Souris

3 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles subissent une injection intracérébrale de vecteurs viraux ou la pose chirurgicale d'un implant dans le cerveau, suivies de tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé, pour étudier le rôle de la dopamine dans la peur et l'anxiété. Le porteur indique que ces chirurgies peuvent provoquer une perte de poids, un détachement de l'implant ou des troubles du comportement. Il affirme que la souris est le "seul organisme modèle" permettant ce type d'étude, d'éventuelles approches thérapeutiques restant renvoyées au long terme.

Objectifs

Le cerveau possède des systèmes dits de récompense qui évaluent les effets bénéfiques de certaines actions et facilitent leur apprentissage. Ils attribuent ainsi une valeur plus ou moins grande à des signaux annonçant une « récompense » et règlent leur valeur motivationnelle. Symétriquement des valeurs motivationnelles sont attribuées à des signaux prédictifs de situations « menaçantes ». Les neurones produisant la dopamine jouent un rôle important dans ces phénomènes et la libération de dopamine module la force de la valeur motivationnelle. Le dérèglement de ces systèmes intervient dans l’addiction aux drogues (valeur motivationnelle excessive) ou dans les troubles anxieux généralisés (valeur « menaçante » excessive). De multiples facteurs participent au contrôle de la libération de dopamine. Parmi eux, les récepteurs de la dopamine appelés autorécepteurs D2 exercent un rétrocontrôle négatif empêchant ainsi une libération excessive de dopamine. Une faible expression de ces récepteurs est un facteur de risque d’addiction chez les humains. Dans ce projet, nous émettons l’hypothèse que le même type d’anomalie favorise l’apparition de troubles anxieux en exacerbant la valeur motivationnelle attribuée à certains signaux prédisant une situation « menaçante ». Nous testerons cette hypothèse en manipulant sélectivement les autoD2R au sein de populations de neurones dopaminergiques spécifiques. Nous utiliserons une combinaison d’approches allant de la génétique moléculaire à la mesure de l’activité des neurones, le tout couplé à des études comportementales.

Bénéfices attendus

Cette étude s’inscrit dans le cadre d’une meilleure compréhension des circuits neuronaux contrôlant les réponses émotionnelles associées à des stimuli aversifs (réponse de peur). Les résultats de ce projet permettront de préciser certains des mécanismes neuronaux et moléculaires sous-tendant l’apparition de troubles anxieux observés dans différentes affections psychiatriques et à terme de proposer des approches thérapeutiques innovantes

Procédures

600 animaux subiront une injection dans la cavité abdominale pour induire des mutations de nos gènes d’intérêts (durée : >1min). 2100 animaux auront une chirurgie pour injecter dans des régions précises du cerveau des vecteurs (virus recombinant non pathogène) pour induire des mutations spécifiques de certains neurones (Durée >45min). 1200 animaux subiront une chirurgie pour poser un implant (fibre photométrique) pour révéler l’activité de certains neurones dans le cerveau (Durée >45min). Tous les animaux auront des tests de comportement.

Impact sur les animaux

La procédure prévoit des injections stéréotaxique. Ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant, dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques (voir annexe). D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.

Remplacement

La réalisation de notre projet repose sur l'utilisation de nombreuses lignées transgéniques exprimant la protéine fluorescente GFP et l'enzyme Cre recombinase nous permettant ainsi d'identifier les neurones et d'invalider par recombinason homologue (système Cre/Lox) notre protéine d'intérêt. La souris est le seul organisme modèle permettant ce genre d'étude. L'utilisation d'animaux demeure donc la seule option à ce jour pour évaluer avec précision et pertinence les liens de causalité entre l'identité moléculaire et cellulaire des neurones dopaminergiques et le controle des réponses émotionnelles dans notre projet de recherche.

Réduction

Ce nombre a été déterminé de manière à reduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité statistique des expériences qui seront menées. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Sample size determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité : p=0.05). Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Dans le but d'une exploitation maximale des données obtenues, plusieurs régions cérébrales seront systématiquement analysées.

