Souris

1 910 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies cérébrales d'injection virale et d'implantation d'électrodes et de fibres optiques, l'implantation sous-cutanée de puces RFID, puis une exposition à la nicotine et une manipulation optogénétique de leurs circuits neuronaux. Le porteur indique que les bagarres entre animaux peuvent les blesser gravement, que les manipulations répétées peuvent diminuer leur bien-être et qu'une trop forte dose de nicotine risque une overdose. Il affirme que seul l'animal vivant permet cette étape d'intégration entre comportement social et neurophysiologie, le bénéfice annoncé visant les troubles addictifs et psychiatriques.

Objectifs

L’addiction au tabac est un problème majeur de santé publique. Cependant nous ne sommes pas tous égaux devant l’addiction et les raisons pour lesquelles nous fumons sont souvent très variées. Les mécanismes qui sous-tendent des différences de vulnérabilité, bien qu’essentiels pour comprendre pourquoi un individu devient et reste dépendant, sont peu étudiés d’un point de vue neurobiologique. Dans ce projet, nous développerons une approche intégrative pour lier les variations dans les traits individuels et la vulnérabilité aux drogues. Nous analyserons l’histoire individuelle de souris au sein d’un groupe pour étudier, sur de longues périodes, les dynamiques sociales entre congénères et les différentes stratégies utilisées dans des tâches de prise de décision. La consommation et le sevrage nicotiniques seront ensuite évalués pour lier les variations de comportements individuels observées avant exposition à la drogue et la vulnérabilité à la nicotine. Nous étudierons électrophysiologiquement comment les relations sociales et les prises de décision individuelles façonnent l’activité des circuits neuronaux impliqués dans la réponse à la nicotine et la susceptibilité à la drogue. Nous insisterons sur les circuits dopaminergiques impliqués dans la motivation et la réponse aux récompenses, ainsi que leurs innervations cholinergiques à travers les récepteurs nicotiniques. Ces circuits seront ensuite manipulés à l’aide d’outils optogénétiques, chémogénétiques ou de « modifications de l’environnement de l’animal » afin de modifier la vulnérabilité individuelle. Tous ces paramètres neuronaux et comportementaux seront des facteurs prédictifs utiles pour comprendre la mise en place des dépendances. Ce projet aborde donc le problème de l’individu face à la drogue. Cela représente un effort unique pour comprendre, à plusieurs niveaux d'analyse (de la molécule au comportement), le rôle des caractéristiques et des histoires individuelles dans le processus d’addiction.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier des voies neuronales spécifiques de la vulnérabilité individuelle aux substances addictives, mais aussi comment un individu adapte ses stratégies face à celles-ci, dans un milieu social. Les prises de décision dans un environnement social sont d'une importance majeure pour s'adapter à son environnement. De nombreuses pathologies sont associées à un déficit d'adaptabilité dans un environnement complexe et social, notamment les troubles du spectre autistique, la schizophrénie ou encore les conduites addictives, souvent favorisées par un contexte favorable à leur développement. Une meilleure compréhension de ces mécanismes, notamment à un niveau comportemental et physiologique, permettra donc d'appréhender plus efficacement les cibles cellulaires en vue de traitements futurs face à un enjeu sociétal majeur.

Procédures

Les souris subiront des procédures chirurgicales en vue d'injecter des adenovirus-associés (AAV) permettant l'expression de gènes spécifiquement dans le cerveau, mais aussi d'implantations d'électrodes d'enregistrements et de fibres optiques afin d'enregistrer l'activité neuronales. Les chirurgies d'injection durent environ 45 mins à 1h. Les chirugies d'implantation d'électrodes et de fibres aux alentours de 1h aussi. Les chirurgies d'injection d'AAV et d'implantation sont séparées car l'expression d'un AAV au sein du cerveau est d'environ 3 semaines. Ainsi, afin d'éviter d'abimer les électrodes et les fibres implantées, celles-ci seront implantées 3 semaines plus tard, augmentant grandement les chances d'avoir des résultats exploitables à l'enregistrement. A leur réveil, le comportement des animaux sera évalué pour coupler la neurophysiologie et l'aspect comportemental. Des micropuces RFID seront implantées en sous-cutané pour permettre de suivre la position de l'animal au sein de l'environnement étudié. Le comportement des animaux sera évalué durant 2 semaines où ceux-ci vivront en communauté dans une grande cage enrichie de 50cm sur 50cm et seront placés par 3. Pour la procédure où l'animal sera étudié seul, le comportement dans la cage durera 5 jours pour limiter l'isolement. En fin de certaines procédures, les animaux seront anesthésiés et un enregistrement unitaire de neurones sera effectué. A la fin de l'enregistrement, la souris sera euthanasiée sans être réveillée.

