Souris
Caractérisation de l’effet d’un régime hyperlipidique sur le remodelage et la fonction cardiaques (CardiaTeam)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime hyperlipidique ou contrôle pendant cinq à quinze semaines, à des tests de tolérance au glucose et à l'insuline pouvant provoquer des signes d'hypoglycémie, puis à une échocardiographie avant euthanasie et collecte d'organes. Le projet vise surtout à tester la reproductibilité entre laboratoires européens de données sur le cœur des souris obèses. Le porteur affirme que les systèmes cellulaires ne reproduisent pas les régulations neuro-hormonales et conclut qu'un modèle animal est "indispensable".
Objectifs
Le projet consiste en une analyse de modèles murins avec études histologiques de divers tissus d'intérêt (cœur, rein, foie, tissu adipeux) visant à : 1/ Comparer la reproductibilité entre différents laboratoires européens des données à l'aide d'un protocole standardisé et unique sur des modèles murins de diabète de type 2 induit par l'obésité, et 2/ Mettre en place une biobanque d'échantillons sanguins et tissulaires pour réaliser des analyses multi-omiques
Bénéfices attendus
Ce projet vise à tester la reproductibilité de ces données en comparant dans différents laboratoires en Europe l'impact d'un régime hyperlipidique chez les souris mâles et femelles sauvages sur la structure et la fonction cardiaques, ainsi que l'évaluation métabolique et l'impact sur d'autres organes (foie, rein, tissu adipeux).
Procédures
La moitié des animaux du projet sera soumise à un régime contrôle de 5 semaines ou de 15 semaines. L'autre moitié des animaux sera soumise à un régime hyperlipidique de 5 semaines ou de 15 semaines. A la fin du protocole expérimental, tous les animaux seront soumis à des tests métaboliques (tests de tolérance au glucose et à l'insuline) ainsi qu'à des analyses échocardiographiques, avant euthanasie et collecte de sang et d'organes. Les tests métaboliques seront réalisés une fois au début du régime et une fois à la fin du protocole. Les mesures seront réalisées à différents temps post-injection : t0, 15, 30, 60, 90, 120 minutes pour une durée de quelques secondes chacune. Les échocardiographies seront réalisées une fois à la fin du protocole expérimental (environ 15 min par animal).
Impact sur les animaux
Certains animaux sont susceptibles de présenter des signes cliniques d’hypoglycémie durant les tests métaboliques (ex. inactivité, yeux fermés, posture prostrée, tremblements, froid au toucher) ou encore une glycémie ≤ 3 mmol/l.
Devenir
A la fin du protocole expérimental, les animaux seront euthanasiés afin de procéder à une collecte multi-organes.
Remplacement
Pour ce type de projet visant à étudier l'impact de troubles métaboliques sur le remodelage et la dysfonction cardiaque, l'utilisation de modèles animaux est indispensable. Des modèles cellulaires seront utilisés en complément (cardiomyocytes de rats nouveau-nés, lignée cellulaire H9C2) afin de valider certaines cibles/voies métaboliques. En revanche, ces systèmes simplifiés ne récapitulent pas toutes les régulations neuro-hormonales d'un organisme complet, dont le rôle dans les régulations métaboliques est bien connu. En ce sens, un modèle animal est indispensable.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au maximum en prenant en compte de l’apparition d'altérations et de la mortalité liée au vieillissement des animaux et suite à la mise sous régime HFD selon les données de la littérature. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous réaliserons toute une série de collecte de données sur une même souris (sang, urine, fécès, organes). Avant sacrifice, des méthodes non invasives seront réalisées (tests cognitifs, échocardiographies, mise en cage métabolique) pour obtenir des informations sur plusieurs thématiques et disciplines (cardiaque, métabolique, physiologique, etc.). Après sacrifice, le sang sera prélevé à la veine cave et un grand nombre d’organes seront récupérés. Ce protocole permettra ainsi d’extraire un maximum de données sur le même animal et d’en réduire leur nombre.
Raffinement
Les animaux seront hébergés et pris en charge selon la règlementation en vigueur. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 4 fois par mois. Du coton ou du sopalin sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentations font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les souris seront au nombre de 5 par cage, et suivies quotidiennement afin d'identifier le plus précocement possible tout signe de souffrance ou de stress : apathie, prostration, perte de poids >20% (les souris seront pesées à leur arrivée puis toutes les semaines), agressivité, difficultés de déplacements. Pour améliorer le quotidien des souris, des matériaux de litière ou des structures de repos adaptés seront installés dans les cages (mouchoirs en papier, rouleaux en cartons, …).
Choix des espèces
Le développement de pathologies est un processus complexe et intégré qui est mieux reproduit dans un modèle animal. Par exemple, la mise en place de pathologies cardiaques fait intervenir des systèmes hormonaux, neuro-hormonaux, des adaptations circulatoires, centrales, métaboliques, etc., si bien que seul un système intégré in vivo permet de reproduire toutes les composantes. En outre, l'obésité étant un facteur de risque connu de dysfonction cardiaque chez l'Homme, il est intéressant de mettre en place des conditions expérimentales (facilement réalisables chez l’animal) pour étudier ces processus chez l’animal. Le modèle "souris" permet d’étudier ce phénomène dans un laps de temps court (quelques mois) et il permet l’utilisation de conditions expérimentales simples à mettre en place (régime HFD) afin d'induire ce processus, permettant des analyses précises. Les souris auront 5 mois au début de l'étude, âge auquel le développement cardiaque est terminé.
Modélisation du système à MCH (Hormone de Concentration de la Mélanine) impliqué dans l’Obesité
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
2048 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, dont 238 en gravité sévère. Elles subissent des prélèvements sanguins répétés au bout de la queue, un régime gras, une privation de nourriture pouvant faire perdre 10 % de leur poids, des injections intrapéritonéales et intracrâniennes après implantation d'une canule dans le cerveau. Le projet utilise des souris "humanisées" exprimant un récepteur humain pour étudier son rôle dans l'obésité, avec des applications thérapeutiques formulées au conditionnel. Le porteur affirme que l'étude du comportement alimentaire nécessite un système intégré impossible à modéliser in vitro.
Objectifs
La prévalence de l'obésité s'accroit de façon alarmante en France et dans le monde, provoquant de nombreuses maladies (diabètes, maladies cardiovasculaires, cancers) et augmentant le risque de complications lors d'infections. Chez l'humain l'obésité résulte d'un dérèglement du contrôle de l'appétit au niveau du système nerveux central. En prenant comme modèle expérimental la souris et le rat, il a été démontré qu’une molécule de signalisation inter-cellulaire, le MCH (hormone de concentration de la mélanine) est un régulateur essentiel du comportement alimentaire et de l'équilibre énergétique. Chez les rongeurs, son action est médiée par un seul récepteur appelé MCHR1 alors que chez l'homme il existe un deuxième récepteur, le MCHR2. Ce second récepteur n'étant pas exprimé chez les rongeurs, nous ne pouvons pas établir facilement son rôle dans la régulation du comportement alimentaire. Nous avons donc développé au laboratoire un modèle de souris "humanisée" qui exprime le second récepteur. Possédant également une lignée de souris transgénique n'exprimant plus le récepteur 1, nous avons également généré par croisement des souris nous permettant d'explorer le rôle du second récepteur en absence du premier. Une première caractérisation de la lignée exprimant le récepteur 2 a été initiée précedemment. L’objectif primordial de ce projet est d'identifier, chez l'humain, la contribution du réseau MCH dans le comportement alimentaire et les maladies métaboliques dues à l'obésité, en utilisant différentes approches (études métaboliques après différents régimes, colocalisation des récepteurs à MCH et de certains neuropeptides dans le cerveau, étude du transcriptome sur cellules uniques de différentes régions cérébrales avant et après régime obésogène, utilisation d’outils pharmacologiques).
Bénéfices attendus
Notre projet devrait permettre de mieux comprendre l'implication du récepteur à la MCH de type 2 dans la régulation de la prise alimentaire et dans la survenue de l'obésité chez l'homme. Cette meilleure compréhension pourrait contribuer à l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la lutte contre l'obésité et contre les maladies
Procédures
432 souris seront nourries pendant 12 semaines par un régime standard ou un régime riche en lipides.- 720 souris subiront des prélèvements sanguins répétés (7 prélèvements au bout de la queue par session, 4 sessions). Ces 720 animaux suivront un régime standard ou riche en lipides, pendant 12 semaines. Ils seront placés dans des cages individuelles pendant 5 jours afin de subir des analyses du métabolisme. 12 semaines plus tard, ils seront à nouveau soumis à ce protocole d’analyse métabolique - 360 souris seront soumises pendant 4 semaines à une légère privation de nourriture (pouvant provoquer une perte de 10% de leur poids) - 60 animaux subiront des injections intrapéritonéales (quelques secondes d'injection) puis un prélèvement sanguin de 100µl sera effectué à 15 minutes, 30 minutes, 1h, 2h , 4h et 6h après l'injection; les animaux seront laissés au repos dans leur cage pendant une semaine avant qu'une nouvelle injection soit effectuée juste avant la mise à mort. -78 animaux seront mis à jeun pendant 5h avant d'être injectés en intrapéritonéale. La même expérience sera réalisée sur 78 animaux ayant subi une implantation de canule intra crânienne: après une semaine de récupération post opératoire, l'injection sera réalisée via la canule . De la même manière 320 animaux dont la moitié aura suivi pendant 12 semaines un régime gras recevront une injection, pour moitié par voie intrapéritonéale, pour moitié par voie intracrânienne. 3 jours avant les injections, les animaux seront isolés dans des cages individuelles permettant une analyse métabolique, mis à jeun pendant 5 heures avant l'injection puis leur métabolisme analysé pendant 24 heures.
Impact sur les animaux
Notre projet comprend 1 procédure légère, 2 procédures modérées et 2 modérées ou sévères. Les nuisances attendues sur les animaux sont de deux ordres: - 1/ nuisance psychologique / stress : l'analyse de l'activité métabolique de nos souris nécessite que nous les isolions très transitoirement (120h) dans des cages spécifiques - 2/ douleur: elle pourra résulter des gestes chirurgicaux et des techniques de prélèvements sanguins que nous avons prévus. Néanmoins toutes les dispositions obéissant aux bonnes pratiques dans ces champs expérimentaux seront prises: anesthésie, administration d'antalgiques, prélèvement terminal sur animal anesthésié immédiatemen suivi de la mise à mort.
