Souris

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont placées jusqu'à quinze jours dans une centrifugeuse reproduisant une hypergravité de 2G, ce qui les plaque au sol et augmente leur stress, puis passent le test de la croix surélevée et le test du labyrinthe en Y avant d'être tuées pour l'étude de leur hippocampe. Le projet vise à comprendre l'effet de la gravité sur la mémoire, en vue d'aider les astronautes lors des vols spatiaux. Le porteur affirme que l'effet de l'hypergravité sur un "organisme entier" ne peut pas être modélisé in vitro.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer les effets de l’hypergravité (à court ou à long terme) sur la potentialisation à long terme (LTP) dans l’hippocampe des animaux, l’un des mécanismes essentiels de la mémoire. Nous allons aussi déterminer si l’exposition à l’hypergravité (2G) va mener à des difficultés dans des tests comportementaux évaluant la mémoire, la cognition et le stress des animaux. Après une période d’habituation, en groupe sociaux, dans des cages de l’animalerie, la totalité des animaux, soit 80 animaux, seront soumis soit à l’hypergravité (2G) pendant 24h (n=20), 48h (n=20) ou 15 jours (n=20) dans une centrifugeuse in vivo, prévue à cet effet soit à 1G (condition normogravitaire, n=20). Pour reproduire un champ gravitaire de 2G, et donc placer les animaux en hypergravité, nous utilisons une centrifugeuse in vivo (programme spatial du CNES). A la fin de ces différentes périodes, la première moitié des animaux de chaque groupe sera mise à mort pour une étude electrophysiologique approfondie sur tranches d’hippocampe. L’autre moitié des animaux effectura des tests comportementaux pour étudier si des modifications sont concommittantes au niveau comportemental (mémoire) et au niveau cérébral (propriétés électrophysiologiques de l’hippocampe). Après 15 jours d’adaptation, durant lesquels ces tests seront effectués à nouveau 4 fois (2 fois par semaine), les souris seront mises à mort pour effectuer des enregistrements electrophysiologiques et voir si les propriétés électrophysiologiques sont modifées.

Bénéfices attendus

Les données qui seront recueillies grâce à ce projet apporteront des informations essentielles sur le rôle de la gravité dans le fonctionnement de l’hippocampe. En effet on sait que le système vestibulaire, qui est l’organe sensoriel sensible à la gravité est directement connecté à l’hippocampe et participe ainsi non seulment à l’orientation dans l’espace mais aussi à la mémoire spatiale et aux autres fonctions contrôlées par l’hippocampe. Comprendre comment la gravité modifie le fonctionnement et la plasticité de l’hippocampe, et indirectement comment elle affecte les fonctions cognitives servira de base pour trouver des contre-mesures pour aider les astronautes à éviter la désorientation et l’altération de leurs fonctions cognitives lors de changement de gravité telles qu’ils subissent lors des vols spatiaux.

Procédures

Après une période d’habituation, en groupe sociaux, dans des cages de l’animalerie, la totalité des animaux, soit 80 animaux, seront soumis soit à l’hypergravité pendant 24h (n=20), 48h (n=20) ou 15 jours (n=20) dans une centrifugeuse in vivo, prévue à cet effet soit à 1G (condition normogravitaire, n=20). A la fin de ces différentes périodes, la première moitié des animaux de chaque groupe sera mise à mort pour une étude electrophysiologique approfondie sur tranches d’hippocampe. L’autre moitié des animaux sera soumise à des tests comportementaux non invasifs. Ces tests seront réalisés sur animaux vigiles et sans anesthésie. Concernant les 20 animaux témoins, ils seront placés, en groupe sociaux, dans une nacelle de centrifugeuse qui sera déposée dans la meme pièce que la centrifugeuse mais qui ne sera pas en rotation. Alors que 10 de ces animaux effecturont le protocole « électrophysiologie », les 10 autres effecturont le protocole « comportement + electrophysiologie ». Les nuisances prévues sont au nombre de 3. Tout d’abord l‘exposition à l’hypergravité (pour 60 souris), puis les tests comportementaux (pour 40 souris) puis l’électrophysiologie post-mortem (pour 80 souris). L’exposition à l’hypergravité va consister en une augmentation progressive de l’accélération générée par la mise en rotation de l’appareil. Nous prévoyons une augmentation lente permettant d’atteindre un vecteur d’intensité gravitaire perpendiculaire au sol des cages de 2G en 5 minutes. Lors de cette augmentation les animaux vont ressentir une augmentation de leur poids qui va les plaquer au sol et réduire leurs mouvements puis les animaux vont s’adapter et on observe qu’après quelques heures ils commencent à retrouver un certain niveau d’activité. On observe pendant cette phase d’adaptation une augmentation du niveau de stress, puis une habituation à ce nouvel environnement et une réapparition des comportements normaux. Les tests comportementaux que nous effectuerons dès la sortie de la centrifugeuse puis à deux autres délais pour les souris exposées durant 2 semaines sont le test de la croix surélevée et le test du labyrinthe en Y (alternance spontanée). Ce ne sont pas des tests qui génèrent une nuisance particulière, les animaux sont libres de leurs mouvements et on recueille seulement des paramètres liés à leur exploration.

