Souris

402 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux reçoivent entre zéro et trois jours une injection dans le foie, âge choisi pour la prise de greffe des cellules progénitrices humaines, puis, selon les procédures, jusqu'à six injections par semaine dans le ventre pendant six à quatorze semaines, des anesthésies hebdomadaires pour suivre leurs tumeurs par imagerie et des prises de sang à la veine temporale. Pour apprendre le geste de l'injection dans le foie, l'équipe utilise trois portées, environ 72 souriceaux, et prévoit des pertes liées à leur jeune âge et au rejet par leur mère après les manipulations. Le porteur écrit que la stratégie testée contre un lymphome "pourrait offrir des réponses anti-cancéreuses durables et efficaces". Chez les souris, les tumeurs peuvent provoquer des difficultés respiratoires, signe de cellules tumorales dans les poumons ou de métastases.

Objectifs

Une nouvelle approche thérapeutique pour traiter les patients atteints de cancer consiste à prélever leurs globules blancs en les modifiant pour leur permettre de reconnaitre et de cibler des protéines présentes à la surface des cellules cancéreuses. Après réinjection aux patients, ces cellules modifiées sont ainsi capables de reconnaitre et de détruire spécifiquement les cellules cancéreuses. Elles représentent aujourd’hui un espoir dans le traitement de certaines leucémies réfractaires ou en rechute et ont considérablement amélioré le résultat global des patients. Cependant plusieurs obstacles restent à résoudre dans ce domaine. Tout d'abord, malgré un taux élevé de patients montrant une réponse complète à ce traitement par thérapie cellulaire, la rechute de la maladie reste un défi important avec des taux de survie sans progression inférieurs à 50 %. Après le traitement, la survie à 3 ans est de seulement 16,1 %. Plusieurs raisons expliquent cet échec à obtenir des rémissions durables. La perte précoce, la faible expansion et l'épuisement des cellules thérapeutiques modifiées, sont des facteurs d’échec importants. La reconstitution tardive des cellules immunitaires effectrices possédant une activité anti-tumorale après la thérapie cellulaire, représente un autre défi important. Cette immunodéficience augmente non seulement les risques de rechute, mais entraîne également un taux important d’infection post-greffe. Dans ce contexte, une stratégie d'implantation de cellules progénitrices pourrait contourner certains de ces principaux défis (disponibilité immédiate, expansion efficace et réponse antitumorale durable) en accélérant la reconstitution d'un thymus chez les patients. Le modèle animal développant une tumeur de lymphome, ainsi que l’efficacité des cellules thérapeutiques modifiées matures ont été validés précédemment. Dans le cadre de ce projet, nous allons évaluer l’effet thérapeutique des cellules progénitrices, en suivant notamment la régression des tumeurs, la maturation des cellules anti-cancéreuses et leur persistance in vivo.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant des cellules progénitrices, et donc d'une plateforme de développement de ces cellules à visée d'utilisation clinique. L’acquisition de ces données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. Cette stratégie pourrait offrir des réponses anti-cancéreuses durables et efficaces en contournant les obstacles majeurs reportés à ce jour dans le domaine des immunothérapies pour le cancer.

Procédures

Durant cette étude, nous procéderons à : - des injections intrahépatiques (1X; durée 5 sec); - des injections par voie sous-cutanée (1X/sem pendant 5 semaines; durée 5-10 sec); - des injections par voie intraveineuse (1 ou 2X selon la procédure; durée 2-3 minutes); - des injections par voie intrapéritonéale (6X/sem pendant 6 à 14 semaines selon la procédure; durée 5-10 sec); - des anesthésies sous isoflurane (1X/semaine, pendant 5 à 13 semaines selon la procédure; durée 20 min maximum ); - des prélèvements sanguins par ponction dans la veine temporale superficielle (1X ou 3X maximum selon la procédure; durée 2-3 min); - un prélèvement sanguin par ponction intracardiaque (1X, après euthanasie).