Devenir
Tous les animaux participant à ce projet seront mis à mort à la fin des procédures. Cela est nécessaire pour 2 raisons. Soit des tissus seront récupérés post-mortem à des fins d'analyse cellulaire et moléculaire. Soit la mise à mort est nécessaire car ils auront exécuté une tâche comportementale et ne seront plus utilisables dans d'autres projets (les animaux doivent être naïfs pour la très grande majorité des études réalisées, de plus le génotype particulier de cetaines de nos souris les rendent inutilisables dans d' autres projets que les nôtres) ou en tant que reproducteurs (l'animalerie où l'élevage est fait dans notre institut à un statut sanitaire plus élevé que celui de l'animalerie où sont réalisées les analyses comportementales, un retour des animaux de la seconde vers la première est donc impossible).
Remplacement
Remplacement : L’étude du comportement alimentaire et de la mise en place de l'obésité nécessite un système intégré affectant simultanément plusieurs tissus (foie, tissus adipeux, pancréas, muscles et cerveau). Notre étude doit donc nécessairement se faire sur l’animal entier et n’est donc pas pour l'instant modélisable in vitro ou sur des cellules en culture
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans chaque procédure est calculé par analyse prédictive afin d’utiliser uniquement le nombre nécessaire. Dans certaines procédures, nous n’utiliserons que les mâles, afin de réduire le nombre de souris utilisées. En revanche, chez certaines de nos lignées de souris génétiquement modifiées, les femelles sont plus stressées que les mâles. Le stress jouant un rôle très important dans la prise alimentaire, nous réaliserons certaines de nos expériences sur des mâles et des femelles afin d'étudier les différences en fonction du sexe.
Raffinement
L'impact de l' isolement des souris en cages métaboliques est atténué par le fait que les souris seront proches les unes des autres (contact visuel, olfactif et sonore), que leur cages expérimentales seront de grandes dimensions et que ces cages présenteront un bon niveau d'enrichissement (litière au fond de la cage, mangeoire, biberon et maisonnette suspendus qui offrent des occasions accrues d'interaction avec l'environnement). Les souris hébergées en cage individuelle en cycle inversé auront à disposition une plus grande quantité de ouate afin de minimiser le phénomène d’hypothermie. L'état des souris est suivi quotidiennement grâce à la mise en place d'une grille de score, l'utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance (utilisation d’analgésique, mise à mort) . Toutes les souris utilisées pour les expériences de comportement alimentaire seront mises à mort en fin de procédure afin que des prélèvements de différentes aires cérébrales et tissus périphériques (tissus adipeux, foie, pancréas) soient réalisés.
Choix des espèces
Pour déterminer le rôle du MCHR2 et élucider son mode d’action, l’utilisation du modèle primate est très compliquée tant d’un point de vue éthique que financier et pratique. Le modèle murin est donc apparu comme le modèle adéquat tant pour sa facilité d'utilisation (natalité importante, faible coût d'élevage), que la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l'homme qui nous permettra de tirer des conclusions extrapolables à l'homme. Notre animalerie agrée nous permet d'avoir des locaux d'hébergement et des conditions d'expérimentation appropriés à ce modèle et nous disposons des lignées de souris transgéniques nécessaires à l'aboutissement de ce projet. De plus, tous les tests sur le comportement alimentaire et les tests métaboliques associés utilisés dans ce projet, sont des tests reconnus et bien caractérisés dans la littérature pour le modèle murin. Pour cette étude nous avons choisi d’utiliser des souris jeunes adultes soit à partir de 12 semaines. L’utilisation de souris trop jeunes (40 semaines) aboutiraient à des résultats peu exploitables au vue des changements métaboliques et comportementaux en fonction de l’âge de la souris.
Microbiote tissulaire pour ralentiret le déclin cognitif associé à l’âge : rôle du processus de senescence des cellules progénitrices du tissu adipeux et cérébral
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
504 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections abdominales et une transplantation de microbiote fécal de patients obèses, subissent une privation de nourriture d'environ 24 heures et des tests comportementaux (conditionnement de peur, suspension par la queue), avec des prélèvements sanguins répétés au bout de la queue. Le projet étudie l'effet du microbiote sur le déclin cognitif lié à l'âge, avec des stratégies thérapeutiques annoncées comme perspective. Le porteur affirme que seul un modèle de souris axénique permet d'isoler l'effet du microbiote transplanté.
Objectifs
Etudier le rôle du microbiote sur les performances cognitives et émotionnelles des souris et ainsi développer des nouvelles stratégies thérapeutiques visant à ralentir le déclin neurocognitif associé à l'âge.
Bénéfices attendus
Le projet devrait ouvrir la voie au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant le microbiote dans le but prévenir ou traiter le déclin cognitif et les troubles émotionnels liés à l’âge. Ces stratégies sont intéressantes car elles visent à bloquer un mécanisme de mort cellulaire commun à tous les organes et qui est associé au vieillissement : le processus de senescence.
Procédures
Au début de la période expérimentale, les souris recevront 3 injections dans l'abdomen afin d'étudier les cellules en division. Les animaux effectueront des tests de comportement pendant 4 semaines (6 tests légers et 1 test modéré) et seront soumis à des prélèvements sanguins à l'extrémité de la queue. Du sang sera prélevé une fois avant et une fois après (chaque fois 100 ul) l'injection d'un liquide contenant du glucose. En plus, une goutte de sang sera prélevée à 15, 30, 45, 60, 90 et 120 min après l'injection. Enfin les souris recevront une autre injection dans l'abdomen, afin de marquer une deuxième population de cellules en division. A la fin de l'expérience, les souris recevront une injection abdominale pour être euthanasiées.
Impact sur les animaux
1)Les quatre injections dans l'abdomen peuvent provoquer des effets aigus tels qu'une irritation respiratoire et cutanée. 2) Les souris devraient développer un comportement de peur se traduisant par une immobilité au cours du test de conditionnement à la peur d’une durée de 3 minutes.3) Les souris peuvent se sentir stressées pendant le test de suspension par la queue durant 6 minutes. 4) Les souris n'auront pas accès à la nourriture, mais à l'eau, pendant environ 24 heures. Cette procédure peut provoquer une perte de poids corporel chez les animaux. 5) Une goutte de sang sera prélevée au bout de la queue toutes les 15 minutes pendant 2 heures. Au cours de ce protocole, deux prise de 100 ul de sang supplémentaires seront réalisées. Un effet indésirable est l'endommagement de la queue et une douleur locale.
Devenir
Après tous les tests de comportement, les souris seront euthanasiées afin d'étudier l'anatomie du cerveau. Les associations entre les résultats anatomie des tissus et les fonctions cognitives ainsi que les états émotionnels seront évaluées pour comprendre comment l'anatomie du cerveau détermine leur fonction.
Remplacement
Notre étude vise à évaluer les effets de la transplantation de microbiote fécal humain sur les performances cognitives et émotionnelles de souris. Cela ne peut être fait que sur un modèle animal. Comme les animaux présentent un microbiote local, notre étude nécessite un modèle animal dans lequel ce microbiote résident est supprimé (c’est-à-dire, des souris axéniques). Celles-ci offrent la garantie de pouvoir étudier spécifiquement l’impact comportemental du microbiote transplanté. De tels modèles axéniques sont actuellement disponibles dans les espèces de souris. Nous proposons une approche unique et originale pour transplanter le microbiote fécal de patients obèses dans ce modèle de souris axéniques. Dans les études que nous réaliserons au laboratoire, nous serons amenés à tester ces souris axéniques transplantées et leur descendance pour lequel il a été montré une stabilisation du microbiote.
Réduction
Pour les études de comportement, notre expérience au laboratoire nous montre qu’un nombre minimum de 12 souris par groupe est nécessaire afin d'avoir un puissance statistique suffisante. Chaque animal sera soumis à l’ensemble des tests comportementaux proposés allant de procédures légères à modérées. Ceci permettra d'obtenir un maximum de données en utilisant un nombre minimum d'animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une structure et des conditions adaptées (litière changée régulièrement, eau et nourriture à volonté, température et hygrométrie régulée) avec une surveillance quotidienne. Les animaux bénéficieront également d’un enrichissement de leurs milieux (tube et tissus, permettant une diminution du stress potentiel et la réalisation de petits nids par les animaux). L'état de santé de l'animal sera contrôlé chaque semaine à l'aide d'une fiche d'évaluation qui comprend l'observation de l'état corporel, de l'état du pelage et de la peau, des écoulements, des yeux, de la bouche, de l'interaction sociale, de la posture, de la mobilité, des comportements indésirables. Si le score total est compris entre 4 et 7, les animaux seront étroitement surveillés de près et quotidiennement. Si les animaux ont des blessures ou montrent des signes de souffrance, des analgésiques une fois par jour sera utilisé pour minimiser la douleur. Les animaux seront observés quotidiennement s'ils atteignent les points finaux prédéfinis. Si le score total est supérieur à 8, un mode de soulagement sera prévu. En particulier, nous proposons d’observer plus régulièrement les animaux et éventuellement de considérer de les euthanasier. Au cours des procédures expérimentales, les souris recevront de intervalles suffisant (au moins un jour) entre chaque injection, et de plusieurs jours de repos après avoir effectué des tâches stressantes. Dans le cas où les souris perdraient plus de 10% de leur poids corporel, de la nourriture supplémentaire serait placée directement dans la cage. Les animaux seront surveillés et pesés avant et après la manipulation. Afin d'éviter la douleur due au prélèvement de sang, les souris recevront une pommade anesthésiante avant le prélèvement sanguin.
Choix des espèces
Afin d'étudier l'effet du microbiote, un modèle axénique sera nécessaire pour éviter les effets de la flore locale de l'animal hôte. Les espèces de souris axéniques sont actuellement disponibles. En plus, les modèles de souris sont des modèles bien adaptés à la recherche en neurosciences comportementales, car ils présentent une variété de comportements pertinents pour les maladies humaines. Ces tests seront effectués sur des souris à l'âge adulte. Pour les souris sauvages : 6, 12 et 18 mois ; les souris ayant des problèmes de mémoire: 3, 6 et 9 mois.
