Souris

1 452 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection d'iodate de sodium détruit leur rétine pour reproduire une dégénérescence comme la DMLA, puis des molécules candidates leur sont administrées par diverses voies, avec des tests comportementaux mesurant la baisse d'acuité visuelle, avant prélèvement des yeux. Le porteur mène ce criblage pour développer des médicaments et renvoie l'usage chez l'humain à une éventualité. Il qualifie le recours à l'animal de 'stricte nécessité' et d''indispensable', affirmant qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit un 'organisme entier'.

Objectifs

Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie in vitro et/ou in vivo, de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte de maladies ophtalmologiques avec la mise en place d’un modèle animal de dégénérescence de la rétine chez la souris ou le rat. L’objectif est de trouver des molécules pouvant retarder la baisse d’acuité visuelle et la dégénérescence rétinienne.

Bénéfices attendus

Ce projet se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de molécules thérapeutiques pouvant avoir un effet sur la dégénérescence de la rétine comme observée dans la DMLA ou la maladie de Stargardt. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de nouvelles molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme.

Procédures

tous les animaux subiront une injection systémique de sodium iodate (sauf le groupe 1, sérum physiologique) pour induire la pathologie. l'injection sera unique et se fera par voie intra-péritonéale sur animal vigile. les traitements pourront être administrés en préventif (jusqu'à 1 mois avant l'induction du modèle) et/ou en curatif (jusqu'à 1 mois après l'induction du modèle). selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra-péritonéale, sous la peau, par voie orale ou par voie topique, sur animal vigile. tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques. Des tests comportementaux pour mesurer l’acuité visuelle seront également réalisés : une fois avant le début des traitements mais après l’injection de sodium iodate afin de confirmer l’induction du modèle et/ou de procéder à l’allocation des groupes (durant la 1ère semaine), puis jusqu’à 1 fois par semaine pendant 4 semaines après l’injection de sodium iodate soit 4 fois maximum pour la durée d’une étude (voir figure en annexe). Le premier type de test dure 5 minutes maximum et chaque animal est testé jusqu’à 10 fois avec un intervalle de 5-10 minutes entre chaque test. Le deuxième type de test dure environ 5 secondes et le test est répété trois fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque répétition.

Impact sur les animaux

Du fait de l'induction du modèle, les animaux vont avoir une diminution de l'acuité visuelle (visible par les tests comportementaux mis en place) qui est liée à une dégénérescence de la rétine sans autre effet indésirable attendu aux doses administrées. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques) ni aux tests comportementaux (procédure légère pour tester l’acuité visuelle).

Devenir

euthanasie pour récupérer différents organes, dont les yeux, pour analyses histologiques ou autre

Remplacement

Notre projet se focalise sur un modèle expérimental nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Ces modèles in vivo permettent de mesurer l’acuité visuelle en reproduisant la physiologie d’un organisme entier. Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant nos procédures expérimentales.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 6 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude. Une analyse statistique appropriée sera réalisée par un test non paramétrique (kruskal-wallis test).

Raffinement

Les animaux seront sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement: les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces. Si les signes persistent au bout de 24h, l’animal sera sorti des procédures expérimentales et euthanasié.

Choix des espèces

L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir en ophtalmologie implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers notre modèle reproduisent au mieux la pathophysiologie de la dégénérescence de la rétine humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur l’acuité visuelle ou l’histologie de l’oeil, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en cellule.

2 475 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris génétiquement modifiées pour reproduire des syndromes de surcroissance comme le syndrome de Protée reçoivent un gavage quotidien pendant deux mois, du tamoxifène puis des inhibiteurs, ainsi qu'une injection sous la peau, pour étudier ces maladies sans traitement connu. Le porteur décrit le gavage comme non traumatisant et surveille surtout le risque de fausse route, et prévoit d'arrêter le traitement quand une malformation atteint un demi-centimètre cube chez un animal témoin. Il affirme que les expériences in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des cultures cellulaires ou des méthodes in silico.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance en mosaïques sont causés par des mutations génétiques causant une croissance anormale des organes et/ou tissus. Nous nous intéressons ici au syndrome de Protée caractérisé par une hypercroissance asymétrique des tissus avec des anomalies vasculaires et lymphatiques mais aussi aux anomalies d’hypercroissance associées à des hypoglycémies. Pour ces 2 types de pathologies il n’existe aucun traitement. Notre objectif est de mettre en place des modèles de souris porteurs de ces mutations dans différents tissus de manière spécifique afin de comprendre les mécanismes moléculaires, cellulaires et endocrinologiques de ces pathologies. Nous explorerons également l’effet de différentes molécules permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements.