Impact sur les animaux

Les animaux seront maintenus en hébergement en cage individuelle ventilée et manipulés sous hotte par du personnel compétent pour éviter tout risque d’infection lié à leur immunodéficience. Lors de la mise au point de la technique d’injection intra-hépatique, une perte du nombre d’animaux peut être attendue en raison du jeune âge des animaux, ainsi que du rejet de la mère après les manipulations. Par ailleurs, les cellules matures pourraient occasionner au long cours une réaction des globules blancs humains contre les tissus de souris. Cet effet peut être observé chez la souris immunodéficiente greffée depuis plus de six mois avec des cellules-souches sanguines humaines. Bien que cet effet soit moins attendu avec les cellules progénitrices grâce à leur maturation dans le thymus de la souris, et donc une tolérance contre les cellules murines, la durée de nos études ne dépassera pas six mois pour éviter cet éventuel effet indésirable. D'autre part, ce projet comprenant l’apparition de tumeurs, le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive. Le poids des animaux et la croissance tumorale suivie par imagerie seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude. Enfin, des difficultés respiratoires peuvent apparaitre, signe de présence de cellules tumorales au niveau des poumons, ou de métastases.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever le sang en vue d'analyses post-mortem.

Remplacement

Toutes les étapes visant à améliorer la performance du produit de thérapie cellulaire ont été mises au point avec des expériences exclusivement in vitro et notamment des caractérisations du produit final par des méthodes de séquençage et d'analyse de populations cellulaires. Néanmoins il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’obtenir les globules blancs matures du point de vue fonctionnel. La seule méthode existante consiste en un système de co-culture des cellules-souches sanguines avec des cellules-souches nourricières . Bien que ce modèle permette d’obtenir des globules blancs exprimant les marqueurs de différenciation, les cellules n’atteignent pas la maturité fonctionnelle. Seule l’injection dans un modèle de xénogreffe permettra de répondre à ce point, modèle où le greffon provient d'une espèce différente du receveur, respectivement cellules d'origine humaine implantées dans un modèle de souris. Cette xénogreffe permettra la maturation et la différenciation complète des progéniteurs des globules blancs dans l’environnement du thymus de la souris. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique de ces cellules avant un développement clinique.

Réduction

La première étape de ce projet vise à acquérir le geste technique d’injection intra-hépatique chez le souriceau nouveau-né, notamment la reproductibilité du mode opératoire et l’inter-opérabilité, ainsi que le suivi de la survie des animaux. Nous utiliserons à cet effet 3 portées, soit environ 72 souriceaux agés de 0 à 3 jours. Il n'y aura pas d'analyse statistique pour cette première étape de mise au point technique. La deuxième étape du projet consiste à injecter les cellules progénitrices et à valider leur effet thérapeutique dans un modèle de cancer . Le produit avec lequel nous envisageons d’effectuer les tests fonctionnels in vivo a été optimisé au préalable, augmentant ainsi la probabilité d’obtention de réponses favorables dès les premières séries d’expérimentations. Par ailleurs, le modèle animal choisi dans cette étude est un modèle murin immunodéficient, utilisé avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules-souches sanguines humaines. L’utilisation de ces souris nous permettra d’obtenir des résultats homogènes et de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental; nous utiliserons ainsi 6 souris par groupe et par condition. En utilisant des tests statistiques non paramétriques, selon le paramètre mesuré (croissance tumorale, poids des souris, analyse des globules blancs), nous réaliserons des études permettant de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en hébergement en cage individuelle ventilée et manipulés sous hotte par du personnel compétent pour éviter tout risque d’infection lié à leur immunodéficience. Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Une surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux sera assurée, avec un suivi de leur poids et de la croissance tumorale. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes sont utilisées avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules humaines. Cette lignée ne présente pas de phénotype dommageable. Le profond déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules-souches sanguines humaines, et offre la possibilité d’étudier l’effet d’immunothérapies avec des cellules humaines dans un hôte murin. Ce modèle est notamment très utilisé pour tester l’efficacité anti-cancéreuse de globules blancs modifiés ou de leurs cellules progénitrices. Par ailleurs, le thymus de ces souris, tout comme celui des patients atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une allogreffe de cellules-souches sanguines (greffon et hôte de même espèce), sont caractérisés par une atrophie majeure et une architecture altérée. Ces souris présentent donc un environment similaire à celui des patients. Nous utiliserons des souris nouveaux-nés (P0), permettant une bonne prise de greffe des cellules progénitrices. Nos précédentes études ont démontré que les cellules progénitrices pourraient se greffer dans le thymus sans conditionnement (irradiation ou chimiothérapie) chez les souriceaux nouveau-nés (0 à 3 jours post naissance). Une fois cette période passée, afin d’obtenir une prise de greffe dans le thymus, il faut irradier les animaux et co-administrer les cellules progénitrices modifiées avec les cellules souche hématopoïétiques.