Phénotypage de mutants de souris génétiquement modifiés modélisant le syndrome Bosch-Boonstra-Schaaf optic atrophy (BBSOA)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pendant les quatre semaines du test TouchScreen, des souris mutantes reçoivent une eau acidifiée progressivement jusqu'à un pH de 2,3, et pour un autre test elles sont enfermées environ 45 minutes dans un cylindre, exposées à des sons allant jusqu'à 110 dB. 60 souris issues de trois lignées mutantes et de deux groupes témoins vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort en fin de projet pour des analyses histologiques et moléculaires. Elles subissent aussi l'implantation d'une puce sous la peau, puis, sous anesthésie, une tomographie par cohérence optique et une électromyographie par aiguilles avec stimulation électrique de 8 mA, ainsi qu'un suivi dans l'arène du Live Mouse Tracker. Les mutations étudiées sont celles du syndrome BBSOA, une maladie génétique rare de l'enfant, et le porteur renvoie les pistes thérapeutiques "à long terme". Il écrit avoir défini "des points limites éthiques", sans dire lesquels.
Objectifs
Les troubles neurodéveloppementaux (NDD) sont des maladies complexes et hétérogènes présentant des symptômes associés à un développement anormal du cerveau pouvant entraîner plusieurs déficits comportementaux, tels des troubles de l'attention/hyperactivité, les troubles du spectre autistique, une déficience intellectuelle, l'épilepsie ou encore les troubles d'apprentissage. Les NDD englobent plusieurs dysfonctionnements cérébraux développementaux, qui se manifesteront par des troubles neuropsychiatriques ou une altération de la fonction motrice, de l'apprentissage, du langage ou de la communication non verbale avec une grande variabilité et différents degrés de gravité. Des études récentes ont révélé un rôle essentiel du développement cortical embryonnaire dans la physiopathologie des NDD, mais la génétique et les mécanismes sous-jacents sont encore méconnus. En particulier, un gène joue un rôle crucial dans le développement du cerveau. Des mutations sur ce gène entraine l’apparition du syndrome Bosch-Boonstra-Schaaf optic atrophy (BBSOA), qui est une maladie génétique rare, décrite pour la première fois en 2014. Les patients présentent une multitude de symptômes neuronaux et comportementaux, y compris, un retard développemental, une déficience intellectuelle, un trouble du spectre autistique, un trouble déficitaire de l'attention avec hyperactivité, des convulsions, une déficience visuelle et auditive. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les mutations de ce gène peuvent causer le syndrome BBSOA. Certains des symptômes observés chez les patients BBSOA fournissent déjà des indices importants sur le rôle de ce gène dans le développement du cerveau. En outre, des corrélations entre la génétique et le comportement commencent à être caractérisées chez les patients atteints de BBSOA. Néanmoins il est nécessaire d’étudier de façon approfondie des modèles animaux qui permettront de reproduire les mutations génétiques décrites chez l’Homme. Au cours de ce projet nous caractériserons le comportement de 3 lignées de souris présentant des différentes mutations sur ce gène. Cela nous permettra de mieux comprendre comment les mutations contribuent aux différentes anomalies du développement neurologique chez les patients atteints du syndrome BBSOA.
Bénéfices attendus
Les troubles neurologiques du développement sont des maladies neuro-développementales qui impliquent un dysfonctionnement de l’apprentissage, la mémoire, la perception, le langage, la résolution de problèmes et/ou l’interaction sociale. Ces troubles sont principalement d’origine génétique et se manifestent au cours de la petite enfance. Ce projet de recherche expérimentale se focalise sur un gène dont le rôle clé pendant le développement cortical est bien connu et dont plusieurs mutations conduisent au syndrome appelé BBSOA. Les enfants atteints de cette maladie présentent des déficits cognitifs et comportementaux, des crises d’épilepsie au jeune âge et montrent des retards dans l’apprentissage et dans le langage. La majorité des patients (>80%) diagnostiquée présente des troubles du spectre autistique (TSA). Les études récentes à ce sujet ont permis de mettre en évidence des anomalies cérébrales, notamment dans les régions du cerveau impliquées dans le langage et l’abstraction. Pour approfondir la compréhension de l’impact fonctionnel des mutations de ce gène, le projet global vise à mieux caractériser les mécanismes dans le cerveau qui sous-tendent les déficits cognitifs des enfants malades. En particulier, cette étude comportementale qui sera comparée avec celle clinique permettra d’étudier l’impact fonctionnel des mutations du gène dans le contexte des TSA avec le but à long terme de déboucher sur des pistes thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Implantation sous-cutanée d'une puce sera faite sur les animaux. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique (durée = 30 minutes) - Injection intra-péritonéale d'anesthésique (durée = 5 secondes) (deux fois)*. -Tomographie par Cohérence Optique (durée = 10 minutes). - Electromyographie permettant la mesure neurophysiologique de la fonction motrice et sensorielle (durée = 10 minutes), insertion d'électrodes à aiguille + stimulation électrique (0,1 ms, 8mA). Les aiguilles sont insérées à travers la peau de l'animal à une profondeur de 1 à 2 mm. - Injection sous-cutanée d'antidote de l'anesthésique (durée = 5 secondes). -Consommation d'eau acidifiée lors du test TouchScreen (4 semaines). - Contention des animaux dans un cylindre fermé lors du test d'altérations des capacités de filtrage de l'information. Dans ce test des sons de 110 dB pour une durée de 40 msec et d'autres plus faibles (65-70-75-85-90 dB ; durant 10 msec) sont présentés à l'animal. Chaque type de stimulus est présenté 10 fois aléatoirement durant le test. Un intervalle de 20 sec sépare 2 stimuli. Avec 11 types de stimuli présentés 10 fois, une session dure environ 45 min.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une implantation d'une puce d'identification par radiofréquence en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse. Lors des périodes d'analyse du test Live Mouse Tracker, ils seront simplement transférés dans une arène de 50 cm de côté qui disposera de sciure, boisson et aliment qu'ils pourront explorer. Lors de la Tomographie par Cohérence Optique et de l'électromyographie ils auront une anesthésie chimique avec une injection intrapéritonéale. Pour le test du Touchscreen, l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test. . Il y une acidification progressive de l’eau (acide citrique 1,5%) de pH 7 à pH 2,3. Lors de la période précédant le test l’animal subit une habituation au lait fraise (12% de sucre) dans biberon pendant 15 min par jour ainsi qu’une variation du pH de 7 à 3 (semaine 1). Puis lors du test le pH varie de 2,8 à 2,3 (semaines 2 à 4). Pour le test d'altérations des capacités de filtrage de l’information, l’animal est placé dans un cylindre fermé.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de réaliser des analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Cette étude comportementale sera complémentaire d'études in vitro sur des cellules de patients BBSOA porteurs des différentes mutations. Ceci permettra de décrypter les anomalies cellulaires et moléculaires à la base du trouble du développement BBSOA. Néanmoins, la présence d’anomalies comportementales des patients ne pourra pas être reproduite in vitro et nécessite donc l’utilisation d’animaux pour mieux comprendre l’impact/ le lien des mutations sur le phénotype neurodéveloppementale.
Réduction
Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Nous utilisons une stratégie de croisement qui permet d'utiliser tous les animaux générés, et les mêmes animaux seront utilisés dans les différents tests comportementaux. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative. Enfin, pour réduire le nombre d’animaux seulement 2 groupes contrôles seront utilisés pour 3 groupes expérimentaux présentant des mutations.
Raffinement
Afin de réduire l'inconfort des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test, afin de réduire le stress auquel seront exposés les animaux. Des phases de récupérations entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. De la même manière lors de l'Electromyographie et de la Tomographie par Cohérence Optique une anesthésie sera faite pour éviter tout stress. Les animaux seront injectés en sous-cutané avec un antagoniste de l'anesthésique après les tests et placés sur une couverture chauffante (37°C) jusqu’à leur réveil. Les animaux seront ensuite replacés dans leur cage d’hébergement et surveillés quotidiennement.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris en raison de ses similarités génétiques avec l'Homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Grâce aux progrès des technologies de manipulation génétique, il est aujourd’hui possible d’introduire des mutations génétiques chez la souris et modéliser donc une maladie génétique humaine chez la souris. Les manipulations génétiques nous permettent de simuler in vivo des altérations de l’expression de gènes ou de la physiologie cellulaire, caractéristiques de pathologies humaines. La génération et l’analyse de ces modèles pourront nous être utiles dans la compréhension des mécanismes à la base de la maladie génétique et au développement de nouvelles thérapies. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes et âgés de 6 à 9 semaines. Cet âge a été choisi car le développement du cortex est terminé, mais ce dernier est encore plastique. De plus les systèmes visuels et auditifs sont aussi matures.
Récepteur purinergique P2X4R, autophagie, stéatose et fibrose hépatiques.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 370 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour prélever leurs organes. Certaines reçoivent pendant quatre mois un régime gras qui provoque surpoids et foie gras, d'autres entrent dans des protocoles qui installent une cirrhose progressive, dont l'un passe par une chirurgie de dix à quinze minutes sous anesthésie. Le projet vise à préciser le rôle du récepteur P2X4R dans la stéatose et la fibrose du foie, avec à terme l'espoir de "pistes de traitement" pour des maladies sans traitement spécifique efficace. Le porteur affirme que les régimes "n'entraînent aucune douleur ou autre nuisance", sans nommer ni l'intervention chirurgicale, ni les autres méthodes d'induction de la cirrhose, ni les molécules administrées, ni les procédures classées sévères.
Objectifs
Il s’agit de déterminer le rôle d'un récepteur (protéine spécifique) dans les maladies du foie au cours desquelles il existe une surcharge en graisse et une fibrose. Nous utiliserons plusieurs modèles expérimentaux permettant de mimer ces maladies chez la souris, ainsi que des molécules pouvant être administrées aux animaus afin de tester l'implication de ce récepteur. L'objectif est de mettre à jour de nouvelles pistes de traitement des maladies du foie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à déterminer le rôle d'un récepteur (protéine spécifique) dans lesmaladies du foie, en analysant son impact sur la stéatose et la fibrose. La persepective médicale est de définir une ou des pistes de traitement liées à cette protéine. En effet à ce jour aucun traitement spécifique de ces patholopgies du foie n'est efficace.
