité thérapeutique du produit. 2) obtenir des données sécurité/ d'abscence de toxicité du produit thérapeutique avant les premiers tests chez l'humain
Procédures
Nous prélèverons 100uL de sang toutes les semaines jusqu'à semaine 12 à partir de J3 après injection des cellules soit au total 11 prélèvements. Chaque prélèvement sanguin prend environ 2 minutes/souris maximum. La douleur des animaux pourra être atténuée par une injection de buprénorphine. L'injection des cellules prend entre 10 et 30 secondes par souris selon la voie d'injection, une seule injection par animal.
Impact sur les animaux
Développement d'une inflammation sévère associées à une perte de poids,une pilo-érection et une prostration de l'animal (dos vouté).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure
Remplacement
L’emploi des modèles animaux est nécessaire au projet car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes alternatives permettant de reproduire in vitro la complexité physiologique des échanges entre les nombreux types cellulaires responsables de la dissémination tumorale et de l'impact du système immunitaire sur celle-ci.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisé, chaque groupe contiendra le nombre minimum indispensable à l'obtention de résultats statistiquement pertinents. Nous prévoyons 3 expériences mais si les 2 premières expériences donnent le même résultat, la 3eme sera annulée pour réduire le nombre de souris utilisé. L'injection de cellules qui peuvent être analysées par la bioluminescence, facilitant ainsi leur suivi dans le temps sans avoir à mettre à mort un groupe d'animaux à un temps précis sera utilisée pour réduire le nombre d'animaux pour chaque expérience.
Raffinement
Dans une approche éthique, nous prévoyons de limiter au maximum le nombre d'animaux avec des scores cliniques sévères et mettre en place des points limites adaptés. Pour les actes de prélèvement invasifs comme les prélèvements sanguins, nous utiliserons un anesthésique local pour limiter la douleur. Nous utiliserons également une litière adaptée (douce, non-poussiéreuse) qui favorise l'expression des comportements normaux de la souris (enfouissement, nidification...). Un apport de gel hydrique dans la cage sera réalisé pour faciliter l'accès des animaux à une source hydrique.
Choix des espèces
Nous avons développé des méthodes permettant de modifier génétiquement les cellules humaines du système immunitaire . Afin de pouvoir estimer l'efficacité, l'abscence de toxicité provoquée par ces cellules sur l'organisme de l'animal et la persistance de ces cellules humaines, nous devons utiliser un modèle murin le plus relevant possible. Seules les souris immunodéficientes NSG ou NXG permettent la prise de greffe de cellules humaines et donc l'analyse de la biologie des cellules humaines in vivo. Souris adultes de 8 à 12 semaines pour leur poids relativement stable en fin de croissance, pour la facilité de manipulation, de prélèvement et d'analyses d'échantillons, d'évaluation physique (bien-être)
Efficacité d’un nouvel antibiotique contre Mycobactérium avium
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Toutes mises à mort à la fin de leur traitement pour la mise en culture de leurs poumons, 210 souris BALB/c vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou sévère. Infectées pendant deux heures par un aérosol de Mycobacterium avium, elles reçoivent ensuite des antibiotiques par gavage à la seringue ou par injection dans le ventre, cinq jours par semaine, pendant un à quatre mois. Le porteur liste parmi les effets attendus des gavages saignements, inhalation et décès, surtout lorsqu'ils sont pratiqués par des novices, qui s'exercent d'abord sur une souris factice. Il qualifie l'infection d'"indolore", sans décrire ce que la maladie fait endurer aux souris ni dire quelles procédures relèvent du niveau sévère.
Objectifs
L'objectif principal du projet est de déterminer l'efficacité d'un nouvel antibiotique, contre les infections respiratoires à Mycobacterium avium, une bactérie particulièrement difficile à traiter. Les objectifs secondaires sont de déterminer les meilleures combinaisons de traitements avec cet antibiotiques et de décrire la réaction des tissus de l'organisme sous ce(s) traitement(s).
Bénéfices attendus
Cet antibiotique a déjà montré une efficacité in vitro (en laboratoire) sur Mycobacterium avium, mais l'efficacité in vivo (chez l'être vivant) reste à démontrer. Si notre hypothèse de travail est correcte, notre projet permettra de mettre en évidence l'efficacité de ce nouvel antibiotique seule et en combinaison avec d'autres antibiotiques spécifiques. Cette efficacité permettra d'informer à court terme d'autres études expérimentales sur des combinaisons à tester et leur durée de traitement, mais également à moyen terme les essais cliniques thérapeutiques pour des patients en grand besoin de traitements plus efficaces et mieux tolérés dans cette indication.
Procédures
Il n'est pas prévu de prélèvement sanguin ou d'intervention chirurgicale. En revanche les souris seront infectées par des aérosols de mycobactérie (durée 120mn) et seront par la suite traitée par différents antibiotiques afin de déterminer leur efficacité. Si l'infection par aérosol est indolore, l'administration des antibiotiques se fait par voie orale (à la seringue) et/ou par voie injectable (dans le ventre). Ces administrations sont répétés tous les jours (durée 5 à 10 secondes), cinq jours par semaine pendant 1 mois, 2, 3 ou 4 mois pour certaines souris.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale du gavage et de l'injection, bien qu'en soit peu délétère, est répétée quotidiennement, pouvant provoquer un stress sur les animaux. C'est pourquoi il est prévu un rapport écrit de la surveillance quotidienne avec évaluation a posteriori du projet. Des points limites spécifiques ont été établis pour la surveillance. Les effets indésirables attendus, surviennet essentiellement lorsque les gavages sont faits par des novices. Ce sont : des saignements, un stress, une inhalation, le décès. Lors des injections, ce sont des douleurs, des hématomes, des troubles cutanés. Toutefois, le personnel novice sera dans un premier temps entraîné sur une souris d'entrainement fictive (Mimicky mouse, Dorset, UK) jusqu'à ce qu'ils acquièrent la dextérité et l'aisance nécessaire pour ne pas faire subir d'effet indésirable inutile aux souris.
Devenir
Afin de pouvoir tester l'efficacité des antibiotiques les animaux doivent être infectés puis traités. Après la durée de traitement prévue dans le protocole il est nécessaire de mettre en culture les poumons afin de mesurer l'efficacité des antibiotiques. Tous les animaux sont donc mis à mort à la fin de la durée de traitement.
Remplacement
La procédure de préhension et de gavage sera apprise sur une souris fictive jusqu'à ce que les personnes formées soient à l'aise avec ces procédure. Des analyses in vitro ont été réalisées en amont pour sélectionner les candidats, mais à ce jour, il n'existe pas de solution alternative satisfaisante pour remplacer les animaux dans cette indication.
Réduction
Le nombre de souris est calculé au plus proche de ce qui est nécessaire pour voir une différence significative entre les groupes de traitement.
Raffinement
Les mesures de raffinement suivantes seront prises pour diminuer la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux. Les souris seront suivies quotidiennement. Dans la cas où une douleur serait observée, les souris auront une injection d'analgésique une fois par jour jusqu'à normalisation de l'échelle de la douleur. Dans le cas d'une aggravation des signes de douleur, les souris concernées seront euthanasiées. Nous avons défini des points limites spécifiques au gavage. Les souris seront gardées dans des cages collectives (en respectant la limite de souris par cage) et enrichies (litières foisonnantes et absorbantes, tunnels, …). Nourriture et boisson seront ad libitum.
Choix des espèces
Dans notre étude précédente la souris BALB/c était le modèle animal répondant le mieux à l’antibiothérapie semblant le plus se rapprocher des données humaines. Il n'est pas justifié d'utiliser des modèles de souris immunodéprimées (ou d'autres espèces animales) moins semblables aux données cliniques
Comparaison de la génération de cellules embryonnaires et de cellules cancéreuses dans le poumon
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Anesthésiées, des souris reçoivent une seule fois des adénovirus, par inhalation par le nez ou par injection dans la trachée après intubation, puis sont tuées une à huit semaines plus tard pour le prélèvement de leurs organes. 620 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort à la fin de l'expérience ou plus tôt si elles atteignent un point limite. L'équipe veut comparer, dans le poumon, la reprogrammation de cellules spécialisées en cellules souches et l'apparition de cellules cancéreuses, un travail mené jusqu'ici sur des cultures de cellules de peau de souris. Comme effets néfastes, le résumé ne décrit qu'une inflammation possible de la trachée et une gêne liée au liquide injecté, sans dire si ces virus font apparaître des tumeurs, ce que les souris endurent pendant les semaines suivantes, ni quels points limites conduisent à leur mise à mort.