Impact sur les animaux

Les animaux qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs associées aux craniotomies effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures. Certaines infections au niveau des sutures pourraient éventuellement survenir. Les bagarres entre animaux peuvent aussi arriver, blessant superficiellement ou gravement certaines souris lors du comportement en groupe. Une même souris passera dans un nombre maximum d'expériences afin de réduire l'utilisation d'animaux. Le fait de passer dans plusieurs expériences d'affilées peut possiblement diminuer le bien-être de l'animal avec les manipulations répétées. Certains effets indésirables liés à la stimulation optogénétique peuvent survenir et troubler l'activité locomotrice. Si de tels troubles sont visibles, la stimulation sera immédiatement arrêtée et l'animal laissé au repos. L'administration de nicotine en eau de boisson ou injection intrapéritonéale peut induire un risque d'overdose à trop forte concentration.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés. - Soit directement à la fin de la procédure si aucune autre procédure n'est nécessaire à effectuer sur ces animaux. Les animaux n'ayant effectué que du comportement seront euthanasiés. - Soit pour extraire le cerveau de l'animal pour l'étudier. En effet, nous devons confirmer la bonne expression des virus injectés dans le cerveau et l'emplacement des électrodes/fibres implantées. Cette confirmation est indispensable comme contrôle pour prouver que l'enregistrement ou la manipulation de l'activité neuronale est bien liée à la zone cérébrale étudiée.

Remplacement

Notre projet vise à étudier la complexité du comportement de la souris. Nous souhaitons utiliser cette méthodologie afin de mesurer de manière automatique les comportements sociaux, la hiérarchie et son incidence sur les comportements individuels ainsi que sur la susceptibilité de certains profils comportementaux à s'administrer des drogues d'abus. Le découplage et la corrélation entre comportement et neurophysiologie est aussi une composante majeure de ce projet. Au sein du laboratoire, l'expérience sur les animaux a été préparée en amont par des méthodes ex-vivo (telle que le patch-clamp recording). Cette dernière étape d'intégration ne peut être réalisée in silico et nécessite donc de se faire sur des animaux vivants. Cette étude n’est donc réalisable que sur des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux, pour ce projet, est déterminé sur la base d'une litterature vaste et robuste dans des domaines similaires. Afin de réduire l'utilisation de souris au minimum, nous nous imposerons un cahier des charges strict. Pour ce faire, les procédures ont été pensées pour qu'une même souris puisse passer dans un nombre maximum d'expériences afin de réduire l'utilisation de nouveaux animaux pour chaque expérimentation. De plus, notre projet s'inscrit dans un temps long, avec l'observation d'une même souris sur une période étirée, limitant de ce fait l'utilisation répétée d'animaux. Les effectifs d'animaux à utiliser ont été calculés au plus juste grâce à des tests de puissance statistique effectuées en amont des expériences. De plus, l'analyse de la littérature dans ce domaine, qui est vaste, nous permet d'estimer au mieux le nombre d'animaux à utiliser pour chaque expérience. Enfin, de notre propre expérience au sein du laboratoire, ayant l'habitude d'effectuer ce genre de procédures, tout ceci nous permet d'estimer un nombre juste d'animaux afin de générer des résultats consistants et interprétables.

Raffinement

Dans nos environnements, l'espace pour chaque souris, ainsi que l'enrichissement, sont supérieurs aux cages conventionelles de stabulation. La taille de la cage, les différentes zones accessibles, la présence d'un nid au centre de l'environnement ainsi que d'un levier permettant d'obtenir de la nourriture ad libitum permettent de diversifier les actions locomotrices et exploratrices des animaux, contribuant à leur bien-être. Tout ceci relève donc d'un plus grand enrichissement. Les souris sont pesées tous les jours et suivies en temps réel via des caméras nous permettant de monitorer à distance le comportement des animaux. Il nous est donc possible d'intervenir rapidement en cas de quelconque soucis. De plus, le bien-être des souris est conditionné par la mise en place de protocoles et de points limites lors des procédures visant à réduire les éventuelles souffrances animales. Par exemple, en cas d'agression entre animaux, des soins seront apportés aux souris blessées et celles-ci seront isolées le temps de la récupération. Si l'animal n'a pas pu récupérer dans une temps raisonnable, la procédure s'arrêtera pour celui-ci. Une fois le regroupement effectué, une surveillance accrue sera effectuée pour observer tout comportement agressif envers l'animal préalablement blessé. Si les comportements aggressifs persistent, la procédure sera arrêtée pour l'animal. Notre design d'électrode pour enregistrer l'activité des neurones est plus léger et moins encombrant que les autres systèmes connus et vendus sur le marché. Lors des chirurgies, certaines douleurs peuvent survenir en post-opératoire. Pour diminuer et abolir ces douleurs, des anesthésiques locaux et des anti-douleurs seront administrés. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale gazeuse controlée durant la totalité de la chirurgie afin de permettre un rétablissement rapide de l'animal. Si l'animal n'a pas récupéré dans les 48h, la procédure s'arrêtera pour celui-ci. Un tapis chauffant sera placé sous l'animal afin d'éviter l'hypothermie.