Procédures
Dans ce projet les animaux sont nourris avec des régimes spéciaux pouvant induire un foie gras associé à un un surpoids (régime gras pendant 4 mois, autres régimes durant 2 à 7 semaines), qui n'entraînent aucune douleur ou autre nuisance. D'autres souris entreront dans des protocoles expérimentaux entrainant le développement progressif d'une cirrhose du foie, dont la nuisance essentielle est la perte de poids corporel qui sera surveillée 2 fois par semaine. Pour induire la fibrose du foie, un des modèles expérimentaux est chirurgical (10 à 15 minutes par intervention), pratiqué sous anesthésie générale par un opérateur entrainé, encadré par des traitements antalgiques prévenant toute douleur post-opératoire. Les prélèvements se font sur les souris après leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Dans ce projet les animaux sont nourris avec des régimes spéciaux pouvant induire un foie gras associé à un un surpoids (régime gras), qui n'entraîne aucune douleur ou autre nuisance. D'autres souris entreront dans des protocoles expérimentaux entrainant le développement progressif d'une cirrhose du foie, dont la nuisance essentielle est la perte de poids corporel qui sera surveillée 2 fois par semaine.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, pour prélèvement des organes nous permettant d'évaluer l'efficacité des traitements utilisés sur les maladies du foie mimées chez ces souris.
Remplacement
Nos projets visent à étudier des mécanismes intégrés au sein de l'organisme et du tissu hépatique conduisant à la surcharge du foie en graisses et à la fibrose. Nos protocoles utilisent à la fois des méthodes in vitro (cultures cellulaires) et in vivo (souris), de façon complémentaire. Les approches in vivo chez la souris restent indispensables dans la perspective médicale de tester un récepteur spécifique comme cible thérapeutique des maladies hépatiques stéato-fibrosantes.
Réduction
Une bonne programmation des expériences, avec réflexion anticipée et approfondie concernant les tissus à prélever, les conditions de prélèvement, ainsi que le nombre minimal de souris à inclure dans chaque groupe expérimental, permettent d’éviter la répétition inutile des expériences. Le nombre d’animaux utilisés est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables
Raffinement
Toutes les souris sont hébergées en cages de 4 à 5, l'environnement est systématiquement enrichi (tubes PVC et petites maisons). La consistance du régime riche en graisses étant assez pâteuse, un morceau de bois est placé dans la cage des souris soumises à ce régime afin de s’assurer que les souris puissent continuer de ronger. Durant les 4 mois de régime, ou au cours des autres protocoles expérimentaux, les souris sont surveillées de près de façon à dépister tout signe de souffrance. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie, avec analgésie avant et après l'intervention. Une grille d’évaluation quotidienne de la douleur a été mise en place pour la surveillance des animaux en cours de procédure afin de s'assurer du bien-être animal.
Choix des espèces
La souris est le rongeur de choix pour l’étude de la surcharge lipidique et de la fibrose du foie, du fait de l’existence de modèles expérimentaux au point dans le laboratoire et de la possibilité de disposer de souris génétiquement modifiées. De plus, les mécanismes impliqués dans ces pathologies chez la souris sont proches de ceux observés chez l’Homme. Nous utilisons des souris prédisposées avec l’âge à une prise de poids et au développement d’une intolérance au glucose. Ces souris sous régime permettent donc d’étudier les complications hépatiques de la surcharge pondérale, responsable d'une partie de plus en plus importante des maladies du foie. Les souris entrent dans les protocoles expérimentaux entre 8 et 16 semaines d'âge en fonction des types de traitements.
Rôle du récepteur des glucocorticoïdes GR et de ses co-régulateurs SRC1 et TIF2 dans l’atrophie musculaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, et une partie d'entre elles reçoit un gavage chaque jour pendant un mois, précédé pour certaines de trois semaines de nourriture au tamoxifène et de cinq jours d'injections dans l'abdomen. Les glucocorticoïdes administrés, dexaméthasone pendant trois jours ou prednisone pendant un mois, doivent provoquer une fonte musculaire qui peut atteindre 20 % du poids du muscle, pour étudier le rôle de deux co-régulateurs du récepteur de ces hormones, supprimés dans le muscle d'une partie des souris. Le gavage peut provoquer des fausses routes, les injections des infections, et le porteur écrit : "Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques." Un test d'agrippement clôt les traitements, et l'espoir de réduire les effets indésirables des corticoïdes chez les patients reste au conditionnel, cette modulation "ouvrirait de nouvelles perspectives thérapeutiques" selon lui.
Objectifs
Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) sont des hormones exerçant différents effets chez les mammifères. Elles contribuent en particulier au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les composés comme la prednisone et la dexaméthasone sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme et certaines myopathies. Néanmoins, leur utilisation prolongée peut entrainer d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose ou l’atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont relayés par le récepteur des glucocorticoïdes appelé GR. Il est communément admis que GR une fois lié à son hormone est convoyé dans le noyau de la cellule, où il se lie à l’ADN pour activer ses gènes cibles. Il effectue cette tache en coopération avec d’autres protéines qui sont appelées des « corégulateurs ». L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de deux de ces corégulateurs dans l'atrophie musculaire dépendante des glucocorticoïdes en utilisant des souris dans lesquelles ils sont sélectivement supprimés dans le muscle squelettique.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle de deux corégulateurs du récepteur des glucocorticoïdes dans le muscle au cours de l'atrophie musculaire provoquée par les glucocorticoïdes. Contrôler l'activité du récepteur des glucocorticoïdes en modulant celle des co-régulateurs ouvrirait de nouvelles perspectives thérapeutiques pour réduire les effets indésirables causés par les traitements prolongés avec ces hormones.
Procédures
Les animaux pour lesquels la mutation doit être induite (groupe 1 et 2) seront traités au Tamoxifène par le biais d’une nourriture spécifique pendant 3 semaines, puis par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 3 sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 4 sera traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Un test d'agrippement sera réalisé une seule fois en tripicat sur l'ensemble des cohortes à la fin des traitements (30 sec/ souris) .
Impact sur les animaux
L’injection de tamoxifène et de dexaméthasone peut causer des infections. Le site d'injection sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. Le gavage peut conduire à des fausses routes. Les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de 20% du poids du muscle.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, même si des myotubes en culture peuvent être utilisés pour modéliser le muscle squelettique et connaitre les effets directs des glucocorticoïdes au niveau moléculaire, ils ne permettent pas de récapituler le microenvironnement musculaire ainsi que les nombreux facteurs et hormones intervenant dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant contribuer à ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence.
Réduction
De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.
Raffinement
Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L'injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.
Choix des espèces
Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et deux de ses co-régulateur dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux inductibles seront donc traités au tamoxifène entre 5 et 7 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection.
Etude de l’implication du microbiote dans les maladies inflammatoires chronique de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
2400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 960 en gravité sévère. Elles reçoivent des transferts de microbiote par voie intracolique ou orale, puis une colite est induite par un produit ajouté à l'eau de boisson, provoquant perte de poids, sang dans les selles et diarrhée. Les rubriques objectifs et bénéfices du résumé reprennent presque mot pour mot la même phrase sur la découverte de déterminants bactériens. Le porteur affirme que le recours à des souris axéniques est "obligatoire" pour établir le rôle du microbiote.
Objectifs
L'objectif est d'étudier l'implication du microbiote (sain ou pathologique) dans l'apparition de la colite. Cela permettra également la découverte éventuelle de déterminants bactériens responsables de l'apparition de ces maladies ou de leur aggravation afin d'envisager de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Cela permettra également la découvert éventuelle de déterminants bactériens responsables de l'apparition de ces maladies ou de leur aggravation afin d'envisager de nouvelles thérapies.
Procédures
Le projet comporte 3 procédures: 1- Transfert de microbiote par administration intracolique sous anesthésie gazeuse 2- Transfert de microbiote par voix orale sur souris vigile 3- Induction de la colite au DSS (ajout dans l'eau de boisson)
Impact sur les animaux
Perte de poids, apparition de sang dans les selles, diarrhée
Devenir
mis à mort
Remplacement
Il est maintenant largement admis que le microbiote intestinal joue un rôle essentiel dans la physiopathologie des maladies inflammatoires de l'intestin. Les interactions complexes entre la muqueuse de l'hôte et son microbiote impliquent des mécanismes qu'il est impossible de reproduire avec des études in vitro. L'utilisation d'animaux élevés en condition axénique est donc obligatoire pour élucider le rôle causatif des modifications du microbiote muqueux dans la physiopathologie des maladies digestives.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux. De plus, nous avons déjà validé certaines de nos approches expérimentales in vitro permettant d'optimiser l'utilisation des animaux. Les résultats actuels ont permis de valider que des lots de 10 souris permettent d'acquérir des données fiables. Les rongeurs utilisés sont consanguins et de même âge réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables.
Raffinement
Le bien-être de l’animal, outre les considérations éthiques, est aussi un facteur de variabilité expérimentale, qui est pris en compte et réduit grâce au suivi rapproché quotidien des animaux, l’enrichissement de leur environnement (coton ou sopalin afin qu'ils puissent faire un nid) et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). De plus une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant l'expérimentation. Les expérimentateurs ont reçu une formation garantissant également les bons gestes lors de la manipulation des animaux (livret de compétences). De plus les animaux seront pesés en début d'expérimentation puis de manière hebdomadaire. Au cours de la procédure 3 (colite au DSS), ils seront pesés quotidiennement afin de vérifier qu'il n'y ait pas de perte de poids supérieure à 20%. Tout animal présentant un aspect inhabituel : prostration, pelage terne et hirsute, traces de blessures infligées par les autres animaux sera isolé. Il fera l'objet d'une attention accrue et benéficiera de soins appropriés (désinfection des plaies par exemple ou accès facilté à la nourriture). Si aucune amélioration de son état n'est constaté au bout de 24h, il sera mis à mort pour eviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix dans l'utilisation de modèles qui reproduisent la complexité des maladies inflammatoires chez l'Homme. Il existe à ce jour peu de modèle d'animaux axéniques. La souris est un de ces modèles. Des études récentes ont montré que le transfert d'un microbiote donné pouvait modifier le métabolisme de l'hôte, dans ce cas, la souris. C'est pourquoi nous avons choisi ce modèle. Les animaux seront utilisés principalement à l'âge adulte pour permettre la bonne maturation des fonctions de barrieres de la muqueuse intestinale (production de mucus, production de peptides antimicrobiens, mise en place efficace des jonctions serrées). Le modèle DSS permettra d'étudier le rôle du microbiote dans la séverité de la colite.