Raffinement

Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille en carton ("sizzle"), igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies sont faites avec des anesthésiques et analgésiques adaptés. Une grille de score avec des points limites sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies.

Choix des espèces

L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles pour l'évaluation du rôle des recepteurs D2R , au cœur de notre projet. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Les animaux seront utilisésentre 3 et 8 mois ce qui permettra de travailler sur une système cérébral stable, mature, qui n'évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs semaines.

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit sous anesthésie quatre injections sous-cutanées dorsales, dont une de LPS destinée à déclencher une inflammation, pour évaluer un hydrogel chargé en lipoxine A4. Le porteur indique que le dispositif peut gêner les mouvements des animaux et prévoit une mise à mort par dislocation cervicale afin de prélever la membrane. Il affirme qu'il est "nécessaire" de travailler sur des systèmes biologiques complexes, les applications en dentisterie restant renvoyées au long terme.

Objectifs

Le contexte clinique du projet est celui de maladies inflammatoires orales (inflammation pulpaire = pulpite et inflammation parodontale = parodontite). Les parodontites et les pulpites sont des maladies respectivement du parodonte (tissu de soutien de la dent) et de l’endodonte (tissu conjonctif situé à l’intérieur de la dent). Ces deux affections sont très fréquentes, génèrent des douleurs, des pertes dentaires, une altération de la qualité de vie et des coûts pour les individus et la société. Dans ces deux situations, des microorganismes sont à l’origine d’une inflammation des tissus conjonctifs constitués par le parodonte et par l’endodonte. Cette réaction inflammatoire est au départ normale et a pour objectif un retour à la normale appelée « homéostasie ». L’homéostasie fait intervenir des médiateurs spécialisés appelés « médiateurs lipidiques pro-résolutifs » tels que les « lipoxines ». Ces dernières ont été étudiées in vitro et in vivo, et ont montré́ une action efficace à différents niveaux de la réponse immunitaire.De plus, les lipoxines ont été étudiées dans différents contexte inflammatoire (maladies auto-immunes, cancers, parodontites...) sur des modèles animaux. Pour répondre à ces besoins, nous avons créé un dispositif (hydrogels) permettant la libération in situ des LXA4. L’objectif du projet est donc d’évaluer le caractère anti-inflammatoire de notre proposition thérapeutique. Pour cela, nous utiliserons le modèle murin de poche d’air sous-cutané (air pouch). Nous induirons la formation d’une cavité en injectant de l’air stérile en sous-cutané au niveau dorsal puis nous procèderons à l’injection de nos hydrogels plus ou moins chargés en LXA4 avant de simuler une inflammation. Ce modèle est pertinent car il permet d’étudier les composants de l'inflammation, la résolution de la réponse inflammatoire, la réponse au stress oxydatif et par conséquent les cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l'inflammation.

Bénéfices attendus

Ce modèle nous permettra d’induire une inflammation dans un système global ce qui n’est malheureusement pas possible avec les expérimentations in vitro. Nous pourrons alors évaluer l’effet anti-inflammatoire de nos hydrogels chargés en LXA4. Les médicaments anti-inflammatoires actuellement disponibles, ont pour objectif d'atténuer une inflammation excessive sans compromettre la défense de l'hôte. Les nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant des LXA4, qui améliorent la résolution de l’inflammation pourraient avoir un meilleur rapport bénéfice/risque. A court terme ce protocole nous permettra de répondre à plusieurs questions. Tout d’abord, nous pourrons choisir une formulation d’hydrogel, la plus efficace pour favoriser la résolution de l’inflammation. Nous pourrons également valider l’effet de la LXA4 in vivo dans un système complexe et non seulement in vitro sur les macrophages. Notre proposition peut également être avantageuse par rapport à d'autres systèmes d'administration de médicaments (tels que des nanoparticules synthétiques) qui ont des effets toxiques indésirables potentiels. A plus long terme, ce protocole marquera une avancée dans l’élaboration d’un système complexe permettant de relarguer des molécules anti-inflammatoires telles que la LXA4 de manière contrôlée dans le temps. En clinique, l’objectif final sera d’apporter une alternative supérieure en termes de cicatrisation et de régénération des tissus concernés dans le cadre des pulpites et parodontites. Bien que notre perspective se concentre sur le domaine de la dentisterie, l'utilisation de notre proposition thérapeutique pourrait être déployée afin de traiter de multiples maladies inflammatoires et/ou des défauts osseux.