Impact sur les animaux

La mise en hypergravité des animaux induit une sensation d’alourdissement qui peut potentiellement induire une augmentation du niveau du stress, en perturbant leur perception de la gravité et de leurs déplacements dans l’espace. Par conséquent, et comme cela a été montré dans la littérature, les animaux vont s’immobiliser pendant une periode de quelques heures avant de s’habituer au nouveau référentiel gravitationnel et reprendre une activité normale.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à la fin de la procédure. En effet la première moitié des animaux est utilisée pour des études electrophysiologiques ex-vivo de tranches d’hippocampe, par conscéquent ils seront mis à mort dès la sortie de la centrifugeuse. L’autre moitié des animaux sera soumise à des tests comportementaux non-invasifs à la sortie de la centrifugeuse, ils seront ensuite réutilisés quelques jours plus tard, pour des mesures électrophysiologiques, pour évaluer des phénomènes de réadaptation plusieurs jours apres la centrifugation. Par conséquent, à la fin de l’étude, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Des études in vitro ou in sillico ne permettent pas de mettre en évidence l’impact de l’hypergravité sur un organisme entier. En effet, la gravité exerce des effets sur l’intégralité de l’organisme (systèmes sensoriels, système musculo-squelettique, viscères etc.), et les effets de ses modifications et de leurs interactions ne peuvent, à l’heure actuelle, pas être modélisés autrement que sur un organisme dans son intégralité. Par ailleurs, étant donné que nous effectuons des tests comportementaux, nous avons besoin des animaux vivants. Pour les enregistrements életrophysiologiques nous avons besoin de tranches de cerveau qui ne sont pas encore modélisables in vitro ou in sillico. Nous avons choisi le modèle souris afin de pouvoir utiliser les données de la littérature sur ce même modèle, car il est de petite taille et peut etre maintenu en groupes sociaux dans des cages standards placées dans les nacelles de la centrifugeuse. De plus, le modèle souris est un mammifère suffisament proche de l’homme pour pouvoir transférer les données obtenues entre ces deux espèces.

Réduction

Nous avons défini le nombre d’animaux dans chaque groupe à n=10 en nous basant sur la littérature disponible sur le sujet et sur les travaux du laboratoire utilisant les mêmes méthodes. De plus, le fait d’utiliser les mêmes animaux pour les études comportementales et pour le suivi de la récupération des animaux après l’exposition à l’hypergravité permet de réduire considérablement leur nombre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables dans des cages standard, répondant aux normes d’éthique. La stabilité des groupes permettra de réduire une éventuelle agressivité. Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, c’est-à-dire dans un environnement stabilisé en température à 21°, hygrométrie (55%), luminosité (100 lux), et durée du cycle de lumière (12h/12h). L’eau et la nourriture seront ad libitum, de la nourriture humidifiée sur le sol ainsi que de la gélatine seront mis dans les cages pour permettre aux animaux de se nourrir et de s’hydrater facilement au début de l’exposition. Leur milieu est enrichi par des frisures de carton et un igloo en papier mâché. Les animaux seront surveillés par un système vidéo dans la centrifugeuse. De plus, à chaque arrêt de la centrifugeuse un responsable des animaux vérifiera quotidiennement l’état des animaux et particulièrement des éventuelles variations de poids, leur apparence physique externe des animaux (poils hérissés, blessures…), des changements de comportement (attitude de prostration, animal ne répondant plus à son environnement, réduction importante de l’activité motrice…). Un animal présentant un tel état de mal-être ou de souffrance sera immédiatement exclu de l’étude et mis à mort.