AdipoMetab
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
5848 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sans réveil à modéré. Elles reçoivent surtout des injections intrapéritonéales et des prélèvements sanguins répétés, certaines lignées génétiquement modifiées développant une insuffisance cardiaque précoce qui réduit leur espérance de vie à quatre mois, ou une obésité avec troubles de la fertilité. Le projet, résumé sous le seul titre "AdipoMetab", étudie la gouttelette lipidique de l'adipocyte, avec des applications thérapeutiques annoncées à plus ou moins long terme. Le porteur affirme que l'impact sur l'"organisme entier" ne peut être modélisé par les cultures d'adipocytes humains.
Objectifs
Le thème central est l’étude de la composition et des voies métaboliques associées à la gouttelette lipidique. Les modifications de ces paramètres seront induites par des changements environnementaux (régimes alimentaires, température d’hébergement) et génétiques (invalidation de gènes, modifications de séquences, transgenèse additive) chez des souris provenant de différents fonds génétiques. Les mesures seront faites chez les souris mâles et femelles à différents âges. Elles porteront sur 1. l’adipocyte, cellule cible des manipulations, 2. le tissu adipeux composés d’adipocytes et d’autres types cellulaires et 3. les organes métaboliques cibles, en particulier le foie et le pancréas en considérant l’impact des molécules produites par le tissu adipeux.
Bénéfices attendus
Selon que nos modèles soient d’ores et déjà disponibles ou en cours de création, nous pourrons évaluer in vivo l’implication de protéines sur la morphologie et la fonction de la gouttelette lipidique et les conséquences métaboliques à l’échelle du corps entier. Ceci nous permettra d’affiner et d’apporter du rationnel scientifique et mécanistique aux données cliniques publiées chez l’Homme, basées sur des données d’association et de corrélation. En combinant une variété de techniques de pointe in vitro (non détaillées ici) et in vivo, le projet AdipoMetab a pour ambition de réaliser des avancées majeures dans la compréhension des mécanismes qui sous-tendent la physiologie de la gouttelette lipidique de l’adipocyte et les désordres physiopathologiques à l’origine de troubles cardiométaboliques. Le projet s’appuie sur des collaborations avec des laboratoires français et étrangers de renom. A plus ou moins long terme, nous attendons donc des résultats scientifiques innovants et prometteurs ayant une relevance clinique. De nouvelles approches, pharmacologiques et nutritionnelles pourront être envisagées afin de normaliser les dysfonctions de la gouttelette lipidique observées dans différentes pathologies cardiométaboliques.
Procédures
Il s'agit d'un projet couvrant des financements obtenus sur 5 ans reposant sur des modèles animaux disponibles ou en cours de création. La très grande majorité de nos lots expérimentaux et de nos procédures consistera à réaliser un phénotypage métabolique in vivo classique dans notre domaine d'expertise, le plus souvent reposant sur des injections intrapéritonéales. Nos procédures sont classées légères, modérées ou sans réveil en terme de sévérité. Légères quand aucune anesthésie ne sera nécessaire. Dans la majorité de nos lots de souris, seront dosés par méthodes des métabolites ou protéines sanguins produits par nos organes d'intérêt. Le sang sera prélevé de façon régulière, mais dans la très grande majorité des cas sur des petits volumes (veine caudale). Au sacrifice, nous prélèverons une plus grande quantité de sang pour un panel de dosages plus large. Les interventions chirurgicales du projet seront réduites à un nombre limité de cohortes, dans un but physiopathologique ou thérapeutique bien défini. Certains lots de souris seront placés sous régime gras pour induire une obésité et les désordres métaboliques associés. D’autres seront traités via injection de vecteur AAV pour exprimer une protéine d’intérêt ou via diffusion chronique d'une molécule avec un système de mini-pompe. L’implantation sous-cutanée de cellules dans les souris immunodéficientes est une procédure largement utilisée en cancérologie. En résumé pour chaque souris sur 8 à 16 semaines (en détail dans les procédures expérimentales), les interventions ne nécessitant au maximum que de petits prélèvements sanguins sur animaux vigiles (veine caudale) après injection intrapéritonéale d’un composé sain : - Procédure 1 (lot 3) : 4 interventions x 2 minutes. - Procédures 2 et 4 : 9 interventions (3x2min, 2h, 2h, 2h, 2,5min, 20min et 6h), soit 12h28 + 1 intervention de 72h (lots 1 et 2) ou 15min (lot 3 (15min). - Procédure 3 : 6 interventions (3x2min, 2h, 2h, 20min), soit 4h26 + 1 intervention de 72h (lots 1 et 2) ou 2x4h (lot 4 ou 5). - Animaux des procédures 5 et 8 : 6 interventions (3x2min, 2h, 2h, 6h), soit 10h26 + 1 intervention de 72h + 1 acte chirurgical de 15min (procédure 5). - Animaux de la procédure 6 : 5 interventions (3x2min, 2h, 2h), soit 4h06 + 1 intervention de 72h + 1 acte chirurgical de 15min (procédure 6). - Animaux de la procédure 7 : 7 interventions (3x2min, 2h, 2h, 2h, 20min), soit 6h26.
Impact sur les animaux
Nous n’attendons pas d’effets indésirables majeurs sur nos modèles murins génétiquement modifiés, notamment du fait des cibles étudiées qui sont majoritairement exprimées dans la gouttelette lipidique de l’adipocyte. Les lignées seront toutes viables et ne présenteront aucun phénotype dommageable. Nous pouvons cependant noter 2 exceptions, mais qui ne concerneront qu’un nombre très restreint de lots expérimentaux : - les souris avec une invalidation totale du gène Pnpla2 codant l’ATGL (adipose triglyceride lipase) présentent une insuffisance cardiaque précoce et de ce fait ont une espérance de vie limitée à 4 mois. - les souris db/db sont un modèle connu d’obésité et de diabète due à une déficience du récepteur de la leptine. L’hyperphagie des animaux entraine une prise de poids très importante. L’absence d’action de la leptine conduit à des troubles de fertilité chez les femelles. Il conviendra de ne pas les manipuler au-delà de 9 mois d’âge. Les procédures employées dans ce projet pourront néanmoins engendrer quelques nuisances, cependant légères ou modérées pour chacune d’entre elles, comme explicité dans la partie adéquate.
Devenir
Ceci est indiqué pour chaque procédure expérimentale. Les animaux subiront plusieurs procédures expérimentales légères au cours de leur période d’étude. Concernant les cultures primaires, les animaux sont mis à mort pour récolter les tissus inhérents aux cultures à réaliser. Enfin pour toutes les cohortes de ce projet, les animaux ne seront pas ré-utilisés. Ils seront mis à mort à l'issue de leur période d'analyse, la plupart du temps entre 2 et 6 mois d'âge (sauf pour les cohortes en vieillissement), ceci dans le but de prélever tous les tissus d'intérêt à ce projet, notamment les différents dépôts adipeux de l'organisme, mais aussi le foie, les muscles et le pancréas.
Remplacement
Une partie importante du projet AdipoMetab réside dans l’étude approfondie des mécanismes permettant à certaines protéines et lipides de réguler la taille de la gouttelette lipidique de l’adipocyte. Les études de biochimie et de biologie cellulaire peuvent être réalisées sur des modèles adipocytaires humains disponibles au laboratoire. Certaines lignées adipocytaires humaines peuvent subir des modifications du génome. Pour une partie des questions portant sur les conséquences de modifications du niveau d’expression ou de la séquence (mutants) de protéines, ces lignées adipocytaires humaines permettront de remplacer les modèles de souris. Par ailleurs, la culture bi- ou tridimensionnelle des adipocytes humains permettra de remplacer l’utilisation de modèles animaux. Cependant, l’impact sur le tissu adipeux, composé de nombreux autres types cellulaires que l’adipocyte, ainsi que sur les autres organes et l’homéostasie métabolique requiert l’utilisation de procédures expérimentales à réaliser sur animaux vivants. Aucun autre modèle n’est susceptible d’apporter les réponses aux questions posées. Les modèles murins décrits dans ce projet s’inscrivent dans un niveau préclinique préalable à un éventuel transfert à visée thérapeutique chez l’Homme. Nous utiliserons enfin dans toute la mesure du possible les banques de données accessibles en ligne. Celles-ci permettront d’acquérir des informations sur la régulation de nos protéines d’intérêt sans avoir à reproduire chez la souris certaines données déjà accessibles. Ces analyses bioinformatiques permettront donc de remplacer certaines procédures expérimentales à effectuer sur nos modèles de souris.
Réduction
Les différentes procédures de phénotypage métabolique nécessiteront d’utiliser, sur la base de données publiées concernant la forte hétérogénéité métabolique inter-individuelle, et sur la base de notre expérience, 8 animaux « contrôles » et 8 animaux génétiquement modifiés par lot en moyenne. Ce nombre est le nombre minimal permettant d’obtenir des résultats robustes basés sur une puissance statistique suffisante, et ce en tenant compte de potentiels animaux non répondeurs ou « outliers ». Pour cela des analyses de variance à 2 facteurs , ainsi que des tests paramétriques de Student (après contrôle de la normalité des données) ou non paramétriques de Mann et Whitney seront utilisés. Pour les expériences ne nécessitant pas d’analyses phénotypiques in vivo, 4 animaux par groupe expérimental seront suffisants. Il est à noter enfin que certains modèles murins seront étudiés sous plusieurs fonds génétiques. En effet, la diversité des traits métaboliques trouvés chez l'Homme peut être obtenue grâce à des études parallèles sur plusieurs souches consanguines ou non consanguines. A cette fin, l’emploi classique d’outils moléculaires permettant la recombinaison d'allèles dans les cellules souches embryonnaires demeure dispendieux en temps et en nombre d’animaux par les croisements qu’il engendre. La technique CRISPR-Cas9 permettra de surmonter cette limitation en permettant une génération de lignées transgéniques sur différents fonds génétiques requérant moins d’animaux.