Procédures

Injections sous cutanées sur animaux anesthésiés sous isoflurane : 4 injections / souris (2 injections d’air + 1 injection hydrogel / contrôle + 1 injection LPS). Chaque injection prendra quelques secondes. Les animaux seront observés après chaque injection pour s'assurer de leur bonne santé.

Impact sur les animaux

Ce modèle bien décrit, entrainera une inflammation contrôlée du tissu sous cutané au niveau de la poche dorsale. Ce protocole de classe modérée ne devrait pas conduire à des effets indésirables ou douloureux pour les animaux bien qu’ils peuvent néanmoins entraîner une gêne dans les mouvements et déplacements des animaux. La lipoxine A4 n’est pas un produit irritant (information vérifiée dans la fiche de données de sécurité du produit fourni par Cayman). Nous resterons bien évidemment très attentifs sur tout comportement anormal des animaux de manière à soulager leur douleur si celle-ci venait à apparaître.

Devenir

Mise à mort par dislocation cervicale pour tous les animaux. Les animaux doivent être mis à mort afin de pouvoir récupérer la membrane de la poche créée et ainsi d'effectuer les analyses histologiques post mortem nécessaires à notre projet.

Remplacement

Cette étude prend en compte la règle des 3R. Les expériences in vitro ne permettent malheureusement pas de mimer les interactions complexes intervenant entre les différents acteurs cellulaires (macrophages, neutrophiles, monocytes…) et les différents systèmes (immunitaires, vasculaires…). Il est donc nécessaire de travailler sur des systèmes biologiques complexes représentés par les animaux afin de mieux étudier les mécanismes mis en jeu lors de la réponse inflammatoire.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les formulations d’hydrogels ont été testées et sélectionnées en amont pour leur biocompatibilité et leur caractère anti-inflammatoire in vitro. Compte-tenu d’études comparables déjà effectuées, le nombre d’animaux par groupe correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité statistique (n=6). L’épaisseur de la membrane de la poche sera comparée dans les différents groupes par une analyse de variance puisqu’il s’agit de valeurs quantitatives indépendantes. Le même type de test sera utilisé pour la comparaison de la quantité de leucocytes présents dans l’exsudat. Le fait de répéter les expérimentations selon l’homogénéité des premiers résultats permettra d’étudier la reproductibilité des effets observés.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse, les animaux seront manipulés plusieurs jours avant l’expérimentation dans un but d’habituation et leur environnement sera enrichi (alpha-dri). Les souris seront hébergées à raison de 5 souris par cage. Nous raffinerons également en réduisant les éventuelles douleurs via des antalgiques (buprénorphine) lors des expérimentations afin d’améliorer la reproductibilité et la qualité des résultats obtenus. Les souris seront observées et pesées quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérimentation. Par ailleurs, des points limites ont été identifiés et les procédures de raffinement à mettre en œuvre lors de l’atteinte de ces points limites ont été décrites. Enfin, les analyses menées sur chaque animal seront complètes : d’une part l’exsudat sera récupéré pour analyse des cytokines et de l’expression génique des cellules, et d’autre part la membrane sera récupérée pour analyses histologiques