354 souris BALB/c vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et une partie d'entre elles passe jusqu'à 90 minutes par séance immobilisée dans un tube de contention, après trois jours d'habituation de 30, 60 puis 90 minutes. Les souris reçoivent des substances sensibilisantes sur les flancs tondus et derrière les oreilles, ou les respirent par le nez et la bouche, au risque d'irritations de la peau ou des voies respiratoires et de signes d'asthme, puis sont mises à mort à différents jours, jusqu'à J13, pour l'analyse de leurs ganglions. Le but affiché est d'identifier des marqueurs qui permettront plus tard de développer une méthode de culture cellulaire capable de repérer les substances qui déclenchent des allergies respiratoires. Les lots décrits dans les procédures totalisent au moins 368 souris, pour 354 déclarées.

Objectifs

L’allergie est classée au 4ème rang des affections chroniques les plus fréquentes par l’Organisation Mondiale de la Santé. Les symptômes allergiques peuvent prendre des formes cutanées ou respiratoires et font suite à l'exposition répétée des sujets à une substance dite sensibilisante. Jusqu'à 25% des cas d'asthme déclarés sont d'origine professionnelle et font suite à une exposition répétée, par voie respiratoire ou cutanée, à des substances sensibilisantes chimiques. A ce jour, aucune méthode n'a été validée par les instances règlementaires européennes pour identifier les substances chimiques avec un potentiel sensibilisant respiratoire. Or, ces substances présentent un danger pour les individus exposés. La différenciation des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques locaux est une étape déterminante dans le développement de la maladie allergique. L’objectif de ce projet est d’identifier des gènes régulant la différenciation des lymphocytes T au cours du processus de sensibilisation respiratoire chez la souris. Afin d’atteindre cet objectif, deux voies d’exposition seront utilisées sur un modèle murin de sensibilisation qui sera combiné à des outils d’analyse de l’expression des gènes afin d’identifier les gènes cibles exprimés par les cellules immunitaires d’intérêt activées par des sensibilisants respiratoires et des sensibilisants cutanés. L’objectif final est de développer un modèle de culture cellulaire, alternatif au modèle animal, qui permettra d’identifier spécifiquement les substances chimiques ayant le potentiel de déclencher une maladie allergique respiratoire, grâce aux biomarqueurs qui auront été identifiés dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes immunologiques mis en jeu au cours de la sensibilisation respiratoire. Ces connaissances sont nécessaires pour améliorer la description des évènements clés menant au développement de l’allergie respiratoire. En outre, de nouveaux biomarqueurs seront identifiés au cours de ce projet, ils permettront de développer un modèle de culture cellulaire alternatif au modèle in vivo permettant de prédire le potentiel sensibilisant respiratoire des substances chimiques. De telles méthodes sont nécessaires, pour identifier le risque associé à l'exposition aux substances sensibilisantes, afin de prévenir le développement de maladies allergiques. Aucun modèle de culture cellulaire n’est validé à ce jour par les instances européennes pour identifier les substances chimiques avec des propriétés sensibilisantes respiratoires.

Procédures

Un lot de 52 souris vigiles seront exposées par application cutanée à 2 sensibilisants allergiques et au solvant approprié. La veille de la première application, les flancs des animaux seront tondus sous anesthésie gazeuse. Les produits seront appliqués sur les flancs des souris à J0 et J5, puis derrière les oreilles à J10, J11 et J12. Les animaux seront mis à mort J0, J3, J7, J10 et J13. Les ganglions lymphatiques auriculaires seront collectés puis analysés par cytométrie en flux. Cette méthode permet d’analyser l’expression de protéines d’intérêt par marquage fluorescent. Trois lots de 28 souris et un lot de 20 souris vigiles seront exposées par application cutanée à 7 substances et au solvant approprié. Les animaux seront mis à mort à J0 et deux autres temps déterminés par les analyses en cytométrie en flux puis différents tissus seront collectés. Deux lots de 36 souris seront exposés de façon vigile à 2 sensibilisants allergiques de référence et au solvant approprié par exposition oro-nasale, une fois par jour pendant 90 min maximum à J0 et J5 puis à J10, J11 et J12 pendant 25min au maximum. Les animaux seront mis à mort à J0, J3, J7, J10 et J13 puis les ganglions lymphatiques mandibulaires seront collectés et analysés par cytométrie en flux. Sept lots de 20 souris vigiles seront exposés aux mêmes 7 substances que pour l’exposition cutanée, par exposition oro-nasale. Les animaux seront mis à mort à J0 et deux autres temps déterminés par les analyses en cytométrie en flux puis différents tissus seront collectés. La fonction respiratoire des animaux sera évaluée à J0, J10 et J12 de façon non invasive. Un lot de 10 souris seront utilisées pendant 2 semaines pour mettre au point l’ajustement du matériel utilisé pour l’exposition oro-nasale et la mesure de la fonction respiratoire. Ces animaux seront réutilisés dans la procédure d'exposition oro-nasale : ils seront inclus dans la phase de phénotypage.