Procédures

Un traitement sera administré par gavage quotidien pour faire diminuer le volume des malformations. Le volume administré sera de 100ul. Celui-ci sera effectué par un technicien expérimenté. Le gavage sera réalisé chez des souris adultes. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché, en silicone, ultra souple et non traumatisante pour l’animal. Le gavage dure environ 15 secondes par animal. Les souris seront gavées pendant 2 mois. Un groupe de souris recevra une injection unique sous cutanée de 100ul. Cette injection sera effectuée par un technicien expérimenté

Impact sur les animaux

Gavage au tamoxifene pendant 5 jours pour induction de la Cre recombinase. Le tamoxifene à cette dose là ne donne pas de toxicité particulière. Gavage avec les inhibiteurs pharmacologique ou véhicule pour réduire le volume des hypertrophies. Le gavage n’entraine aucune nuisance particulière sauf une fausse route qui sera particulièrement surveillée. Les inhibiteurs pharmacologiques ne donnent pas de toxicité particulière aux doses utilisées. Le traitement sera interrompu lorsqu'une malformation chez une souris du groupe contrôle aura atteint le volume de 0.5cm3.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur les syndromes de surcroissance, les expérimentations in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences in vitro, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu.

Réduction

La taille des groupes utilisés représente le minimum nécessaire et suffisant pour l’obtention de résultats significatifs, en utilisant des tests statistiques adaptés, qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés aux procédures expérimentales.

Raffinement

Enfin, nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Par ailleurs, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Nous espérons ainsi identifier de nouveaux traitements médicamenteux qui pourraient améliorer les conditions de vie des patients porteurs de ces mutations génétiques et pour lesquels aucun traitement satisfaisant n'existe.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée.

1 764 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent une chirurgie crânienne de deux heures puis une injection d'anticorps dans le cerveau, d'autres reçoivent des injections répétées de psychotrope pour reproduire des symptômes de schizophrénie, à l'âge adulte ou dès la naissance, avant des tests comportementaux d'exploration et de réaction à des sons. Le porteur teste des anticorps issus de lamas censés cibler une protéine liée au glutamate, et renvoie les retombées pour les patients au conditionnel. Il affirme que le volet comportemental force le recours à la souris et conclut que le remplacement n'est pas possible.

Objectifs

La schizophrénie est une maladie psychiatrique hautement invalidante touchant environ 1% de la population. La recherche actuelle suggère que le glutamate, messager majeur dans le cerveau, est lié à la maladie quand il est trop concentré, mais les essais jusque là ont échoué à cause d'actions mal ciblées à l'origine d'effets secondaires. Une famille de protéines permet cependant de réduire les quantités de glutamate localement, ce qui diminue les risques d’effets secondaires. Nous avons montré que des petits anticorps provenant des lamas pouvaient réduire les symptômes de la maladie chez la souris en ciblant un type de protéine de cette famille. Dans cette étude, nous cherchons à observer les effets de nouveaux anticorps ciblant un autre type de protéines de cette famille, pour potentiellement trouver des résultats similaires par une autre voie. Pour ce faire, nous les testerons chez des souris modèles reproduisant différent symptômes puis enfin sur des souris modèles ne possédant plus la cible de nos anticorps, en contrôle.

Bénéfices attendus

L'utilisation des petites molécules thérapeutiques a historiquement été limitée à cause de leur manque de précision. Nos anticorps, eux, ciblent exclusivement leur cible, ce qui en fait des agents thérapeutiques prometteurs. De plus, cibler le système du glutamate permet de s’attaquer directement à la source de la maladie, plutôt que de se limiter au traitement supericiel de certains symptômes d’hallucinations et de délires tel que le font les traitements actuels. Adresser de manière complète le problème permettrait de réduire tous les symptômes, en particulier cognitifs et/ou de l’humeur, ce qui serait un immense pas en avant pour les patients et limiterait les interruptions de traitement.