Choix des espèces

Les données bibliographiques les plus récentes sur ce sujet ont portés sur le modèle souris, il parait donc judicieux de poursuivre avec cette espèce pour pouvoir confronter nos résultats et apporter de nouvelles données. Nous avons également choisi le modèle souris car il est de petite taille et supporte très bien une modification de la gravité jusqu’à 2g. De plus, son génome est connu et suffisament proche de celui de l’homme pour obtenir des premiers résultats concluants. Nous utilisons des souris adultes de 8 semaines car pour étudier la plasticité synaptique hippocampique, nous souhaitons que la croissance et le développement cérébral soit atteint.

1404 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée par ajout de dextran sulfate de sodium dans l'eau de boisson, avec pour une partie des animaux une induction de cancer intestinal par injection, puis une injection de cellules B régulatrices et des prélèvements sanguins. Le projet teste une thérapie cellulaire contre les maladies inflammatoires de l'intestin, les souris étant tuées pour caractériser leur réponse immunitaire. Le porteur affirme que les migrations et interactions cellulaires en jeu ne peuvent pas être modélisées in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est de caractériser l’effet protecteur d’une thérapie cellulaire utilisant des cellules B régulatrices (Bresg) dans des modèles de maladies inflammatoires de l'intestin (MII). Les MII incluent la colite ulcéreuse (CU) et la maladie de Crohn (MC) qui sont des troubles chroniques et récidivants, dont le cancer est une complication à long terme potentiellement mortelle. Plus de 2 millions d'Européens et 1,5 million de Nord-Américains sont atteints de MII. Bien que les traitements actuels permettent de ralentir la progression de ces maladies chez certains patients, une rémission durable et la prévention du cancer associé ne sont pas toujours possibles, et il n'existe actuellement aucun traitement curatif pour les MII. Les MII impliquent des cellules du système immunitaire responsables de la pathologie intestinale. L’activation de ces cellules pathogènes est normalement empêchée par un autre type de cellules du système immunitaire appelées Bregs. Les Bregs sont déficitaires chez les patients atteints de MII si bien qu’elles ne bloquent plus l’activation des cellules qui causent la maladie. Il y a un grand espoir qu’il soit possible de traiter les MII en transférant des Bregs protectrices chez ces patients. Des Bregs peuvent être produites en grand nombre en utilisant un protocole récemment établi. Les MII peuvent être modélisées chez la souris. En utilisant ces modèles les objectifs de ce projet sont de caractériser l’effet des Bregs produites in vitro sur la progression de la maladie, leur localisation dans les souris traitées, les mécanismes moléculaires impliqués dans leur effet bénéfique, et leur capacité à compenser pour des défauts dans d’autres mécanismes régulateurs importants dans l’inflammation intestinale. Le projet évaluera également la capacité de ces Bregs à empêcher le développement de cancer intestinal provoqué par l’inflammation.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l'optimisation d'une nouvelle approche de thérapie cellulaire basée sur les Bregs pour traiter les MII et empêcher le développement de cancers associés, ainsi que la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans cet effet thérapeutique au niveau de l'organe affecté, l'intestin. Les MII, y compris la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, sont des troubles chroniques et récidivants du tractus gastro-intestinal. Il n'existe actuellement aucun traitement curatif des MII. Les dysfonctionnements du système immunitaire contribuent à l'inflammation intestinale aberrante chez ces patients. L'activation de la réponse immunitaire est normalement contrebalancée par des lymphocytes régulateurs, tels que les lymphocytes B régulateurs (Bregs). Les Bregs sont déficients dans les MII et donc incapables de bloquer la réponse inflammatoire conduisant à la maladie. Il existe un grand espoir qu'il soit possible de traiter les MII en transférant des Bregs protectrices à ces patients. Les Bregs peuvent être produits en grand nombre par différenciation des cellules B naïves à l'aide d'un protocole récemment établi.