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par les animaux seront principalement dues aux voies d’administration des substances chimiques. Malgré le plus grand soin apporté pour limiter l’inconfort des animaux, la procédure de sensibilisation par application cutanée pourra induire de l’irritation cutanée. L’exposition des animaux par inhalation pourra induire de l’irritation des voies aériennes. L’exposition par inhalation, qui sera faite par voie oro-nasale, pourra induire du stress chez les animaux qui seront mis en tubes de contention. Avec les deux procédures, des signes d’asthme pourront également apparaitre. Dans tous les cas, dès l’apparition de signes de souffrance non réversibles, les animaux seront mis à mort.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures d'exposition cutanée et oro-nasale, les animaux seront mis à mort. Les animaux utilisés pour la mise au point de l'exposition oro-nasale pourront être inclus dans la procédure d'exposition oro-nasale si leur état n’a pas nécessité de mise à mort.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux à des fins expérimentales car le modèle animal permettra d’étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la différenciation des lymphocytes T lors du processus de sensibilisation in vivo. Aucun modèle de culture cellulaire n’est à ce jour établi et validé pour étudier ces mécanismes. C’est d’ailleurs l’objectif au terme de ce projet : le développement d’un modèle de culture cellulaire à partir des données issues de ce projet afin de proposer un modèle alternatif pour l’évaluation du potentiel sensibilisant respiratoire.

Réduction

Nous avons réduit au minimum le nombre d’animaux utilisés afin de pouvoir effectuer des analyses statistiques valables entre les groupes expérimentaux. En accord avec la littérature, nous avons porté à 4 le nombre de souris par groupe. En outre, nous allons collecter le maximum de tissus afin de pouvoir effectuer les analyses post-mortem nécessaires à ce projet en utilisant un nombre minimal de souris. L’analyse sur cellule unique permet de diminuer la variabilité entre les individus, car environ 2000 cellules seront analysées dans chaque échantillon, ce type d’analyse permet donc de réduire le nombre d’animaux à inclure par groupe expérimental.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera évalué chaque jour lors des soins quotidiens apportés par les zootechniciens et lors des contrôles quotidiens effectués par les autres membres participant à ce projet (techniciens de recherche et chercheurs). Toutes les personnes intervenant dans ce projet sont formées initialement et de façon continue à l’expérimentation animale et en particulier au bien-être animal. Les gestes réalisés seront maitrisés afin de garantir le confort maximum des animaux lors des traitements. Les animaux seront hébergés par groupe dans des cages répondant aux exigences de la réglementation en terme de dimensions. Un enrichissement varié (maisonnette et éléments de nidification) leur sera apporté. Une observation renforcée après les expositions aux substances chimiques permettra la prise en charge rapide des animaux en cas de souffrance ou d’atteinte de point limite. Les animaux exposés par inhalation oro-nasale seront habitués aux tubes de contention pendant plusieurs jours et suivant un temps de contention croissant avant d’être exposés aux substances chimiques. Nous proposons d’habituer les animaux comme suit: Jour 1 : habituation de 30 min Jour 2 : habituation de 60 min Jour 3 : habituation de 90 min Jour 4 : exposition de 90 min

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est justifiée pour plusieurs raisons : -la souris est l’espèce couramment utilisée pour les études de toxicologie, elle est notamment l’espèce sélectionnée dans la ligne directrice 429 de l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economiques) portant sur le modèle Local Lymph Node Assay qui permet d’identifier les substances chimiques allergéniques; -la composition et le fonctionnement du système immunitaire de la souris sont semblables à celui de l’Homme et les résultats issus des expériences pourront donc être extrapolés raisonnablement aux effets attendus chez l’Homme ; -la souche BALB/c est choisie car son système immunitaire est adapté aux études de sensibilisation allergique. Cette souche, bien qu’orientée Th2, permet d’étudier la différenciation des lymphocytes T en ses différents sous-types et plusieurs études ont montré qu’elle permet le développement d’une réaction allergique respiratoire aux substances chimiques. Les animaux seront utilisés à l’âge de 8-10 semaines, stade de développement auquel la souris atteint l’âge adulte. Nous souhaitons étudier la réponse allergique sur des animaux ayant un système immunitaire mature.