Choix des espèces

L’utilisation de souris est justifiée puisque le modèle d’injection d’air stérile sous-cutané a été développé chez cet animal de manière rapide et reproductible. Ces modèles sont décrits et reconnus dans le domaine de l’inflammation. Les animaux reçus auront 6 semaines, ils auront une semaine d’acclimatation dans l’animalerie avant le début du protocole. Les souris auront donc 7 semaines au début du protocole et 8 semaines à la fin du protocole. Ce choix correspond à notre volonté de travailler sur de jeunes adultes afin d’éviter les effets liés à la sénescence, de plus cela correspond aux protocoles standards retrouvés dans la littérature concernant ce modèle d’inflammation.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une greffe chirurgicale de cellules tumorales dans les poumons, puis reçoit dix-huit injections intrapéritonéales et plusieurs anesthésies, pour tester le repositionnement d'un médicament de cardiologie contre le cancer du poumon. Le porteur indique que la tumeur pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires et une perte de poids. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative et qualifie le modèle murin d'"indispensable", les retombées pour les patients restant renvoyées à un éventuel repositionnement futur.

Objectifs

Le cancer du poumon est aujourd'hui la première cause de décès en France et dans le monde. Nos travaux ont montré que les tumeurs pulmonaires humaines présentent des voies métaboliques remaniées, permettant d’établir une nouvelle approche thérapeutique que nous proposons d’évaluer au stade préclinique. 50% des cancers du poumon produisent leur énergie à partir des lipides. L’inhibition de l’enzyme impliquée entraîne une forte inhibition de la croissance tumorale in vitro et in vivo. De plus, un médicament utilisé en cardiologie bloque cet enzyme et entraîne l’inhibition de la croissance tumorale. Afin de progresser vers le repositionnement de cette molécule dans le traitement ciblé du cancer du poumon nous devons apporter une preuve de concept in vivo et établir une preuve de mécanisme in vivo. Pour cela, un modèle murin de tumeur du poumon est indispensable.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d'obtenir une preuve de concept dans le repositionnement d'une drogue, avec autorisation de mise sur le marché, dans le traitement du cancer du poumon.

Procédures

1_ Chaque animal subira une fois une procédure chirurgicale afin de greffer les cellules tumorales dans les poumons. L'animal sera anesthésié par de l'isoflurane pendant une très courte durée (

Impact sur les animaux

Les souris vont développer un cancer intra-pulmonaire, ce qui peut entrainer des difficultés respiratoires. Les injections quotidiennes en IP peuvent causer des irritations au niveau du site d'injection. La présence de la tumeur peut entrainer une perte de poids chez l'animal.

Devenir

A l'issue des 21 jours de suivi, tous les animaux sont euthanasiés, et les tumeurs, ganglions lymphatiques et rates sont prélévés.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologie observée chez l'Homme, peut apporter la réponse du système immunitaire. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo, qui ne reconstituent pas la complexité du système immunitaire.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Le nombre d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter-lots est de 10. Les expériences seront répétées à deux reprises. Un premier test statistique nous permettra de vérifier les différences significatives entre les groupes d’animaux. Il sera ensuite suivi d’un test de comparaisons multiples.

Raffinement

1.Hébergement: les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect du bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention: les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise les méthodes de préhensions douces. 3. Formation: une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Anesthésie et Analgésie : durant la chirurgie, les animaux sont placés sous anesthésie et reçoivent des injections d’analgésique afin de limiter les douleurs et leurs stress lors de la procédure. 5. Points limites : Des points limites adaptés ont été définis afin de mettre fin à l’expérience si un animal dépasse ce seuil fixé.

Choix des espèces

Pour cette étude seront utilisés des souris. Ces souris sont utilisées dans la recherche sur le cancer du poumon en raison de leur capacité à développer le processus étudié (cancer du poumon) induit par les lignées tumorales pulmonaires. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge, la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l'inoculation de cellules.

235 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une à deux chirurgies cérébrales pouvant durer quatre heures, des injections répétées et des enregistrements tête fixée qui les immobilisent, certaines étant isolées. Le projet étudie le rôle de neurones du cervelet dans l'apprentissage spatial, bénéfices thérapeutiques renvoyés au long terme. Le porteur affirme qu'analyser en parallèle le comportement et l'activité neuronale est "indispensable" et possible seulement chez l'animal vivant.