Procédures

La colite sera induite dans 1404 souris par ajout de dextran sodium sulfate (DSS) à l'eau de boisson. Ces souris suivront 8 traitements différents. Le nombre de souris est indiqué pour chacun de ces traitements. 1) injection de Bregs, prélèvement de sang par la veine mandibulaire, analyse J10 : 90 souris. 2) injection de PBS, prélèvement de sang par la veine mandibulaire, analyse J10 : 15 souris. 3) injection de Bregs, analyse J10 : 345 souris. 4) injection de PBS, analyse J10 : 210 souris. 5) Injection de Bregs, analyse J28 : 384 souris. 6) Injection de PBS, analyse J28 : 96 souris. 7) pré-traitement AOM, injection de Bregs, analyse semaine 12 : 216 souris. 8) pré-traitement AOM, injection de PBS, analyse semaine 12 : 48 souris.

Impact sur les animaux

La colite aiguë est induite par ajout de DSS dans l'eau de boisson pendant une semaine à une concentration de 4,0 % (modèle aigu). Pour le modèle chronique, les souris ont une eau de boisson avec du DSS à 2,5 % pendant une semaine, puis une semaine pendant laquelle l’eau de boisson ne contient pas de DSS, suivie par une semaine avec de l’eau de boisson à 2,5% en DSS (modèle chronique). Dans le modèle aigu, les souris développent la colite quelques jours après l'administration de DSS. Pour le modèle chronique, la concentration de DSS a été optimisée afin que les souris développent une maladie plus légère. Dans le modèle chronique, les souris développent progressivement la colite après le premier cycle d'administration de DSS et sont en rémission pendant la semaine suivante, puis la maladie rechute avec le deuxième cycle d'administration de DSS et se rétablit progressivement après le retrait du DSS. L'induction d'un cancer associé à une colite se fait par injection intrapéritonéale d'AOM suivie de trois cycles d'administration de DSS via l’eau de boisson (modèle AOM/DSS). Dans ce modèle de cancer, les symptômes sont provoqués par des poussées de colite pendant les cycles de traitement par DSS. Les symptômes cliniquement apparents liés à la tumeur sont généralement peu nombreux et le nombre d’animaux devant être mis à mort pour atteinte de point limite est généralement

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Ceci est justifié par le fait que la réponse au traitement, et leur système immunitaire seront alors caractérisés.

Remplacement

Les protocoles expérimentaux nécessaires à ce projet ont été optimisés par des expériences in vitro en vue d'un remplacement afin de réduire le nombre de souris nécessaires. En outre, le protocole de production des Bregs a été sélectionné suite à un long travail d'optimisation in vitro afin de générer des cultures contenant uniquement des Bregs. Les propriétés moléculaires de ces Bregs ont déjà été étudiées in vitro afin de réduire le besoin d'expérimentation animale. Ce projet vise à caractériser l'effet Bregs dans des modèles de MII et de cancer du côlon associé. Les réponses immunitaires se développent dans les organes lymphoïdes secondaires et impliquent des processus d'interaction entre différents types de cellules et des migrations cellulaires qui ne peuvent actuellement pas être modélisés in vitro. Les maladies inflammatoires intestinales impliquent également la migration des cellules du système immunitaire vers l'intestin, puis l'interaction de ces cellules avec les cellules intestinales locales. Ces processus ne peuvent pas être étudiés in vitro. Il n'y a donc pas d'alternative à la réalisation des études décrites chez la souris.

Réduction

Le protocole d'induction des MII a été optimisé de manière à ce que les maladies se développent de façon homogène chez des souris génétiquement identiques, ce qui permet de réduire le nombre de souris nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement valides. Des mesures de remplacement et d'affinement ont également permis de réduire le nombre de souris nécessaires à ce projet. Le nombre de souris utilisées est maintenu au minimum pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. Ces estimations sont basées sur notre expérience, et sur les estimations obtenues avec le programme d'analyse de puissance statistique G*Power. Nous comparerons le jour d'apparition des signes cliniques, le score clinique maximum et l'incidence de la maladie avec le test de Mann-Whitney, et le niveau global de la maladie avec des ANOVA à mesures répétées. En outre, nous utiliserons une stratégie d'imagerie par luciférase pour suivre le devenir des Bregs au fil du temps sur le même animal, ce qui réduit le nombre d'animaux à utiliser.