Objectifs
Lors du développement de l’embryon, à partir de quelques cellules dites cellules souches, des milliards de cellules vont être produites et acquérir une spécialisation (cellules de poumon, de peau, etc.) lors d’un processus appelé différenciation. Ces dernières années, des travaux montrant qu’il est possible de reprogrammer une cellule différenciée en une cellule souche, ont apporté la preuve que la différenciation est un processus réversible. Le mécanisme de reprogrammation partage des similarités avec ceux qui aboutissent à l’apparition de cellules cancéreuses (tumorigenèse). Des études réalisées à partir de cultures de cellules de peau de souris nous ont déjà permis d’identifier certaines de ces similarités. Afin de nous rapprocher de ce qui se passe chez l’Homme, nous souhaitons maintenant étendre notre étude comparative de la reprogrammation et de la tumorigenèse au poumon, chez la souris.
Bénéfices attendus
On sait aujourd’hui que le développement tumoral n’est pas seulement lié à une prolifération anarchique des cellules. Les changements d’identité cellulaire (modification de la nature et de la fonction d’une cellule) constituent un domaine émergeant et on sait maintenant qu’ils sont à l’initiation de certains cancers. L’étude de ces mécanismes est donc cruciale pour faire émerger de nouvelles thérapies mais également pour approfondir nos connaissances sur la biologie du cancer. Grâce à des modèles cellulaires en culture, nous avons identifié des mécanismes et des acteurs importants pour l’identité cellulaire. Nous souhaitons cette fois approfondir notre analyse dans un modèle murin et plus proche de la pathologie humaine en étudiant ces mécanismes dans le poumon.
Procédures
Les animaux seront tout d’abord soumis à une anesthésie puis inhalation intra-nasale de virus ou à une anesthésie / analgésie profonde puis injection intra-trachéale de virus par intubation. Dans le premier cas, la procédure totale dure environ 5 minutes (2 minutes d’endormissement, 3 minutes injection + réveil) et dans le second 20 minutes. Dans les deux cas, cette procédure n’est réalisée qu’une seule fois. Une à 8 semaines après inhalation / injection, les animaux sont mis à mort pour prélèvement d’organes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables liés à l’injection intra-nasale en elle-même sont très légers puisque l’anesthésie est très courte et la méthode d’injection n’est pas invasive. Les effets indésirables liés à l’injection intra-trachéale sont ceux pouvant résulter d’un acte opératoire classique sans chirurgie (il s’agit d’une intubation). Dans ce cas, une inflammation est possible due au passage du cathéter dans la trachée et une gêne est également envisageable due à l'injection d'un faible volume de liquide qui va descendre volontairement dans les poumons.
Devenir
Les animaux ne pouvant pas être réutilisés pour un autre projet, ils seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, ou en cas d’atteinte d’un point limite conduisant à l’interruption de la procédure d’élevage.
Remplacement
Jusqu’à présent, le projet a complètement été mené grâce à des expériences in vitro, donc sans faire appel à aucun modèle animal. Dans un but de mener des études plus approfondies et pour se rapprocher de la biologie du cancer il nous est indispensable de passer à des modèles in vivo de manière complémentaire aux modèles in vitro que nous avons déjà.
Réduction
Les effectifs définis dans ce protocole ont été déterminés grâce au comportement connu de ces modèles expérimentaux et tiennent compte des exigences statistiques nécessaires à l’exploitation des résultats. Afin de limiter le nombre nécessaire de souris, nous avons réduit au maximum le nombre de souris utilisées (20/groupes) dans nos procédures sans en compromettre l’interprétation et la puissance statistique des analyses. D’autre part, le projet sera réalisé pas à pas ce qui permettra de ne pas inclure tous les animaux prévus s'il n'y a pas besoin.
Raffinement
Les procédures seront réalisées sous anesthésie / analgésie. Les animaux seront suivis 2 fois par jour sur les 48h suivant l’administration des adénovirus afin d’identifier toute complication liée au mode d’inoculation (gonflement de la trachée/région du cou). Les animaux seront par la suite observés 3 fois par semaine afin d’identifier tout signe potentiel de mal-être ou de souffrance. Nous avons défini une série de points limites conduisant à l’arrêt de nos protocoles et à la mise à mort immédiate des souris concernées.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études de cancérogénèse du fait de l’existence de nombreux modèles génétiquement modifiés bien caractérisés qui permettent de reproduire de manière fidèle la progression tumorale observée chez les patients. Les souris jeune adultes seront infectées entre l’âge de 6 et 8 semaines afin de standardiser nos groupes d’études.
Etude du flux autophagique dans un modèle murin d’insuffisance cardiaque d’origine génétique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
92 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leur cœur et parfois de muscles des pattes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les souris mutantes, porteuses d'une mutation identifiée chez un patient humain, développent une insuffisance cardiaque dès leurs premières semaines de vie. 28 d'entre elles passent une à quatre échographies cardiaques sous anesthésie, 32 reçoivent une injection puis sont tuées quatre heures plus tard, et 32 autres subissent d'abord deux jeûnes de 22 heures séparés par deux heures d'accès à la nourriture, pour étudier le système qui élimine les protéines altérées des cellules du cœur. Le porteur justifie l'âge retenu, de deux à cinq mois, par un stade où l'insuffisance cardiaque permet des expériences "sans souffrance animale anticipée".
Objectifs
La cardiomyopathie dilatée (CMD) humaine est une maladie grave conduisant à l’insuffisance cardiaque et est la première cause de transplantation cardiaque. Les apports récents de la génétique dans ont permis l’identification de nombreux gènes (plus de 30) impliqués de cette pathologie. Ces découvertes n’ont cependant pas été accompagnée, le plus souvent, de l’étude des mécanismes de mise en place de la maladie dont l’identification doit conduire à des développements de médicaments spécifiques jusqu’ici inexistant. Nous avons développé un modèle de souris dans lequel nous avons introduit une mutation identifiée chez un patient humain de façon à reproduire la maladie. Ce modèle développe une insuffisance cardiaque dès les premières semaines de vie des animaux, et reproduit les observations dans l’espèce humaine. Les objectifs du projet visent à caractériser aux niveaux moléculaires et cellulaires les conséquences de cette mutation. Cela permettra une meilleure compréhension des mécanismes à l’origine de la maladie et servira à la mise en place de nouvelles thérapies. Pour cela, nous avons cibler l’étude d’une des voies qui maintiennent la qualité des protéines structurelles et contractiles des cellules cardiaques, régulées en partie par le gène muté chez le patient, et qui participent au maintien de la fonction contractile. Notre hypothèse est que des mutations affectant les systèmes participant au maintien de l’intégrité du stock protéique cellulaire induisent l’accumulation de protéines altérées au sein de la cellule qui serait toxique et, à terme, responsable de CMD. Ce projet a donc pour but de déterminer si ces voies sont dérégulées dans ce modèle murin muté.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’avancer dans la compréhension des mécanismes conduisant à la cardiomyopathie dilatée associée à des mutations génétiques particulières et ainsi révéler d’éventuelles cibles thérapeutiques appartenant aux voies de régulation de la qualité des protéines de la cellule cardiaque. Par extension, le projet doit permettre de mieux comprendre la pathogénèse de l’insuffisance cardiaque humaine, un problème majeur de santé publique dans les pays développés.