Procédures

Dans un premier temps, l’activité de nos anticorps sera évaluée après injection dans le cerveau, ce qui nécessite d'une part une chirurgie crânienne d'une durée de deux heures par animal, et d'autre part une injection unique sur vingt minutes. Si nos anticorps parviennent à passer directement dans le cerveau depuis le sang, cette procédure pourra être remplacée par une injection simple en périphérie (moins de cinq minutes). En ce qui concerne nos modèles, ils se basent sur l’injection régulière (moins de cinq minutes) de psychotrope soit sur deux semaines (une fois par jour) à l’âge adulte soit sur une semaine (un jour sur deux) chez le nouveau-né. Les tests comportementaux seront non invasifs et non douloureux avec de l'exploration d'arène et des réactions aux stimuli sonores sur deux ou trois jours, pour un total de deux heures pour chaque test, soit six heures par animal pour réaliser tous les tests. Tous les animaux à la fin des expériences seront mis à mort par injection d’anesthésique suivie d’une perfusion pour fixer les tissus et récupérer le cerveau.

Impact sur les animaux

Cette étude utilisera des animaux non mutés ou ne possédant plus les protéines cibles. Ces déficiences n'induisent pas de douleurs chez l'animal. La chirurgie présente des risques de mort lors de l’anesthésie, ainsi que de gêne et de douleur suite à l’opération. Les modèles murins de schizophrénie seront mis en place par des injections répétées de psychotrope au stade adulte ou au stade nouveau-né. Outre la douleur des injections, ces modèles impliquent des difficultées de mobilité, de mémoire, et de sociabilisation (sans agressivité). D’après les données chez l'animal obtenues par nos collaborateurs, aucun signe de souffrance n’est attendu après unique injection d’un anticorps. Les anticorps qui seront évalués dans cette étude n'ont pas d'effets indésirables attendus après injection unique.

Devenir

Pour toutes les procédures, les animaux seront mis à mort afin de récupérer le cerveau pour des analyses sur les tissus.

Remplacement

Le remplacement de l’animal n’est pas possible pour cette étude. Les anticorps développés jusque-là ont une cible murine et, bien que leurs caractéristiques aient été décrites en laboratoire, les aspects les plus complexes (circulation dans le système, délai d’action, durée de l’effet) ne peuvent être reproduits. L'étude se concentre de plus sur un trouble psychique dont les mécanismes ne sont pas bien décrits, mais pour lesquels la littérature présente plusieurs modèles murins représentant bien différents symptômes de la maladie. L'aspect comportemental de ce projet, à l'heure actuelle, force l'utilisation de l'animal.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour l'étude a été déterminé afin de minimiser l'utilisation de l'animal tout en assurant la pertinence statistique des études réalisées par la suite, en prenant en compte des variabilités attendues car observées dans des travaux similaires et les risques de pertes liés à la chirurgie. Si, au cours du projet, les variabilités observées sont plus faibles, les groupes seront réduits en conséquence. Mâles et femelles seront utilisés, car les modèles murins de schizophrénie utilisés ne présentent pas de variabilité en fonction du sexe. Les nanobodies injectés auront déjà été sélectionnés pour leurs caractéristiques in vitro. Pour chaque étape, les nouveaux résultats permettront de réduire la sélection. Les mêmes animaux seront observés à travers différents tests comportementaux.