48 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont réparties entre sédentarité et accès à une roue, suivies par IRM et mesure de la respiration en cage individuelle, avant une prise de sang sous anesthésie puis l'euthanasie pour prélever leurs articulations. Le projet vise à décrire l'effet de l'hygiène de vie sur le vieillissement des articulations, un champ que le porteur présente comme peu étudié. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne peut répondre à la question car il faut maintenir la communication entre organes au cours du vieillissement.

Objectifs

Nous savons peu de choses sur la façon dont les tissus articulaires réagissent au vieillissement naturel. Or la réduction de mobilité est sans aucun doute l'une des conséquences les plus débilitantes du vieillissement. Cette réduction de mobilité devient également un problème croissant avec l’augmentation de l’inactivité physique et de la sédentarité des enfants et adolescents, souvent associés à des risques de surpoids et d'obésité. Il y a actuellement une littérature abondante sur l’impact bénéfique de l’exercice physique (et délétère de la sédentarité) sur la qualité de l’os chez les sujets jeunes ou âgés (humains et murins). Il est par exemple reconnu que la pratique régulière de l’exercice physique pendant la croissance permet d’optimiser le capital osseux pour toute la vie. En revanche, on ne sait rien quant à son impact sur l’articulation et sur la façon dont les différents types cellulaires composant les 3 tissus de l’articulation (membrane synoviale, cartilage et os sous-chondral) sont modifiés chez le sujet jeune et âgé en fonction de son hygiène de vie. Nous faisons donc l’hypothèse que 1) le vieillissement normal modifie l'écosystème ostéoarticulaire, 2) la sédentarité du jeune adulte induit un vieillissement accéléré des articulations et 3) l’exercice physique a un effet bénéfique sur le vieillissement des articulations.

Bénéfices attendus

- Impact scientifique et technologique : Identification de nouveaux gènes jouant un rôle clé dans la longévité et la bonne santé des articulations, acquisition de nouvelles connaissances dans le domaine de la biologie ostéoarticulaire qui seront mises à disposition de la communauté scientifique internationale et pouvant servir à d’autres disciplines de la biologie. - Impact sociétal et économique : ce projet peut déboucher sur l’identification de gènes candidats qui pourraient représenter des cibles thérapeutiques intéressantes pour développer des traitements agissant contre le vieillissement des articulations et/ou des marqueurs de la qualité de la membrane synoviale, du cartilage et de l’os sous-chondral utilisables en cliniques.

Procédures

Aucun prélèvement ne sera effectué sur animal vigile. Les tests que nous réaliserons sont non invasifs : activité physique si l’animal le souhaite ; mesure de la composition corporelle par IRM (2 minutes 1 fois semaine); mesure du métabolisme par analyse de la respiration (animal placé en cage individuelle, deux fois 48h) . En fonction des lots, les animaux pourront être placés en cage avec des roues leur permettant de retrouver une activité physique spontanée pendant 8 semaines ou tout au long du test. En fin de protocole, les animaux recevront une injection intra-péritonéale d'anesthésique. Nous effectuerons alors un prèlèvement de sang sur l'animal endormi et il sera euthanasié.

Impact sur les animaux

Les 2 effets indésirables majeurs attendus sont le stress lié à l’hébergement ponctuel en cage individuelle et à la sédentarité. Afin de limiter ces effets, nous proposons de réaliser un enrichissement avec un tunnel en plexi rouge pour toute la durée de l’expérimentation, d’héberger les animaux par cage de 4, et de n’isoler que les animaux inclus dans les groupes « activité physique volontaire » uniquement pendant la période où ils sont dans les cages avec roue connectée. Par ailleurs, la température d'élevage ayant un impact sur le métabolisme, celle-ci sera de 22 à 23°C pour améliorer le confort des animaux.

Devenir

Euthanasie pour réaliser les prélèvements nécessaires aux analyses moléculaires.

Remplacement

Il est actuellement impossible de répondre à notre question scientifique par le biais d’approches in vitro car il est nécessaire de maintenir la communication entre tous les organes au cours du vieillissement pour vérifier l’impact de l’activité physique sur le cartilage et l’os.