Raffinement

Le protocole d'induction des MII a été affiné de manière à ce que l'évolution de la maladie ne dure que 10 jours dans le modèle aigu, si bien que les souris ne sont malades que pour quelques jours, et soit plus douce dans le modèle chronique afin de réduire la souffrance des animaux. Dans le modèle de cancer associé à la colite, les symptômes sont causés par des poussées de colite pendant les cycles de traitement par le DSS. Le protocole a été raffiné au niveau des doses utilisées afin que les symptômes cliniquement apparents liés à la tumeur soient généralement rares. Nous avons établi des points finaux pour chaque procédure afin d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont logés en groupes de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des objets sont ajoutés à leurs cages pour enrichir leur environnement. Ils sont observés quotidiennement par le personnel de l'animalerie formé au bien-être des animaux, et par les expérimentateurs. Le score clinique et le poids sont mesurés quotidiennement pour les expériences avec le modèle de colite aiguë et deux fois par semaine pour les modèles de colite chronique et de cancer de l'intestin.

Choix des espèces

Les modèles de MII et de cancer colorectal proposés ici sont bien standardisés. Les connaissances disponibles sur ces modèles permettent de mieux définir les plans expérimentaux et donc de réduire le nombre de souris nécessaires. De nombreux outils sont disponibles pour ces modèles, ce qui permet d'aborder les problèmes posés de la manière la plus pertinente, et de récupérer le maximum d'informations. Ces modèles expérimentaux ont été utilisés pour le développement de thérapies actuellement utilisées chez les patients atteints de MII. Même si ces modèles ne sont pas une copie parfaite des MII ou des cancers associés, ils constituent des modèles utiles pour le développement de pistes thérapeutiques pour la pathologie humaine. L’utilisation de souris de fond génétique C57BL/6 de 6 à 14 semaines est approprié pour ces études car cela correspond à l’âge pendant lequel la maturité du système immunitaire est appropriée pour étudier cette maladie.

1593 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une greffe sous-cutanée de quatre biomatériaux sous anesthésie, puis est tué de six heures à six semaines après l'opération pour récupérer les implants. Le porteur qualifie la chirurgie de faiblement invasive et bien supportée, tout en reconnaissant un risque de septicémie. Il affirme que la sélection du meilleur couple cellules-biomatériau passe par l'animal, une partie du travail restant menée in vitro.

Objectifs

Le traitement des grands défauts osseux est un défi chirurgical puisque 5 à 20% des fractures des os longs sont incapables de se consolider après 6 mois, causant ainsi des morbidités et des hospitalisations prolongées. Actuellement, une partie de l’os de la hanche du patient est prélevée puis greffée au niveau du site du défaut osseux. Ces fractures vont augmenter avec le vieillissement de la population, ce qui nécessite de trouver des alternatives de soin moins invasives et moins douloureuses pour le bien être des individus touchés. Plusieurs alternatives ont donc été développées comme l’utilisation de matériaux synthétiques ou d’origine naturelle (biomatériaux). Cependant, ces supports ne possèdent pas la capacité de former de l’os du fait, notamment, de l’absence de cellules souches. L’ingénierie tissulaire combinant les cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse humaines (BMSCs) avec des biomatériaux, représente une approche prometteuse pour réparer l’os endommagé. Cependant, malgré des résultats cliniques encourageants (essais de phase II), le délai de reconstruction de l’os reste encore trop long pour 75% des patients, révélant ainsi la nécessité d’optimiser l’efficacité de ces approches. Les résultats encore insuffisants des essais cliniques sont probablement dus à la courte durée de vie des BMSCs en raison du foyer inflammatoire et de l’absence de nutriment et d’oxygène au niveau du site endommagé. Ce projet est une phase préliminaire permettant d'étudier la vascularisation au niveau de l’implant afin d'améliorer la survie des cellules stromales mésenchymateuses greffées et ainsi améliorer la formation osseuse. L’association cellules-biomatériau ainsi que la répartition des cellules au sein du biomatériau semblent donc être fondamentales. L’objectif de ce projet à long terme est d’améliorer les thérapies de reconstruction osseuse existantes en concevant un produit d’ingénierie tissulaire efficace, adapté au patient et à moindre cout.

Bénéfices attendus

Tout d’abord, en travaillant sur les procédés de culture des cellules stromales mésenchymateuses humaines, nous envisageons de réduire le temps et le cout de production des cellules. Concernant le biomatériau, nous utiliserons des biomatériaux issus de l’impression 3D permettant une adaptabilité parfaite au défaut du patient. Ce projet nous permettra de déterminer le biomatériau avec la porosité et les propriétés biomécaniques les plus adaptées au développement de la vascularisation, ainsi qu’à la croissance et à la différenciation vers la voie osseuse de nos cellules.