Procédures
28 animaux seront soumis à 1 à 4 échographies cardiaques d'une durée de 10 minutes chacune sous anesthésie gazeuse (âges 2 à 5 mois). -32 animaux seront soumis à l’âge de 2 ou 3 mois à une injection (environ 100µL de solution) suivie de leur euthanasie après 4 heures -32 animaux seront soumis à l’âge de 2 ou 3 mois à un jeûne de 2 fois 22h séparé par un accès libre pendant 2h à la nourriture (procédure de synchronisation du jeûne) puis à une injection (environ 100µL de solution) suivie de leur euthanasie après 4 heures.
Impact sur les animaux
Les manipulations étant réalisées juste avant (4h) l'euthanasie des animaux, celles-ci n’auront pas d’effets indésirables à long terme. Les effets indésirables potentiels sont liés aux stress potentiels à la suite de la manutention lors des injections, des pesées ou des échographies. Une autre source d’effet est liée aux injections elles-mêmes bien que réalisées avec une aiguille fine et d’un volume réduit. Les animaux pourraient développer une insuffisance cardiaque génératrice d’inconfort mais qui sera contrôlée par échocardiographie pour empêcher une souffrance animale. Le jeûne est une source de mal-être anticipé mais la perte de masse sera contrôlée attentivement pour éviter la souffrance animale. Il existe un risque anesthésique lors des échocardiographies.
Devenir
les procédures sont toutes suivies de l'euthanasie des animaux pour pouvoir collecter le tissus d'intérêt (ici le coeur et parfois les muscles des jambes)
Remplacement
Les maladies cardiaques d’origine génétique sont difficiles à modéliser dans des systèmes ex-vivo ou en culture cellulaire. Les cardiomyocytes sont des cellules qui n'existent pas en lignées. Nous disposons des procédures d'établissement de Cardiomyocytes issus d'iPS (des cellules pluripotentes capablent de donner tout les types cellulaires de l'organisme in vitro) et utilisons également ce modèle. Cependant, ces cellules ne permettent pas de remplacer le recours aux animaux en particulier pour les analyses physiopathologiques nécessitant l’intégration des signaux neuro-humoraux et mécaniques comme pour les pathologies cardiaques.
Réduction
Les modèles cellulaires seront cependant utilisés quand cela sera adapté, pour valider les observations réalisées chez les souris et cela dans le but de limiter le recours à de plus nombreux animaux. Le nombre d’animaux requis est réduit en limitant la taille des groupes et en utilisant une approche statistique indiquée pour les petits effectifs. Les procédures ne seront réalisées principalement que sur les souris mâles d’un seul génotype, qui présentent la maladie le plus tôt. Nous générons dans ce projet une lignée de souris nouvelle portant deux mutations différents dont l’association est nouvelle. Ainsi une étude pilote sera effectuée sur 20 animaux afin de déterminer les conditions optimales de l’expérimentation dans czette nouvelle lignée en observant les phénotypes cardiaque et musculaire. Avec ce pilote, l’expérimentation utilisera au plus 92 animaux ; Sans le pilote l’expérimentation utiliserait 124 animaux. Si le pilote n’est pas concluant pour valider l’hypothèse de base de cette expérience, alors l’étude expérimentale par croisement ne sera pas réalisée (soit 32 animaux en moins). Si l’étude pilote valide l’âge de 2 mois pour l’expérience, alors les animaux contrôles serviront dans les deux expériences prévues par le projet (16 animaux en moins).
Raffinement
Il s’agit de fournir aux animaux un environnement enrichis avec du coton et des serpentins de carton. Les animaux ne restent pas seuls dans les cages. Les cages sont nettoyées une fois par semaine. Les procédures proposées dans ce projet restent peu douloureuses et parcimonieuses (une seule injection /jeûne court /échocardiographies pour l’étude pilote uniquement). L’injection est réalisée par du personnel expérimenté. Les animaux seront euthanasiés après chacune des procédures et les tissus collectés pour maximiser l’information analysable à partir de chaque animal inclus dans le protocole. La procédure d’échocardiographie est non invasive et le bien-être des animaux, en particulier en relation avec l’éventuelle dégradation de leur fonction cardiaque, sera surveillé étroitement. La procédure d’échographie permettant le suivi de la fonction cardiaque est indolore puisque réalisée sous anesthésie légère respiratoire et sur plaque chauffante pour éviter l’hypothermie. L’utilisation des contrôles identiques aux deux protocoles de stimulation sera choisie si les résultats du pilote indiquent cette possibilité.
Choix des espèces
La souris a été choisie dans le cadre de ce projet puisqu’il s’agit de réaliser un croisement de lignées préexistantes pour produire un hybride de deux anomalies génétiques. Le recours à cette espèce est lié au fait que nous possédons déjà des informations sur des lignées développant une cardiomyopathie dilatée en relation avec l'atteinte génétique du gène d'intérêt, qui permettront des comparaisons, un approfondissement des connaissances et d'éventuelles généralisations sur les mécanismes de la pathogénèse. La génétique du modèle souris est bien connue ainsi que la maitrise des techniques de modification des gènes utilisé dans ce projet. Les procédures seront réalisées sur des animaux âgés de 2 mois à 5 mois. A ces âges, le phénotype pathologique est présent mais l’insuffisance cardiaque reste à un stade modéré, ce qui permettra la mise en place des différentes expériences sans souffrance animale anticipée.
Identification des protéines de surface et du sécrétome des glioblastomes pour mettre en évidence de nouvelles cibles médicamenteuses
- Recherche appliquée
- Cancers
Parmi les 3 450 souris, certaines sont immunodéprimées pour accepter des cellules de glioblastome d'origine humaine, les autres, immunocompétentes, recevant des cellules tumorales de souris. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère : jusqu'à deux chirurgies, l'implantation de cellules cancéreuses dans le cerveau puis une résection, des injections cinq jours sur sept pendant 28 jours, deux séances de radiothérapie et une prise de sang tous les quinze jours. Les tumeurs, cérébrales ou sous la peau, peuvent selon le porteur "générer des souffrances et une perte d'appétit", et l'équipe veut savoir si un inhibiteur de la respiration mitochondriale les ralentit et prolonge la survie. Le porteur écrit que la mise à mort finale de toutes les souris vise à "éviter des souffrances", et prévoit de maintenir les mêmes souris en vie pour établir des courbes de survie.
Objectifs
Le glioblastome (GB) est la tumeur cérébrale la plus commune et agressive chez l’adulte. Malheureusement, il n’existe aucun traitement efficace pour cette maladie et la survie moyenne des patients est d’environ 15 mois après le diagnostic. Les patients atteints de GB subissent généralement une résection chirurgicale pour éliminer autant que possible la tumeur cérébrale. Après la chirurgie, dans le but d’éliminer les cellules cancéreuses restantes, un traitement aux rayonnements ionisants (IR) et au Témozolomide (TMZ) est administré aux patients. Malheureusement, ce traitement standard actuel n’empêche pas la tumeur de récidiver. Les cellules à l'origine des récidives tumorales sont appelées « cellules de type-souches de glioblastome » (GSCs). Comprendre le fonctionnement de ces cellules est essentiel pour développer de nouvelles stratégies pour les cibler, les tuer et éviter la récidive de la tumeur. Nous avons récemment identifié un inhibiteur de la respiration mitochondrial (qui fournit de l'énergie aux cellules), capable d'éliminer ces GSCs. Nous étudierons si l’administration de cet inhibiteur ralentit la progression tumorale et prolonge la survie des animaux en combinaison ou non avec les traitements actuels standards. De plus essayerons d’identifier les protéines qui existent spécifiquement chez les cellules de glioblastome et qui sont impliquées dans le développement de la maladie et la résistance aux thérapies.
Bénéfices attendus
Ces expériences nous permettront d’identifier les protéines spécifiquement surexprimées par les glioblastomes. Ces protéines anormalement surexprimées par les glioblastomes, représentent de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous pourrons également identifier des protéines impliquées dans la résistance aux traitements actuels, en identifiant les protéines surexprimées dans les cellules de glioblastomes n’ayant pas été éliminées par la thérapie et donc résistantes. Enfin, nous étudierons si l’inhibition de la respiration mitochondriale (qui permet de fournir de l'énergie aux cellules) diminue la progression tumorale et augmente la durée de vie des animaux de façon plus efficace que les traitements actuels. Ainsi, en utilisant des modèles souris de glioblastomes ressemblant aux tumeurs observées chez les patients atteints de glioblastome, de nouvelles cibles thérapeutiques pourront être identifiées.