Objectifs

Le but de ce projet est d'examiner la fonction de neurones du cervelet dans l’apprentissage d’une tâche cognitive complexe de navigation spatiale orientée vers la récompense. Il a été montré chez l'Homme et la souris que ce type de tâche met à contribution le cervelet. Ces neurones participent à l'activité que le cervelet exerce sur le reste du cerveau. Nous mettrons au point des outils génétiques afin d’interférer avec leur activité, et modifier l'influence du cervelet pendant un apprentissage. L’efficacité d’expression des outils sera validée in vitro puis in vivo. L'évolution des performances d'apprentissage sera comparée entre les souris exposées à la stimulation et contrôles. En parallèle à l’étude comportementale, nous étudierons le rôle des neurones dans les mécanismes de plasticité synaptique dans le cortex cérébelleux in vitro. Cette étude nous permettra de mieux comprendre le rôle du cervelet et les mécanismes cellulaires de l’apprentissage in vivo et in vitro. Les protocoles seront optimisés afin de respecter les devoirs de Réduction et Raffinement et pour assurer l'absence de douleur. La surveillance continue de l'animal permettra d'arrêter toute procédure expérimentale lorsque l'animal montre des signes d’anxiété. Les procédures visent à optimiser le confort des animaux et réduire le nombre d'animaux utilisés. L'optimisation des soins aux animaux nous permettra d'utiliser certains animaux pour plusieurs sessions d'enregistrement.

Bénéfices attendus

Comprendre les mécanismes neuronaux qui sous-tendent des fonctions cognitives complexes telles que la navigation est un des enjeux majeurs de la recherche en neuroscience. Il contribue à appréhender le fonctionnement du cerveau en conditions normales et par conséquent, il aide à mieux cibler les altérations qui se présentent en conditions pathologiques et à long terme développer des thérapeutiques.

Procédures

Un lot de souris sera soumis à une chirurgie qui durera 2h, un deuxième lot sera soumis à deux chirurgies de 2h et neuf injections intrapéritonétales (une injection par jour) et un troisième lot sera soumis à une chirurgie de 2h puis une chirurgie de 4 h et douze injections intraperitonéales (1 injection par jour).

Impact sur les animaux

Les souris subiront plusieurs chirurgies. Elles sont donc susceptibles de ressentir de la douleur postopératoire. Certaines seront utilisées pour des enregistrements avec tête fixée ce qui peut engendrer un stress car elles ne sont alors pas libres de leurs mouvements. D’autre part, il sera parfois nécessaire d’isoler un animal, ce qui peut aussi engendrer du stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort soit pour prélèvement du cervelet, soit pour analyser l'expression des outils génétiques dans le cervelet et l'implantation des électrodes.

Remplacement

Afin de comprendre le rôle des interneurones dans le comportement moteur il est indispensable d'analyser le comportement et l'activité des neurones en parallèle. Ceci est possible exclusivement chez un animal vivant. Les études in vitro et les animaux invertébrés ne permettent pas l'étude des comportements complexes ; la souris est donc l'espèce la plus appropriée pour ce type d'études.

Réduction

Le nombre d'animaux prévu est inspiré du nombre d’animaux utilisé dans des travaux précédents de l’équipe et est réduit au minimum pour nous permettre de générer des données statistiques solides

Raffinement

Les procédures tiennent compte des temps de récupération et du nombre de tests pour réduire le stress et la fatigue des animaux. Les animaux sont placés dans des cages au format réglementaire, en communauté de 2 à 5, dans des conditions d’hébergement contrôlées (12:12 h cycle jour/nuit, 22°C ± 2°C, humidité de 50%). L’eau, la nourriture et du matériel de nidification, seront placés dans chacune des cages. Lorsque la procédure nécessite l’isolement d’un animal, un jouet d'exploration supplémentaire (cube, tunnel ou abri) est placé dans la cages de manière à lui offrir plus d’enrichissement. Les animaux sont suivis quotidiennement par les mêmes manipulateurs afin de réduire leur stress au maximum. Toutes les conditions sont réunies pour prendre en compte la douleur de l’animal (anesthésie, analgésie, suivi post-opératoire). Des points limites sont définis et un suivi régulier des souris par un personnel qualifié sera réalisé après chirurgie à l’aide de grilles d’évaluation (étude du comportement, du poids et de l’apparence). Des méthodes seront mises en place pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies pour trois raisons : - la taille de l’animal qui permet son installation sur le poste d’observation dont le laboratoire dispose et sur les postes de travail. - la disponibilité de souches de souris transgéniques nécessaires à ce projet. - nos études comportementales ont été validées sur des souris. Par soucis de reproductibilité nous souhaitons poursuivre avec la même espèce. Le projet porte sur l'étude des réseaux neuronaux à l'âge adulte. Les animaux seront utilisés à partir de P30 afin de préparer l'expérimentation et jusqu'à 3 mois.