Raffinement

Cette étude utilisera des animaux non mutés ou ne possédant plus les protéines cibles. Ces déficiences n'induisent pas de douleurs chez l'animal. Tous les animaux suivront une période de cinq jours d’habituation à la manipulation et aux tests afin de réduire au maximum le stress lié au contact humain et à l’environnement d’étude. Des groupes d’animaux subiront des chirurgies et seront donc endormis profondément par l'utilisation d'anesthésiques appropriés et leur douleur sera traitée avec des anti-douleurs afin de minimiser la souffrance et la mortalité des animaux. Des mesures préventives aux impacts secondaires de la chirurgie (baisse de température, déshydratation, sécheresse des yeux) seront mises en place, avec une semaine de récupération sous surveillance quotidienne. Les résultats actuels ne permettent pas d’affirmer que nos anticorps entrent dans le cerveau d’eux même, mais une étude parallèle est prévue, et si l’injection directe est possible elle sera alors favorisée pour limiter la souffrance animale. Les injections de psychotropes, outre la douleur de la piqûre, induisent des déficits de mobilité et de mémoire qui seront surveillés en fonction de l'âge de l'animal pour identifier aussi tôt que possible toute souffrance non prévue par l'étude. Les données obtenues par nos précédents collaborateurs suite à un traitement aigu avec ces anticorps ne montrent pas de signe de souffrance supplémentaire à l’introduction de l’aiguille chez l’animal. Le comportement des animaux sera évalué via une grille de score de douleur à chaque étape pour intervenir au plus tôt en cas de signes de souffrance plus importants que prévus dans le cadre des manipulations. Un score élevé nous amènera a contacter la structure de bien être animal pour prendre la décision d'utiliser des anti-douleurs ou euthanasier l'animal.

Choix des espèces

Les anticorps produits jusque-là visent des cibles murines avec une forte spécificité et les modèles d'intérêt pour la schizophrénie sont particulièrement bien documentés chez la souris. Afin d’identifier rapidement les composés ayant un potentiel thérapeutique, nous avons décidé d’utiliser d'abord un modèle rapide pour évaluer un symptôme simple de la maladie. Les composés ayant montré une capacité à atténuer ce symptôme seront ensuite caractérisés plus en profondeur dans un modèle d’exposition précoce à un psychotrope. Ce modèle, impliquant une période d’expérimentation plus longue, se veut plus proche de la maladie. Les souches déficientes pour les cibles visées sont des contrôles essentiels pour confirmer que l’activité des anticorps est propre à leur action sur la cible. Ces souris ont déjà été étudiées, et ne montrent pas de souffrance par rapport aux souris non mutées.

40 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras pendant environ 90 jours, elles reçoivent des antibiotiques puis l'application quotidienne d'une bactérie sur la langue, avec des tests de préférence alimentaire et un prélèvement de sang intracardiaque terminal. L'objectif est d'étudier le rôle du microbiote buccal sur le goût du gras et l'obésité, en vue d'applications en alimentation vétérinaire et humaine. Le porteur affirme que les relations entre organes nécessitent l'utilisation d'animaux, malgré des tests in vitro déjà menés sur des cellules gustatives.

Objectifs

Contrairement aux nombreuses études concernant le microbiote intestinal, très peu d'études ont exploré le microbiote oral et sa relation avec la prise de poids. Les seules études disponibles démontrent chez l’homme comme chez la souris que les bactéries du microbiote buccal peuvent induire l’obésité. Nous avons observé, par Séquençage métagénomique du gène codant pour l’ARN 16S bactérien qu’il existe une dysbiose (augmentation du rapport Firmicutes/Bacteroidetes) ainsi qu’une diminution de la diversité du microbiome oral chez les souris rendues obèses avec un régime hypercalorique contenant 32% huile de palme) en comparaison aux souris sous régime standard. L’analyse du phylum et du genre a démontré qu’une espèce bactérienne (bactérie A) appartenant au genre Streptococcus est plus abondante dans le microbiome oral des souris obèses. Cette bactérie (commensale) abondamment présente dans la flore intestinale murine est non pathogène de classe 1 et ne présente aucun risque pour l’homme. Pour des raisons de confidentialité on ne divulguera pas son nom et on l’appellera bactérie A. L'obésité résulte d’une surconsommation d’aliments caloriques due à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. Les bourgeons du goût localisés dans les papilles gustatives linguales représentent le siège de la perception gustative. Chaque bourgeon du goût est constitué par un amas de cellules gustatives. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors, TR), présents sur ces cellules que les saveurs sont détectées. Les récepteurs CD36 et GPR120 (et aussi GPR40) sont impliqués dans la détection des lipides (acides gras) alimentaires et par conséquent la préférence pour les aliments gras. Dans ce contexte, nous souhaitons mettre en évidence le rôle de la bactérie A au niveau oral sur le comportement alimentaire, la perception gustative lipidique et l’induction de l’obésité. Le but de cette étude est de : 1- Evaluer l’effet de l’application orale de la bactérie A sur le comportement alimentaire en évaluant la préférence lipidique par test double choix et test de licking chez des souris obèses et contrôles non obèses 2- Évaluer l’effet de l’application orale da la bactérie A sur l’évolution du poids corporel et la glycémie chez des souris obèses et contrôles non obèses