Réduction

Nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment dans notre laboratoire et dans des publications utilisant des modèles expérimentaux similaires pour estimer le nombre d’animaux nécessaire. Compte tenu des données de la littérature montrant un dimorphisme sexuel de l’activité physique sur le remodelage osseux et une moindre variabilité inter-individuelle chez les femelles, nous n’utiliserons que des femelles. Compte tenu de l’expérience que nous avons sur les variabilités individuelles et le nombre de genoux requis pour obtenir une quantité suffisante de cellules pour les analyses transcriptomiques, nous réaliserons donc des expériences avec des lots de 8 souris. Ces expériences ne seront pas répétées. Nous nous sommes rapprochés des équipes qui étudient l’impact de l’âge et de l’exercice physique sur le métabolisme musculaire pour optimiser l’utilisation de ces animaux. Leur expertise nous a permis de choisir convenablement les paramètres du protocole expérimental. De plus, ils prélèveront lors de l’euthanasie finale les muscles squeletiques afin de compléter une étude en cours (analyses histologiques et tri cellulaire) et de constituer une banque de données.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours y compris le weekend et les jours fériés et les signes de souffrance (perte excessive de poids, hyperactivité ou au contraire isolement, hérissement des poils, dos voûté) seront recherchés. En cas d’apparition, ces manifestations cliniques seront scorées suivant une échelle prenant en compte plusieurs de ces paramètres, avec établissement de points limites entrainant euthanasie des animaux si nécessaire en accord avec la SBEA. Un enrichissement des cages sera réalisé en utilisant des tunnels de plexiglass rouge de façon à diminuer le stress des animaux et à les habituer aux mesures de composition corporelle qui sont réalisées dans un tube de contention similaire. La température de thermoneutralité pour les souris est proche de 30°C et il est bien documenté qu’il y a un impact de la température sur le métabolisme des tissus musculaires et adipeux. Nous maintiendrons les animaux pendant toute la durée de l’expérience entre 22-23°C pour nous approcher de cette température idéale tout en permettant de recouper nos résultats avec les données existantes.

Choix des espèces

La fonction musculaire chez la souris est similaire à celle de l'homme et nous permettra de transposer facilement nos résultats précédemment obtenus sur le modèle souris. De plus, l'utilisation de la souris nous permet également d’avoir accès à une bibliographie riche et d'utiliser un large panel de réactifs de biochimie et de biologie moléculaire. Dans cette étude nous utiliserons des souris standard (non génétiquement modifiées). Pour étudier l’effet de l’activité physique et du vieillissement, nous prévoyons de comparer des animaux jeunes adultes (âgés de 4 mois) et des animaux de 15 mois (« âgés »). Les animaux seront sédentaires ou auront la possibilité de courir sur des roues s’ils le souhaitent.

750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour la recherche mais pour l'enseignement en BUT. On leur injecte du cyclophosphamide pour provoquer une inflammation de la vessie et une hypersensibilité, testée par stimulation mécanique de l'abdomen au filament, puis un traitement, avant prélèvement des organes pour des travaux pratiques d'histologie et de biochimie. Chaque binôme d'étudiants prend en charge trois souris pour comparer les situations traitée et non traitée. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne remplace ce protocole car l'intégration de la douleur implique tout le système nerveux.

Objectifs

Le projet comprend l'utilisation d'un modèle animal d'inflammation viscérale qui sera utilisé de manière transversale dans la SAE (situation d'apprentisage et d'évaluation) 3.02 par les étudiants inscrits en BUT du département de Génie Biologique. Une fois l'inflammation induite, un traitement pharmacologique sera adminsitré au temps 4 heures post induction. Les animaux seront évalués sur leur phénotypoe douloureux puis mis à mort pour prélèvements d'organes cibles qui seront utilisés pour des analyses immunohistochimiques et biochimiques et moléculaires ultérieures. Cette formation a été validées par le Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. Les DUTs sont régis par un Programme Pédagogique National (PPN) et la Licence professionnelle BIB a une formation acréditée dans le cadre de son dossier d'enseignement.

Bénéfices attendus

Ce modèle d'inflammation aigue réalisé chez la souris permet de mettre en pratique les notions sur la physiopathologie et la pharmacologie de l'inflammation et de la douleur vues en cours par les étudiants. Les prélèvements réalisés en point final serviront à des travaux pratiques d'histologie, de biochimie et de biologie moléculaire permettant un enseignement pluridisciplinaire sur un même modèle d'étude pertinent cliniquement.

Procédures

Le jour de l'expérimentation, les animaux subiront une injection intra-péritonéale de cylophosphamide ou de Nacl0.9, puis, 4 heures après une injection sous cutanée de prégabaline ou de Nacl0.9. Il seront testés trois fois, une fois avant chaque injection, et une fois 30 minutes après l'injection de prégabaline avec un test permettant d'évaluer leur sensibilité à une stimulation mécanique.