Procédures
- Les animaux seront soumis à des chirurgies. Les chirurgies sont des procédures qui durent environ 25 minutes et seront réalisées au maximum deux fois. - Les souris seront soumises à des traitements chaque jour pendant 5 jours, après 2 jours de repos un nouveau cycle de 5 jours de traitement sera réalisé. Les cycles de traitement seront répétés sur une durée de 28 jours. L'injection des traitements dure moins de 1 minute par souris.- Les souris seront soumises à une radiothérapie 2 fois à 4 jours d'intervalle. Cela dure 5 minutes par souris. - Les souris seront soumises à des prises de sang chaque 15 jours. Cela dure 5 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront une chirurgie (implantation de cellules de glioblastome dans le cerveau) et une implantation en sous-cutanée de cellules de glioblastome, qui peut induire des souffrances et une perte d’appétit. Le développement de tumeurs cérébrales ou sous-cutanées peut générer des souffrances et une perte d’appétit. Les animaux recevront des traitements par injections. Les injections peuvent induire une anxiété et une irritation au point d’injection. Les animaux recevront une radiothérapie qui peut induire des souffrances, une perte d’appétit, une irritation de la cornée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issu de la procédure. Les animaux sont implantés avec des cellules de cerveau cancéreuses et développeront des tumeurs. Ils seront sacrifiés à la fin de la procédure pour éviter des souffrances.
Remplacement
Nous avons isolé et mis en culture des cellules de glioblastome à partir de tumeurs de plusieurs patients. Nous avons obtenu des données robustes en utilisant ces modèles de culture cellulaire pour supporter l’hypothèse qu'un inhibiteur de la respiration mitochondriale (qui fournit de l'énergie aux cellules) peut représenter une stratégie thérapeutique efficace pour traiter le glioblastome. En effet, nous avons montré que cet inhibiteur diminue fortement la multiplication et le caractère agressif de ces cellules. Nous souhaitons maintenant savoir si ce composé est efficace lorsque les cellules de glioblastome sont dans leur environnement tumoral et si ce composé peut augmenter l'espérance de vie des animaux de façon plus efficace que les traitements actuels standards utilisés pour traiter le glioblastome. Le micro-environnement et les échanges entre les cellules non-tumorales ont un rôle majeur dans la progression de la maladie. Des modèles d’organoïdes composés de plusieurs types cellulaires ont été développés. Cependant, ces modèles ne sont pas parfaits et ne nous permettent pas l’étude du rôle du micro-environnement dans le glioblastome. En effet, les composants immunitaires dans les cultures d’organoïdes ne peuvent pas être maintenus sur de longues périodes et le manque de cellules endothéliales et de système vasculaire tumoral est un problème majeur qui limite l'utilité des organoïdes des tumeurs cérébrales. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable. Nous avons utilisé des lignées cellulaires dérivées de patients comme preuve de principe pour minimiser l'utilisation de souris.
Réduction
Une manip pilote avec un petit groupe d'animaux est tout d'abord réalisée pour définir les meilleures conditions. Nous avons mis en place des stratégies pour réduire le nombre de souris en utilisant le même groupe de souris pour obtenir plusieurs résultats. Par exemple, l'imagerie bioluminescente est une méthode non invasive qui nous permet d’évaluer le volume de la tumeur dans le temps tandis que les mêmes souris peuvent être maintenues pour générer les courbes de survie et pour les prélèvements sanguins.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cages collectives, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d’un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre d’explorer, de jouer et de ronger. Ces cages offrent aux animaux un espace important pour se redresser. Les chirurgies (implantation des cellules et résection) se déroulent sur animaux anesthésiés. Les animaux sont placés sur un tapis chauffant. Des analgésiques sont donnés en amont de la chirurgie. L'incision avec un ciseau au niveau de la peau de la tête se fait suite à une anesthésie locale. Les animaux ont gel ophtalmique tout au long de l'opération afin de réduire la sécheresse oculaire. Une injection de saline est réalisée pour éviter une déshydratation de l’animal. Suite aux chirurgies, un analgésique est administré 2 fois par jour pendant les 72h suivant l’opération. Pour le suivi de la croissance tumorale, une méthode non invasive est utilisée, les souris sont anesthésiées et maintenues sous anesthésie dans une boîte d’imagerie. Du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux pour éviter un dessèchement de la cornée. Les souris sont réchauffées grâce à une plaque chauffante à 37°C placée dans l’imageur. Les injections intrapéritonéales et les radiations sont des procédures rapides. Les animaux sont ensuite replacés dans leurs cages avec leurs congénères et surveillés quotidiennement pour détecter l’apparition d’éventuels effets secondaires. Suite à la prise de sang, une injection de saline est réalisée. Des points limites sont définis pour éviter une souffrance à l’animal.
Choix des espèces
2 modèles expérimentaux seront utilisés : •Des souris immuno compétentes qui recevront des cellules de types souches de glioblastome d’origine souris. Ce modèle nous permet d’étudier le rôle du microenvironnement dans le développement tumoral. •Des souris immunodéprimées qui recevront des cellules de types souches de glioblastome d’origine humaine. Ces souris permettent d'implanter des cellules humaines sans que le système immunitaire ne rejette la greffe. Ce modèle nous permet d’obtenir des tumeurs ressemblant aux tumeurs observées chez les patients atteints de glioblastome. Nous utiliserons des souris de 7 à 9 semaines pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs mois, donc l’implantation dans de jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.
Effets de composés chimiques ou biologiques sur des maladies dermatologiques induites chez les rongeurs (acné, psoriasis, prurit, dermatite atopique)
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Rats : 1500
Gerbilles de Mongolie : 1000
Traités chaque jour à l'imiquimod sur la peau ou injectés de cytokines pour provoquer un psoriasis, enduits d'allergènes pendant deux à sept semaines pour déclencher un eczéma, des rongeurs sont aussi tondus, épilés, et parfois porteurs de collerettes et logés seuls. 10 000 souris, 1 500 rats et 1 000 gerbilles de Mongolie, soit 12 500 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à sévère, tous tués à l'issue pour prélever leur peau et de grands volumes de sang. Le porteur attend du psoriasis à l'imiquimod une perte de 15 à 25 % du poids en 72 heures, sans retour au poids initial, et de l'eczéma jusqu'à 20 %, pour tester des molécules candidates contre l'acné, le psoriasis, l'eczéma et les démangeaisons. Pour filmer leurs grattements, il prévoit un isolement sans eau ni nourriture de 2,5 heures dans la description des procédures, et de 4 h 30 dans celle des effets néfastes.
Objectifs
L’objectif est de tester l’efficacité thérapeutique de composés chimiques ou biologiques dans un modèle de maladies dermatologiques chez le rat, la souris ou la gerbille : acné, psoriasis, dermatite atopique. Les différentes procédures de ce projet permettront d’évaluer l’efficacité thérapeutique de composés chimiques ou biologiques qui auront été présélectionnés in vitro sur des critères de puissance et d’efficacité En fonction de leurs propriétés pharmacocinétiques, ils pourront être testés en mode préventif ou thérapeutique .
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur plusieurs maladies dermatologiques : psoriasis, eczéma, acné, et sur un de leurs symptômes, le prurit. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies pour laquelle les options sont pour le moment limitées et imparfaites.