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence le rôle du microbiote oral, et particulièrement la bactérie A, sur le comportement alimentaire et l’induction de l’obésité. Si cette étude fonctionne, elle serait intéressante, à terme, dans un contexte d’alimentation vétérinaire mais aussi dans un contexte d’alimentation humaine.

Procédures

L’ensemble des souris subira : - Mise sous régime (obésogène ou standard) toute la durée de l’étude (environ 90 jours) - Pesée tous les 3 ou 4 jours, toute la durée de l’étude - 10 jours de traitements antibiotiques dans l’eau de boisson - Application orale de la bactérie A chez les souris vigiles. Application quotidienne sur la langue, pendant 3 semaines ; technique de non invasive chaque application dure moins de 30 secondes - Mesure de glycémie (3 mesures) au début de l’expérience (temps 0), puis avant le traitement aux antibiotiques et au point final avant la mise à mort lors du test de tolérance orale du glucose (OGTT). Prélèvement d’une goutte de sang sous anesthésie locale (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute). - Un seul test OGTT : Les souris seront soumises à un test de tolérance au glucose (OGTT) nécessitant un gavage au glucose (quelques secondes le temps de la contention) et 5 prélèvements sanguins de faible volume seront réalisés sous anesthésie locale (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute). - Quatre Tests de double choix et quatre tests de licking pour chaque souris. Ces tests nécessitent une individualisation cinq jours avant le début des tests ainsi qu’une mise à jeun hydrique 6h avant chaque test. La durée est de 12 h pour le test de double choix et 5 minutes pour le test de licking. - Un seul test OGTT : Les souris seront soumises à un test de tolérance au glucose (OGTT)nécessitant un gavage au glucose (quelques secondes le temps de la contention) et 5 prélèvements sanguins de faible volume seront réalisés sous anesthésie locale (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute). - Un prélèvement sanguin : À la fin de l’étude, un prélèvement sanguin de 0,5 ml en intra-cardiaque sera réalisé sur souris anesthésié avec l’isoflurane (3 %) - Prélèvement d’organes : Les organes seront prélevés, après mise à mort

Impact sur les animaux

Cette étude à un impact sur les souris puisqu’on induit une obésité ce qui implique un certain inconfort et de potentielles complications liées à l’obésité. Aussi, on supprime le microbiote endogène de la souris par traitement antibiotique. Le traitement aux antibiotiques peut également induire des troubles digestifs et par conséquent impacter la prise alimentaire et induire des diarrhées. De même, les animaux peuvent subir un stress, dû aux manipulations répétées pour appliquer sur la langue la bactérie A, ou suite aux prélèvements sanguins (lors de mesure de la glycémie pendant l’expérimentation et lors du test d’OGTT) ou encore des suites d’individualisation (pour les tests double-choix et licking).

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes..

Remplacement

Les études physiologiques et les relation inter-organes nécessitent l’utilisation d’animaux. De plus, nous avons déjà étudié, in vitro, sur une lignée de cellules gustatives murines les mécanismes moléculaires d’action de la Bactérie A immortalisée ainsi que de la paroi de la bactérie A. Les tests effectués in vitro n’ont montré aucun effet toxique.

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires, in vitro, nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, après estimation la taille des groupes minimale est de 10 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans les conditions habituelles de l’animalerie et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront isolées, un enrichissement supplémentaire sera apporté (igloo en cellulose et sizzle pad). Si les animaux observés quotidiennement et si un signe clinique fait apparaitre un mal-être ou une douleur chez les animaux, ils seront euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane (3%).