Procédures

Chaque animal du projet sera soumis à un acte chirurgical sous anesthésie générale d’une durée de 15 minutes environ. Les animaux seront mis à mort afin de récupérer les biomatériaux greffés 6 heures, 72 heures, 1 semaine, 2 semaines, 4 semaines et 6 semaines après l’acte chirurgical.

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale de greffe sous-cutanée est faiblement invasive et très bien supportée par les animaux. Une fois réveillés de l’anesthésie, les animaux retrouvent très rapidement leur mobilité permettant de retrouver une alimentation et des interactions sociales normales. Toutefois, bien que toutes les précautions nécessaires d’asepsie soient respectées, un risque de septicémie suivant l’acte chirurgical ne peut être écarté.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue du projet afin de récupérer les échantillons greffés en sous-cutané.

Remplacement

Une partie du projet s’effectuera in vitro en testant la toxicité des potentiels biomatériaux sur les cellules ainsi que les capacités d’adhésion des cellules au biomatériau, son impact sur la différenciation vers la voie osseuse et sur la sécrétion de protéines favorisant l’inflammation. Le but de ce projet est de déterminer la meilleure association cellules / biomatériau afin d’améliorer les stratégies thérapeutiques existantes. Pour sélectionner la meilleure association, des analyses in vivo sont nécessaires afin d’étudier les interactions avec les cellules de l’hôte ainsi que la mise en place de la vascularisation.

Réduction

-La procédure chirurgicale est maitrisée dans le laboratoire et est effectuée par du personnel qualifié. - chaque animal est greffé avec 4 biomatériaux en sous-cutané afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en s’assurant de la véracité des résultats obtenus - Pour que l’étude soit statistiquement pertinente, 6 implants par condition dans 6 animaux indépendants seront réalisés. Afin de limiter les effets donneurs-dépendants, l’étude sera menée en utilisant les cellules stromales mésenchymateuses de 3 donneurs différents.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès libre à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, abris en carton, ou carré de coton compacté. La présence de blessure ou de tout autre signe de souffrance seront évalués quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Une période d’acclimatation d’une semaine est respectée avant de démarrer toute procédure sur les animaux. Une grille de score d'évaluation est proposée pour la prise en compte des critéres d'arrêt de la souffrance. Pour cela, nous suivrons la grille d’évaluation proposée : a)Changement du poids corporel 0. Normal 1. Perte de poids 20% b)Apparence physique 0. Normale 1. Manque de toilettage 2. Poil ébouriffé, paupière fermée 3. Poil très ébouriffé, posture anormale c)Comportement 0. Normal 1. Changements mineurs : activité réduite 2. Anormal : inactif 3. Très agité ou immobile, auto-mutilation Tout animal auquel aura été attribuée une valeur totale comprise entre 3 et 4 recevra de la Buprénorphine toutes les 12h pendant 3 jours après la chirurgie (0.1mg/kg en sous-cutané). Tout animal auquel aura été attribuée une valeur > 4 sera immédiatement mise à mort.

Choix des espèces

Afin d’éviter les biais dus à des variations physiologiques durant la phase de croissance osseuse, les souris utilisées seront d’âge adulte situé entre 6 semaines et 9 semaines (au-delà de cet âge une diminution de la masse osseuse due au vieillissement est observée)

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intramusculaires et intrapéritonéales, des mesures de force musculaire sous anesthésie, un test de suspension et un test d'actimétrie, pour mettre au point une thérapie génique contre une myopathie liée au gène Bin1. Le porteur décrit une atteinte musculaire qu'il juge légère et sans douleur, mais tue les souris pour prélever leurs organes et parce que la maladie deviendrait sévère si elles restaient en vie. Sur le remplacement, il affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas un "organisme entier" et conclut que seul le modèle animal permet d'étudier la maladie.

Objectifs

Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.

Bénéfices attendus

Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.