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime riche en graisse induisant l'obésité, isolées en cage individuelle pour la calorimétrie, puis testées pour la tolérance au glucose et à l'insuline avec prélèvements sanguins avant la mise à mort. Le projet étudie le rôle d'une enzyme dans les troubles métaboliques liés à l'obésité, applications thérapeutiques annoncées au conditionnel. Le porteur affirme qu'il faut étudier ces mécanismes "dans un organisme vivant" et qu'"aucune méthode alternative" n'existe.

Objectifs

L’obésité́ et le diabète de type 2 sont des problèmes majeurs de santé publique. Au cours des dernières décennies, de nombreuses études ont montré́ que les cellules immunitaires dans le tissu adipeux viscéral (TAV) des patients obèses sont responsables d’une inflammation chronique. Celle-ci serait largement impliquée dans le développement des désordres métaboliques et cardio-vasculaires compliquant l’obésité́. En particulier, la transformation de cellules immunitaire anti-inflammatoires, abondants dans la TAV maigre, en cellules immunitaires pro-inflammatoires dans le TAV obèse, conduirait à la production de médiateurs de l’inflammation et jouerait un rôle majeur dans cette inflammation chronique. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsable de cette inflammation sont encore méconnus. Les identifier permettrait de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre les syndromes métaboliques et l’obésité́. Nous avons observé́ que la déficience en une enzyme impliqué dans la dégradation de l’ADN libéré́ par les cellules mortes rend les souris plus susceptibles au développement du syndrome métabolique induit par l’obésité́. L’absence de cette enzyme augmente la capacité́ de l’ADN libéré́ par les cellules mortes, qui s’accumule au cours de l’obésité́, à activer les réponses inflammatoires causant le syndrome métabolique. Notre objectif est d’évaluer le métabolisme énergétique des souris déficientes en cette enzyme.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de mettre en évidence comment la DNase1L3 contribue aux troubles métaboliques induits par l’obésité. Ainsi notre projet pourra conduire aux développements de nouvelles approches thérapeutique basées sur la supplémentation en DNase1L3 afin de limiter l’inflammation chronique induite par l’obésité mais aussi aux troubles métaboliques induite par celle-ci.

Procédures

Déroulement de la procédure : • Acclimatation/habituation (semaine 1) • 1ère séance de calorimétrie (semaine 2-4) • 1ère analyse de la composition corporelle (semaine 4, l’analyse dure environ 3 min par souris) • Exposition au régime riche en graisse (semaine 4-14) • 2ème séance de calorimétrie (semaine 15-16) • 2ème analyse de la composition corporelle (semaine 15) • Test de tolérance au glucose (semaine 16) • Test de tolérance à l’insuline (semaine 17) Nous réaliserons un seul test de tolérance au glucose et un seul test de tolérance à l’insuline. Pour les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, nous réalisons des prélèvements sanguins au niveau de la queue des souris. Le volume de sang nécessaire est limité (inférieur à 1% du volume sanguin total). Un délai d’une semaine minimum est respecté entre chaque test.