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de l’obésité car c’est un modèle qui est assez documenté conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 6 semaines chez la souris est relativement courte, ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. Des souris mâles de 8 semaines seront mises sous régime obésogène pour maitriser l’induction de l’obésité.

3 680 animaux non-humains, 1 840 souris et 1 840 rats, vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des composés à tester puis subissent une chirurgie de clampage de l'artère rénale d'environ 45 minutes, avec un risque d'hémorragie et une atteinte de la fonction rénale. La mise à mort permet d'analyser les organes. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité du syndrome d'ischémie-reperfusion et conclut à la nécessité d'expériences in vivo.

Objectifs

La transplantation d’organe est un traitement de choix de certaines maladies chroniques arrivées à un stade ultime ; elle concerne surtout les organes vitaux abdominaux ou thoraciques et notamment les reins. Le syndrome d'ischémie reperfusion (IR) est un phénomène incontournable en transplantation rénale. L’ischémie correspond à la phase où l’organe du donneur est isolé de la circulation sanguine et subit un défaut d’apport en nutriments et en oxygène, c’est-à-dire depuis le prélèvement chez le donneur jusqu’à la reprise du flux sanguin dans l’organe chez le receveur. La reperfusion de l’organe chez le receveur se traduit par une reprise de la circulation sanguine en lien avec le retour de l’apport en nutriments et en oxygène. Cette reperfusion est brutale ce qui génère énormément d’inflammation au niveau du greffon. À court terme, les conséquences délétères du syndrome d'IR se traduisent principalement par une reprise différée de la fonction rénale mais à plus long terme, on peut observer l’apparition d’une fibrose rénale voir la mort du greffon. Chez l'homme, la prévention du syndrome d'IR fait l'objet de recherches cliniques à travers le conditionnement du donneur, les molécules additives aux solutions de conservation, les modalités de perfusion du greffon rénal ou encore les molécules administrées chez le receveur. Les progrès engendrés par les traitements immunosuppresseurs expliquent, qu’aujourd’hui, l’IR est une cible thérapeutique majeure. Les modèles précliniques, en particulier murins, ont permis de nombreuses avancées dans la compréhension physiopathologique du phénomène d'IR. L’IR provoque des nécroses tissulaires dans le rein qui activent le système immunitaire en libérant des protéines importantes qui participent au processus inflammatoire et engendrent les lésions. Ces protéines peuvent être utilisées comme cibles pour neutraliser la cascade inflammatoire et par conséquent améliorer la reprise de fonction immédiate du rein. Cette stratégie pourrait se révéler bénéfique, sur le long terme, sur la survie des greffons qui représente un enjeu majeur en transplantation. L’objectif de notre projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés issus de notre recherche dans un modèle d’IR chez la souris ou le rat afin de prévenir et de traiter le syndrome d’IR chez l’homme. Ces composés ayant par ailleurs montré leur efficacité in vitro sur des cellules rénales humaines de patients.

Bénéfices attendus

Les traitements existants sont des cocktails d’immunosuppresseurs avec le risque de nombreux effets secondaires. L’identification d’un ou plusieurs candidat (s) médicament (s) agissant plus spécifiquement au niveau du greffon augmentera l’efficacité du traitement et permettra de diminuer les effets secondaires.

Procédures

1/ Administration des composés à tester ou de leur solvant, par voie orale ou sous-cutanée ou intra-veineuse ou intra-péritonéale, une à deux fois par jour pendant un maximum de 6 jours sous un volume de 5 à 10ml/kg en fonction de la voie d’administration 2/ Injection sous-cutanée d’un analgésiant 2 fois le jour de la chirurgie 3/ Chirurgie sous anesthésie gazeuse pendant environ 45 minutes, une fois dans l’étude 4/ Anesthésie gazeuse pour prélèvement sanguin, urinaire et mise à mort, une fois dans l’étude

Impact sur les animaux

Pendant la chirurgie sous anesthésie générale, il y a un risque d’hémorragie lié aux gestes chirurgicaux lors du clampage en lésant l’artère rénale. À la suite de la chirurgie, les effets indésirables attendus sur les animaux sont : une atteinte partielle de la fonction rénale, une mobilité réduite, ainsi qu’une perte de poids n’excédant pas 10% dans les 24 à 48h post-chirurgie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement de la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans le syndrome ischémique. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et évaluer de potentiels candidats médicaments.