Procédures

Les 100 souris de la cohorte « Injections intra-musculaires » seront soumises aux procédures suivantes : - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, non-invasive, hebdomadaire de 6 à 12 semaines d’âge, 20min par animal. - Injections intra-musculaires sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 8 semaines d’âge, 5min par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 12 semaines d’âge. Les 120 souris de la cohorte « Injections Intra-péritonéale » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intra-péritonéale, animal vigile, unique au premier jour post-natal, 1min par animal. - Test de suspension, animal vigile, non-invasif, hebdomadaire de 3 à 10 semaines d’âge, 5min par animal. - Test d’actimétrie, animal vigile, non-invasif, unique à 10 semaine d’âge, 24h par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 10 semaines d’âge.

Impact sur les animaux

Les animaux présentent une légère atrophie et faiblesse musculaire mais qui n’affecte pas leur qualité de vie de manière significative aux âges analysés. Les animaux interagissent, se déplacent et s’alimentent normalement (poids normal). A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. La pose des électrodes sous-cutanée et l’injection intra-musculaire peux causer une inflammation dans le muscle tibial antérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. La myopathie étudiée est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.

Remplacement

Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.

Réduction

Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Afin de limiter le nombre d’animaux de la cohorte d’injections intra-musculaires nous injecterons les deux pattes (muscle tibial antérieur) de chaque animal, l’une avec la solution contrôle et l’autre avec un des traitements. L’utilisation d’un contrôle interne à chaque souris plutôt qu’un groupe de souris contrôles permet de renforcer la puissance statistique en s’affranchissant de la variation inter-groupes et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus. La mesure de la force musculaire in vivo par la procédure non-invasive hebdomadaire nous permet de faire le suivi de chaque animal, ce qui renforce la puissance statistique et nous affranchit de créer une cohorte d’animaux pour chaque semaine d’âge analysée.

Raffinement

Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire hebdomadaire, les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir tout stress causé par la procédure. Un gel protecteur oculaire sera appliqué pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les souris seront observées jusqu’à leur réveil (~5min) pour s’assurer qu’elles sont capables de se déplacer après le test. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale , les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.

Choix des espèces

Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. Nous utiliserons ces animaux à des stades très précoces pour étudier l’effet de notre traitement avant l’apparition des symptômes mais également des animaux adultes pour étudier cet effet après l’apparition des symptômes.

640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 600 tuées à l'issue et 40 réutilisées pour des formations. Chaque souris reçoit sous anesthésie une injection intracolonique de composés irritants comme l'huile de moutarde ou la capsaïcine, pour développer un modèle de douleur viscérale du côlon irritable. Le porteur indique que la stimulation ne peut être interrompue en fin d'observation, ce qui justifie la mise à mort des animaux dès la fin de la phase expérimentale. Il affirme que l'étude d'analgésiques chez l'animal vigile reste "la seule option" avant le passage chez l'humain.

Objectifs

Le syndrome du côlon irritable est un trouble gastro-intestinal caractérisé par des douleurs abdominales récurrentes associées à des troubles du transit intestinal. Environ 1 personne sur 10 dans le monde souffre du syndrome du côlon irritable et ce diagnostic est associés à une altération de la qualité de vie des patients ainsi que des impacts socio-économiques importants. L’objectif de ce projet est de développer deux modèles d’hypersensibilité viscérale non invasifs et ne nécessitant pas l’hébergement isolée des animaux. Ce modèle est basé sur l’administration de composés irritants, l’huile de moutarde et la capsaïcine, naturellement présents dans l’alimentation. L’administration de ces composés permet de stimuler les voies nerveuses viscérales et cause un ensemble de comportements spécifiques qui sont quantifiés afin d’obtenir une estimation de l’hypersensibilité viscérale. Le développement de ces modèles permettra de tester le potentiel analgésique de composés pharmacologiques pour avancer leur développement.

Bénéfices attendus

La douleur viscérale est une cause récurrente de consultation médicale. Les options pharmacologiques pour la prise en charge du syndrome du côlon irritable, qui entraine des douleurs viscérales récurrentes, restent limitées et concentrées sur la régularisation du transit intestinal, bien que la douleur soit la plainte principale des patients. Ce projet vise à développer un modèle d’hypersensibilité viscérale qui sera intégré à batterie de tests conçue pour évaluer rapidement et sur un nombre réduit d’animaux le potentiel analgésique de composés pharmacologiques. Le développement et l’amélioration de modèles afin que ceux-ci se rapprochent de la physiopathologie du syndrome du côlon irritable soutient la recherche pharmaceutique dans le développement de traitements en raffinant les outils d’évaluation des molécules. Enfin, le test de composés pharmacologiques des batteries de tests est une bonne pratique recommandée afin d’augmenter la probabilité de succès des composés lors des phases cliniques de leur développement.