Impact sur les animaux

Ce modèle induit une inflammation localisée au niveau de la vessie entraînant une hyperactivité de cet organe et une hypersensibilité qui peut être révélée par stimulation mécanique de l'abdomen de l'animal. Ce modèle répond bien au traitement à la prégabaline.

Devenir

Mise à mort pour tous les animaux pour prélèvements de tissus et de sang pour des analyses de biochimie, d'immunohistochimie et de biologie moléculaire ultérieures.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de produit inflammatoire.

Réduction

Chaque binome d'étudiant aura trois souris en charge (une traitée avec le véhicule, une avec le cyclophopshamide à 150mg/kg, ip et une avec du cyclophosphamide à 150mg/kg, ip et de la prégabaline à 30 mg/kg, sc) afin de comparer les divers paramètres phénotypiques, biochimiques et de biologie moléculaire entre une situation normale et pathologique avec et sans traitement et de présenter in fine ces résultats sous forme d’un mini-article scientifique. Les résultats seront groupés pour que les étudiants puissent réaliser des analyses statistiques, mettre en forme et discuter les résultats obtenus. Avec ce projet, les étudiants auront accès à des tissus sur lesquels plusieurs intervenants de disciplines variées leur permettront de pratiquer des techniques de biochimie, de biologie moléculaire et d'immunohistochimie, permettant au final de réduire considérablement le nombre d'animaux qui aurait été nécessaires pour tous ces enseignements s'ils n'étaient pas mutualisés. Par ailleurs, dans la mesure du possible, les animaux utilisés dans ce projet pourront être des animaux utilisés préalablement au sein de l'IUT à visée de prise en main par les étudiants afin de réduire le nombre global d'animaux utilisés au sein de la structure.

Raffinement

Le test de von frey est réalisé avec un filament fin (0.16g) appliqué sur un temps court permettant une évaluation de la sensibilité mécanique de l'animal sans induire de souffrance . Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation et 24h à la salle d'expérimentation. Des points limites, précoces et spécifiques sont définis qui conduisent si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Les étudiants auront préalablement été formés en BUT1 et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie). Un enrichissement du milieu est apporté (tunnel en plastique et des briquettes en bois à ronger) afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux.

Choix des espèces

La souche CD1 est utilisée au sein du département de Génie biologique depuis de nombreuses années. C'est un bon modèle pour les études comportementales, qui est par ailleurs peu stressé, donc facile d'utilisation par les étudiants de notre formation. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8 à 12 semaines), comme généralement utilisés par la communauté scientifique

1 212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris de lignée NOD développent spontanément un diabète de type 1, avec soif excessive et perte de poids, et reçoivent par voie intraveineuse sous anesthésie des nanoparticules d'oxyde de fer censées réguler leur système immunitaire. Le porteur teste ce traitement en prévention et en curatif, et renvoie une application chez l'humain au long terme. Il qualifie le recours à la souris d''incontournable' et affirme qu'aucun modèle in vitro n'étudie les mécanismes immunitaires du diabète auto-immun.

Objectifs

L'organisation mondiale de la santé considère aujourd’hui le diabète comme une priorité sanitaire. Environ 5% des patients diabétiques souffrent du diabète auto-immun de type 1, la maladie métabolique la plus fréquente chez l'enfant dans les pays développés. Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune complexe qui résulte de la destruction spécifique des cellules pancréatiques qui produisent l'insuline et de la perte de la capacité à contrôler le niveau de glucose dans le sang. Le diabète de type 1 survient suite à une réaction anormale du système immunitaire. De nos jours, il n’existe pas de traitement curatif sûr pour cette pathologie. Ce projet repose sur l'hypothèse que la régulation de la réponse immune peut avoir le potentiel d'induire la rémission du diabète de type 1 déclaré et/ou de le prévenir lorsqu'il est appliqué dans le prédiabète tardif, avant le déclanchement de la maladie. Des nanoparticules d’oxyde de fer, portant des molécules qui régulent le système immunitaire seront utilisées pour les traitements de souris non-obèses diabétiques. Ce type de nanoparticules est déjà utilisées en clinique en tant qu’agent de contraste en radiologie. Ce projet vise à valider et améliorer le protocole thérapeutique en termes de durée de traitement, de dose et de voie d’administration de souris diabétiques et à développer un protocole pour un traitement prophylactique. Il est également prévu d’examiner l'impact du traitement par nanoparticules sur le système immunitaire à court et à moyen terme pour la compréhension des mécanismes impliqués dans leur effet thérapeutique au niveau de l'organe affecté et du système immunitaire. Globalement ces travaux pourront contribuer à terme à valider une approche d'immunothérapie antigène-spécifique pour l'homme.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu pour ce projet est l’optimisation d’une nouvelle approche de thérapie du diabète de type 1 basée sur l’administration de nanoparticules capables de réguler le système immunitaire. Un deuxième bénéfice potentiel est la compréhension des mécanismes impliqués dans un effet thérapeutique du traitement au niveau de l'organe affecté et du système immunitaire. Ces connaissances pourraient contribuer, à plus long terme, à la translation de ce type de traitement à l’homme.