Réduction

Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à l’heure arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton, carrés de coton et feuilles de cellulose). Après la chirurgie, un enrichissement plus doux (igloo en carton) sera utilisé afin d’éviter tout accroc avec la cicatrice. La litière sera également remplacée par une litière plus douce et plus absorbante en fibre de cellulose pour éviter tout irritation de la cicatrice. Afin de palier l'inconfort lié aux procédures et obligatoirement lors des gestes de chirurgie, un programme d'anesthésie sera effectué par inhalation d’isoflurane (induction 3 à 5%, maintien 1 à 3%). Pour prévenir de la douleur, de la buprénorphine à 0.1 mg/kg en sous cutanée sera administrée 30 minutes avant et 4 heures après la chirurgie suivi d’un apport dans l’eau de boisson à 0.01 mg/ml pendant 48 heures. Pendant la chirurgie les animaux seront placés sur un tapis chauffant, une sonde rectale sera placée afin de mesurer leur température corporelle, le tapis régulera alors sa température pour maintenir le corps à 37°C. Pendant la phase de réveil, les animaux seront placés sur un tapis chauffant (37°C). Afin de faciliter la prise de nourriture, quelques croquettes humidifiées seront placées directement dans la cage. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse pouvant être infligées aux animaux, une surveillance journalière ainsi que des points limites précoces et spécifiques à ce modèle ont été établi conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal. Lors de la mise a mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane (induction et maintien de 3-5%).

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Le modèle utilisé sera mis au point, sur la base de la littérature existante. Nous nous appuierons sur de la bibliographie solide et sur un modèle déjà bien documenté afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour la mise au point. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte afin de travailler sur des organes parfaitement développés.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sous la peau puis des injections intraveineuses de molécules-vecteurs, la mise à mort se faisant par dislocation cervicale pour collecter sang et organes. Le porteur cite comme effets possibles des chocs anaphylactiques et des détresses cardio-respiratoires. Il affirme qu'aucune alternative ne donne accès aux fonctions physiologiques des mammifères et conclut que le développement de ces vecteurs ne peut se faire qu'in vivo.

Objectifs

Le cancer est encore aujourd’hui une des causes majeures de mortalité dans le monde et pour lequel les besoins médicaux actuels restent très insatisfaits, avec certains cancers nécessitant de nouvelles approches thérapeutiques. Ainsi, les cancers du pancréas, les cancers des poumons et de la prostate (ainsi que leurs métastastases) sont des exemples d’enjeux de santé publique. Ces dernières années, les recherches privées et publiques ont augmenté leurs efforts, suscitant de grands espoirs pour les patients malades et leurs familles. Cette demande de projet s’inscrit dans cette dynamique, avec pour objectif d’améliorer les perspectives thérapeutiques. Ce projet innovant a pour objectif d’évaluer si des molécules conjugués à des vecteurs (V-molécule) ciblants les récepteurs aux lipoprotéines LDL (LDLR) ou à la Transferine (TfR) permettent d’observer un effet clinique (thérapeutique, de distribution, d'extinction de gènes...) sur des modèles de tumeurs humaines implantées sur le modèle de souris. L’objectif principal de ce projet sera donc de développer, tester et optimiser nos molécules-vecteurs (V-molécule) pour améliorer la délivrance d’agents thérapeutiques au niveau des tumeurs. Par ces approches systémiques nous tenterons d’améliorer le potentiel d’actions de nos vecteur-médicaments. Les statines sont le traitement de référence pour soigner l’excès de cholestérol, ou plus exactement le LDL-cholestérol (lipoprotéine de faible densité), il s’agit d’un des médicaments les plus couramment utilisés dans le monde. Cette inhibition stimule secondairement l’expression des récepteurs aux LDL, permettant leur entrée dans la cellule cible. Il est fort probable que certains patients traités pour des cancers prennent des traitements à base de statine. Il est donc très important d’étudier l’effet de la prise de statine dans nos modèles tumoraux afin de voir leur effet sur l’expression du récepteur au LDL dans les tumeurs et autres tissus.