Procédures

Les animaux seront soumis à l’administration de composés irritant naturellement présents dans l’alimentation par une injection intracolonique réalisée sur des animaux sous anesthésie gazeuse puis observés pendant les vingt minutes suivant leur réveil. Cette intervention type administration ne prend que quelques minutes. Chaque animal ne subira la procédure qu’une seule fois.

Impact sur les animaux

Dans le domaine de la pharmacologie préclinique de la douleur, l’induction des modèles entraîne inévitablement l’apparition de symptômes douloureux. L’administration intracolonique des composés irritants est réalisée sous anesthésie gazeuse afin favoriser le relâchement musculaire de l’animal et d’éviter tout dommage tissulaire ou stress lié à la contention. Les modèles d’hypersensibilité viscérale par irritation colonique entrainent un ensemble de comportements spécifiques (léchage de l’abdomen, étirement de l’abdomen, écrasement/pression de l’abdomen contre le sol, rétraction de l’abdomen) qui sont quantifiés afin d’obtenir une estimation de l’hypersensibilité viscérale pendant les 20 minutes d’observation. L’interruption de la stimulation chimique à la fin de la période d’observation n’étant pas réalisable, les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure. Aucun autre effet indésirable n’est attendu en dehors de la période d’observation.

Devenir

Le stimulus administré (i.e. injection d’une substance irritante dans le côlon) ne pouvant être effectivement interrompu à la fin de la période d’observation et l’hypersensibilité viscéral induite risquant de se prolonger, les animaux seront euthanasiés dès la fin de la phase expérimentale. Par ailleurs, pour la procédure 1 : le groupe Sham neutre qui reçoit un véhicule et le groupe naïf qui ne reçoit aucune substance pourront être réutilisés pour des formations. De ce fait, ces animaux (n=40) ne seront pas mis à mort à la fin de la phase expérimentale.

Remplacement

L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par l’Association Internationale pour l’Etude de la Douleur (IASP), la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est basé sur les données publiées dans l’article princeps décrivant le développement des modèles ajusté pour prendre en compte la variabilité de ces modèles rapportée dans la littérature. Ce nombre est cohérent avec l’expérience du laboratoire dans des modèles équivalents (Cette estimation théorique sera confirmée lors des stades initiaux de développement du modèle (dès que l’approbation du projet permettra le début des expérimentations et la génération de données) par la réalisation d’une analyse statistique par la méthode des tirages aléatoires et d’un calcul de puissance. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet.

Raffinement

Dans le domaine de la pharmacologie préclinique de la douleur, l’induction des modèles entraîne nécessairement l’apparition de symptômes douloureux et l’objectif des études réalisées ne permet pas la mise en place de dispositions spécifiques (e.g. couverture analgésique). Le choix d’un modèle d’hypersensibilité viscérale aigue constitue un raffinement par rapport aux modèles chroniques qui augmentent la durée pendant laquelle les animaux sont exposés à des nuisances. L’irritation colonique subie par les animaux est limitée à la durée de l’observation et l’administration des composés est réalisées sous anesthésie gazeuse. La concentration des composés irritants sélectionnée sera la concentration minimale permettant d’éliciter une réponse reproductible avec le minimum d’effets secondaires pour les animaux. Les animaux seront suivis de près à la suite de l’instillation. De plus, avant l’instillation les animaux sont habitués au dispositif expérimental pour limiter les impacts sur leur bien-être. La procédure est arrêtée en cas d’atteinte de points limites tels que : Signes notables: freezing, tremblements, immobilité et signes sévères : morsure/mutilation de l'abdomen ou de la zone périanale, saignement anal, prostration/absence de réaction à la stimulation. Ces signes notables/sévères sont traités pour chaque animal. L'apparition récurrente de ces signes pendant la procédure entrainera la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration de la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’Association Internationale pour l’Etude de la Douleur est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. La souris a été sélectionnée pour ce projet car les modèles développés dans ce projet l’ont initialement été chez la souris et bien reproduits et caractérisés dans la littérature. Les animaux utilisés seront des souris adultes, en cohérence avec la population humaine chez laquelle la prévalence est maximale.