Choix des espèces

Le système dopaminergique mesocorticolimbique des rongeurs est relativement bien conservé par rapport à l’Homme, anatomiquement et fonctionnellement. Les récepteurs nicotiniques et les afférences cholinergiques sont organisées de manières similaires. Ce n’est pas le cas chez les invertébrés, poissons et oiseaux. Par ailleurs, il existe beaucoup d’endophénotypes de l’addiction clairement établis chez la souris. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux, difficilement accessibles chez d’autres modèles. Si les modèles d’invertébrés et poisson peuvent être utilisés pour étudier les mécanismes de renforcement aux drogues, l’organisation anatomique est trop différent pour qu'ils puissent être utilisés pour comprendre la modulation nicotinique du système dopaminergique. Des modèles de mammifères (rat, singe) ne se justifient pas non plus car les outils génétiques nécessaires pour disséquer les mécanismes sous-jacents n’existent pas chez ces espèces. Enfin, notre environnement élargi et enrichi a été spécifiquement développé et adapté à l'étude de la souris. Les animaux utilisés seront à l'âge jeune adulte - adulte. Avant 8 semaines, les souris sont considérées comme étant au stade adolescent. Ainsi, sachant que le comportement à cet âge est différent de l'âge adulte, et que notre étude porte sur l'âge adulte uniquement, nous éviterons d'étudier le comportement de souris avant 8 semaines. De plus, l'implantation de fibres et d'électrodes représentant une certaine charge de poids sur la tête de l'animal, nous préférons le faire une fois que ceux-ci sont plus grands et ne pas influencer leur comportement avant 8 semaines. Ainsi, les procédures qui nécessitent des injections virales uniquement se feront sur l'animal entre 4 et 6 semaines afin d'observer un temps d'infection nécessaire par le virus concerné (entre 3 et 6 semaines d'expression). Les souris qui se verront implanter des fibres optiques ou des électrodes d'enregistrement subiront une chirugie à partir de 8 semaines (âge adulte pour une souris). Les expériences comportementales se feront aussi à partir de 8 semaines d'âge.

128 souris vont être utilisées, gardées en vie à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles servent de support à des étudiants apprenant les prélèvements sanguins, chaque animal subissant quatre prélèvements sur quatre sites différents sous anesthésie, l'exercice étant répété une semaine plus tard puis une seconde fois avec un autre groupe. Le porteur indique que la répétition des gestes par des novices et le couplage à l'anesthésie font passer la sévérité de légère à modérée, et prévoit une réutilisation ultérieure des animaux. Il justifie l'anesthésie par le stress qu'induirait autrement la contention, et présente cette formation comme la source de techniciens "très recherchés".

Objectifs

Durant leur cursus, nos étudiants suivent une formation qui qualifie le personnel appliquant des procédures expérimentales aux animaux, spécifique aux modèles rongeurs. Cette formation réglementaire nous permet de former des techniciens hautement qualifiés en expérimentation animale, qui sont des professionnels très recherchés dans notre bassin d’emploi. Le programme de la formation inclut l’acquisition de compétences théoriques et pratiques permettant la manipulation d’animaux dans le respect de leur bien-être. Parmi ces manipulations à maîtriser figure la réalisation de prélèvements sanguins, chez le rongeur de laboratoire. Pour permettre l’acquisition de cette compétence, les travaux pratiques que nous souhaitons réaliser permettent une familiarisation progressive des étudiants avec ces techniques. Durant les travaux pratiques précédents, les étudiants ont appris à réaliser la contention des animaux, des injections, leur anesthésie. Ils ont également suivi des enseignements d’éthique, de réglementation et savent évaluer le bien-être animal afin d’être en mesure d’adapter leur pratique au comportement de l’animal qu’ils manipulent. Les objectifs pédagogiques de cette séance de travaux pratiques sont multiples : -Connaissance de la diversité des voies de prélèvement veineux, recommandations, méthodes, avantages et inconvénients de chacune - Connaissance des recommandations en termes de volumes maximaux et de fréquence des prélèvements sanguins -Apprentissage des règles d’asepsie, propres à la pratique de prélèvements sanguins. - Connaissance du matériel nécessaire aux prélèvements, préparation de ce matériel -Acquisition des compétences techniques de prélèvement sur veines caudale et saphène - Etude de la régulation de la glycémie, par analyse des prélèvements sanguins réalisés - Renforcement de l’apprentissage du contrôle des paramètres physiologiques et du respect du confort de l’animal durant une anesthésie

Bénéfices attendus

Au cours d’une procédure expérimentale, le technicien doit être en mesure de limiter le degré de mal-être généré à l’animal, en apportant des réponses adéquates afin de restreindre celui-ci. Ceci nécessite un apprentissage, réalisé durant des séances de travaux pratiques. Ce projet permettra à nos étudiants, futurs techniciens pratiquant l'expérimentation animale, d'acquérir la compétence de réalisation de prélèvements sanguins chez la souris, tout en veillant à respecter son bien-être. La liste plus précise des compétences acquises est décrite dans la partie Objectifs.

Procédures

Anesthésie par voie gazeuse (isoflurane) : deux anesthésies par animal, espacées d'une semaine minimum. Prélèvements sanguins : 4 prélèvements de faible volume (de l'ordre de 10 microlitres), réalisés sur des sites de ponction disctincts (2 veines sapheines et 2 veines caudales) chez la souris anesthésiée et analgésiée (buprénorphine). Ces prélèvements seront répétés une semaine plus tard, dans les mêmes conditions. La durée de l'anesthésie, durant laquelle se réaliseront les prélèvements, ne dépassera pas 1h.

Impact sur les animaux

Les actes pratiqués ici sont individuellement d’un degré de sévérité léger mais leur répétition (4 prélèvements sanguins par animal), leur réalisation par des étudiants novices et le couplage à une anesthésie pourraient les classer dans un degré de sévérité modéré. Les effets indésirables possibles, qui seront recherchés et évalués à l'aide d'une grille de scoring et conduiront à la réalisation d'un traitement antalgique adapté, sont : - une perte de poids (évaluée en pourcentage et par jour), - un comportement inadapté (comportement des animaux sans intervention du manipulateur – contractions, boiteries des pattes postérieures, position antalgique, prostration - et en réponse au geste du manipulateur : agressivité ou passivité) - une déshydratation (détectée par l’apparence physique telle que yeux plissés, enfoncés, pli de peau moins élastique …), -un aspect physique altéré (poil hérissé, sale), -une hyperventilation

Devenir

Il n'est pas justifié d'euthanasier les animaux suite à cette procédure et cela irait à l'encontre de la règle des 3R. Les animaux seront réutilisés pour d’autres projets se déroulant à l’IUT, après vérification du rétablissement total de ceux-ci si jamais ils avaient présenté des signes de souffrance.

Remplacement

Nous commençons l’apprentissage sur support non vivant, avons recours à des vidéos plutôt qu’à une démonstration sur animal.

Réduction

Réduire le nombre d’animaux : Nous commençons l’apprentissage sur support non vivant, avons recours à des vidéos plutôt qu’à une démonstration sur animal, ne recourons qu’à une souris pour deux étudiants, par séance, tout en permettant à chacun de s’entraîner au prélèvement sanguin sur deux voies distinctes, nous utilisons le sang prélevé pour étudier l’évolution de la glycémie des souris durant la séance, sans recourir à un autre TP spécifique et donc à d’autres animaux. Par ailleurs, nous aurons 7 groupes d’étudiants mais n’aurons recours au maximum qu’à quatre lots de 8 souris, chaque lot étant utilisé 2 fois, par deux groupes d’étudiants dont la séance de TP sera espacée d’au moins une semaine, de manière à permettre une totale récupération de l’animal. Après ces séances, les animaux pourront être réutilisés dans d’autres TP de notre établissement, correspondant à des procédures sans réveil ou de gravité légère (autres projets autorisés).

Raffinement

Nous aurons recours à une analgésie centrale, au moyen d’une prémédication à la buprénorphine à 2 mg/kg. Après réveil, les zootechniciens surveilleront le réveil des animaux et leur bien-être durant quelques heures puis quotidiennement à l’animalerie. Il est important qu’ils soient informés des actes réalisés sur les animaux durant les TP, de façon à connaître les douleurs potentiellement occasionnées. Une grille d’évaluation du bien-être des animaux est couramment employée pour ce type d’acte. Prenant en compte des critères objectifs, elle servira à adapter un traitement antalgique. Si le traitement n’aboutit à aucune amélioration (suite à évaluations, plus fréquentes si une douleur a été détectée), l’euthanasie de l’animal sera réalisée après anesthésie (injection létale d'Exagon après anesthésie à l'isoflurane). Les animaux sont amenés en salle de TP une heure avant le début de la séance, afin de s’acclimater à ce nouvel environnement. Des recommandations sont données, rappelées aux étudiants à chaque séance afin que la manipulation ait lieu dans le calme. Le recours à l’anesthésie des animaux, pour des actes de prélèvement sanguin périphériques, peut sembler exagéré et nous pourrions nous contenter de placer les souris dans des tubes à contention en les maintenant en veille. Cependant, pour permettre à chaque étudiant de pratiquer ce geste tout en réduisant le nombre d’animaux, nous allons réaliser 4 prélèvements sanguins sur le même animal. Nous pensons que ceci pourrait générer, chez la souris vigile, un stress supérieur à celui induit par une anesthésie à l’isoflurane. Les animaux seront maintenus sur tapis chauffants reliés à des sondes thermiques durant l’anesthésie et seront réveillés au calme et au chaud.

Choix des espèces

Les souris sont les animaux les plus utilisés en expérimentation, il est donc logique que nous formions nos étudiants à la manipulation de cet animal. Les actes de prélèvements sanguins sont fréquemment réalisés chez cette espèce. Adultes de plus de 7 semaines, habitués à la préhension et la contention, plus faciles à manipuler que de jeunes animaux.

90 souris au système immunitaire humanisé vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules de leucémie pouvant induire une tumeur et des métastases, avec des prélèvements sanguins réguliers et une imagerie sous anesthésie deux à trois fois par semaine. Le porteur indique que les animaux développant des métastases douloureuses seront euthanasiés. Il qualifie ces souris humanisées d'approche "indispensable" et affirme que les interactions entre système immunitaire, pathologie et traitement ne peuvent être recréées in vitro.

Objectifs

Les lymphocytes T sont des cellules du système immunitaire qui présentent des fonctions « tueuses » puissantes et leur capacité à reconnaître et tuer spécifiquement des cellules tumorales est une promesse thérapeutique d'importance. Le but de cette expérimentation animale est de vérifier si des cellules précurseurs des lymphocyte T sont capables de migrer dans le thymus et s'y différencier afin d'acquérir les caractéristiques fonctionnelles des lymphocytes T matures : c'est-à-dire, reconnaissant une cellule tumorale afin de s’activer et d’éliminer les cellules cibles l'exprimant.

Bénéfices attendus

Les lymphocytes T immatures peuvent au préalable être modifiés génétiquement pour leurs permettant de s'attaquer à des cellules tumorales cibles. Il s'agit donc de vérifier l'efficacité d'un modèle permettant de développer des nouvelles méthodes thérapeutiques pour guérir les cancers. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous validons en outre un modèle davantage spécifique de l'utilisateur final des ces cellules à visées thérapeutiques : l'Homme.

Procédures

Injection : 3 maximum, d'une durée de 10 à 15 secondes chacune; prélèvements sanguins : toutes les 2 semaines, d'une durée de 10 à 15 secondes chacun. Imagerie in vivo sous anesthésie générale : 5-10 minutes par souris 2 à 3 fois par semaine.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales peut induire une tumeur et la présence de métastases.

Devenir

Les animaux ayant reçu une injection de cellules tumorales risquent de développer des métastases amenant une souffrance. Ils seront dès lors euthanasiés.

Remplacement

Les tests in vitro ont été envisagés. Néanmoins, il n’est pas possible de recréer, in vitro, les interactions complexes qui peuvent exister entre un organe fonctionnel (le système immunitaire), une pathologie et les effets thérapeutiques et toxicologies de composés à visées thérapeutiques les impliquant. Les souris aux organes humanisés constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de nouvelles thérapies.

Réduction

Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux par groupe (n=10) est réalisée sur la base de notre expérience, ainsi que sur la littérature scientifique tout en tenant compte du taux d’humanisation de 82,5%. Trois groupes sont prévus et un total de 3 études sera réalisé, au total, pour valider le modèle.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Six morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposes. A leur entrée dans le projet, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation et seront habituées a la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle cumulative de scores prenant en compte : l’aspect du pelage, les mouvements, l’activité, la couleur des muqueuses et le score corporel. Les souris seront évaluées quotidiennement et l’échelle sera appliquée dès que nécessaire. Une souris avec un score clinique ≥ à 7 sera euthanasiée pour raison éthique. Le poids sera monitoré 3 fois par semaine. Une perte de plus de 20%, calculée à partir du poids le plus élevé sera considérée comme une raison de mise à mort. Toute anormalité non objectivable par l’échelle de score clinique devra être rapportée au vétérinaire qui aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur si elle/il le juge nécessaire.

Choix des espèces

Nous maitrisons l'humanisation du système immunitaire sur les souris NCG. En se basant sur cette expertise, il est essentiel de continuer sur cette espèce. La procédure expérimentale requiert des animaux entrant en étude vers l’âge de 3-4 semaines. Des animaux plus âgés présentent des taux de succès inférieurs pour la prise de greffe.

400 rats et 100 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'implantation chirurgicale d'une prothèse crânienne sous anesthésie de 2 à 6 heures, puis jusqu'à une dizaine de sessions d'enregistrement, certaines en contention sur plateforme rotative, d'autres après une lésion vestibulaire provoquant des troubles de l'équilibre. Le porteur indique que la lésion vestibulaire entraîne des vertiges et une désorientation transitoires, et que les lignées modèles d'épilepsie-absence figent l'animal quelques secondes à minutes. Il affirme qu'aucune simulation ni organoïde ne reproduit ces interactions neuronales, l'euthanasie survenant entre 3 et 12 mois.

Objectifs

Le fonctionnement du cerveau est basé sur l'interaction réciproque entre les neurones, qui traitent l'information, et le réseau sanguin, qui répartit en permanence le soutien métabolique selon les contributions de différentes aires cérébrales. Ce couplage entre métabolisme et traitement cognitif sert de moyen d’exploration des processus cérébraux, grâce à l’imagerie des processus vasculaires et métaboliques pour identifier et comprendre les réseaux neuronaux associés à chaque comportement, activité physiologique ou pathologique. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment les différentes aires fonctionnelles du cerveau interagissent pour produire des processus cognitifs, des comportements, ou des anomalies handicapantes telles que les absences (brêves périodes de passivité associée à une perte de conscience). Ce projet associe trois axes d’analyse complémentaires : 1/Comment mesurer simultanément la dilatation des vaisseux sanguins et la charge en oxygène du sang pour estimer la charge métabolique des aires cérébrale à travers l’ensemble du cerveau ? On développe des méthodes pour la mesure du métabolisme tissulaire in vivo sur l’ensemble du cerveau de façon minimalement invasive, en combinant des moyens acoustiques et optiques. 2/L’orientation spatiale nécessite des repères visuels stables, i.e. dont le mouvement apparent est uniquement causé par les mouvements de l’animal. Comment le cerveau identifie et utilise de tels repères à partir des signaux visuels et vestibulaires ? On aborde une situation physiologique, la dynamique des réseaux impliqués dans des fonctions cognitives d’orientation spatiale, où des aires cérébrales spécialisées coopèrent pour produire une fonction intégrée. 3/Existe-t-il des marqueurs de l’activité cérébrale annonçant la survenue d’absence, et quels en sont les mécanismes déclencheurs? On explore une situation pathologique, l’épilepsie de type absence (non convulsive), où des réseaux distribués à travers le cerveau perturbent l’ensemble de l’activité jusqu’à interrompre le comportement et figer l’animal de façon transitoire (typiquement 3s à 3min).

Bénéfices attendus

Les données obtenues dans ce projet apporteront une meilleure connaissance de mécanismes cérébraux physiologiques et pathologiques. D’un point de vue scientitifque on attend de mieux comprendre quelles aires cérébrales sont impliquées dans l’orientation et dans l’attention (interrompue par les absences) et globalement de mieux comprendre comment les différentes aires cérébrales spécialisées interagissent pour produire un effet de conscience. D’un point de vue technologique on développe des moyens d’observation donnant une vision étendue des liens entre mécanismes métaboliques et cognitifs. L’ensemble de ces progrès constitueront une base pour mieux comprendre et à terme traiter les pathologies impliquant l’orientation, les absences, ou les troubles métaboliques, dont l’impact sur la santé est significatif.

Procédures

Chaque animal est soumis à une unique procédure chirurgicale d'implantation d'une prothèse crânienne et d'un système d'attache permettant des mesures ultérieures non invasives (EEG, imagerie ultrasonore, imagerie optique). Cette étape est réalisée en une seule chirurgie sous anesthésie profonde d’une durée de 2-6h, suivie d’une période de récupération de 5-7 jours. Chaque animal participe ensuite à une campagne d’observation non invasive, composée au maximum d’une dizaine de sessions d’enregistrement espacées de 3 jours à 3 mois, étalée sur une durée totale maximale de 1 an. Chaque session nécessite une brêve anesthésie initiale, pour fixer le système d’enregistrement, pendant environ 30 minutes. Une fois le système attaché la session peut se dérouler de trois façons différentes : 1/L’animal est maintenu anesthésié pour la session de mesure, d’une durée maximale de 6h ; 2/L’animal réveillé reste en contention sur une plateforme rotative, pour évaluer des stimuli visuo-vestibulaires imposés, sur une durée maximale de 6h ; 3/L’animal est mobile, en restant attaché au système de mesure par un cordon léger, pour une durée d’enregistrement des mesures en continu de 6h à une semaine. Les animaux participant à l'étude de l'intégration visuo-vestibulaire sont soumis à une brève chirurgie de lésion vestibulaire (environ 30 minutes), sous anesthésie profonde, au milieu de la période d'observation. Les animaux sont euthanasiés à l'issue de la dernière session d'observation.

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale d’implantation d’une prothèse crânienne est associée à un risque post-opératoire de douleur à traiter de façon préventive, d’infection ou de dégradation de la prothèse à surveiller. La procédure de lésion vestibulaire produit un stress lié à un défaut de sens de la verticale et des accélérations de la tête, se traduisant par des mouvements déséquilibrés de l’animal et/ou une immobilisation inhabituelle. Ce handicap est transitoire, grâce à compensation du système nerveux atteinte en une semaine environ. Les sessions d’observations avec l’animal en contention sur une plateforme rotative peuvent induire des vertiges brefs et du stress en cas de stimuli visuel et vestibulaire discordants. Les sessions d’observation sur animal éveillé peuvent produire un stress pendant la durée de la session, lié à la contention ou à la gêne occasionnée par le câble rattachant la tête au système de mesure. Les lignées établies comme modèles d’absence spontanée présentent des périodes de quelques secondes à quelques minutes pendant lesquelles l’animal est figé, interrompant son comportement pour le reprendre à la fin de l’absence. Bien que le comportement soit inhabituel pour des rongeurs il n’est pas dommageable dans le cadre sécurisé du laboratoire (notamment absence de prédateur). La rotation imposée sur une plateforme mobile, et la lésion vestibulaire provoquent des vertiges et perte d'équilibre. La récupération spontanée d'une lésion vestibulaire est de 3 jours.

Devenir

La qualité des mesures obtenues au moyen d'une prothèse crânienne permettant l'observation décroit avec le temps, ce qui ne permet pas de conserver les animaux pour obtenir plus de données. Les animaux sont gardés en vie durant au maximum 12 mois pour permettre d’obtenir des données suffisantes en qualité et quantité pour établir des observations répondant aux questions abordées par le projet. On prévoit une euthanasie entre un âge de 3 et 12 mois.

Remplacement

Les questions abordées dans ce projet concernent les propriétés émergentes des interactions entre assemblées de populations neuronales réparties à travers le système nerveux, en rapport avec des questions de physiologie et pathologies des mammifères. La diversité des types cellulaires, de leurs connexions, la richesse des intéractions moléculaires -d’ailleurs tous encore incomplètement décrits- font qu’il n’existe aucun moyen de simulation ou de remplacement par des organismes plus simples ou des organoïdes. En outre les mécanismes étudiés sont très dynamiques et propres aux animaux vivants, ce qui ne permet pas de les aborder sur des tissus fixés.

Réduction

On prévoit d’employer au maximum 400 rats et 100 souris sur 5 ans. Nos études déjà publiées ont montré que la bonne sensibilité des méthodes utilisées dans nos approches EEG-imagerie fonctionnelle permet typiquement de dresser un panorama de l’activité fonctionnelle et d’exhiber des variations statisiquement significatives avec un nombre limité d’animaux (par exemple sur la dynamique d’activation, la comparaison avec une situation contrôle). Ces animaux permettront d’aborder nos trois axes d’étude (méthode, orientation, absence). L’étude de méthode compare les variations temporelles des signaux cérébraux entre des activités de base et des activité induites pharmacologiquement sous anesthésie, suivant un protocol établi. L’étude sur l’orientation spatiale repose sur un groupe avec lésion vestibulaire et un groupe contrôle, tous deux soumis à des stimuli concordants ou discordants. L’étude sur les absences compare également deux groupes d’animaux, présentant des absences spontanées contre animaux contrôles. Pour réduire les effectifs, étant donné les similitudes techniques entre les procédures engagées pour ces 3 axes d’étude, des données pourront être partagées et le cas échéant des animaux pourront participer à plusieurs axes d’étude.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés pendant 5 jours suivant leur arrivée aux conditions de température et d'humidité de l'animalerie. Les conditions de stabulations sont conformes aux standards: taille des cages, nourriture et eau ad libitum, éclairage suivant un cycle régulier jour/nuit. L'environnement est enrichi par des buchettes. Les animaux sont hébergés par groupes sauf lorsque cela représente un risque post-opératoire (détérioration des prothèses par un congénère). Le projet n’a pas de finalité associée à la douleur et ne prévoit pas l’occurrence de situation douloureuse, en dehors d’un épisode d’intensité au maximum modérée, post-opératoire sur une durée de 3 jours, pris en charge de façon systématique et anticipée. La survenue éventuelle d’autres épisodes douloureux pourrait se produire en cas de complication chirurgicale, impliquant une vigilance quotidienne. Afin de minimiser les douleurs post-opératoires les animaux recevront un traitement antalgique initié dès le début de la chirurgie. Durant toute l'étude : les animaux seront évalués quotidiennement par les zootechniciens pour des comportements tels qu'une posture ou des mouvements anormaux. En cas de comportement anormal, les animaux seront isolés et feront l'objet de soins adaptés par les expérimentateurs pendant 72h. Les animaux seront euthanasiés s'ils présentent des signes de douleur persistants ou perdent 10% ou plus de leur poids pendant cette période, selon une grille standard. L'atteinte d'un point limite exige une ou plusieurs des actions suivantes : -l'isolation et la surveillance bi-quotidienne, injection de solution glucosée en sous-cutanée en cas de dénutrition - l'administration d'un analgésique -l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Les rats et souris forment un modèle des activités cérébrales et du couplage neuro-vasculaire des mammifères. Ils forment des modèles particulièrement développés pour étudier les circuits cérébraux de l’orientation spatiale, des comportements cognitifs simple et du sommeil. De plus, des lignées spécifiques (WAG/Rij, GAERS) sont des modèles de référence pour les absences. Le projet repose sur des rats et souris adultes, dès la fin du sevrage, soit un âge compris entre 4 semaines et 1 an, poids d'un animal sain (souris 10-20g, rat 150-500g). Des animaux adultes présentent un référentiel stable des capacités cognitives et du couplage neurovasculaire. Les lignées WAG/Rij et GAERS présentent des absences spontanées qui émergent dans les 2-4 semaines suivant la naissance, ce qui en fait d'excellents modèles. Les modèles rats et souris sont complémentaires : la taille du cerveau de rat est particulièrement adaptée à la technique d'imagerie ultrasonore (résolution spatiale, masse de la sonde fixée sur le tête de l'animal), la souris offre une perspective de comparaison avec un corpus d’études plus diversifié.

4 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une implantation de tumeur cérébrale par stéréotaxie, un suivi par IRM répété, des injections intraveineuses, sous-cutanées ou intracérébrales sur plusieurs cycles et des gavages, pour tester un peptide et des nanotechnologies portés par une société de biotechnologies. Le porteur décrit des effets possibles d'hyperpression intracrânienne, d'œdème et de perte de poids, et justifie l'effectif élevé par les 17 procédures prévues. Il qualifie le passage par un modèle animal d'"indispensable" et conclut que le glioblastome ne peut être reproduit in vitro, les bénéfices pour les patients restant conditionnés à des étapes réglementaires ultérieures.

Objectifs

Le glioblastome (GBM) est le cancer cérébral le plus fréquent et le plus agressif, avec 200 000 décès par an dans le monde, une survie médiane de 14 mois et aucun traitement curatif. Le traitement actuel consiste en une extraction chirurgicale de la tumeur suivie par le protocole de Stupp (radiothérapie et chimiothérapie avec le témozolomide). Des travaux ont montré l’activité anticancéreuse du peptide NFL sur des cellules de GBM (rats, souris, humain) cultivées en laboratoire et sur des rats porteurs d'un GBM (après une simple administration directement dans la tumeur). Ce peptide tue également les cellules responsables de l'apparition du GBM. De plus, lorsque le peptide se trouve à la surface de nanotechnologies, ce peptide augmente leur entrée dans des cellules de GBM de souris comparativement aux nanotechnologies seules. Chez l'animal (souris), une seule injection des nanotechnologies couplées au peptide et chargées en un anticancéreux, directement dans la tumeur, diminue de manière plus efficace le volume de la tumeur comparativement aux nanotechnologies chargées en anticancéreux mais sans peptide à leur surface. Une société de biotechnologies en santé travaille sur les formulations de ce peptide seul et combiné à des nanotechnologies pour en faire de futurs candidats-médicaments pour le traitement du GBM. Leur développement pharmaceutique a permis de les formuler pour une utilisation clinique. Le but de ce projet de recherche pré-clinique non réglementaire est d’étudier la tolérance et l’efficacité de ce peptide seul ou combiné à des nanotechnologies après administrations chez des souris saines ou porteuses de GBM humain en déterminant la voie d’administration la plus adaptée afin de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients.

Bénéfices attendus

La société de biotechnologies en santé qui travaille sur les formulations du peptide NFL seul et combiné à des nanotechnologies visent à en faire de futurs candidats-médicaments dans le traitement du GBM. Ces travaux avancés de recherche pré-clinique non réglementaire ont pour but de valider l’innocuité des traitements et leur efficacité et ainsi, confirmer leur intérêt thérapeutique. Si l’intérêt thérapeutique est attesté et la posologie déterminée, ces travaux pourront servir de base pour la mise en place d’essais pré-cliniques règlementaires avant la mise en place d’essais cliniques chez l'Homme. Le but de ce projet est de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients opérables ou non.

Procédures

Dans la mise au point du modèle, les animaux subiront 3 types d'intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (4 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours) et une injection intraveineuse. Dans l'étude de toxicité, les animaux subiront un type d'intervention : des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) ou une injection intracérébrale. Dans l’étude de biodistribution et pharmacocinétique tissulaire, les animaux subiront jusqu'à 5 types d’intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (3 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours), des injections intraveineuses ou sous-cutanées sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) ou une injection intracérébrale qui durera plusieurs minutes et une perfusion cardiaque. Dans l’étude de pharmacocinétique, les animaux subiront deux types d’intervention, une injection unique intraveineuse ou sous-cutanée ou intracérébrale qui durera plusieurs minutes et des prélèvements répétés de sang au niveau de la veine caudal, de la veine jugulaire ou du sinus retro-orbital (3 prélèvements maximum, qui dureront quelques minutes chacun et qui seront espacés de plusieurs minutes à plusieurs heures). Dans l’étude d'efficacité, les animaux subiront quatre types d’intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (1 à 6 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours), des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours) ou une injection intracérébrale qui durera plusieurs minutes et des gavages répétés (1 gavage par jour pendant 5 jours suivi de 2 jours de repos, sur 5 cycles maximum).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des candidats médicaments seront évalués lors de chaque phase du projet. Les nanotechnologies pouvant être chargés d’anticancéreux (paclitaxel, etc.), des effets indésirables communément retrouvés après injection de ce type de composé pourraient être observés (modification de la formulation sanguine, perte de poids, faiblesse, etc.). Les effets indésirables peuvent être également liés à l’acte chirurgical et la croissance tumorale (hyperpression intracrânienne, oedème, etc.) ainsi qu’à l’injection des traitements (rougeur, inflammation, etc.).

Devenir

A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements de sang et/ou d’organes.

Remplacement

L’utilisation des candidats médicaments étant à visée humaine, dans le domaine de la neuro-oncologie, il est nécessaire de réaliser des études précliniques pharmacologiques non-réglementaires, comme ici des études toxicologiques et d’efficacité pour démontrer et valider sans aucune ambiguïté leur innocuité et efficacité avant les études précliniques réglementaires et les essais cliniques chez l’Homme. Des travaux menés sur des cultures de cellules tumorales et saines ont déjà été réalisées ou sont en cours pour valider les molécules et formulations testées. Pour compléter l’étude, il est indispensable de passer sur un modèle animal mimant les conditions de développement du GBM humain avant de pouvoir tester les molécules sur des patients atteints de ce cancer. Le développement de ce type de modèle (modèle CDX) dans ce projet ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques dans un microenvironnement particulier, notamment dans le cas du glioblastome, ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.

Réduction

L'étude de toxicité permettra de raffiner la dose administrée, et ainsi de réduire le nombre de lot d’animaux à tester dans les études suivantes (études 2, 3 et 4). Une seule dose à la fois sera testée. Ainsi, si la plus haute dose n’est pas toxique, les doses plus basses ne seront pas systématiquement testées. Le nombre de souris immunodéprimées pourra également être réduit au strict minimum en fonction des résultats obtenus chez les souris immunocompétentes. Pour finir, lors de l’étude d’efficacité, seuls les traitements ayant montré la meilleure biodistribution et pharmacocinétique tissulaires seront testés pour réduire le nombre d’animaux. Enfin, ce traitement étant destiné aux hommes et aux femmes, ces études seront d'abord effectuées sur un premier sexe, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux pour le deuxième sexe. Ce nombre n'est pas inclu dans cette saisine mais est estimé à 1526 comparativement à 4640 pour le premier sexe. Le nombre d’animaux choisi par groupe est suffisant pour garantir des données précises, représentatives de l’espèce, et statistiquement exploitables. Il n’est pas utile d’avoir plus d’animaux, mais il est préférable de ne pas en utiliser moins, au risque d’être confronté à des variations entre des animaux d’un même groupe. L’effectif des souris utilisées (4640) est très important, toutefois il est justifié par le nombre de procédures (17) dont la logique de déroulement est clairement établie. Si certaines de ces procédures étaient un échec complet (peu probable et non souhaitable), cela pourrait entraîner un arrêt du projet tel qu’il est établi aujourd’hui et diminuerait le nombre de vies animales utilisées, afin d’éviter de recourir inutilement à des vies animales.

Raffinement

La douleur et l’angoisse de chaque animal seront évaluées par un suivi quotidien. Afin d’évaluer de façon raffiner la souffrance/douleur des animaux tout au long de l’expérimentation, un système de score sera mis en place pour chaque animal et pour chaque paramètre contrôlé. Dans le cas où un animal présenterait un ou des signes de souffrance, un médicament contre la douleur serait administrée jusqu’à ce que ces signes disparaissent. L'atteinte d'un des points limites par un animal impliquera sa mise à mort. Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi, mais la décision finale sera prise dans les 24h par le porteur de projet. Au fur et à mesure des études précédentes, nous avons pu affiner cette grille et la prise en compte de la douleur animale.

Choix des espèces

Des recherches bibliographiques montrent que la souris est l'espèce la plus utilisée et adaptée pour l’implantation de cellules de GBM, qu’elles soient issues de lignées immortalisés ou de patients. Il s'agit de l'espèce la mieux décrite dans la littérature. Les souris seront utilisées entre 6 et 8 semaines d’âge. Cet âge est majoritairement retrouvé dans les études bibliographiques in vivo sur modèle orthotopique de GBM chez la souris.