Bénéfices attendus

En ce qui concerne la partie expérimentale, notre procédure met en avant la sensibilité d’action de nos V-molécules et les faibles quantités administrées, ce qui réduit également les risques de toxicités pour les animaux. D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos molécules Vecteurs (V-molécules) constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les implantations des cellules tumorales se font en sous-cutanée sur le flanc de l’animal anesthésié (anesthésie gazeuse isoflurane). Cet acte chirurgical sera effectué une seule fois par souris et cela prend environ 1 minute. Les injections des "V-molécules" : les souris recevront une injection IV (veine caudale) de V-molécule et de molécule controle. Les animaux sont endormis pour injecter les molécules en solution isotonique stérile. Il y a l'injection d'une molécule par animal et cela prend environ 2 min.

Impact sur les animaux

Dans ce projet nous proposons d’étudier la biodistribution de nos V-molécules sur des temps d’incubation relativement courts. Les effets indésirables pour les souris sont principalement le stress causé par la capture, l'implantation des cellules tumorales en sous cutanées, les injections en IV des composés V-molécules, ainsi que le développement de la tumeur chez l’animal en tant que pathologie. Les composés pharmacologiques peuvent (éventuellement) causer des effets secondaires observés post-administration comme des chocs immunitaires (anaphylactique), des réactions allergiques, des détresses cardio-respiratoires et des modifications et des troubles comportementaux.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale afin de collecter le sang et les organes qui seront utilisés pour faire des analyses complémentaires.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos V-molécules ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des conjugués développés. L'utilisation de rongeurs impose la prise en compte de la règle des 3 R, la conformité vis à vis des recommandations et cahier des charges.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs in vitro nous permet aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux se répartit sur des groupes de n=15 (V-molecule et molecule controle), à raison de 120 souris par an, réparties sur 4 études de 30 individus, sera suffisant pour appréhender un effet de nos molécules sur la croissance tumorale. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Ce nombre d'animaux pour ces procédure nécessaire à l'obtention d'une significativité statistique (réduction, règle des 3Rs) a été défini en déterminant: -le test statistique : T-test (2 groupes), -l'effet biologique et la dispersion escomptées, cette estimation a été faite d'après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société, -le risque alpha.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal, appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien et vétérinaire pour exercer dans le respect des 3R. Nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Au minimum la veille des tests, les souris sont déplacées dans une pièce cyclée, insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 5 individus par cage, litières (copeaux de bois) et raffinements (maison en carton et Sizzle-Nest). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Une personne compétente (formation en experimentation animale + chirurgie) réalisera les implantations sous-cutanées de cellules tumorales. Une observation quotidienne des animaux (poids, douleurs, souffrance) sera faite ainsi qu'une surveillance du volume des tumeurs et des antalgiques sont prévus en cas de nécessité. Toute perte de poids, signe de douleur (analgésiques prévus en cas de nécessité) ou souffrance notable (cardiaque, respiratoire) de l'animal éveillé après anesthesie (anesthésie gazeuse isoflurane) ou au cours du developpement tumoral constituera le point limite de l'expérience. Un enrichissement materiel (twists, cocon ou nid) de l'environnement des animaux est mis en place dans toutes les cages afin qu'ils expriment un répertoire diversifié de comportements normaux. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs d'un seul fournisseur extérieur.

Choix des espèces

- Facilité d'utilisation en général, espèce athymique (NU(NCr)-Foxn1nu ) comme modèle in vivo, pour faciliter la mise en place et la prise de tumeurs solides en sous-cutanée (facilité et maîtrise de l’injection, déficience du système immunitaire), ainsi que pour le suivi de leur croissance. - Modèle d’injection de lignées tumeurs en sous-cutanée bien décrit dans la littérature et déjà utilisé dans le passé par des membres du laboratoire ou membres du projet collaboratif. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de lignées cancéreuses, c’est à dire des souris athymiques « jeunes adultes » âgés de 6 semaines au moment de l’implantation de la lignée tumorale et 10 à 12 semaines au moment du traitement (injection de la V-molécule) en fonction de la taille des tumeurs.