Procédures

Le dosage glycémique pour suivre l’évolution du diabète sera effectués par prélèvements d’une goutte de sang pour (un lecteur de glycémie capillaire) lorsque la glycosurie avec la bandelette s’avère positive sur toutes les souris (1212). Les traitements curatifs ou prophylactiques du diabète auto-immun par les nanoparticules seront administrés par voie intraveineuse sous anesthésie générale gazeuse (1038 souris). La durée des traitements sera soit de 10 jours soit de 4 semaines. L’injection des lymphocytes par voie intraveineuse sous anesthésie gazeuse se fera sur 120 souris et 54 souris seront utilisées pour les préparations cellulaires. Le temps estimé pour effectuer le dosage de glycosurie ou de glycémie est environ 10 secondes par souris. Les temps pour effectuer l’injection intraveineuse, après induction de l’anesthésie, est 5 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles sont inclus les animaux est modéré. Aucun effet indésirable majeur n’est attendu à la suite des traitements avec le nanoparticules car elles sont déjà utilisées en clinique en tant qu’agent de contraste en radiologie. Le déclenchement du diabète chez les souris non-obèses diabétiques survient entre 13 et 30 semaines avec un incidence moyenne de 18 semaines. L'incidence du diabète est de 70% chez les femelles. Des diminutions de la teneur en insuline se produisent chez les femelles à environ 13 semaines d'âge. Le début du diabète est marqué par une glycosurie et puis par une glycémie modérée. La maladie peut induire chez les souris une surconsommation d’eau et tardivement une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Ceci est justifié par le fait que la réponse au traitement, et leur système immunitaire seront alors caractérisés.

Remplacement

Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l’étude des mécanismes immuno-pathologiques. Aucun modèle in vitro alternatif n’est disponible pour étudier les mécanismes immunitaires complexes intervenant dans la physiopathologie du diabète auto-immun et donc impossible d’analyser in vitro, mais qui dispose du modèle très performant, la souris NOD. Étant donné que le paramètre principal étudié dans ce projet est la survenue d’une maladie résultant d’un ensemble complexe d’acteurs cellulaires et de médiateurs solubles, l’utilisation du modèle de la souris est incontournable.

Réduction

Le nombre de souris utilisées est maintenu au minimum pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. L’incidence du diabète et les différences entre les populations lymphocytaires au cours des différents traitements seront analysées par un test statistique adapté. Le protocole expérimental prévoit l’analyse du système immunitaire de tous les animaux traités avec les nanoparticules pour limiter la répétition des expériences.

Raffinement

Les points finaux pour chaque procédure ont été établis afin d’éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés dans des cages adaptées, 3-5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une surpopulation. L’environnement est enrichi par des objets. Les animaux sont observés quotidiennement par le personnel de l'animalerie formé au bien-être des animaux et par les expérimentateurs. Les injections intraveineuses sont effectuées sous anesthésie générale.

Choix des espèces

La NOD est considérée comme le meilleur modèle du diabète auto-immun spontané permettant d’étudier la maladie et la réponse immunitaire diabétogène. La souris NOD développe un diabète auto-immun entre 13 et 30 semaines d'âge. Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l'étude de cette maladie, en effet les mécanismes immunopathologiques découverts à l'aide des modèles murins sont similaires chez l'homme. Aucun modèle in vitro alternatif n'est disponible pour étudier les mécanismes immunitaires complexes intervenant dans la physiopathologie du diabète auto-immun. Les souris NOD adultes développent un diabète auto-immun entre 13 et 30 semaines. Notre étude d’incidence se concentre sur des animaux déclarant un diabète entre 13 et 22 semaines d’âge. Les souris de 12 semaines seront utilisées pour le traitement de prévention de la maladie et les études mécanistiques.