Impact sur les animaux

Dans notre étude, les animaux seront isolés à l’âge adulte. Cet isolement est nécessaire pour quantifier la consommation de nourriture de chaque animal et réaliser les mesures de calorimetrie indirecte. Afin de compenser le manque d’interactions sociales et le possible stress d’isolation, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. Afin de réduire au maximum le stress ressenti par les animaux nous réalisons une période d’habituation de 2 semaines des animaux aux expérimentateurs. De plus les animaux seront manipulés et pesées quotidiennement ou de façon hebdomadaire (période d’induction de l’obésité), nous pourrons donc détecter très rapidement toute modification comportementale. Les souris exposées au régime riche en graisse peuvent développer des dermatites, bien que cela soit très rares chez la souche de souris utilisée dans cette étude.

Devenir

Toutes les souris utilisées dans ce projet seront mises à mort à la fin de l'expérience pour récupérer du sang et des tissus afin de réaliser des études biochimiques et moléculaires complémentaires.

Remplacement

Le but de ce projet de physiologie intégrée est de comprendre les bases biologiques de la régulation de la balance énergétique et les mécanismes physiopathologiques menant aux désordres métaboliques, en particulier l’obésité. Dans ce contexte, de nombreuses structures cérébrales entrent en jeu et communiquent, non seulement entre elles, mais aussi avec les organes périphériques (foie, muscles, tissu adipeux…). Il est donc nécessaire d’étudier ces phénomènes dans un organisme vivant. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative ou substitutive permettant de répondre à ce type de question par un remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons utilisé un test de puissance pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquements (21 animaux par groupe).

Raffinement

1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 9 semaines. Ils seront manipulés pendant 2 semaines. Cette habituation, permettra de diminuer le stress des animaux en réponse aux expérimentateurs. 2) L’évaluation de la prise alimentaire et des paramètres de calorimétrie indirecte nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement se compose de frisure de papier kraft et de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et d’un tunnel en carton pour se cacher et réaliser le transfert et la manipulation des animaux. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis, ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, les attitudes, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant) et de décider si l'animal peut être maintenu dans l'étude ou s'il doit être mis à mort afin d'éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le comportement alimentaire, la balance énergétique et le métabolisme glucidique et lipidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire et de la balance énergétique fait de la souris un bon modèle prédictif. Toutes les souris de cette étude seront étudiées à l’âge adulte, âge qui correspond à un stade où les circuits neuronaux contrôlant la prise alimentaire sont matures.

360 souris et 360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie cérébrale leur implante des canules profondes, suivie de sessions de prélèvement de trois à quatre heures reliées par des câbles et d'un isolement post-opératoire. Le projet mesure l'effet de candidats médicaments sur l'activité cérébrale, le porteur qualifiant la technique de "translationnelle". Il affirme que les cultures de neurones ne suffisent pas et que le retrait de la canule laisserait des lésions "non compatibles avec une vie dans de bonnes conditions".

Objectifs

La concentration de molécules (e.g. neurotransmetteurs) spécifiques dans des régions cérébrales précises est modifiée dans certaines conditions psychiatriques ou neurologiques ; étudier ces facteurs peut informer sur l'efficacité de candidats traitements dans le traitement de ces pathologies, ou sur leur mécanisme d'action. Le projet consiste à évaluer l'effet de nouveaux candidats médicaments sur l'activité métabolique cérébrale chez le rongeur. La méthode de microdialyse cérébrale peut être réalisée sur animal anesthésié ou vigile. Cette méthode consiste à recueillir et à analyser certaines substances chimiques présentes dans le milieu extra cellulaire interstitiel du parenchyme cérébral. Outre l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapies, la microdialyse cérébrale peut aider à la compréhension d’événements neurologiques.

Bénéfices attendus

La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions ainsi que l’espérance de vie des patients atteints de maladies neurologiques. La technique de microdialyse est une méthode translationnelle qui permet d'évaluer l'effet de nouvelles substances pharmacologiques sur les concentrations de substrats cérébraux telles que des neurotransmetteurs ou des acides aminés sans avoir recours à une extraction tissulaire. Cette méthode permet de mieux comprendre les relations entre neurotransmission et modifications comportementales chez le petit animal.