Procédures
Le psoriasis sera induit chez des rats/souris par application quotidienne (5 minutes) d’Imiquimod, ou par injections intradermiques quotidiennes de cytokines (sous anesthésie générale avec analgésie, 1 heure), pendant au maximum 15 jours. La dermatite atopique (eczéma) sera induite chez les rats/souris par applications topiques répétées de DNFB pendant 2 semaines ou d’OVA pendant 7 semaines (actes quotidiens de 5 minutes). Un score clinique sera établi deux fois par semaine par observation de la peau, et la quantification du nombre et de la durée des grattements sera déterminée à l’aide d’une caméra haute vitesse. Cette étape nécessitera l’isolement des animaux pendant 2,5 heures sans accès à la nourriture et à la boisson, une seule fois pendant l’étude. Les animaux seront pesés deux fois par semaine (5 minutes). Des démangeaisons pourront être déclenchées par administration intradermique à des souris/rats/gerbilles de substances pruritogènes sous anesthésie générale avec analgésie (1 heure). Ils seront pesés 2 fois dans la semaine d’étude (5 minutes). Pour les modèles d’atrophie des glandes sébacées, des composés seront administrés aux souris/rats pendant 4 à 24 semaines à une fréquence et par des voies variables. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine (5 minutes). Les applications topiques et intradermiques seront précédées par une tonte et une dépilation de la peau (acte d’environ 15 minutes). Les animaux porteront des collerettes et seront hébergés individuellement. Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par voie: intranasale et intratrachéale (anesthésie, 1h), intramusculaire et intradermique (anesthésie, avec analgésie, 1h), orale sur animaux vigiles (1 minute), sous cutanée (avec ou sans anesthésie et pansement occlusif, 5-30 minutes) et intrapéritonéale (anesthésié, 1 heure, ou vigile, 1 minute), ou par mini pompe osmotique posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (anesthésié 1 heure). Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 1 heure si anesthésie). Des biopsies de peau pourront éventuellement être réalisées, sous anesthésie générale avec analgésie (1h30). Les études de psoriasis dureront au maximum 4 semaines, celles d’eczéma 6 semaines maximum, celles de prurit 1 semaine maximum, celles d’acné 24 semaines maximum et celles de pharmacocinétique uniquement 48h maximum.
Impact sur les animaux
Dans ces modèles de maladies dermatologiques, des lésions dermatologiques sont attendues. Dans le cas du modèle d’atrophie des glandes sébacées, les seules lésions et pertes de poids qui pourraient survenir proviendraient d’une toxicité des produits administrés. Dans le cas du modèle de psoriasis à l’Imiquimod, des lésions de type psoriasis sont attendues c’est-à-dire des plaques d’érythème. Une perte de poids de 15-25% du poids initiale est attendue dans les 72h suivant la première administration d’Imiquimod. Cette perte de stabilisation ensuite sans retour au poids initial. Dans le cas du modèle de psoriasis induit par injection de cytokines, les lésions de type psoriasis seront plus limitées et les animaux perdront peu de poids (
Devenir
Après les 4 procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération de la peau et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionné dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.
Réduction
En cas de mesures simples de pharmacocinétique, il a été démontré que 3 animaux par groupe étaient suffisants. Dans le cas du modèle de prurit à la Substance P, nous avons démontré par le passé que 12 animaux par groupes sont nécessaires pour obtenir des différences significatives sur les paramètres d’intérêts. Dans les modèles d’eczéma induit par des allergènes, le nombre nécessaire a été évalué par le passé et dépend des paramètres évalués : il faut 12 animaux par groupe pour la mesure du nombre de grattements, 8 animaux par groupe pour comparer l’épaississement de l’épiderme et du derme, 10 pour la mesure d’infiltration de cellules inflammatoires par analyse histologique, 10 animaux par groupe pour comparer la mesure de l’expression de différents gènes dans la peau. Dans le cas de l’eczéma induit par S. aureus, il a été estimé sur la base de la littérature que 10 animaux par groupes seraient nécessaires. Ce nombre sera réévalué à l’issue des études pilotes. Dans le cas du modèle de psoriasis, il a été mis en évidence lors des études passées que 10 animaux par groupe sont nécessaires pour observer des différences statistiquement significatives.
Raffinement
Un scoring adapté au modèle sera réalisé au moins deux fois par semaine, sauf dans le cas du modèle de prurit (pas de lésions) et lors de l’induction du modèle d’eczéma à S aureus (pas de mesures lorsque le pansement est en place). La fréquence de retrait du pansement pourra être augmentée, afin de mieux comprendre la cinétique de la maladie, et la fréquence de retrait pourra être adaptée. Au préalable, des tests de réactions aux pansements et à leur retrait fréquent seront effectués (sous anesthésie). Les animaux seront pesés au moins 2 fois par semaine : 10-15% de perte de poids : pesée quotidienne, réhydratation sous cutanée (SC) une fois par jour. 15-25% : pesée quotidienne, réhydratation SC deux fois par jour. Le poids constituant un point limite sera adapté au modèle (voir procédures). Un gel nutritif ou de l’eau gélifiée dès 10% de perte de poids sur certains animaux. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus. Les actes douloureux (injection IM ou ID, pose de mini pompe, biopsie) seront réalisés avec analgésie. Les actes peu stressants (autres administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (administrations IV, IP et topiques) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Lors d’administrations topique, le port d’une collerette avec hébergement individuel pourra être nécessaire. Une période d’acclimatation à son port sera réalisée et un enrichissement supplémentaire sera fourni. Un nettoyage quotidien des yeux avec une compresse imbibée de sérum physiologique stérile palliera au manque de toilettage imposé par le port de la collerette. Pour évaluer l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte (cf. procédures). Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction des maladies et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les différents modèles dermatologiques d’intérêt sont bien décrits chez la souris et le rat. La gerbille est aussi bien décrite dans le cas des modèles de prurit. L’espèce la plus pertinente pour les études, en particulier sur la base des paramètres pharmacologiques de la substance à tester, sera choisie si le modèle est décrit chez plusieurs espèces. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), étant donné que les modèles dermatologiques d’intérêt sont bien décrits dans la littérature sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines.
Rôle de la tubuline beta1 dans la fonction plaquettaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
237 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Porteuses d'un défaut génétique plaquettaire reproduisant celui d'un patient, elles font l'objet de prélèvements d'organes post-mortem pour étudier le rôle de la tubuline beta1 dans la fonction des plaquettes et de la thyroïde. Le porteur affirme qu'il n'y a "pas de contraintes pour les animaux" puisque tout se déroule sans réveil. Il indique que les plaquettes ne peuvent pas être mises en culture et conclut qu'il est "nécessaire" de disposer de plaquettes issues de sang frais dans un organisme vivant.
Objectifs
Chez un individu en bonne santé, les plaquettes sanguines participent lors d’une coupure du vaisseau sanguin à l’arrêt du saignement en colmatant la brève vasculaire. En revanche, dans des conditions pathologiques, ces plaquettes peuvent ne pas être fonctionnelles ce qui peut causer des saignements abondants (hémorragie) ou au contraire, entrainer une trop grande réactivité des plaquettes et dans ce cas induire une occlusion des vaisseaux sanguins, c’est la thrombose. Par ailleurs la production des plaquettes dans le sang nécessite des remaniements importants de la morphologie de la cellule pour qu’elle devienne fonctionnelle. Ces modifications morphologiques impliquent un remodelage constant du squelette (appelé cytosquelette) de la plaquette. Récemment, il a été montré que des défauts génétiques touchant certaines protéines du cytosquelette des plaquettes avaient également une répercussion sur des maladies de la thyroïde. Le projet a pour objectif de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans ces deux défauts plaquettaires et thyroïdiens associés aux atteintes génétiques du cytosquelette.
Bénéfices attendus
Dans son ensemble, ce projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la production des plaquettes et leur morphologie, mais également d’aborder de façon plus approfondie le rôle de la tubuline β1 dans les fonctions plaquettaires. Par ailleurs, cette étude devrait permet d’envisager un meilleur suivi de ces patients qui sont susceptibles de présenter des risques de thrombose.
Procédures
Toutes les procédures se feront sur animaux anesthésiés. A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés sans retour au préalable à la conscience.
Impact sur les animaux
Le projet ne comporte que des procédures sans réveil sous anesthésie générale. Il n’y a donc pas de contraintes pour les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure (sans réveil). Des prélèvements d’organes post-mortem seront alors effectués.
Remplacement
Dans ce projet, une partie de notre étude repose sur des études in vitro de cultures cellulaires. Ces modèles cellulaires in vitro sont essentiels pour orienter nos recherches, mais ces cellules ne sont pas des plaquettes. En effet, les plaquettes sont des cellules qui ne peuvent pas être mises en culture. Par ailleurs, hors d’un organisme vivant, leur survie est limitée à quelques heures. Il est donc nécessaire de disposer de plaquettes isolées à partir de sang frais. Le modèle murin que nous avons généré porte le même défaut génétique plaquettaire qu’un patient. Ces souris permettront d’étudier les plaquettes sanguines dans un organisme vivant, d’évaluer les interactions entre toutes les composantes du sang, et d’évaluer les risques de saignement ou d’occlusion des vaisseaux encourus par le patient porteur de ce même défaut génétique.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude est de 237 animaux. Nous avons pu définir au plus juste ce nombre sans compromettre les résultats (qui resteront statistiquement analysables) en nous basant sur notre expérience personnelle, les données de la littérature et par une validation de ce nombre par un logiciel de statistique (GPower3.1).
Raffinement
Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie, traitements analgésiques...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Pour limiter le stress des souris, les animaux seront sortis de la zone d’hébergement de l’animalerie juste avant l’expérimentation.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et pratiques. En effet, la souris est l'animal dont la génétique est la mieux connue et avec laquelle il est assez facile de générer des modèles porteurs de défauts génétiques spécifiques comme ici où notre modèle murin est porteur d’un défaut génétique comparable à celui décrit chez un malade. Par ailleurs, notre structure utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d'animalerie, d'élevage, d'expertises techniques pour l’expérimentation animale, mais également un atout majeur dans le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. De plus, la souris est l'animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale ce qui permet de comparer plus facilement les résultats. Enfin la méthodologie envisagée dans ce projet est adaptée au modèle murin et nous avons acquis au cours des années une expertise notable et de bonnes pratiques expérimentales avec cette espèce.
Evaluation d’un traitement combinant la radiothérapie et deux immunomodulateurs dans des modèles de cancers du colon et du mélanome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des immunomodulateurs par voies intrapéritonéale et orale, pour tester une molécule associée à la radiothérapie contre le cancer du côlon et le mélanome. Le porteur décrit les atteintes très brièvement, la tumeur et le traitement pouvant "affaiblir la souris", sans détailler les points limites. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le micro-environnement tumoral et conclut que le projet doit être mené sur un organisme disposant d'un système immunitaire.
Objectifs
L’efficacité des immunothérapies ciblant l’axe PD-1/PD-L1, est très prometteuse, mais il semblerait que, dans certaines situations, ce traitement ne soit pas suffisant pour complètement activer la réponse immunitaire antitumorale. Dans ces cas, l’association de ce traitement avec notre molécule d’intérêt pourrait présenter une activité synergique bénéfique in vivo. De plus, l’efficacité accrue des traitements combinés radiothérapie/immunothérapie en comparaison avec les monothérapies est un des axes les plus prometteurs en ce qui concerne la lutte contre le cancer du colon et du mélanome.
Bénéfices attendus
L'ajout de la molécule (ACB1801) dont l’activité semble augmenter l’activité de protéines impliquées dans la présentation d’antigène in vitro, semble améliorer la réponse aux monothérapies ciblant PD-1 dans des modèles in vivo. Nous souhaitons donc combiner ces traitements avec la radiothérapie, afin d’améliorer l’efficacité de ces thérapies dans le cadre du cancer du colon et du mélanome. Déterminer si il y a une toxicité de la triple combinaison sur l'animal afin d'éviter les effets seconduires chez le patient.
Procédures
Les seules interventions prévues sont l'injection de cellules tumorales en sous cutané ainsi que l'injection en intrapéritonéal et par administration orale des immunomodulateurs pour les deux procédures.
Impact sur les animaux
Le traitement ainsi que la façon dont pousse la tumeur peuvent, dans certains cas, affaiblir la souris.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés du fait des greffes qu'ils ont eues et pour effectuer des prélèvements d'organes en vue d'analyses sur certains d'entre eux.
Remplacement
Le recours à des modèles animaux nous permettra d’étudier les effets des combinaisons thérapeutiques dans un contexte qui inclut le micro environnement tumoral et qui permet donc l’interaction des cellules tumorales avec le stroma (dont les cellules immunitaires sous dépendance de médiateurs type cytokines ou cellules provenant du reste de l'organisme). Cela est indispensable dans le contexte de la radiothérapie (par exemple: effet «bystander» de l’irradiation i.e. effets que les cellules irradiées pourraient exercer sur des cellules non irradiées à proximité ou à distance par exemple). Il n’existe pas de modèle in vitro permettant une telle étude. Le projet nécessite donc d’être mené sur un organisme vivant disposant d’un système immunitaire.
Réduction
Nous avons choisi d'utiliser les modèles du cancer du colon et des mélanomes pour lesquels il y a beaucoup de données dans la littérature ainsi que dans notre laboratoire concernant la réponse à la radiothérapie et l'immunothérapie. Ceci nous permettra de réduire les conditions expérimentales (dose d'irradiation et d'immunomodulateurs) et donc le nombre d'animaux nécessaires pour tester nos hypothèses. De plus nous nous sommes basés sur des analyses statistiques pour déterminer le nombre nécessaire d'animaux.
Raffinement
Le développement de la tumeur sera suivi par la mesure du volume tumoral et les souris seront pesées très régulièrement. Un suivi quotidien de signes éventuels de souffrance sera effectué. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les procédures seront effectuées sous anesthésie locale ou générale. En cas de besoin, une analgésie sera utilisée. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Leur environnement sera enrichi (sizzlenests, maisons en cartons).
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie. Les souris C57BL/6 et Balb/C ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les souris seront âgées de 8 ou 9 semaines, un âge où la souris est suffisamment développée (jeune adulte).
Evaluation de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle d’acné chez la souris et le hamster
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Hamsters dorés : 150
670 animaux non-humains, 520 souris et 150 hamsters dorés, vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les hamsters reçoivent de la testostérone pour élargir leur organe de flanc, les souris subissent des mesures de peau, et tous reçoivent quotidiennement des molécules contre l'acné avec imagerie sous anesthésie et prélèvements sanguins. Le porteur précise qu'aucune analgésie ne sera employée, car elle risquerait d'interférer avec l'analyse. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle capable de remplacer la peau comme tissu vivant et revendique un projet "nécessaire".
Objectifs
Ce projet est nécessaire pour l’évaluation de l’efficacité de molécules thérapeutiques ayant une activité sur l'acné. Ces tests sont requis pour permettre le choix des meilleures molécules ou traitements thérapeutiques avant essai chez l’homme (tests cliniques).
Bénéfices attendus
L'acné est une maladie de la peau qui a des répercussions psychologiques très importantes chez les patients car elle modifie l'image corporelle des individus à des moments clés de la vie (l'adolescence, la femme jeune) et parce qu'elle atteint le visage, elle interfère alors dans la relation avec les autres. Les personnes touchées sont en proie au mal-être et ont tendance à se replier sur elles-mêmes. Les bénéfices de ce projet, si une molécule se révélait efficace, serait de mettre sur le marché cette molécule permettant aux patients atteints d'acné de guérir de l'acné et de son inflammation, réduisant ainsi les conséquences physiques et les répercussions psychologiques impactées par cette maladie de peau.
Procédures
Les Hamsters seront tondus pour identification au niveau des organes de flanc (durée d'intervention < 5 minutes), ils recevront le traitement sur les organes de flanc (durée d'intervention
Impact sur les animaux
L'injection de testosterone chez les Hamsters peut avoir une répercussion sur le comportement (augmentation de l'agressivité, excitation, dominance...). Des effets indésirables peuvent être observés lors de l'administration des molécules thérapeutiques : mauvaise tolérance pouvant entraîner une perte de poids, irritation en cas d'application topique.
Devenir
A l'issu des procédures tous les animaux seront mis à mort après une anesthésie générale (isoflurane afin de prélever les tissus et réaliser des analyses ex vivo pour l'évaluation de l'efficacité des traitements testés.
Remplacement
Nous n'utiliserons le modèle animal d'inflammation provoquée par l'acné qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles alternatifs qui permettent d’effectuer un premier test d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles alternatifs ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau - L’efficacité ne pouvant être complètement testée dans les modèles alternatifs, des premières preuves d’efficacité chez l'animal doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme).
Réduction
Le nombre d'animaux sera de 8 par groupe (groupe d'animaux traités avec excipient de la molécule à tester, la molécule à tester ou le traitement thérapeutique de référence commercialisé type bétaméthasone). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable. Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées (histologie/immunohistologie/ PCR/ cytométrie et approches "omiques") afin d'obtenir le plus d'informations possibles relatives à l'efficacité des molécules administrées sur les animaux.
Raffinement
Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des lésions induites...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - Perte de poids supérieure à 20 % du poids normal maintenue sur 72h ; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication sur le site d’application de la molécule topique. Si l'un de ces points limites est atteint, les animaux seront euthanasiés immédiatement. L'utilisation de l'imagerie permettra aussi d'augmenter le raffinement (finesse de l'analyse, suivi longitudinal,...) et entraîne une réduction du nombre d'animaux utilisés grace au suivi longitudinal du même animal. Les animaux seront anesthésies lors des prélèvements sanguins et les étapes d'imagerie OCT. Aucune analgésie ne sera employée car cette dernière risquerait d'interférer lors de la phase analytique.
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris Rhino et hamster) sont d’excellents modèles d'acné. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l’évaluation de l'acné dans ces espèces. De plus, ces animaux présentent des lésions d'acné très semblables à celles observés chez l’humain. De plus, ils présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Tous les animaux auront le même âge. Il s'agit également du stade auquel les animaux sont les moins susceptibles de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale.
Exploration fonctionnelle de la contribution des fibres CLTMRs dans la modulation de la douleur post lésionnelle-Etude pilote par neuroimagerie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris triples mutantes, elles reçoivent du tamoxifène par injection puis par trois gavages, avant une séance d'IRM sous anesthésie légère, pour tester si l'on peut suivre l'activation de certains neurones sensoriels. Le porteur présente une étude pilote censée conditionner un projet plus large sur la douleur, les animaux étant tués faute de pouvoir être relâchés. Il affirme que la détection des variations cérébrales ne peut se faire que sur animal vivant.
Objectifs
Il s'agit ici d'une étude pilote dont les objectifs sont les suivants : Le but de ce projet est d'étudier la biologie d'une classe particulière de neurones somato-sensoriels non myélinisés capables de transduire des stimulation mécaniques à bas seuil, détectées au niveau de la peau poilue. Typiquement, chez l'homme, ces neurones interviennent dans la détection et transduction du toucher social ou affectif. De manière intéressante, des études récentes, y compris certaines réalisées au sein de notre équipe, suggèrent que ces neurones sont aussi capables de moduler la douleur postlésionnelle ainsi que la réponse immunitaire cutanée. Cependant, ces conclusions ont toutes été formulées de manière indirecte et à l'heure actuelle, aucune étude n'apporte la démonstration directe de leur fonction in vivo, à l'état basal et dans la modulation de la douleur post-lésionnelle. C'est précisément le but de notre projet. Il repose sur l'utilisation d'une série de lignées de souris génétiquement modifiées de manière à générer des souris triple mutantes permettant d'activer, inhiber ou bien éliminer séléctivement ces neurones in vivo, et ce, de manière inductible. Le but de cette étude pilote est de vérifier qu’il est possible de suivre par IRM la réponse cérébrale induite par l'activation de ces neurones. Les résultats de cette étude préliminaire conditionneront la mise en œuvre d’un projet s’appuyant sur des méthodes d’IRM fonctionnelle pour l’étude des réseaux cérébraux de la nociception impliquant ces neurones.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de cette étude pilote sont les suivants : La prise en charge de la douleur est actuellement un enjeu majeur. En effet, 1/5 de la population mondiale est atteinte de douleurs chroniques, ce qui représente un problème socio-économique important et souligne que les mécanismes moléculaires et cellulaires intervenant dans la mise en place et le maintien des douleurs chroniques restent peu compris. Dans ce projet, nous allons nous intéresser à une classe particulière de neurones somatosensoriels, qui semblent avoir des propriétés de modulation de la douleur post-lésionnelle. Par conséquent, nous allons augmenter nos connaissances fondamentales sur les mécanismes cellulaires impliqués dans la mise en place et la durée de l'hypersensibilité sensorielle induite par des lésions tissulaires. De plus, notre projet est conçu de sorte à permettre la découverte de nouvelle pistes thérapeutiques, qui pourraient avoir une application chez les patients humains. A noter que les neurones étudiés ont été également décrits chez l'homme.
Procédures
L'ensemble des animaux recevra une série administrations de tamoxifen : une injection intra-péritonéale à P42 suivie de 3 gavages espacés de 3 jours, 3jours après l’injection I.P. Une session d'imagerie (d'une durée inférieure à 1h30) sera ensuite réalisée de façon non invasive sur chaque souris (sous anesthésie et sédation légères) à l’état basal (avant injection) et après injection.
Impact sur les animaux
Les animaux seront examinés une seule fois par IRM avant et après administration du véhicule ou d’une solution d'un composé appelé Clozapine-N-Oxyde (CNO. Nos données préliminaires nous permettent d’affirmer que les doses de tamoxifen et CNO utilisées ici n’ont aucun effet délétère sur nos souris triples mutantes. L’examen IRM sera conduit sous anesthésie gazeuse. La seule nuisance ou effet indésirable possible pour ces animaux est la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, un évènement rare lorsque l’isoflurane est administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l'IRM permet de détecter les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie ce qui permet le réveil rapide des animaux.
Devenir
Les animaux seront tous euthansiés à l'issue de la procédure d'imagerie. Etant donné que nous travaillons sur des souris génétiquement modifiées et sur des souris dégénérées, leur mise en liberté est inconcevable.
Remplacement
Ce projet sera conduit dans le strict respect de la règle des 3R. Le recours à l’animal est incontournable car la détection de variations hémodynamiques cérébrales résultant d’une stimulation pharmacologique ne peut être réalisés que sur des animaux vivants. Il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro ou in silico.
Réduction
L’utilisation d’une technique d’imagerie non invasive permettra de réduire le nombre d’animaux, grâce au suivi longitudinal de chaque individu. En l’absence de données préliminaires permettant de connaître la taille d’effet attendu (l’objectif de ce projet exploratoire étant justement d’apporter des informations sur la réponse cérébrale au CNO) nous avons estimé la taille des groupes nécessaires à l'obtention de données fiables sur la base de notre expérience en IRM préclinique. Les animaux seront leur propre contrôle. Les données seront analysées au moyen d’une analyse statistique non paramétrique pour mesures répétées adaptée aux petits échantillons.
Raffinement
Le raffinement concernera toutes les procédures du projet ainsi que les conditions d’hébergement des animaux et devrait permettre de réduire le stress et l’angoisse. Tous les examens cliniques par imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse avec monitoring physiologique. Un délai d'acclimatation minimum de 14 jours et une habituation à l'expérimentateur seront assurés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec cycle jour/nuit, nourriture et boisson ad libitum et enrichissement environnemental. Les cages contiendront des rondins de bois à ronger, du coton pour la nidification, un refuge en plastique, et une roue fast-track avec igloo afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels.
Choix des espèces
Chez la souris, la population des C-LTMRs est similaire à celle décrite chez l'homme sous le nom de C-Tactile. Cette étude pilote sera réalisée sur des souris âgées de 8 à 12 semaines car nous travaillons sur la physiologie d’animaux adultes.
Précision de la reconnaissance du cancer colorectal avec un fluorophore ciblé pour améliorer la surveillance et réduire une chirurgie inutile.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de lignées de cancer colorectal humain, subissent une ou deux chirurgies sous anesthésie, des résections de tumeur et pour certaines cinq séances d'irradiation, avant d'être tuées pour prélèvement. Le projet évalue un dispositif d'imagerie par fluorescence censé guider le chirurgien, le porteur reconnaissant inflammation, perte de poids et douleur postopératoire. Il affirme que la validation du dispositif rend l'étape animale "indispensable" avant tout essai clinique.
Objectifs
Le cancer colorectal est l’un des cancers les plus fréquents et mortels chez les hommes et les femmes avec un taux de survie de 63 % à 5 ans malgré la mise en place d’un programme de dépistage. Des cancers colorectaux (CCR), 30 % sont localisées dans le rectum (CR). Le CR nécessite un diagnostic et un traitement spécifiques. La résection chirurgicale est le traitement de référence, mais elle induit une morbidité importante et une qualité de vie réduite. Les chirurgiens doivent se reposer sur leurs sens de la vision et du toucher afin de distinguer les tissus malades devant être retirés des tissus sains à préserver. Cette absence de guidage est critique ; une identification inadéquate des zones de résection peut être responsable du développement de métastases, d’une récidive locale et de la diminution de la survie. Pour répondre à cette problématique, l’imagerie est devenue un domaine de recherche majeur, notamment autour de l’imagerie de fluorescence. Cette technique non-irradiante est adaptée aux contraintes d’un bloc chirurgical. Elle nécessite l’usage d’un fluorophore sensible et spécifique au tissu malade ciblé. La stratégie « Watch and Wait » (observer et attendre) est une approche permettant de préserver les organes. Un suivi précis de ces patients est crucial pour identifier toute (re)croissance tumorale locale ou dans des organes avoisinants. C'est pourquoi de nouvelles technologies de surveillance ont été développées afin de permettre un suivi plus précis et plus objectif et de minimiser le risque de récidive et d’améliorer les résultats cliniques et la qualité de vie des patients. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif l’évaluation d’un nouveau système d’imagerie avec un fluorophore cible comparé à différents systèmes d’imagerie et à d’autres fluorophores. Pour ce faire, un modèle murin de xénogreffe de cancers colorectaux permettant de reproduire les conditions du cancer colorectal humain sera utilisé. Ce nouveau dispositif d’imagerie, s’il est validé, pourrait être utilisé au cours d’une chirurgie CRC ou d’une coloscopie afin d’aider les chirurgiens dans leur prise de décision. Ce projet sera donc réalisé sur un effectif total de 850 animaux dans le respect de la règle des 3 R.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait contribuer à optimiser les thérapies chirurgicales des cancers colorectaux en réduisant le nombre d'opérations inutiles après une réponse clinique complète et d'assurer un meilleur suivi des patients. En effet, le traitement à visée curative du cancer colorectal consiste en une chimioradiothérapie néoadjuvante suivie d'une résection chirurgicale. Cette technique a permis de diminuer la récidive avec de meilleurs résultats à long terme. Toutefois, il est difficile pour les chirurgiens de distinguer les tissus cancéreux des tissus sains. Ainsi, de nouveaux outils d'imagerie diagnostique pourraient améliorer le contraste entre les tissus cancéreux et les tissus sains adjacents pendant la chirurgie. L'imagerie moléculaire ciblée sur la tumeur est une technologie émergente qui pourrait répondre au besoin d'évaluation nécessaire aux chirurgiens. Cette technique innovante peut permettre une visualisation peropératoire en temps réel de la tumeur en mettant en évidence de manière sélective les cellules cancéreuses. Ainsi, cette étude pourrait permettre la mise en place d’essais cliniques chez l’homme et fournir de meilleurs outils d'orientation aux chirurgiens traitant des patients atteints de cancers colorectaux.
Procédures
Les animaux des différentes procédures expérimentales seront soumis à : - Implantation d’une lignée cellulaire au niveau des deux flancs sous anesthésie générale gazeuse sur 72 animaux (PE1, partie 1) - Implantation de 3 lignées cellulaires sous anesthésie générale gazeuse sur 778 animaux (PE1, partie 2 et PE2-PE9) - 1 chirurgie sous anesthésie générale gazeuse pour exposer la tumeur sur 666 animaux pendant environ 1 heure (PE1, 2, 3, 4, 5, 7 et 8) - 2 chirurgies sous anesthésie générale gazeuse sur 184 animaux pendant 1 heure (PE6 et 9) - 1 résection de tumeur complète sous anesthésie générale gazeuse sur 697 animaux pendant 1 heure (PE2, 3, 4, 5, 6 résection totale, 7, 8 et 9) - 1 résection de tumeur incomplète sous anesthésie générale gazeuse sur 69 animaux pendant 1 heure (PE6 résection partielle) - imagerie (non invasive) sous anesthésie générale gazeuse sur 850 animaux pendant 5 minutes - 5 séances d’irradiation sous anesthésie générale gazeuse sur 46 animaux pendant 10 minutes une séance par jour pendant 5 jours - Euthanasie prélèvements d’organes terminaux sous anesthésie générale sur tous les animaux (850).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables qui pourraient être observés sur notre modèle de souris de cancers colorectaux sont : - Inflammation ou nécrose de la tumeur, - Perte de poids, - Douleur suite à la chirurgie. Une grille d’évaluation de la souffrance/points limites des souris établies tous les 2-3 jours permettra de détecter et suivre la totalité des effets secondaires et de les gérer en cas de besoin.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de prélever les tissus pour des études et validations post-mortem.
Remplacement
Après un début de développement du dispositif d’imagerie grâce à des approches « in silico » (numériques) et « in vitro » (substrats de synthèse, tissus, organes isolés), le recours à l’animal s’avère essentiel pour avancer dans la validation de cette nouvelle technologie. Il s’agit de démontrer l’efficacité du dispositif d’imagerie en temps réel au cours d’une chirurgie, en validant des paramètres spécifiques dans différentes procédures expérimentales réalisées sur un modèle de cancers colorectaux. L’objectif principal est de démontrer que le nouveau dispositif d’imagerie permet de distinguer les tissus sains des tissus cancéreux pour guider le chirurgien lors de son opération. Cette étape sur l’animal est indispensable afin de pouvoir envisager, par la suite, la mise en place d’essais cliniques chez l’homme.
Réduction
Le nombre de mesures réalisées par animal a été optimisé (plusieurs systèmes d’imagerie seront utilisés sur un même animal) afin de réduire le nombre d’animaux au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les études seront réalisées par étapes, avec des phases préalables de validation et d’optimisation des modèles sur de faibles effectifs avant de passer aux étapes suivantes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec du matériel pour la nidification. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement quelques jours avant de démarrer les procédures expérimentales ; la mesure de leurs tumeurs et leur poids sera réalisée 3 fois par semaine. L’implantation des tumeurs, les chirurgies et les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale. L’usage d’analgésie avant les opérations permettra une meilleure gestion de la douleur. Une partie des animaux sera sacrifiée sans réveil après la chirurgie. Les animaux qui seront réveillés après chirurgie seront suivi quotidiennement afin de pouvoir détecter et gérer la douleur en cas de besoin. La surveillance et les soins des animaux avant l’intervention seront assurés par une équipe qualifiée de zootechniciens, vétérinaires, techniciens et chirurgiens. La structure en charge du bien-être animal accompagnera le projet dans sa mise en œuvre, avec les conseils du vétérinaire désigné qui prendra les dispositions nécessaires au maintien du bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. Il est ainsi possible d’obtenir un modèle standardisé optimal de tumeurs colorectales, modèles plus difficiles à réaliser chez d’autres espèces. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Sa petite taille, sa prolificité, les facilités zootechniques, les risques sanitaires moindres et une littérature abondante sont autant d’arguments complémentaires en faveur du choix de cette espèce. Nous utiliserons des souris nude. Ce modèle de souris permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs. Ces souris sont connues pour être de bons modèles pour le développement de tumeurs sous-cutanées. Les animaux seront livrés à partir de l'âge de 5 semaines. A cet âge, nous pourrons réaliser les analyses prévues sur les tumeurs. L’utilisation de souris nude, sans poils, fera en sorte que la couleur de la peau et les poils n'interfèrent pas avec les différentes technologies d'imagerie utilisées.