Raffinement
Afin de maintenir le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par les zootechniciens, ce qui permettra de déceler très rapidement toute souffrance. Un suivi du poids régulier (hebdomadaire à bi-mensuel) viendra compléter ces observations. Les souriceaux mâles seront uniquement regroupés au moment du sevrage. Les souris seront placées, au maximum par 5, dans des cages comprenant des enrichissements. Les animaux ne seront pas isolés, à l’exception de leur utilisation aigue dans certaines procédures de ce projet. Seule la procédure 15 (mesure de la dépense énergétique par calorimétrie indirecte) nécessitera un isolement individuel de maximum 3 jours, justifié pour évaluer le métabolisme individuel de chaque animal dans une cage standard dédiée. La durée de l'isolement est limitée à la période minimale. Les cages seront placées les unes à côté des autres permettant aux animaux d'être en contacts visuels et auditifs. Durant cette expérimentation, un contrôle bi-quotidien des animaux est effectué. A la fin de l'expérience, les animaux seront réintroduits dans leur groupe respectif. Ces éléments ne dérogent pas à l’article R214-95 du code rural et de la pêche maritime. Les classes de gravité des procédures utilisées dans le projet sont légères ou modérées et n’entraînent pas de perte d’animaux. Un moyen de raffinement consiste à procéder dans la mesure du possible selon les procédures employées à des anesthésies par inhalation ou par voie intraveineuse selon ces mêmes procédures et l’interaction possible de ces molécules avec les marqueurs évalués. Une couverture analgésique pré et/ou post-opératoire sera par ailleurs appliquée dans les procédures nécessitant des actes chirurgicaux peu invasifs et courts : procédures 5 (buprénorphine, 0,05-0,1 mg/kg, injection sous cutanée) et 6 (kétoprofène, 2mg/kg, injection sous-cutanée). Enfin, en lien avec les classes de gravité légères à modérées de nos procédures et la surveillance quotidienne des animaux, les points limites seront les suivants : - Aspects généraux : 1-perte de poids (
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo-sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Cette pertinence est améliorée par l’humanisation des modèles murins au niveau génétique et environnementale, ce que nous effectuons en utilisant divers régimes alimentaires et/ou différentes températures d’hébergement. Nous étudions l’importance des protéines impliquées dans le maintien de la gouttelette lipidique des adipocytes. A travers l’utilisation du modèle souris, nous pouvons travailler sur des modèles génétiquement modifiés qui présentent une invalidation pour le/les gène(s) d’intérêts ou des modifications génétiques similaires à celles retrouvées chez des patients. Les souris seront étudiées à l’âge adulte (entre 7 et 20 semaines). Des analyses de suivi seront également effectuées sur un groupe d’animaux de nos différentes lignées allant jusqu’à 18 mois, ceci dans le but de déterminer sur le plus long terme les effets sur le développement du tissu adipeux et la physiologie de l’organisme des protéines d’intérêt de la gouttelette lipidique.
Etude au sein du réseau hippocampoamygdalien des altérations cellulaire et synaptique spécifiquement associées à une mémoire de type post-traumatique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 960 en gravité sévère. 700 d'entre elles subissent une injection virale dans le cerveau et pour une partie l'implantation d'une fibre optique, puis toutes reçoivent trois chocs électriques lors d'un conditionnement de peur avant d'être mises à mort environ 90 minutes plus tard. Le projet cherche à identifier les altérations cérébrales associées au passage d'une mémoire émotionnelle normale à une mémoire de type post-traumatique. Le porteur affirme qu'aucune alternative ne permet d'étudier la mémorisation sans une espèce proche de l'humain.
Objectifs
Si les caractéristiques cliniques de l’état de stress post-traumatique (ESPT) sont bien décrites, les bases neurobiologiques de cette pathologie sont encore méconnues. L’un des traits cardinaux de cette pathologie, se développant à la suite d’un événement de stress intense, est une altération mnésique paradoxale associant à la fois une amnésie et une hypermnésie. S’il est connu qu’un épisode de stress et que la formation d’une mémoire peuvent s’accompagner de phénomènes de plasticité cellulaire (modifications de la morphologie cellulaire et des épines dendritiques, altération de la neurogénèse adulte) et synaptique, notamment au sein du réseau hippocampoamygdalien, les effets différentiels de deux types de mémoires sur ces phénomènes restent méconnues. Ce projet a pour objectif de déterminer dans quelle mesure certaines de ces altérations du réseau hippocampo-amygdalien peuvent être spécifiquement associées au passage d'une mémoire émotionnelle normale à une mémoire de type psottraumatique.
Bénéfices attendus
En identifiant les bases neurobiologiques spécifiques de la mémoire traumatique, ce projet doit ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le traitement de ce trouble lié au stress.
Procédures
700 animaux sont soumis à des procédures chirurgicales : 300 animaux (3 réplications avec 20 animaux par groupe) sont soumis à une procédure d’injection virale permettant de visualiser les neurones. Cette procédure sous anesthésie générale dure environ 30 minutes. 400 animaux (2 réplications avec 20 animaux par groupe) sont soumis à une procédure d’injection virale afin d’exprimer un canal sensible à la lumière dans les neurones d’intérêt et aussi à une procédure d’implantation de fibre optique afin de manipuler par la lumière l’activité de ces neurones. Cette procédure sous anesthésie générale dure environ 60 minutes. Les animaux sont soumis à une procédure comportementale (1 seule fois) où ils recevront 3 chocs électriques (0.3 mA, de 1 seconde).
Impact sur les animaux
Ce modèle de conditionnement implique des effets stressants chez les animaux liés à : - une chirurgie - un isolement - l'application de chocs électriques lors de la procédure comportementale. Néanmoins, afin de réaliser nos études neurobiologiques, les animaux sont mis à mort rapidement (90min) à la suite de ce conditionnement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort après les procédures comportementales, en vue de la réalisation d’analyses.
Remplacement
L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus de mémorisation. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus à l'espèce humaine. 3) Le modèle comportemental a été établi chez la souris et l’ensemble des appareils comportementaux que nous utiliserons sont dimensionnés pour cette espèce.
Réduction
Concernant la réduction, l’effectif se justifie par l’utilisation d’un nombre suffisant d’animaux dans chaque condition expérimentale afin que les analyses statistiques envisagées puissent être concluantes. Nous avons en effet déterminé ce nombre suites aux expériences précédentes utilisant les mêmes tests comportementaux.
Raffinement
Concernant le raffinement, les souris issues de centres d’élevages agréés, seront hébergées tout au long de leur vie en cage collective avec un environnement enrichi dans une animalerie agréée comportant une régulation de la température, de l’hygrométrie et du cycle jour/nuit. Elles recevront de l’eau et de la nourriture à volonté, elles seront changées régulièrement et elles seront observées tous les jours de la semaine et pesées 1 fois par semaine par un personnel qualifié. Au cours de ces observations, si un animal présente des blessures, il sera immédiatement soigné et surveillé deux fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal être (perte de poids, poils hérissés, prostration…), il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera euthanasié dans les 48h. Concernant les procédures de chirurgies, nous appliqueront des mesures de raffinement adaptées afin d’éviter la douleur et le risque d’infection. Suite à l’anesthésie, l’animal reçoit une injection d’un médicament ayant un effet anti-douleur qui sera encore efficace lors de son réveil. Du gel hydratant est également posé sur chaque oeil afin d’éviter tout dessèchement. La zone d’incision est désinfectée, ensuite, un anesthésique local est injecté dans la zone à inciser. A la fin de l’opération, l’animal est placé dans une chambre chauffée à 36°C et est régulièrement surveillé jusqu’à son réveil puis est remis dans sa cage avec un peu de nourriture humide. Un suivi postopératoire est effectué pendant 4 jours avec l’observation de la plaie. Par ailleurs, le lendemain les reçoivent une injection d’un antiinflammatoire non stéroïdien toutes les 12h le jour de l’opération et le lendemain.
Choix des espèces
La souris: -est un mammifère présentant une proximité phylogénétique avec l’espèce humaine et certains de ses comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. L’essentiel des données de l’équipe concernant la mémoire émotionnelle ont été obtenues chez la souris: pour une comparaison des résultats, l’étude des mécanismes neurobiologiques responsables du passage d’une mémoire normale à une mémoire traumatique implique l’utilisation de cette espèce -permet des approches invasives (approches pharmacologiques etc.) permettant d’étudier l’effet de molécules sur le système nerveux central et les phénomènes de mémorisation via l’étude comportementale -offre la possibilité d’être manipulée génétiquement: l’utilisation de souris transgéniques permettra l’analyse des modifications neuromorphologiques. A plus long terme, dans le cadre de collaborations, des modèles knockout ou transgéniques seront utilisés pour compléter l’exploration des mécanismes de plasticité altérés dans cette pathologie de la mémoire. Tous les animaux utilisés seront âgés de 8 à 12 semaines, ce qui correspond au stade jeune adulte chez la souris. Etant donné que les études comportementales et pharmacologiques réalisées précédemment dans l'équipe ont été réalisées chez des souris jeunes adultes, dans un souci de cohérence, ce stade de développement a été sélectionné.
Effets d’un composé client sur la cachexie dans un modèle murin de cachexie induite par l’inoculation de cellules LLC
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
68 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une inoculation de cellules cancéreuses pulmonaires qui provoque une tumeur et une fonte progressive de la masse musculaire, des administrations quotidiennes pendant 21 jours, des prélèvements sanguins et une ponction cardiaque terminale. L'étude est commandée par une société cliente pour tester l'efficacité de ses composés contre la cachexie, débouché commercial et clinique formulé au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animal ne permet d'étudier cet état pathologique complexe.
Objectifs
Le projet faisant l’objet de la présente demande d’autorisation vise à étudier les effets d'un composé en développement chez un modèle de cachexie induite par des cellules pulmonaires cancéreuses, les cellules LLC (Lewis Lung Carcinoma). La cachexie correspond à une perte de masse corporelle, tout particulièrement de masse musculaire, telle qu'elle ne peut plus être inversée ni trouvée à l'aide d'une nutrition adaptée. Elle est observée au cours de plusieurs maladies comme l’anorexie mentale, l’insuffisance cardiaque ou hépatique, le SIDA ou encore le cancer. Dans le cas de la cachexie liée au cancer, cette dernière résulte d’altérations métaboliques liées à la présence d’une ou plusieurs tumeurs. Le modèle que nous utilisons est un modèle qui mime très bien l’étiologie de cette pathologie chez l’humain, puisque la perte de poids et de masse musculaire obtenue résulte également du développement d’une tumeur sous l’effet de l’inoculation des cellules LLC. Cette étude est commanditée par une société cliente dans le cadre de la recherche de l’efficacité de leurs composés dans ce domaine d’application.
Bénéfices attendus
Si la présente étude permet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur la cachexie, ces deniers seront employés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché. Ils constitueraient ainsi les tout premiers traitements autorisés pour la prise en charge de la cachexie. Les patients atteints de cancer bénéficieraient ainsi d'un traitement permettant de bloquer ou de réduire le développement de la cachexie, améliorant ainsi considérablement leur pronostic vital ainsi que leur qualité de vie. Par ailleurs, dans un second temps, l'efficacité potentielle d'un tel traitement pourrait être testée dans d'autres pathologie induisant un état de cachexie tel que le SIDA ou les insuffisance cardiaques et hépatiques par exemple.
Procédures
Ce projet comporte 4 types d'interventions différents : (1) Inoculation de cellules LLC : Durée de 5 minutes environ. (2) Mesures de composition corporelle : Durée de 1-2 minutes (répétée 3 fois au cours du projet). (3) Administrations sous-cutanées et orales : Durée 10 secondes environ; administrations quotidiennes pendant 21 jours. (4) Prélèvements sanguins : deux prélèvements par la veine caudale à D0 et D7 (Durée de 2-3 minutes) et un prélèvement terminal par ponction cardiaque à l'issue de l'étude (durée 1 minute).
Impact sur les animaux
Le modèle employé dans le présent projet est un modèle de cachexie résultant du développement d'une tumeur sous-cutanée induite par l'inoculation de cellules Lewis Lung Carcinoma (LLC). Le développement tumoral induit un état de cachexie progressif s'accompagnant d'une réduction de masse maigre et d'une perte de poids corporel. Pour des raisons éthiques, le modèle est limité à 21 jours post inoculation des cellules LLC après lesquels les animaux seront euthanasiés. L'hébergement individuel est nécessaire de par la nécessité de la mesure individuelle de la prise alimentaire. L'anesthésie constituera une nuisance sur les animaux. Les mesures de tumeur peuvent générer un stress voire une douleur pour l'animal. L'ensemble des traitements (par sous-cutanée, par voie orale) ainsi que les pesées et les mesures de composition corporelle peuvent être source d'angoisse. Les prélèvements sanguins en vigile constituent également un effet indésirable attendu sur les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des anayses biochimiques et histologiques sur la tumeur, les muscles droits et gauches de la patte (gastrocnemius, soleus, EDL, plantaris, tibialis, vastus lateralis), le diaphragme, le coeur et le tissu adipeux blanc sous-cutané qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’efficacité réelle d’un composé sur la cachexie. En effet, la cachexie est un état pathologiques complexes lié à un grand nombre d'altérations métaboliques, périphériques et centrales, et immunologiques. Ainsi, l'état de cachexie implique un défaut dans la communication cerveau-système musculaire ainsi qu'un déséquilibre hormonal majeur induisant de profondes modifications des voies de signalisation intracellulaires. Pour autant, les mécanismes intimes de mise en place de la cachexie restent assez largement méconnus à aujourd'hui. Ainsi, compte tenu de la complexité de l'étiologie de la cachexie, il n'existe pas aujourd'hui d'alternative non animal dans ce domaine permettant de modéliser correctement la pathologie et de tester des candidats médicaments. Nous avons choisi un modèle utilisant l'espèce souris qui est parfaitement caractérisé dans la littérature scientifique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et %), prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire, volume tumoral (longitudinal et terminal), poids de la tumeur, densité de la tumeur, poids corporel sans tumeur, composition corporelle (avec et sans tumeur), muscles droits et gauches de la patte, diaphragme, coeur, le tissu adipeux blanc sous-cutané et cytokines sur serum et sur tumeurs. Le groupe contrôle du modèle a été réduit à 8 animaux (contre 12 pour les groupes cachexiques) du fait d'une moindre variabilité des paramètres mesurés, ces souris ne développant pas de tumeur.
Raffinement
Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques. Il s'agit d'un modèle de cachexie chez la souris induit par une inoculation de cellules LLC. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cage individuelle et un enrichissement du milieu sera assuré par l'ajout de petites maisons dôme (mouse house), de briquettes en bois et de matériel de nidification. Afin de réduire toute douleur au cours des procédures expérimentales, l'inoculation des cellules LLC sera réalisée sous anesthésie gazeuse (les animaux seront placés sur tapis chauffant) et les mesures de composition corporelle seront réalisées chez l'animal vigile (durée de la mesure : 2 minutes). Les administrations sous-cutanées et per os seront réalisées par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique, et deux sites d'administration seront utilisés pour les injections sous-cutanées (zones scapulaires droite et gauche) en alternance d'un jour à l'autre). Enfin, compte-tenu du développement d’une tumeur et d’un état de cachexie progressif chez les animaux, le développement de cette dernière sera limitée à 21 jours post inoculation et un suivi journalier particulièrement étroit des animaux à l'aide d'une grille de score de souffrance permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Les animaux seront anesthésiés par l'administration d'un mélange de kétamine/xylazine (100mg/kg et 10 mg/kg respectivement; 10ml/Kg; i.p.) avant qu'une ponction cardiaque ne soit pratiquée et qu'ils soient euthanasiés par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Le modèle souris C57BL/6 J est très bien documenté dans la littérature en tant que modèle de cachexie induit par une inoculation de cellules LLC. Le choix du modèle souris C57BL/6 a été validé avec le client et le chef de projet. Les animaux utilisés seront de jeunes souris adultes (5 semaines à réception ; 7 semaines au début du traitement). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine qui sera ciblée par les composés à tester, à savoir une population adulte présentant un état cachectique lié au cancer.
Evaluation de l’efficacité antitumorale de particules d’oxyde d’hafnium après injection intra tumorale et activation par la radiothérapie dans des modèles de cancer chez les souris nude
- Recherche appliquée
- Cancers
1000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses humaines, puis pour une partie d'entre elles une injection intra-tumorale de particules d'oxyde d'hafnium et une à trois expositions aux rayonnements ionisants, la croissance tumorale ne permettant pas de les maintenir en vie dans des conditions confortables. Le projet vise à démontrer l'efficacité antitumorale de ces particules contre les cancers de la tête et du cou, bénéfice pour l'humain formulé au conditionnel. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "incontournable" et "nécessaire" pour disposer d'un système immunitaire complet et se conformer aux standards réglementaires.
Objectifs
Notre objectif général est d’étendre les modalités du traitement des sarcomes des tissus mous (STS) par des particules d’oxyde d’hafnium aux cancers de la tête et du cou (Head &Neck abrégé en H & N). Plus précisément, l’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet antitumoral de particules administrées par injection intra-tumorale (IT) unique et activées par les rayonnements ionisants, par comparaison avec la radiothérapie seule, en termes de retard de croissance tumorale et de survie, associés à une très bonne tolérance chez les animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de démontrer l’efficacité d’un traitement par des particules d’oxyde d’hafnium activées par radiothérapie (retard de croissance tumoral, tolérance chez l’animal) sur un modèle de cancer supplémentaire (cancers de la tête et du cou). Plusieurs modèles de lignées cellulaires humaines sont prévus afin de couvrir un panel de situation dans lesquelles les particules d’oxyde d’hafnium activées pourront avoir un bénéfice concernant l’efficacité antitumorale et la tolérance par rapport à la radiothérapie seule : une efficacité tumorale plus forte associée à des effets indésirables plus faibles. Le bénéfice final du projet étant de prouver l’augmentation du temps et de la qualité de vie sur des souris porteuses de tumeur par rapport à un traitement par radiothérapie seul. Ce projet permet alors de mettre en exergue les bénéfices attendus pour un traitement chez l'homme sur des modèles similaires.
Procédures
Geste pratiqué n°1 : Contention manuelle et injection sous-cutanée de cellules cancéreuses sur animal vigile (une dizaine de seconde). Utilisation de lidocaïne localement sur la zone d'injection. Injection unique pour chaque animal. Tous les animaux de cette étude sont concernés par ce geste. Contention manuelle sur animal vigile pour mesure de la croissance tumorale (une dizaine de seconde par mesure) 2 à 3 fois par semaine, pendant une à deux semaines avant le geste pratiqué n°2. Geste pratiqué n°2 : Uniquement sur les souris dont les tumeurs se sont développées (taille environ 100mm3). Anesthésie gazeuse (isoflurane) et utilisation de lidocaïne localement sur la zone d'injection (tumeur). Injection intra-tumorale d'un contrôle (véhicule - glucose) ou de particules d'oxyde d'hafnium (10-15 secondes par injection). Injection unique pour les animaux sélectionnés. D’après les groupes établis, deux tiers des animaux de cette étude sont concernés par ce geste. Geste pratiqué n°3 : Contention de l'animal vigile dans un système de protection adapté (environ 1 minute). Exposition à des radiations ionisantes sur la zone tumorale (le reste de l’animal est protégé dans un système de contention). Chaque animal est exposé une à trois fois (une exposition par jour) selon la lignée cellulaire d’étude. Dans le cas de plusieurs expositions, elles se font sur des jours consécutifs. Chaque exposition dure en moyenne 5 minutes. Un suivi clinique est effectué sur l’animal afin de surveiller sa nutrition et son hydratation. D’après les groupes établis, près de la moitié des animaux de cette étude sont concernées par ce geste.
Impact sur les animaux
Angoisse et douleur peuvent être associées aux injections (injections sous-cutanées de cellules tumorales et injections intra-tumorale de particules d’oxyde d’hafnium). L’injection intra-tumorale de particules peut également entrainer une gêne liée à la pression intratumorale. L’anesthésie effectuée afin de limiter ces nuisances et de permettre les injections peut entrainer des conditions d’hypothermie chez l’animal. Une perte de poids peut être attendue à la suite de l’exposition aux rayonnements ionisants. Cette perte de poids peut être associée à une dégradation de l’état général (prostration, refus de s’alimenter ou de boire). La croissance tumorale peut aboutir à des volumes de tumeur important pouvant être une nuisance pour l’animal. Le risque de nécrose de la tumeur est à prendre en compte également. Enfin, la contention des souris (identification, suivi et mesures des tumeurs) peut également engendrer un stress.
Devenir
Les animaux dont les points limites sont atteints seront euthanasiés. Durant cette étude, les souris sont injectées avec des cellules tumorales et la croissance tumorale ne permet pas un maintien en vie dans des conditions confortables. De plus, des prélèvements et analyses post-mortem impliquent une euthanasie de l'ensemble des animaux.
Remplacement
Le recours à l’animal pour ce projet est incontournable. Les interactions avec un système immunitaire complet est nécessaire pour étudier les effets des particules d’oxyde d’hafnium dans le cancer de la tête et du cou, tout en déterminant et en évaluant les risques à prendre en compte pour un développement en thérapeutique humaine. De plus, le recours à l’animal est actuellement nécessaire pour être en conformité avec les standards internationaux exigés par les instances réglementaires.
Réduction
La première partie du projet permet d'optimiser les conditions d'étude (paramètres d'injection, croissance tumorale, état de la tumeur) avec deux lignées cellulaires de cancer de la tête et du cou actuellement non-renseignées dans la littérature et dans les projets précédents. Si cette première partie du projet ne permet pas d'isoler des conditions d'étude adéquates avec l'une de ces lignées cellulaires, celles-ci ne seront pas inclus dans la seconde partie du projet qui se fera sur 3 lignées cellulaires au lieu de 4, réduisant le nombre total de souris de 25% dans l'étude (passant de 1000 à 720 souris pour cette étude). La robustesse de l'étude en diminuant au maximum le nombre de souris inclus dans ces procédures a été assurée par un calcul de puissance (test statistique). Les résultats de cette étude seront interprétés par des tests statistiques.
Raffinement
Après leur réception à l’animalerie, les animaux ne seront pas utilisés pendant une semaine (période d’acclimatation). Les animaux seront hébergés en groupe de 5 animaux/cage maximum, dans des conditions sanitaires et environnementales contrôlées (nourriture stérilisée et eau disponible à volonté). De l’enrichissement sera prévu : du coton ou des lanières de Kraft (E-Kube) sera mis à disposition dans la cage afin que les souris puissent faire un nid ainsi que des maisons ou qui leur servent d’abri. L’inconfort, la douleur ou l’angoisse ressentie par les animaux seront pris en compte. Une anesthésie locale à la lidocaïne sera pratiquée systématiquement avant un geste pouvant occasionner une angoisse ou de la douleur (injection des cellules tumorales en sous cutané ou injection de particules par voie intratumorale). Une anesthésie gazeuse à l’isoflurane sera mise en place pour l’injection des particules par voie intratumorale afin de faciliter le geste et la rapidité d’exécution, et diminuer le stress et l’inconfort de l’animal. L’anesthésie gazeuse est privilégiée afin d’avoir un réveil rapide (1 à 2 minutes) de l’animal et de s’émanciper des risques d’hypothermie associés à une plus longue anesthésie générale. Néanmoins, l’animal sera placé sur un tapis chauffant afin de s’affranchir totalement de ce risque. La surveillance clinique quotidienne (examen de santé) lors des jours ouvrés permettra de détecter précocement tout signe clinique et de le traiter. Une mesure de l’évolution de la taille de la tumeur et du poids sera réalisée deux à trois fois par semaine. Pour les périodes de week-end, l’état de l’animal et son évolution seront évalués les jours précédents et il sera alors décidé si 1/ les points limites sont atteints ou sur le point de l’être 2/ si aucun risque n’est estimé pour le week-end ou 3/ si le doute nécessite un suivi au cours du week-end. Les points limites seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Dans la recherche en oncologie, le modèle de tumeurs humaines xenogreffées chez la souris nude est le modèle de référence pour l’étude des traitements anti-cancéreux. En ce sens, cette espèce de rongeur a été choisi pour l’évaluation de l’efficacité antitumorale d’oxyde d’hafnium activé par la radiothérapie. Souris de 7 semaines, jeunes adultes. Pour des raisons techniques, le poids des animaux doit être au minimum de 20 grammes afin d’assurer de bonnes conditions de traitement par radiothérapie. Pour les irradiations localisées, les animaux sont disposés dans des systèmes de contention exposant uniquement la zone d’intérêt. Ces systèmes sont adaptés à des souris de taille adulte.
Evaluer l’efficacité thérapeutique d’un nouveau traitement contre les complications des radiothérapies cérébrales sur un modèle murin
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation cérébrale sous anesthésie, des administrations intra-nasales, une perfusion intracardiaque et des prélèvements sanguins, puis passent des tests comportementaux répétés (labyrinthe en Y, labyrinthe en croix surélevé, rotarod) avant d'être euthanasiées pour prélever leurs structures cérébrales. Le projet teste des vésicules extracellulaires censées limiter les troubles cognitifs provoqués par la radiothérapie chez les patients, retombées renvoyées au conditionnel. Le porteur affirme que les modèles in vitro ne permettent d'évaluer ni le réseau vasculaire ni les troubles cognitifs et conclut que le recours à la souris est "indispensable".
Objectifs
La radiothérapie dans le traitement des tumeurs cérébrales peut conduire à la mort de cellules non tumorales comme les cellules constituant les vaisseaux sanguins et les neurones. En effet, chez 50-90% des patients suite au traitement de tumeurs du cerveau par radiothérapie il est observé dans les 6 mois des troubles neurologiques avec des troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes. Il est donc indispensable de proposer de nouveaux traitements afin d’améliorer la qualité de vie des patients. Dans ce projet, nous allons évaluer l’efficacité thérapeutique des vésicules extracellulaires issues de cellules souches mésenchymateuses (CSM) pour limiter les impacts de la radiothérapie. Les CSM sont un type de cellules souches adultes très utilisées en médecine dite régénérative. Elles ont la capacité de se renouveler pour créer des cellules spécialisées capable de réparer la fonction d’un organe. Elles sont prélevées chez une personne à partir de la moelle osseuse ou de la graisse corporelle. Elles sont mises en culture puis administrées à l’homme. Cependant, cette stratégie thérapeutique cellulaire a ses limites telles que la transplantation autologue des CSM (prélèvement et administration chez la même personne). Cette technique limite le nombre de patients pris en charge en raison du temps nécessaire à la mise en culture. On note surtout une efficacité des cellules diminuées en fonction de l’âge et de facteurs de risques associés (hypertension, cholestérol). Les cellules peuvent être aussi inutilisables si elles ont été irradiées lors du traitement par radiothérapie. Des études ont démontré que l’effet thérapeutique des CSM serait majoritairement lié à la sécrétion de vésicules extracellulaires (VE). Elles sont produites en grand nombre par les CSM suite à leur activation par des facteurs stimulants. Une production de VE in vitro permet de s’affranchir des limites liées à l’utilisation des CSM via le patient. Les VE sont stockées et conservées sous forme lyophilisée simplifiant leur administration. Les VE permettent de limiter la destruction des vaisseaux sanguins (qui est observée après exposition aux rayonnements ionisants) et donc pourraient permettre de limiter le développement des troubles cognitifs. Dans le cadre de ce projet, la mesure du flux sanguin cérébral sera réalisée dans un autre établissement possédant expertise et équipement pour le réaliser de façon non invasive.
Bénéfices attendus
Les bénéfices que ce projet apportera sont multiples tel que - une nouvelle thérapie non-invasive - une réduction des troubles cognitifs (troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes) - une amélioration de la qualité de vie
Procédures
Prélèvement sanguin (80 microL) 1 fois sous anesthésie gazeuse isoflurane avant euthanasie, durée du prélèvement sanguin 15 secondes Perfusion intracardiaque sous anesthésique, durée 15 minutes Irradiation cérébrale sous anesthésie gazeuse : 10 min sous anesthésie gazeuse isoflurane Administration intra-nasale sous anesthésie gazeuse : environ 5 min par administration Les animaux subiront plusieurs fois les procédures qui suivent à différents temps. Tests comportementaux réalisés 4 fois (1, 2, 4 et 6 mois): - Labyrinthe en Y : 10 min, - Labyrinthe en croix surélevé : 5 min, réalisé 4 fois (1, 2, 4 et 6 mois) - Rotarod : 3 fois 3 min par séance (1h entre chacun des 3 passages) Analyse échodoppler sous anesthésie gazeuse : 10 min sous légère anesthésie gazeuse Ils seront transportés dans un autre établissement, anesthésiés et rasés entre la base de la nuque et les oreilles avec une tondeuse afin de pouvoir appliquer un gel et la sonde échographique pour évaluer la vasoréactivité cérébrale : mesure de la demande en sang du cerveau. Une diminution de ce flux sanguin nous renseigne sur une diminution du nombre de vaisseau et donc la mise en place des complications aux rayonnements ionisants et le développement des troubles cognitifs.
Impact sur les animaux
Pour les irradiations, les animaux étant anesthésiés pour limiter les mouvements, il peut y avoir un effet des anesthésies répétées et les effets potentiels de l’anesthésie sur les variables physiologiques. Pour les administrations, même si les animaux sont légèrement anesthésiés, il est possible de noter un inconfort transitoire après l’administration. Pour les transports, il peut être noté un stress chez les animaux suite aux changements des conditions environnantes. Après irradiation, un animal peut développer des difficultés à se déplacer et/ou une apparence extérieure piloérection, dos rond ou amaigri Après administration nasale, les effets indésirables peuvent être un écoulement nasal important et/ou une tête penchée, difficultés à se déplacer, amaigrissement
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements des structures cérébrales.
Remplacement
Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles pré-cliniques (modèles animaux). De plus, les modèles in vitro (culture isolée de cellule en boîte de pétri) ne permettent d’évaluer le réseau vasculaire ni les troubles cognitifs. Par conséquent l’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour valider notre approche thérapeutique.
Réduction
Les modèles d’expérimentation animal présentent une certaine variabilité de réponse. De plus le retour d’expérience des médecins, chercheurs et biostatisticien déterminent qu’un nombre de 12 ou 15 animaux comptabilisés dans chaque groupe expérimental est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes (Anova, Ttest) afin de valider notre nouvelle thérapie.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées aux procédures réalisées afin de limiter au minimum la souffrance animale (suivi des animaux, anesthésie pour les irradiations, administrations intra-nasales et imageries, hébergement en groupe avec enrichissement).
Choix des espèces
Afin de développer et proposer des thérapies, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle in vivo. Le modèle murin sélectionné pour ce travail est le plus pertinent puisqu’il est le plus utilisé dans les études précliniques. Également, nous avons déjà démontré dans différents modèles murins soumis aux rayonnements ionisants l’efficacité thérapeutique des VE-CSM dans les processus de néovascularisation et la réparation tissulaire. Enfin, nous maîtrisons les techniques indispensables afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires et cognitifs pour démontrer l’efficacité de notre traitement.