Procédures

La collecte de dialysats cérébraux nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (entre 1h et 1h30) afin de placer la ou les canules dans des régions cérébrales situées en profondeur. Lors de la collecte des microéchantillons ou dialysats, les animaux sont reliés à une seringue et un collecteur de fraction par l'intermédiaire de câbles/cathéters en polyéthylène (les durées de sessions de perfusion/prélèvement sont en général de l'ordre de 3 à 4 h). Les animaux recevront des administrations de candidats traitements en général par bolus (durée de l'ordre de la seconde), de manière aigue ou chronique.

Impact sur les animaux

Des douleurs peuvent être liées à l'implantation d'électrodes au niveau cérébral (ces animaux seront placés sous traitement analgésique qui sera adapté sous contrôle vétérinaire). Suite à la chirurgie, les animaux sont isolés pour protéger la canule de microdialyse (cependant, ils gardent un contact visuel, sonore et auditif avec leurs congénères). Les animaux peuvent perdre du poids ou une plaie peut se former au niveau de la zone d'implant en raison d'une infection post-chirurgicale. Lors du test, les animaux sont connectés pendant plusieurs heures à des cables pendant la diffusion du perfusat et la collecte du dialysat suite à l'administration d'une substance pharmacologique.

Devenir

Les rongeurs seront euthanasiés à la fin des expériences car des prélèvements de tissu (cerveau) seront réalisées, pour dosage de biomarqueurs ou pour vérifier le placement de la sonde. De même, le retrait de la canule implantée pourrait entraîner des lésions non compatibles avec une vie dans de bonnes conditions.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, des modèles alternatifs ont été développés au laboratoire mais ne permettent de mesurer que la présence de certaines molécules secrétées par des cultures primaires de neurones. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi d'évaluer l'effet de substances pharmacologiques sur l'activité métabolique cérébrale.

Réduction

Les analyses statistiques seront affinées pour utiliser le nombre minimum d'animaux; les tests qui seront appliqués ne sont pas encore connus (mise en place de la technique), des études de variabilité et d'homogénéité seront réalisées pour déterminer les analyses les plus pertinentes (paramétriques ou non paramétriques). Des prélèvements de sang ou d'organes peuvent être également ajoutés à la fin des expériences pour compléter les analyses et éviter l'utilisation d'autres animaux.

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Les animaux reçoivent un traitement analgésique général au début de la chirurgie puis pendant 48 h et un traitement analgésique local supplémentaire pendant la chirurgie. Lors de la chirurgie, l'implantation d'une canule peut induire une hémorragie. Si cette dernière ne peut être maitrisée, l'animal sera euthanasié. Suite à la chirurgie, les animaux vont être pesés quotidiennement pendant 48 heures pour évaluer leur récupération. Un rat montrant une perte de poids supérieure à 15%, des signes de souffrance (poil hérissé, manque de toilettage) ou une atteinte locomotrice (démarche anormale, chutes...) sera euthanasié. Les conditions d'hébergement sont également optimisées avec la présence d'un enrichissement adapté (bois à ronger par exemple). Les animaux isolés sont hébergés dans des cages transparentes leur permettant de voir, sentir et entendre leurs congénères. Dans certains modèles, l'activité métabolique permet de compléter l'analyse comportementale et raffiner le modèle. Il arrive que l’animal se gratte au niveau de l’implant, endommageant les tissus autour de l’implant. Dans ce cas, l’animal est désinfecté quotidiennement avec une solution antiseptique. Un antibiotique peut être administré, le cas échéant.

Choix des espèces

Les études de mesure de l'activité métabolique cérébrale sont effectuées chez le rongeur (souris ou rat) car ces modèles sont translationnels. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est souvent lié aux études préalablement réalisées (études de pharmacocinétique par exemple) et à la disponibilité de la molécule. On utilisera de préférence la souris lorsque la molécule est en quantité limitée. Le choix de l'espèce peut aussi être lié au modèle expérimental choisi. Par exemple, certains modèles mimant la maladie de Parkinson ont été préférentiellement développés chez le rat. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique).